tema5

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Dr. Antonio Barbadilla

Tema 5: Ligamiento y mapas genéticos

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Ligamiento y mapas genéticos Ligamiento y mapas genéticos

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Objetivos tema 5:Ligamiento y cartografía genética

(mapas)

Objetivos tema 5:Ligamiento y cartografía genética

(mapas) Deberán quedar bien claros los siguientes puntos

•Los conceptos de ligamiento, recombinación y entrecruzamiento•Cómo calcular las frecuencias de recombinación en loci ligados•Construcción de mapas genéticos a partir de cruzamientos pruebas de 2 y 3 factores (puntos) •Interferencia y coeficiente de coincidencia•Demostración citológica del entrecruzamiento•Análisis de tétradas en hongos ascomicetos•Recombinación mitótica•Cartografía genética en humanos•Ligamiento y recombinación en bacterias y virus

3



3

Ligamiento: Asociación de genes en el mismo cromosoma formando grupos de ligamientos

Ligamiento: Asociación de genes en el mismo cromosoma formando grupos de ligamientos

Ligamiento total

A

A

a

a

B

B

b

b a

a b

b

A

AB

B

Genotipo F1

AB / ab

Gametos (100% gametos parentales)

50 % AB50 % ab

4



4

Segregación independiente (no ligamiento, 2a ley de Mendel)

AA

aa

B

B

b

b

AA

B

B

AA b

b

aa

B

aa

b

b

B

Genotipos F1 A B-- --a b

AB

Ab

aB

ab

gametos

50%recom-binan-

tes

Proporción 1:1:1:1

5



5

Mensaje: La frecuencia de gametos recombinantes (FR) debe estar entre el ligamiento total (0%) y la segregación independiente (50%)

0% FR 50%

6



6

Ligamiento: Ligamiento: •Descubrimiento del ligamiento (Morgan con mutantes de Drosophila melanogater)

7



7

Mutantes de Drosophila melanogater

+: salvaje Cy: Curly

ap: apteravg: vestigial

sd: scalloped

dp: dumpy

D: Dichaete c: curved

+: salvaje w: white

sepia Bar

Estudio del ligamiento con mutantes

8



8

Ligamiento:

•Simbolismo del ligamiento

Configuración en acoplamiento o cis -> AB/ab Configuración en repulsión o trans -> Ab/aB

•Prueba de ligamiento: desviación de la proporción 1:1:1:1 en un cruzamiento prueba de un dihíbrido

9



9

Grupos de ligamiento en

Drosophila

10



10

Ligamiento a nivel del DNA

Haplotipo

11



11

Cruzamiento prueba: Cruzamiento prueba:

AA BB aa bb

A B a b

Aa Bb aa bb

Genotipos P

Gametos P

F1

Cruza-miento prueba

ab

AB

Ab

aB

ab

Aa Bb

Aa bb

aa Bb

aa bb

Gametos

Genotipos

A- B-

A- bb

aa B-

aa bb

Fenotipos

X

12



12

Mensaje:El cruzamiento prueba permite inferir las proporciones de los gametos que se forman en el doble heterocigoto

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Recombinación: la generación durante la meiosis de genotipos haploides distintos de los genotipos parentales

A B a b

Aa Bb

Gametos P

F1

AB

ab

Ab

aB

Gametos

Gametos parentales

Gametos recombinantes

14



14

Recombinación:•Recombinación intercromosómica: genes (loci) en diferentes cromosomas (leyes de Mendel)

•Recombinación intracromosómica: genes situados en el mismo cromosoma ---> Entrecruzamiento

AA

aa

B

B

b

b

AA

B

B

AA b

b

aa

B

aa b

b

B

Genotipos F1 A B-- --a b

AB

Ab

aB

ab

50%recom-binan-

tes

Proporción 1:1:1:1

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15

Entrecruzamiento (Crossover): El intercambio de cromátidas no hermanas entre cromosomas homólogos durante la meiosis por un proceso de rotura y reunión del DNA

A

A

a

a

A

A

a

a

B

B

b

b

A

A

a

a

B

B

b

b

B

B

b

b

A

A

a

a

B

B

b

b

Cromosomas en la meiosis Productos meióticos

Recombi-nantes

Meiosis con

entrecruzamient

oentre los

genes

Meiosis sin

entrecruzamient

oentre los

genes

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16

Meiosis y entrecruzamientoMeiosis y entrecruzamiento

17



17

Entrecruzamiento visto mediantemicroscopía electrónica

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18

Entrecruzamiento visto mediantemicroscopía electrónica

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19

Entrecruzamiento en el nivel

del DNA

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20

Migración ramal

21



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Cartografía genética:

La cartografía genética asigna el lugar cromosómico de un gen (o locus) y su relación de distancia con otros genes (o loci) en un cromosoma dado

A. Sturtevant (1913). La distribución y el orden lineal de los genes se pueden establecer experimentalmente mediante el análisis genético

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22

Supuesto: las frecuencias de entrecruzamiento, y por tanto la frecuencia de recombinación, depende de la distancia entre genes

Unidad de distancia: La unidad de mapa (u.m.) o el centimorgan (cM) --> La distancia entre genes (loci) en los que la frecuencia de recombinación es del 1%

A CB

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23

Meiosis

1

2

3

4

A C CB

24



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•Mayor distancia entre loci --> Mayor número de entrecruzamientos

•Más Entrecruzamientos ---> Más Recombinación

A mayor frecuencia de recombinación mayor la distancia entre loci

El número de etrecruzamientos por meiosis y por cromosoma se puede representar por una distribución aleatoria de Poisson, con media

!)(

i

eif

i

)21ln(

)1(2

1

FR

eFR

25



25

Mapa a partir de cruzamientos prueba de dos puntos (dos loci en

el mismo cromosomas)

Se determina la distancia 2 a 2 entre loci y éstas se suman para estimar la distancia genética total de un cromosoma

A B

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26

Ejemplo:Experimento de Morgan pr = Ojos Púrpura

vg = Alas vestigialesAmbos alelos son recesivos respecto al salvaje

P pr+ pr+ vg+ vg+ X pr pr vg vg

F1 pr+ pr vg+ vg X pr pr vg vg

Fenotipos F 2 pr+ vg+ 1339 pr vg 1195 pr+ vg 151 pr vg+ 154 ____ 2839

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27

Metodología

•Normalmente heterocigoto X homocigoto recesivo (cruzamiento prueba) -> AB/ab X ab/ab•No se observa en la F2 la proporción fenotípica 1:1:1:1, y la proporción no es predecible a priori porque depende de la distancia entre los genes estudiados•Las dos clases mayoritarias corresponden a los gametos no recombinantes (parentales), y las minoritarias a los recombinantes (no parentales)•La frecuencia de recombinación (recombinantes/total X 100) refleja la distancia genética entre los dos genes. Una unidad de mapa o centimorgan (1cM) = 1% de recombinantes•Se ordernan tres genes cuyas distancias se han medido dos a dos

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Fenotipos F 2

pr+ vg+ 1339 pr vg 1195 pr+ vg 151 pr vg+ 154 ____ 2839

305

FR = 305/2839 = 0,107 = 10,7 cM

Proporción no 1:1:1:1. Un test de 2 es muy significativo

pr vg

10,7 cM

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Orden de los genesSe han estudias tres pares de genes y estas son las distancias entre ellos: distancia A-B = 12; distancia B-C = 7; y distancia A-C = 5

¿Cuál es el orden de los genes? Las distancias deben ser aditivas y consistentes entre sí

Supongamos las tres ordenaciones posibles

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Orden de los genesOrdenaciones posibles

Caso 1: Marcador A está en el medio:

Caso 2: Marcador B está en el medio:

Caso 3: Marcador C está en el medio:

AA C

CB

B

7

12 5

A

B

C

A12

5

CB7

A

B

C

A12

5BC

7Aditivida

d

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Las distancias de mapa no son completamente aditivas

A B C

FR = x FR = y

A C

FR < x + y

b pr c19,55,9

23,7

25,4

Distancia experimento dos puntos b-c

La mejor estima distancia, suma (b-pr) + (pr-c)

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Relación entre frecuencia de recombinación y entrecruzamiento (o distancia real de mapa)

Las distancias de mapa no son completamente aditivas porque los dobles recombinantes entre dos marcadores A y C no se detectan en un cruce de dos puntos, subestimándose la distancia A y C

A B C

a b c

A b C

a B c

•La relación entre la distancia real de mapa (número de entrecruzamientos) y la frecuencia de recombinación entre dos marcadores o loci no es lineal. Cuanto más lejos están los marcadores peor es la estima•La frecuencia de recombinación (FR) entre dos marcadores no puede superar el 50%

FR 0,5

A B C

a b c

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Función de mapa

Es una función que permite estimar la distancia de mapa mejor que empleando solamente la frecuencia de recombinación, pues corrige los intercambios (entrecruzamientos) no detectados

50

40

30

20

10

FR observada

(%)

=1 =2 =3 =4

50 100 150 200Unidades de mapa reales

Número medio de entrecruzamientos por meiosis

)1(2

1 eFR

Zona de linealidad

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34

Demostración 1: Muchos entrecruzamientos entre a y b

Es igual de probable cualquier combinación, ++, ab, a+, +b,

es como si segregaran independientemente ambos loci. Luego, la FR máxima es 50%

¿Por qué la frecuencia de recombinación (FR) entre dos marcadores no puede

superar el 50%?

35



35

Demostración 2: caso completo para 1 ó 2 entrecruzamientos

¿Por qué la frecuencia de recombinación (FR) entre dos marcadores no puede

superar el 50%?

FR promedio de un doble entrecruzamiento = 8/16 = 50%

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Mapa a partir de cruzamientos prueba de tres puntos (tres loci en el mismo

cromosomas) A B CMetodología•Triple heterocigoto X homocigoto recesivo (cruzamiento prueba) -> ABC/abc X abc/abc•Si hay ligamiento, no se observa en la F2 la proporción fenotípica 1/8 para cada tipo de gameto•Se agrupan las clases recíprocas (aquellas que tienen un fenotipo mutante en el par recíproco, como el par de fenotipos fenotipos ABC-abc ó Abc-aBC. Las clases recíprocas deben ser de frecuencia parecida•Orden de los genes:

•Los fenotipos no recombinantes (parentales) son los más frecuentes•Los fenotipos menos frecuentes resultan de un doble entrecruzamiento•Al comparar los fenotipos no recombinantes con los doble entrecruzados, el gen del medio es el que está cambiado

•Distancias de mapa: a la distancia entre genes consecutivos debe sumarse las frecuencias de los dobles entrecruzamientos

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37

Ejemplo:Tres mutantes marcadores b = Cuerpo negro; pr = Ojos Púrpura; c = curved, alas curvadasLos tres alelos son recesivos respecto al salvaje

P b+ b+ pr+ pr+ c+ c+ X bb prpr cc

F1 b+b pr+ pr c+ c X bb pr pr vg vg

Si no están ligados Si están ligados 1/8 bb prpr cc 1/2 bb prpr cc 1/8 bb prpr c+c 1/2 b+b pr+pr c+c 1/8 bb pr+pr cc 1/8 bb pr+pr c+c 1/8 b+b prpr cc 1/8 b+b prpr c+c 1/8 b+b pr+pr cc 1/8 b+b pr+pr c+c

F2

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Resultados del cruzamiento prueba, F2

Fenotipo Genotipo Número Número de recombinantes entre b-pr pr-c b-c

Salvaje b+b pr+pr c+c 5701 Black, purp, cur bb prpr cc 5617Purp,curved b+b prpr cc 388 388 388Black bb pr+pr c+c 367 367 367Curved b+b pr+pr cc 1412 1412 1412Black,purp bb prpr c+c 1383 1383 1383Purp b+b prpr c+c 60 60 60Black,curved bb pr+pr cc 72 72 72

Total 15 000 887 2927 3550

Porcentaje 5,9% 19,5% 23,7%

El gen pr está en el medio

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b pr c

b pr+ c+

b+ pr+ c+

b+ pr c

b pr c

b+ pr+ c+

b+ pr+ c+

Tetrada meiótica Gametos

b pr c b pr c

b pr cb pr+ cb pr c

b+ pr+ c+ b+ pr+ c+

b+ pr+ c+

b+ pr c+

Entrecruzamiento entre b y pr

Doble entrecruzamiento en la región b-pr-c

40



40

b pr c19,55,9

23,7

25,4

Distancia b-csin considerar los dobles recombinantes

La mejor estima distancia entre los extremos es la

suma (b-pr) + (pr-c)

Mapa genético de los marcadores

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Coeficiente de coincidencia: mide si los entrecruzamientos son independientes entre sí

•Si los múltiples entrecruzamientos suceden independiemente los unos de los otros, la frecuencia de los dobles entrecruzamientos será al producto de la frecuencia de los intercambios sencillos

•Coeficiente coincidencia (CC) = (número de dobles entrecruzamientos observados)/(número de dobles entrecruzamientos esperados)

•Si CC < 1, dobles disminuidos•Si CC > 1, dobles incrementados

•Interferencia: 1 - CC

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42

Mapa de ligamiento

parcialde los 4

cromosomas de Drosophila melanogaster

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Mapas genéticos (de recombinación) versus mapas

físicos

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Importancia mapas de recombinación

• Describir Ias tasas de recombinación a lo largo del genoma• Predecir la transmisión genética de un gameto• Localización de genes que influyen el fenotipo (QTLs)• Marco de referencia para cartografía física• Marco de referencia para la cartografía de genes asociados a enfermedades

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Frecuencia de recombinación por unidad de DNA

Especies Tamaño haploide Unidades de mapa Tamaño de la unidad mapa Distancia media del genoma entrecruzamientos consecutivos

Fago T4 1.6 x 105 pb 800 200 pb 1.0 x 104 pb E. coli 4.2 x 106 pb 1750 2400 pb 1.2 x 105 pbLevadura 2.0 x 107 pb 4200 5000 pb 2.5 x 105 pbHongo 2.7 x 107 pb 1000 27000 pb 1.3 x 106 pbNemátodo 8.0 x 107 pb 320 250000 pb 1.2 x 107 pbMosca de la fruta 1.4 x 108 pb 280 500000 pb 2.5 x 107 pbRatón 3.0 x 109 pb 1700 1800000 pb 9.0 x 107 pbHumanos Varón 3.3 x 109 pb 2809 1200000 pb 6.0 x 107 pb Mujer 3.3 x 109 pb 4782 700000 pb 3.5 x 107 pb

Mapas genéticos versus mapas físicos

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Análisis de tétradas

Los hongos ascomicetos retienen los cuatro productos haploides de cada meiosis en un saco denominado asca

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Hongos ascomicetos

Estos organismos son únicos porque se puede analizar meiosis individuales, permitiendo estudiar aspectos básicos de la genética de la meiosis (un proceso central de la biología de los eucariotas)

•Cartografiar los centrómeros como si fuesen loci•Investigar la posibilidad de interferencia de cromátida•Examinar los mecanismos de entrecruzamiento

No ordenadas Lineales

Tétradas Octadas Tétradas OctadasPatrones distintos de

ascosporas y ascas en Neurospora

CoprinusLagopus

(basidiomiceto)Saccharomyce

s cerevisiae

Aspergillus nidulans

Ascobolus immersus

Ustigalo hordei

(basidiomiceto)

Neurospora crassa

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48

Meiosis y mitosis postmeiótica en la tétrada lineal de Neurospora

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49

Distancia de un locus al centrómero en Neurospora

No recombinación entre el locus y el centrómero

4:4

50



50

Recombinación entre el locus y el centrómero

2:2:2:2

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51

Distancia de un locus al centrómero: estímese el porcentaje de tétradas que muestran patrones de segregación en la segunda división para ese locus y divídase por 2

Patrones MII = 9 + 11 + 10 + 12 = 42 o sea 14%Puesto que sólo la mitad de los cromosomas que sufren entrecruzamiento son recombinantes, la distancia de mapa (medida como frecuencia de recombinación) será 14/2 = 7 unidades de mapa ó cM

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Demostración citológica del entrecruzamiento

•Demuestra el intercambio de cromátidas•Coincidencia entre quiasma y lugar de intercambio•La existencia de recombinación mitótica

Técnica de cromosomas arlequinados

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53

Retinoblastoma hereditario por entrecruzamiento mitótico

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54

R

R

r

r

R

R

r

r

R

r

R

r

Célula normal R/R

Célula retinoblastoma r/r

Retinoblastoma hereditario por entrecruzamiento mitótico

Mitosis

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Cartografía en humanos

Mapas genéticos (de recombinación)

•Herencia ligada al cromosoma X•Marcadores polimórficos asignados a colecciones de familias (CEPH).

•alozimas•DNA (RFLPs, microsatélites, RAPDs,...)

•La caza de genes asociados a enfermedades

Mapas físicos

•Métodos especiales de cultivo celular: hibridación de células somáticas•Hibridación in situ de sondas de DNA en cromosomas metafásicos•Secuenciación del DNA

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56

Cartografía genética en humanos

Estudios familias•Herencia ligada al cromosoma X marcadores clásicos•Autosómicos marcadores clásicos

•Cartografía marcador-enfermedad•La caza de genes asociados a enfermedades

•Cartografía marcador-marcador•Estudios marcadores polimórficos asignados a colecciones de familias (CEPH). DNA (Microsatélites, RFLPs, RAPDs,...)

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57

Mapa genético de

alta resolución

del Cromosoma

1 Homo

sapiens.

http://lpg.nci.nih.gov/CHLC/

The Cooperative Human Linkage

Center

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58

Xg Proteína grupo sanguíneo

Ictiosis (un efermedad de la piel)

Albinismo ocular

Angioqueratoma (crecto celular)

CentrómeroFosfoglicerato-quinasaAlfa-galactosidasa

Xm

Deutan (ceguera color rojo-verde)

G6PD

Protano (ceguera color rojo-verde)Hemofilía A

Cartografía a través de la herencia ligada al cromosoma X (359 loci se han asignado al X)

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Ligamiento y recombinación en bacterias y virus

Ligamiento y recombinación en bacterias y virus

Procesos sexuales en bacterias y virus: Transformación, conjugación, transducción y sexducción en bacterias y recombinación vírica

•Conjugación

•Ciclo biológico de fagos

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60

Procesos sexuales en bacterias y virusProceso sexual: combinación del material genético de dos individuos

distintos

Sexducción

Transducción

Conjugación

Transformación

Recombinaciónvírica

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Incorporación del material genético por transformación

Se requiere un doble entrecruzamiento para la transformación

Ejemplo del uso de la fecuencia de transformación para estimar distancias genéticas: Una cepa his+ met+ se transforma con his- met-

34 hist- met+

28 hist+ met-

194 hist- met-

Distancia entre ambos genes = (transformantes sencillos/total transformantes) =

(34 + 28 )/(34 + 28 + 194) = 0,24

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62

Conjugación bacteriana

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63

Cinética conjugación bacteriana

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64

Conjugación, recombinación y mapas

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Mapa bacteriano por conjugación.

Unidades en minutos

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Virus bacteriófagos:

•Fase lítica o infecciosa•Fase lisogénica (la bacteria o huésped lisogénico y el fago temperado)

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67

Virus bacteriófagos:

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Transducción:

•Especializada o restringida•Generalizada

Recombinación bacteriana por transducción

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