Solubilidad de proteínas
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Solubilidad de proteínas
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Solubilidad de proteínas
Solubilidad de proteínas
Buffer: Ofrece un medio estable para la solubilidad.
Se utiliza la menor concentración posible para no afectar a fuerza iónica del medio.
Proteínas con fuertes interacciones hidrofobicas necesitan aumentar la fuerza iónica del buffer (NaCl o KCl).
Agentes caotrópicos: Se utilizan para disminuir las
interacciones prot-prot de los agregados.
Ph: Algunas proteínas necesitan el agregado de Ac. o bases
fuertes para su solubilidad
Hay que tener en cuenta que hacia extremos de Ph se producen desnaturalización de las proteínas.
Temperatura: En general la solubilidad decrece al
disminuir la temperatura.
Se utiliza un amplio rango de temp. en los procesos de solubilización de proteínas (4°c hasta 60°c).
Clarificación.
Proceso por el cual se elimina la proteína que no ha sido solubilizada.
El mejor método consiste en la Sedimentación Mediante centrifugación.
Vg= D2[(d1-d2)/18µ]g
D: diámetro de la partícula
d1 y d2: densidades de la partícula y del medio respectivamente
µ: viscosidad del medio
g: aceleración de la graved.
Generalmente el factor limitante en una centrifugación es el tamaño de las partículas o de los agregados formados.
Se utilizan distintas vel. de sedimentación a diferentes tiempos para sedimentar las distintas proteínas.
Se busca una vel. que separe en 15-30 min.
MECANISMOS DE REACCIÓN DEL MÉTODO
RANGO DE SENSIBILIDAD
SUSTANCIAS DE INTERFERENCIA
Métodos para medir solubilidad
La elección del método
La cantidad de proteína disponible a ensayar
La concentración de proteína
Especificidad del ensayo
Facilidad y fiabilidad, exactitud y precisión para llevar a cabo el ensayo
Medición del nitrógeno proteico
Método de Kjeldahl
El método se basa en la determinación de la cantidad de Nitrógeno orgánico contenido
Proteína + H2SO4 CO2 + (NH4)2SO4 + SO2
Se requieren 2 g de proteína. Para 10-40 mg se miden con el método micro-Kjeldahl.
No detecta enlaces N-O y N-N.
Interfieren ácidos nucleicos y otros componentes orgánicos con N.
Separar precipitando con TCA
Medición a 280 nm (uv)
Presencia de aás. aromáticos hacen que las proteínas tengan un máx. de Abs a 280 nm.
No es destructivo, es rápido, alta sensibilidad
Ley de Lambert-Beer:
A = E280 . l . C
El valor de E280 depende de la cantidad de aás. aromáticos que contiene la proteína. Los valores están entre 0,4-1,5
Se requieren alrededor de 0,1-2,0 mg de proteína
Interferencias: Ácidos nucleicos y nucleótidos (anillos de purina y pirimidina)
Corrección de la ecuación, midiendo a 260nm.
Prot (mg/ml)= 1,55 A280 – 0,76 A260
Minimizar la absorción de los buffers
Blancos de medida
ABSORBANCIA A UV-lejano (205nm)
Las uniones peptídicas absorben a 191-194 nm
Como todas las proteínas tienen estas uniones, el valor de E205 es el mismo (E=31)
Se hace a 205nm porque a 191-194 absorbe el oxígeno, interfiere en la medida.
Mide en el rango de 0,01-0,05 mg/ml prot.
Cubetas limpias y buffer que minimicen la A.
Se agrega Brij-35
Concentración (mg/ml) = 31 . A205
Para corregir la absorción del triptófano y la tirosina a 205nm
E205 = 27 + 120 (A280 / A205)
Los ácidos nucleicos contribuyen poco en la A205.
Sólo las proteínas puras pueden dar una medida exacta.
Es un método mas sensible que A280 , los enlaces peptídicos son constantes.
Ensayo de lowry
Combina la reacción de Biuret con la reducción del reactivo de Folin-Ciocalteu (ácidos fosfomolíbdico y fosfotúngstico) por la oxidación de tirosina y en menor medida triptófano, cisteína, cistina de las cadenas polipeptídicas
Los iones Cu+2 ayudan a exponer los residuos de tirosina y en la reacción redox.
Varias sustancias interfieren (desventaja), como fenoles, agentes buffer, timol.
La intensidad depende de la cantidad de Tyr
El reactivo de Folin se descompone rápido.
La curva estándar se hace en un rango de 0-100µg.
Biuret
Una solución diluida de sulfato cúprico en tartrato
fuertemente alcalino es adicionado a una solución
proteica de concentración de 1-6 mg/ml. La
reacción entre el Cu+2 y los nitrógenos de enlaces
peptídicos
adyacentes genera
un complejo de color
azul-violeta que
absorbe a 540-560 nm.
La reacción no depende de la composición específica de aminoácidos.
Algunos buffers (ej: Tris) interfieren con el análisis.
El amoníaco proveniente de la precipitación con sulfato de amonio debe ser removido ya que interfiere con la medida.
Método de BCA
El ácido bicinconinico en forma de sal de
sodio es:
Soluble en agua
Estable
Altamente especifico y sensible al Cu+ en solución alcalina.
Sensibilidad:
0.02-1.0mg/ml (estándar)
0.5-10 µg/ml (micro-BCA)
El Cu+ producto de la reacción de Biuret forma un complejo con dos moléculas de BCA color púrpura; el cual exhibe absorbancia a 562nm.
Reactivos quelantes como EDTA interfieren con el ensayo, de modo que para eliminarlos la proteína se debe precipitar con TCA o acetona.
Bradford
El colorante CoomassieBrilliant Blue forma fuertes complejos no covalentes con las proteínas a pH 1. Esta unión desplaza el máximo de absorción del colorante de 465nm (rojo) a 595 nm(azul) debido a la estabilizacion de la forma anionica del colorante.
La sensibilidad del ensayo puede mejorarse leyendo la diferencia entre el colorante-proteina (595 nm) y colorante libre (465nm).
El colorante se une principalmente a aa basicos y aromáticos.
Tolera altas concentraciones de sal (1 M KCl, 5 M NaCl), pero es sensible al EDTA, glicerol, SDS, β-mercaptoetanol.
Para medidas cuantitativas se aconseja comparar los resultados con los obtenidos por otro método.
Consideraciones generales
Estandars proteicos: la mayoría de los métodos utilizan una curva patrón.
En la preparación de una proteína estándar se
aconseja usar proteínas que han sido dializadas y
liofilizadas. También podrían usarse estandars
altamente purificados disponibles comercialmente.
En general lo mejor es utilizar como proteína
estándar la misma que se quiere determinar
Remoción de compuestos que interfieren:
ya que para pruebas de solubilidad se
recomienda que la proteína sea lo más pura
posible.
Se debe: llevar al pH del ensayo, precipitar
contaminantes (TCA, acetona, ácido) y
centrifugar, luego resuspender el pellet. También
podemos dializar y ultrafiltrar; o usar soportes
DEAE cellulose de afinidad.
Determinación de humedad: Todas las determinaciones de solubilidad están fundadas sobre muestras de proteínas desecadas.
Protocolo
Al momento de realizar un protocolo para determinar la solubilidad de una proteína hay que tener en cuenta varios factores.
Existe una estrecha relación entre la estabilidad de una proteína y su solubilidad. Por lo cual, normalmente simulando su entorno natural obtendremos la mayor solubilidad.
¿Qué factores debemos tener en cuenta?
Definimos que la solubilidad de una proteína era función de T, μ, D, [ ], pH, y otros componentes, entonces debemos manejar estas variables al momento de determinar la solubilidad.[ ] se recomienda utilizar concentraciones teóricas finales de entre 1-10mg/ml a no ser que se necesite determinar algún tipo de concentración especifica.μ, existen 4 tipos de proteínas distintas según su solubilidad
Albuminas( salt-free o baja fuerza iónica)Globulinas( moderada fuerza iónica 0,1-0,15M)Prolaminas(fuerza iónica 0,3-0,6M y etanol 50-90%)Glutelinas(alta fuerza iónica 0,5-1M)
pH, la solubilidad de una proteína depende fuertemente del pH del medio. Para mantener este pH, es necesario utilizar distintos sistemas Buffer; también hay que tener en cuenta que las sales de estos sistemas pueden interactuar con la proteína de manera benéfica o no. Otra manera de mantener el pH es adicionando HCl o NaOH, monitoreando con un pHmetro durante 30min.
Luego de tener determinadas estas variables, es importante definir de que manera se va a rehidratar la proteína.
Al polvo, se le agregan pequeñas cantidades de solvente, agitando de manera lenta, lo cual evita la inclusión de aire y formación de espumas lo que lleva a desnaturalización.
Una vez agregado todo el solvente, se incuba a 24°C durante 30min, para asegurarnos que haya llegado al equilibrio.
Una vez realizada la suspensión, se debe clarificar la solución y separar las fases.
Para esto, se coloca la suspensión en un tubo adecuado para una centrífuga y, se centrifuga durante un tiempo determinado y a una cierta fuerza g, las cuales dependerán del tamaño y densidad de los insolubles. En la mayoría de los casos 16000g y 30min es lo adecuado, sino se pueden probar distintas g 16000, 20000 y 30000 durante 30 min y comparar los resultados.
En esta etapa hay que tener especial cuidado en no tocas el pellet durante la separación del sobrenadante.
Por último, se determina la concentración utilizando micro-Kjeldhal, en el cual determinamos la concentración como nitrógeno soluble o a través del método espectrofotométrico que mejor se adecue(Lowry, Bradford, BCA, 280nm, 205nm).
