SISTEMAS LIGADOS Trx-Glutatión EN PLATHELMINTOS

Curso de Biología Parasitaria2007

TPX GPX

SOD

SISTEMA GLUTATIÓN

NADPH

NADP+

GlutatiónGlutatiónreductasareductasa

GlutarredoxinaGlutarredoxina

red red

ox ox

Blancos

red

ox

GlutatiónGlutatión

red

ox

redox Glutatión Glutatión peroxidasaperoxidasa

SISTEMA TIORREDOXINA

NADPH

NADP+

Tiorredoxina Tiorredoxina reductasareductasa TiorredoxinaTiorredoxina

red red

ox ox ox

red

Tiorredoxina Tiorredoxina peroxidasaperoxidasa Blancos

red

ox

TIORREDOXINA GLUTATIÓN REDUCTASA

Tiorredoxina Tiorredoxina glutatión glutatión reductasareductasa

TiorredoxinaTiorredoxina

red red

ox ox

NADPH NADP+

Blancos

red

ox

Tiorredoxina Tiorredoxina peroxidasaperoxidasa Blancos

red

oxdominioTR

dominioGrx

ORGANIZACIÓN DE LA TR, GR, Grx y TGR

dominio Grx

dominioTR

TR CVNVGC FAD NADPH región interfase GCUG

Grx CPYC GSH

GR CVNVGC FAD NADPH región interfase

TGR CVNVGC FAD NADPH región interfase GCUGCPYC GSH

TCTGTATATTAGTGCATGTCATCTAAAATGGCTCCAATTCCCGATGATACTTCTTCGTGG

GCTAAAACGGCCGTATTTGACTTTGTGGTCCCGACGCCCCAGGATACTACACGGGGTTTG

GGCTATCGAACTCAGCTTCGCAGCATTAACGTAGAGTATGTTAATGCTTTTGCTGAGGTG

GTCGATCCGCATACAATAAAATACACGAAGAAAAACAAGGAAACCGGCACCGTGACCGCA

TCCGTAGCGATGAAGGCTGGTGCAACCAAGGCTGATTTCGACCGTACCATAGGGATTCAC

CCCACTTGTTTTGAGGGGTTTACTACAATGCACGTGACAAAAGACTCGGGCGCCAGCGCT

AAGGTGACCGCTTGCTGAGGTTAATTCCCTGCTGGAGGTTTTCAGTCGGTTATGTTTATC

CGTTCACTTTCCAACCAATCCGTGTTTTGTGAAAAGACCCTGAGCTTGGTAAATCCTATC

CCGTCCCGGGAGCCAAGTTGTAGGGGATGCCCGCATGGGCCAAACGAACGGCAGCCCCCC

CCCCCCCCCTTCTTTGATTACGAAATCTCTCATTTAACATGTTGTGCAGTCTTTATGTCT

TTCTCCGAAAAAAAAAAAAAA

OBTENCIÓN Y ANÁLISIS UN ADNc DE LA TR DE F. hepatica

720

1740

60

480

780

1800

1860

2040

2100

2160

2301

EL ELEMENTO SECIS

G - CG - CU - AU - AC - GG UA - UG UU - AC - GC - GC - GA - GG - AA - T

2012 2067

AA

U

UA

C

U

G

C UA

CC

G

GUUUUGUAAG A

G - CC - GC - GC - GU - A

GCCCGCAUGGG

núcleoSECIS

tallo inferior

bucle de adenosinas

tallo superior

5 pb

lazo3 nt

Fasciola 1 ----------------------------------------MAPIPDDTS-----------SmanTGR 1 -----------------------------------------MPPADGTS-----------EgraTGR 1 -------------MFGCHCLRRACTPLSAIACFFNPRRTAMAPIGGSAEQV---------

Fasciola 9 ---------SWVKKTINSSAVLLFSKS--------RCPYCRAVKQIFNDDKVNHAVIELD

SmanTGR 8 ---------QWLRKTVDSAAVILFSKT--------TCPYCKKVKDVLAEAKIKHATIELDEgraTGR 38 ---------EKLRNKINNAAVLVFAKS--------FCPYCKKVMERFNNLKIPFGYLDLD

Fasciola 53 KRPDGAKIQQVLSQISGISTVPQVFVRGEFVGDSSTISKLKKEDKLTEVIKK-NTYDYDLSmanTGR 52 QLSNGSAIQKCLASFSKIETVPQMFVRGKFIG DSQTVLKYYSNDELAGIVNE-SKYDYDLEgraTGR 82 LKKNGSDYQKMLQEITGRTTVPQVFFRGEFIG GCDDVMAID-DDTIVKKANE-MKYDYDM

Fasciola 292 V VGASYVALECAGFLTRFGF DTTVMVRSIFLRGFDQQMADMIGEYMKEHGTKFVRSCVPTSmanTGR 291 VIGASYVALECAGFLASLGG DVTVMVRSILLRGFDQQMAEKVGDYMENHGVKFAKLCVPDEgraTGR 318 CVGASYVSLECAGFLSSIGC DVTVMVRSIFLRGFDQQMAGLISDYIAKYGVKFVRPCVPT

Fasciola 584 TKD -ASAKVTACUGSmanTGR 584 TKK -VSPIVSGCU GEgraTGR 610 TKS

SGSGSG-ASATVTGCUG

SmanTGR 111 IVIGGGSGGLAAGKEAAKYGAKTAVLDY VEPTPIGTTWGLGGTCVNVGCIPKKLMHQAGLEgraTGR 140 VIIGGGSGGLALAKESAKSG AKVALLDFVVPTPMGTTWGLGGTCVNVGCIPKKLMHQAAL

Fasciola 112 VVIGGGSGGLAASKEAARFGAKTAVFDFVVPTPQDTTRGLGGTCVNVGCIPKKLMHQAAL

ANÁLISIS DE LA SECUENCIA AMINOACÍDICA

Grx

sitio de unión al FAD centro redox

sitio de unión al NADPH

selenocisteína

66 kDa

PURIFICACIÓN DE LA ENZIMA NATIVA

ENSAYOS DE ACTIVIDAD TR, Grx y GR

ESSE + GSH GSSE + ESH (reacción espontánea)

GSSE + GSH GSSG + ESH (actividad Grx)

NADPH+ +NADP+DTNB 2 TNB (actividad TR)

GSSG + NADPH + H+ 2GSH + NADP+ (actividad GR)

NADPH

NADP+

TGRTGR

red

ox

TiorredoxinaTiorredoxina

red

ox ox

red

InsulinaInsulina

 

LA ENZIMA PURIFICADA POSEE ACTIVIDAD TR

NADPH

NADP+

GlutathioneGlutathionereductasereductase

GlutaredoxinGlutaredoxin Targets

red red red

ox ox ox

GlutathioneGlutathione

red

ox

ox

NADPH

NADP+

Thioredoxin reductaseThioredoxin reductase(TR)(TR)

ThioredoxinThioredoxin Targets

red red red

ox ox

Targets redox

LA ENZIMA PURIFICADA POSEE ACTIVIDAD GR

NADPH

NADP+

GlutathioneGlutathionereductasereductase GlutaredoxinGlutaredoxin

red red red

ox ox ox

GlutathioneGlutathione

red

ox

ox

NADPH

NADP+

Thioredoxin reductaseThioredoxin reductase(TR)(TR)

ThioredoxinThioredoxin Targets

red red

ox ox

targets

LA ENZIMA PURIFICADA POSEE ACTIVIDAD GRX

NADPH

NADP+

GlutathioneGlutathionereductasereductase GlutaredoxinGlutaredoxin Targets

red red red

ox ox ox

GlutathioneGlutathione

red

ox

ox

NADPH

NADP+

Thioredoxin reductaseThioredoxin reductase(TR)(TR)

ThioredoxinThioredoxin Targets

red red red

ox ox

Targets redox

El dominio Grx recibe electrones de dominios TR y

también podría recibir del sistema glutatión

La fusión de dominios hace posible la transferencia de electrones a blancos de

ambos sistemas

Tiorredoxina Tiorredoxina glutatión glutatión reductasareductasa

TiorredoxinaTiorredoxina

red red

ox ox

NADPH NADP+

Blancos

red

ox

Tiorredoxina Tiorredoxina peroxidasaperoxidasa Blancos

red

oxdominioTR

dominioGrx

A partir del gen de la TGR se producen dos isoformas de ARNm por empalme alternativo en trans

1 2 1 2

TRGrxSL

SL Grx TR

región codificante

mit MFGCHCLRRACTPLSAIACFFNPRRTAMAPIGGSAE..

cit MAPIGGSAE..

Las isoformas de ARNm codifican para variantes

citosólica y mitocondrial

¿Hay TGR en los compartimientos mitocondrial y citosólico?

Mic Mit Cit Nuc Tot

66 kDa

Echinococcus granulosus posee variantes mitocondriales y citosólicas de TGR

Entonces...

Tiene E. granulosus TR, GR and Grx convencionales?

En otros plathelmintos:

In Taenia crassiceps:

Tracing GR and TR activities resulted in purification of TGR

(Rendon et al. 2004)

In Schistosoma mansoni:

Auranofin inhibits both TR and GR activities in crude extracts

(Alger and Williams, 2003)

Datamining transcriptomes could provide some answers

October 2003: Schistosoma transcriptomes released

. Schistosoma mansoni (140.000 ESTs, covering 90-95% of the gene complement)

. Schistosoma japonicum (45.000 ESTs)

. Echinococcus granulosus and Echinococcus multilocularis (10.000 ESTs–Oct 2004)

S. mansoni S. japonicumcTGR

38* 18*

mtTGR 4 2

GR 0 0

TR 0 0

cGrx 0 0

mtGrx 8*

0

cTrx1 6 26

cTrx2 2 1

mtTrx 15 3

cTPx1 12 29

cTPx2 30 20

mtTPx 16 10

cGPx 39 20

secGPx 10 1

Similar results in E. granulosus and E. multilocularis

. absence of GR and TR

. presence of cytosolic and mitochondrial Trx and TPx

En plathelmintos, se postula a la TGR como la responsable de llevar a cabo ambas funciones, GR y TR

ESTUDIO DE INMUNOPROTECCIÓN EN CONEJOS CONTRA F. hepatica

semana 0

- 100 μg FhTGR- PBS

1º inmunización

semana 4

- 100 μg FhTGR- PBS

2º inmunización

semana 6

Desafío

- 50 metacercarias

semana 18

Sacrificio

Nº de Parásitos promedio ± DS parásitos/animal

Grupo FhTGR 0,3 ± 0,8 2; 0; 0; 0; 0; 0

Grupo Control 9 ± 1,8 10; 12; 8; 8; 7; 9

Schistosoma mansoni

Utilizando un ARNi, se observó que la TGR es esencial para la vida del parásito.

Auranofin: inhibidor de la TGR. En ensayos in vitro y utilizando concentraciones fisiológicas se observó que los parásitos mueren rápidamente.

Además, tratando a ratones infectados con este compuesto se observó una reducción del 60% de los parásiros encontrados.