Revista de Divulgacin Cientfica y Tecnolgica de la Asociacin Ciencia Hoy

ARTICULO Protenas a PedidoPrincipios y aplicaciones de la mutagnesis sitio-dirigida Nora B. Calcaterra, Elena G. Orellano, Nstor Carrillo y Eduardo A. Ceccarelli Facultad de Ciencias Biquimicas y Farmacuticas, Un. Rosario

Hoy es posible modificar a voluntad la secuencia de aminocidos de una protena: agregarle o quitarle uno de ellos, substituir uno por otro o, incluso, fundir dos o ms protenas para generar un producto polifuncional. Pero la cuestin crucial no es tanto cmo construir nuevas protenas sino cmo disearlas de un modo racional para que cumplan funciones determinadas.

El objetivo de la biologa moderna es interpretar las propiedades de los organismos a partir de la estructura de sus molculas constituyentes. Franois Jacob, La Igica de la vida, Random House, New York ,1976. En la actualidad se pueden preparar en el laboratorio fragmentos de ADN puro, lo cual permiti poner a punto gran variedad de tcnicas mediante las cuales alterar el material gentico ("La reaccin en cadena de la polimerasa", CIENCIA HOY, 23:52-59). Una de ellas, quiz la mas precisa y sutil, la mutagnesis dirigida in vitro, o mutagnesis sitio-dirigida, consiste en alterar un cierto nmero de nucletidos de un gen, lo cual resulta en la consiguiente modificacin de la protena que se sintetiza a partir de este (en jerga, se dira la protena que este codifica;"Del cido nucleico a la protena"). La mutagnesis sitio-dirigida emplea, en forma muy ingeniosa, tcnicas bioqumicas, genticas y microbiolgicas. La figura 1 ilustra cmo se produce un cambio en la secuencia del ADN: se advierte que la secuencia denominada triplete - ATA (adenina-timina-adenina), de la hebra de ADN que interesa, se transforma en AAA (adenina-adenina-adenina), cambio por el cual, en la protena resultante, el aminocido isoleucina ser reemplazado por lisina. El proceso podra resumirse como sigue: Antes que nada, se debe disponer del gen (o sea, la secuencia de nucletidos) que codifica (es decir, que posee la informacin necesaria) para que se sintetice la protena que se quiere modificar. Este gen salvaje se inserta en un plsmido, nombre que, en las bacterias, designa a molculas de ADN circular denominadas, tambin, cromosomas accesorios, en las que se encuentran genes mediante cuya informacin se puede sintetizar diferentes clases de protenas, por ejemplo, molculas que inactivan antibiticos u otros productos naturales. Los plsmidos se replican en la bacteria en forma independiente del cromosoma principal y se purifican fcilmente utilizando tcnicas bioqumicas. En una segunda etapa, se separan las dos hebras del ADN y se asla la que interesa; sobre

ella se une (o hbrida) un oligonucletido (una secuencia corta de ADN) complementario del ADN salvaje, que posea la modificacin deseada. En la figura, el triplete TTT no es perfectamente complementario del ATA porque la A es complementaria de T; dos T no se unen con fuerza. Sin embargo, el oligonucletido queda unido a la hebra del ADN por la fuerza de interaccin de las bases del resto de la secuencia. Posteriormente se completa la sntesis de la doble hebra de ADN, en un proceso catalizado por la enzima ADN polimerasa, la cual utiliza el oligonucletido como iniciador y el ADN de simple hebra como molde.FIG.I: DISEO DE UN EXPERIMENTO DE MUTAGNESIS SITIO-DIRIGIDA

Todos los procesos descriptos se realizan en un tubo de ensayo. El plsmido mutado se introduce en una bacteria para obtener muchas copias del mismo (o sea amplificarlo). Los sistemas de reparacin de la clula husped comienzan por corregir los errores que pudiesen existir en la regin donde se realiz la mutacin, reemplazando al azar las bases que no aparean en una u otra hebra. En consecuencia, se obtienen dos poblaciones celulares con ADN de doble hebra, una con esta mutada y otra con el plsmIdo salvaje. Mediante tcnicas adecuadas. microbiolgicas y de biologa molecular, es posible seleccionar el ADN mutado, purificarlo, amplfcarlo y luego utilizarlo para producir la protena en cuestin. Una de las condiciones bsicas para llevar a cabo mutagness de protenas es poder sintetizar adecuadamente tanto la protena mutada cuanto la salvaje. En principio, es posIble reintroducir el gen mutado (o transgn) en el organismo de origen, es decir, en las clulas que producen la forma salvaje de la protena, y tambin se cuenta con mtodos eficientes para introducir transgenes en un gran nmero de organismos, desde bacterias a animales. Sin embargo, para realizar investigaciones relacionadas con la estructura y la funcin de protenas, o con la generacin de nuevos productos, hacerlo en microorganIsmos presenta algunas ventajas. Las bacterias y las levaduras pueden hacerse crecer en condiciones controladas, se dividen rpidamente, con lo que permiten la acumulacin de grandes cantidades de protena transgnica en corto tiempo, y los procedimientos de manipulacin gentica y de sntesis son, en general, ms sencillos que para los organismos complejos. En cualquier caso, la eleccin del husped siempre depende del producto que se desea sintetizar y de sus propiedades. Por ejemplo, muchas protenas slo adquieren funcionalidad biolgica despus de una modificacin posterior al proceso de su sntesis (o modificacin post-traduccional), como es la glucosilacin, consistente en all adicin de azcares a la cadena polipeptdica. Pero como las bacteras no pueden realizar este tipo de modificaciones, en tales casos los estudios mutagnesis deben llevarse a cabo en eucariotas (seres vivos cuyas clulas poseen ncleo, a diferencia de los procariotas, como las bacterias, que carecen de l), eventualmente en microorganismos eucariotas como las levaduras. La sntesis de una protena en bacterias utilizando genes eucariotas implica la conversin del gen

eucariota en uno procariota, para lo cual se han preparado distintas tcnicas y encontrado vectores apropiados, llamados genricamente vectores de expresin. Un vector es una secuencia de ADN preparada en el laboratorio que contiene las seales de reconocimiento necesarias para que la bactera pueda realizar la transcripcin del ADN al correspondiente ARNm, y la traduccinn de este en el producto final, la protena. Estos vectores poseen, adems, sitios en los cuales puede ligarse el gen forneo. Una de las tcnicas ms usuales para introducir un gen exgeno en un vector de expresin es generar protenas de fusin: se acopla el gen forneo a uno con la informacin necesaria para sintetizar una protena bacteriana. La bacteria reconoce su propio gen y las seales que contiene, con las cuales comienza a sintetizar la protena, pero luego lee la informacin del transgn, que incorpora al proceso. La figura 2 proporciona dos ejemplos. En el primero (Fig. 2A), el producto de fusin consiste en una pequea porcin de la enzima b-galactosidasa, ligada al extremo amino terminal de la protena transgnica. Estas extensiones, en muchos casos, no afectan significativamente la estabilidad o la funcin de la protena sintetizada. En el segundo ejemplo (Fig. 2B), la protena transgnica se fusiona a la regin carboxilo terminal de la enzima glutatin S-transferasa, una protena completa (denominada pptido base). El producto resultante posee dos protenas diferentes, unidas por una secuencia que las conecta. En muchos casos, los dos pptidos se pliegan correctamente y generan un producto de fusin con la actividad biolgica de ambas sustancias iniciales. El ltimo sistema presenta ventajas prcticas, ya que los pptidos de base se escogen para permitir mtodos rpidos y eficientes de purificacin, como se muestra en la figura 3, en la que el vector de expresin, que contiene el gen de la glutatin S-transferasa (GST), ligado al de la protena transgnca (PT), se asla e introduce en una bacteria (Fig. 3 etapa I) que produce la protena de fusin (Fig. 3, etapa 2). La mezcla de protenas, producto del cultivo bacteriano, se pasa por una columnas de afinidad (Fig.3, etapa 3), que consta de una matriz slida unida a una molcula pequea que interacciona con fuerza con el pptido base. En el ejemplo, esa molcula es el glutatin : la protena de fusin queda retenida en la columna. Las protenas indeseables se eliminan por elucin (o sucesivos lavados) y, posteriormente, se despega la protena de fusin, que as se obtiene purificada. FIG.2: EJEMPLOS DE PROTENAS DE FUSIN DISEADAS PARA SU EXPRESIN TRANSGNICA EN LA BACTERIA ESCHERICHIA COLI, PT REPRESENTA LA SECUENCIA DE LA PROTENA TRANSGNICA.

FIG.3: ESQUEMA DE LA PURIFICACIN DE PROTENAS DE FUSIN POR CROMATOGRAFA DE AFINIDAD. GST SIGNIFICA GLUTATIN, S-TRANSFERASA Y PT, PROTENA TRANSGNICA

Las regiones carboxilo terminal de los pptidos base pueden ser manipuladas genticamente mediante la introduccin de secuencias de aminocidos reconocidas por proteasas de restriccin (enzimas que cortan la cadena peptdica en esas regiones), con lo cual las protenas transgncas pueden ser separadas de dichos pptidos (Fig. 3, etapa 4) y sometidas a una segunda cromatografa de afinidad que, ahora, retenga estos (Fig. 3, etapa 5). Hay varios factores que influyen en la sntesis de las protenas transgnicas. Uno de los ms importantes es la frecuencia de uso de codones. La concentracin intracelular de cada ARN de transferencia vara significativamente de un organismo a otro. La presencia en un gen eucariota de un triplete poco usado en bacterias, o viceversa, disminuye drsticamente la sntesis de la protena, factor que debe ser tenido en cuenta para elegir el husped ms conveniente. Adems, muchas protenas sintetizadas en sistemas transgnicos no son capaces de plegarse correctamente y adquirir una conformacin funcional, sino que precipitan en conglomerados insolubles. No se conocen los factores que determinan el plegamiento de un pptido cuando es sintetizado en una clula extraa, aunque se presume que son los mismos que en el resto de los seres vivos ("Chaperones moleculares: una ayuda para la clula"). El punto crucial, sin embargo, no est relacionado con las tcnicas y consideraciones de orden prctico, descriptas en los prrafos precedentes y necesarias para encarar experiencias de mutagnesis sitio-dirigida, sino con las modificaciones a introducir en una protena para obtener la funcionaldad biolgica buscada. En los ltmos aos se ha acuado el trmino ingeniera de protenas para definir el conjunto de procedimientos moleculares aplicables al diseo y construccin de protenas con funciones o propiedades predefinidas. La ingeniera molecular de protenas se apoya en las leyes por las cuales una secuenca lineal de aminocidos adquiere su estructura tridimensional, la que, a su turno, determina la funcin biolgica de la protena. Junto con la cristalografa de rayos X, la mutagness sitio-dirigida es una de las herramientas ms poderosas para disear protenas ms estables, ms activas, ms especficas, etc., y sirve tanto para la investigacin bsica como para la aplicada. La mutagnesis opera de manera ptima si se trabaja con protenas cuya estructura tridimensional sea conocida de modo preciso, pues se tendr informacin detallada acerca de la posicin relativa de un aminocido con respecto a otro, y podrn hacerse inferencias sobre la fijacin de lgandos, el plegamiento de la protena, su actividad biolgica, etc. Pero aun sin contar con evidencias mayores sobre esas posiciones relativas de los aminocidos, es posible substituirlos para: (i) confirmar experimentalmente la funcionalidad inferida a partir de los datos estructurales y (ii) mejorar o alterar esa funcionalidad. La mayor parte de los actuales estudios de mutagness encuadran en el segundo propsito ("Sandwich aromtico para las flavo-protenas"). S no se tienen datos estructurales, todava es posible construir un modelo, basado en conformaciones conocidas de protenas homlogas; la exactitud del modelo, no obstante, depende de la similitud de las secuencias en cuestin. En los ltimos aos se ha trabajado exitosamente en la mutagness de aminocidos -que no variaron mucho a lo largo de la evolucin- relacionados con el sitio activo de diferentes enzimas y con los sitios de fijacin de ligandos.

Cuando se desconocen tanto la estructura tridimensional de una protena como la de sus eventuales homlogas, an se puede obtener cierta informacin sobre la funcionalidad de determinados aminocidos mediante experimentos de modificacin qumica. Consisten en alterar las cadenas laterales de los aminocidos utilizando reactivos especficos, y luego establecer la ubicacin del residuo afectado en la secuencia primaria de la protena. La funcionaldad del aminocido puede evaluarse estudiando los efectos de la modificacin sobre parmetros como la afinidad por sustratos e inhibidores, las velocidades absolutas y mecanismos de reaccin (para enzimas), la estabilidad de la protena, su proteccin por ligandos, etc. Para que los datos sean de utilidad, es indispensable que la modificacin sea especfica. Por lo general, los modificadores qumicos son molculas voluminosas que se unen covalentemente a la cadena lateral del aminocido con el cual reaccionan; alteran la funcin biolgica de la protena por efectos estrcos, electrostticos, etc. As, se han documentado numerosos casos de aminocidos, supuestamente esenciales segn los datos de las modificaciones qumicas, cuya mutagnesis no tiene efecto alguno sobre la funcionaldad de la protena. De todos modos, los modificadores qumicos constituyen una ayuda inapreciable en aquellas ocasiones en que no es posible contar con informacin estructural, y seguirn emplendose para estudiar protenas cuya conformacin tridimensional sea desconocida. Existe tambin una tcnica, denominada mutagnesis generalizada, que permite seleccionar mutantes generados al azar para lo que se producen muchas variantes de la misma protena, cada una de ellas mutada en un aminocido, pero en sitios diferentes. As, porque se deseaba incrementar la resistencia a la temperatura de cierta enzima, la neomicina fosfotransferasa, capaz de inducir resistencia al antibitico kanamicina, se llev a cabo una mutagnesis generalizada del gen, se transfiri la poblacin de genes mutantes a un husped termorresstente y se seleccionaron las colonias bacterianas capaces de crecer, en presencia del antibitico, a temperaturas elevadas. Tambin ha sido posible cambiar la especificidad de sustrato de numerosas enzimas bacterianas utilizando este procedimiento. Sin embargo, aunque la mutagness generalizada es una herramienta importante para la bsqueda de protenas con propiedades mejoradas, su aplicacin depende, estrictamente, de la disponibilidad de un protocolo riguroso de seleccin de la protena de inters, el cual, en muchos casos, puede ser difcil de disear. En ocasiones, la mutagness se utiliza como herramienta complementaria de otras, para lo cual se intenta realizar substituciones que no afecten la conformacin y la funcionalidad de la protena. Por ejemplo, se ha diseado un mtodo para estudiar intermediarios del plegamiento de una protena, que utiliza una reaccin qumica cuyo efecto es inducir rupturas en regiones prximas a un residuo de cistena. Debido a su complejidad, slo puede ser aplicado a protenas con una cistena. La mutagnesis sitio-dirigida, sin embargo, permite ampliar enormemente las posibilidades de esta tcnica, por la va de introducir restos de cistena en diferentes lugares de la cadena polipeptdica, de manera que las etapas de plegamiento pueden investigarse en distintos dominios de la protena. La condicin es que la cistena introducida no afecte las propiedades estructurales y funcionales de la protena en su estado nativo, lo cual puede verificarse por mtodos bioqumicos y biofsicos. Mientras que el objetivo de largo alcance de la ingeniera de protenas es poder obtener substancias que se caractericen por poseer atributos predeterminados, definidos por su inters prctico, la cuestin fundamental en lo inmediato es dilucidar las relaciones entre la estructura y la funcin de las protenas. Este ha sido el objetivo de muchos qumicos y bioqumicos durante dcadas, pero en los ltimos aos han cambiado la eficiencia y la precisin con las que pueden llevarse a cabo las modificaciones, as como los niveles de resolucin con que se puede trabajar en la escala molecular. Las nuevas tcnicas, adems de acercarnos a los resultados prcticos buscados, contribuyen a generar los conocimientos fundamentales que permitiran convertir la ingeniera de protenas en una realidad.

LECTURAS SUGERIDAS

CARRILLO, N., CECCARELLI,E.A., KRAPP, A.R., BOGGIO, S., FERREYRA, R.G. & VIALE, + A., 1992, "Assembly of plant ferredoxin-NADP oxidoreductase in Escherichia coli requires GroE molecular chaperones", Journal of Biological Chemistry, v.267:15537-15541 ORRELLANO, E.G., CALCATERRA, N.B., CARRILLO, N. & CECCARELLI, E.A., 1993, + "Probing the role of the carboxyl terminal region of plant ferredoxin-NADP reductase by sitedirected mutagenesis and deletion analysis", Journal of Biological Chemistry, v.268:1926719273 WATSON, J. GILMAN, N., WITTKOWSKI, J. & ZOLLER, M., 1992, Recombinant DNA, Scientific American Books, New York.