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Universidad Nacional de RosarioFacultad de Ciencias MédicasCátedra de Microbiología, Virología y Parasitología

Área Defensa

Material ComplementarioLaboratorio 4

2016

Diagnóstico de infecciones urinarias desde el laboratorio microbiológico clínico

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Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología – Área Defensa 2016 – Laboratorio 4

Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología Facultad de Ciencias Médicas – Universidad Nacional de Rosario

Laboratorio Nº 4 – Área Defensa 2016

Diagnóstico de infecciones urinarias desde el laboratorio microbiológico clínico Mapa conceptual

Paciente

Muestra

Prevalencia• Escherichia coli• Otras enterobacterias• Enterococcus sp.• ECN• Etc.

Tratamiento

Cultivo semicuantitativo

Recuento deUFC/ml orina

Identificación germen

Pruebas sensibilidad AMB por difusión con monodiscos

> 105

Entre 104 – 105

= 103

< 200

Pruebas metabólicas Sensible - Resistente

Conservacióny transporte

Examen microbiológicodirecto

En fresco Por coloración

Sedimento urinario

LeucocitosPiocitos Gram Nicolle

Diagnóstico microbiológico

Diagnóstico clínico

EdadSíntomas

Factores predisponentesTratamiento ambulatorio

Etc.

Chorro medioCateterismo vesicalPunción sonda vesicalPunción suprapúbica

4 – 8 °C

Objetivos:

• Comprender los alcances de las precauciones para la toma de muestra y su repercusión en el cultivo.

• Valorar y jerarquizar el desarrollo de los cultivos microbiológicos de orina.

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• Interpretar los resultados obtenidos Punto de partida Después de las infecciones respiratorias, las infecciones urinarias son las más frecuentes en el ser humano. Son el motivo de consulta más habitual en la atención primaria de la salud. Se presentan en todos los grupos etarios desde los primeros tiempos del nacimiento hasta los adultos mayores, desde pacientes ambulatorios a hospitalizados, desde continentes hasta incontinentes, etc. No se puede valorar y jerarquizar el hallazgo microbiológico si no se tiene en cuenta todo el contexto del paciente (sexo, edad, factores predisponentes, tratamientos antimicrobianos, síntomas, etc.) pues podríamos caer en errores diagnósticos de falsos resultados tanto positivos como negativos, redundando ello en la conducta médica a seguir. La metodología microbiológica para realizar el urocultivo no ha cambiado demasiado en el tiempo a pesar de los avances tecnológicos e informáticos que se incorporaron a esta especialidad. Es amplísima la bibliografía que existe sobre el tema Este apunte complementario del laboratorio de habilidades Nº 4 (Defensa 2014) fue elaborado a fin de brindar mínimos conocimientos para poder valorar y jerarquizar el informe microbiológico del cultivo de orina (urocultivo) y así poder correlacionarlo con el paciente que le dio origen.

Infección Urinaria (IU)

Definición: Presencia de síntomas y signos sugerentes asociado a invasión y multiplicación en la vía urinaria de organismos patógenos (especialmente bacterias). Clasificación: - Infección urinaria a) Según su adquisición:

• de la comunidad • intrahospitalaria (con mayor de 72 hs de internación , sondaje vesical o instrumentación

urológica) b) Según su localización:

• altas o pielonefritis aguda: fiebre, escalofríos, sudoración, afectación del estado general dolor lumbar, y puño percusión positiva.

• bajas o cistitis: disuria, tenesmo vesical, polaquiuria, incontinencia y dolor suprapúbico. c) Por su vía de propagación:

• Ascendente: Es la más frecuente. Los gérmenes provienen de la región periuretral y vaginal. La existencia de sondas, traumatismos ó estasis urinarios producen la migración de las bacterias por uretra lo que conduce a una colonización y multiplicación vesical pudiendo alcanzar el riñón. La existencia en la mujer de una uretra más corta que en los hombres y existe menor distancia entre el meato urinario y el ano explica que en ellas las IU sean más frecuentes.

• Hematógena: Se producen como consecuencia de una sepsis previa. Poco frecuente. Los riñones pueden infectarse por esta vía como sucede en la bacteriemia estafilocóccica ó en la tuberculosis. Esta patogenia, la clínica y la evolución son diferentes de las que se

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producen por vía ascendente y por ello no se incluyen en el concepto convencional de infección urinaria. Ejemplos de ello son: Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus aureus, Candida albicans y Candida spp.

• Por contigüidad: a través de instrumentación • Vía linfática: sin evidencia

- Reinfección: IU recurrente por un mismo microorganismo o por otro con una separación MAYOR a 6 semanas. No requieren estudios urológicos con excepción de mujeres con pielonefritis ó infección a Proteus spp (descartar litiasis) - Recidiva: recurrencia de la infección urinaria por el mismo microorganismo en un tiempo MENOR de 6 semanas de una IU. Posibles causa: tratamientos cortos, tratamientos con antimicrobianos inadecuados, anomalía renal subyacente (litiasis, obstrucción, prostatitis crónica). Prevalencia de los microorganismos aislados: Ejemplo En el presente gráfico presentamos la prevalencia de los microorganismos aislados en un estudio realizado en la ciudad Rosario (Sta. Fe-Arg) en una población de adultos mayores. Se procesaron 12.544 urocultivos en un período de 2 años, siendo 52,88% negativos, 3.49% se repitió el examen y el resto resultó positivos (44,63%). De estos últimos el 54,62% procedían de pacientes internados y el 45,38% de pacientes ambulatorios.

Referencia: KES: grupo Klebsiella, Enterobacter y Serratia, BNF: Bacilos no fermentadores (predominio de Pseudomonas aeruginosa) Mecanismos de defensa del hospedero • Uretra

- Presencia de Ig A - Longitud y secreciones prostáticas (varones)

2515

1229

567

302

67

535

293

45

483

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

E. Coli

Grupo KES

ProteaeBNF

Citrobacter

Enterococcu

s

Staphylococcus

Strptococcus

Candida

E. Coli

Grupo KES

Proteae

BNF

Citrobacter

Enterococcus

Staphylococcus

Strptococcus

Candida

Pae SauU

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Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología – Área Defensa 2016 – Laboratorio 4 • Vejiga

- Flujo Urinario - Factores intrínsecos de la mucosa (leucocitos, Igs, urea, alta o baja osmolaridad, bajo

pH, lisozima) • Uréteres

- Esfínter que impide el reflujo vesicoureteral

Factores predisponentes: Alteraciones de los mecanismos de defensa • Intrínsecos

- pH vaginal alto. - Elevada densidad de receptores para adhesinas. - Configuración anatómica urogenital femenina. - Micción anormal. - Coito - Embarazo - Obstrucción del tracto urinario - Diabetes mellitus - Reflujo vesico ureteral - Transplante renal

• Extrínseco - Hospitalización. - Instrumentación del tracto urinario.

Diagnóstico microbiológico: UROCULTIVO Nos podemos preguntar ¿para qué hacer este estudio? • En cuanto al paciente, para:

- Confirmar la etiología infecciosa de un cuadro clínico compatible que presenta el paciente.

- Orientar la terapia antimicrobiana ó reajustar si es necesario el tratamiento antimicrobiano empírico inicial ante la presencia de signos y síntomas

• En cuanto a la población, para: - Determinar conducta epidemiológica a seguir - Identificar agentes prevalentes en el medio que trabajamos - Conocer perfil de sensibilidad antimicrobiana a fin de reajustar tratamientos empíricos - Detectar aparición de nuevos patógenos ó cambio de prevalencia de algunos - Vigilar la aparición de aislamientos resistentes

Etapas

Solicitud de examen

Examenmicrobiológico

Entrega de resultado

Toma de muestra

Transporte de muestra

Fasepre-analítica

Faseanalítica

Fasepost-analítica

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Tipos de muestras

Métodosinvasores

Métodosno invasores

Punción suprapúbica

Cateterizaciónvesical

Orina de2do. chorro

Orina por recolector

Catéter vesical evacuatorio

Toma de muestra: Indicaciones e incidencia en el resultado Pacientes continentes Recuento de UFC

Retención: primera orina de la mañana o 3 hs. de retención como mínimo (orina concentrada)

Microbiota habitual piel y mucosas

Higiene de la zona genital: jabón nuevo sin antisépticos, toalla limpia. En la mujer realizar higiene de la zona perineal y de ser posible utilizar tampón vaginal. En el hombre higienizar el meato uretral. Separar labios/Retraer prepucio: descartar primer chorro y orinar directamente en el recipiente estéril (chorro medio).Terminar de orinar afuera

Recuento de UFC Multiplicación de MO

Llevar inmediatamente al laboratorio o refrigerar. Conservar a 4-8 °C

Pacientes incontinentes - Punción de la sonda

Se utiliza en aquellos enfermos en los que no es posible retirar o reemplazar la sonda. Se obtura la sonda con una pinza ad hoc. Se desinfecta la parte externa de la sonda en la zona proximal con alcohol de 70º y luego con alcohol yodado o iodopovidona. Se punza la sonda con aguja y jeringa estéril. Se coloca la aguja en un descartador estéril y en la punta de la jeringa un obturador. Se envía de inmediato al laboratorio o se conserva refrigerada.

- Recolección a través de una sonda estéril recién colocada Aprovechando la colocación o el cambio de sonda, se recoge directamente la orina que fluye por el extremo distal de la sonda nueva en un frasco estéril. En un paciente sondado lo mejor es realizar la toma de muestra en el recambio de la misma. NUNCA se estudia microbiológicamente la punta de la sonda vesical. Esta muestra NO será admitida en el laboratorio de microbiología para su procesamiento.

- Cateterización evacuatoria Es el método de elección para pacientes en los que habitualmente se practica el cateterismo intermitente (enfermos con vejiga neurogénica). En algunos centros lo utilizan para lactantes ó adultos mayores hospitalizados en lugar de la toma al acecho. Sin embargo, presenta el riesgo de producir el ascenso de los microorganismos desde la uretra a la vejiga y generar así una IU iatrogénica.

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Para efectuar este método se desinfecta la zona perineal, se introduce la sonda por la uretra y se recoge la porción media del chorro de orina que sale por la sonda. Del mismo modo pueden obtenerse muestras a partir de ureterostomías, nefrostomías o vesicostomías.

- Punción suprapúbica Este procedimiento deberá ser efectuado por médicos entrenados, reservándose para casos especiales, como neonatos graves, pacientes cuyos urocultivos previos presenten resultados conflictivos, sospecha de microorganismos de difícil desarrollo. Primeramente se verifica que el paciente presente un globo vesical palpable, se desinfecta la zona pubiana con alcohol de 70º, luego con iodopovidona y se deja actuar un minuto. Se punza con aguja adecuada en la zona ubicada 1 o 2 cm por encima de la sínfisis pubiana. Se aspira la orina Se coloca la aguja en un descartador estéril y en la punta de la jeringa un obturador. Se envía al laboratorio de microbiología.

Conservación y transporte La muestra debe ser conservada preferentemente en el gabinete de la heladera (4-8 ºC) y transportada en un contenedor con refrigerante si el trayecto es largo o la temperatura ambiente lo amerita. ¿Por qué?

- Para mantener la viabilidad del agente infeccioso - Evitar el sobrecrecimiento de contaminantes ó del agente patógeno alterando así el

recuento de colonias

Procesamiento de la muestra EXAMEN MICROBIOLÓGICO DIRECTO INVESTIGACIÓN CONVENCIONAL DEL MICROORGANISMO

• Observación microscópica directa en fresco del sedimento de orina Se trasvasan aproximadamente 10 ml de orina en un tubo cónico y se centrifuga a 3000 rpm durante 5 minutos. Se vuelca el sobrenadante de modo que quede aproximadamente 0,5 ml en el fondo del tubo a modo de sedimento. Se resuspende por agitación en ese volumen de líquido, se coloca una gota entre porta y cubreobjeto, luego se observa en microscopio óptico con un aumento de 400 X.

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Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología – Área Defensa 2016 – Laboratorio 4 Se deberá consignar la presencia de LEUCOCITOS y PIOCITOS, como así también los otros elementos (hematíes, cilindros, células, cristales, etc.) que figuran en el sedimento urinario. Se promediará el número de c/u por campo microscópico observado. Se semicuantifica lo observado como abundantes (mayor de 5 leucocitos/campo), regular o escasa cantidad. El sedimento de orina, realizado con una muestra correctamente recolectada, es una herramienta de laboratorio fundamental para la interpretación del urocultivo.

• Observación microscópica directa por coloración Gram-Nicolle del sedimento de orina

Con el mismo sedimento de orina se extrae una gota del tubo y se extiende sobre un portaobjeto, se fija por calor hasta su secado y se colorea siguiendo los pasos de la técnica de Gram Nicolle. Posteriormente se seca el frotis coloreado luego del último enjuague y se observa al microscopio con 1000 X previamente habiendo colocado un gota de aceite de inmersión sobre el frotis. Se observa la morfología de las bacterias, la pared celular de las mismas y si hay más de un tipo morfológico.

• Cultivo semicuantitativo - recuento de UFC (unidades formadoras de colonias)/ml de orina

La siembra debe realizarse de la orina sin centrifugar con un ansa calibrada (5 μl), lo que permitirá obtener una estimación semicuantitativa del desarrollo microbiano expresados en Nº de UFC/ml de orina. Existen numerosos medios de cultivo para sembrar una muestra de orina. Cada laboratorio de microbiología utiliza el que considera más apropiado para la rutina de su trabajo. Se siembra en medios diferenciales y enriquecidos con el fin de obtener la recuperación de la mayoría de los patógenos posibles y teniendo en cuenta los de mayor prevalencia en el medio que trabajamos o de la epidemiología del lugar. Existen en la actualidad, medios cromogénicos (Lab Nº 3 Injuria 2016). Éstos incluyen en su composición compuestos cromógenos incoloros o débilmente coloreados que son sustratos de enzimas específicas. Cuando estas enzimas (producidas por los MO) degradan el sustrato cromogénico, éste se transforma en una molécula coloreada dando lugar a una colonia con color característico. De esta manera, estos medios de cultivo permiten la identificación presuntiva de algunos patógenos urinarios frecuentes en un solo paso. Cada bacteria se caracteriza por un color determinado de colonia, lo que permite observar mejor las muestras polimicrobianas. Una vez efectuada la siembra, las placas se incuban en estufa de cultivo a 37 ºC, en atmósfera aerobia durante 24-48 hs. El desarrollo se expresa en UFC/ml de orina (unidades formadoras de colonias/ml de orina) ó sea se cuentan las colonias que desarrollaron en la placa donde se sembró 5 μl y se multiplica ese número x 200 (para expresar cantidad de UFC/ml de orina). Recuentos de UFC:

Ejemplo: cuento 170 UFC en la placa, luego lo multiplico por el factor 200: 170 x 200= 34.000 UFC/ml pero se informa de acuerdo a los rangos antes mencionados.

Mayor de 100.000

Entre 10.000 y 100.000

Entre 1000 y 10.000

Menor de 200

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Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología – Área Defensa 2016 – Laboratorio 4 En el ejemplo se informaría, Recuento de colonias: entre 10.000 y 100.000 UFC/ml de orina

(Adaptado de Jerarquización de muestras clínicas - Red Whonet Argentina 2016)

- Urocultivos por chorro medio (monomicrobianas)

Jerarquización de los recuentos de UFC/ ml

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Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología – Área Defensa 2016 – Laboratorio 4

Sedimento de orina

Con reacción inflamatoria

> 103 UFC/ml < 103 UFC/ml < 103 UFC/ml> 103 UFC/ml

Jerarquizar No jerarquizar Evaluar contextodel paciente

No jerarquizar

Adultos – Hombres

Aislamientos polimicrobianos: Repetición

Sin reacción inflamatoria

Si no es posible, colocar en el informe, observaciones

- Urocultivo por punción suprapúbica

Aislamiento de gérmenes de piel

> 103 UFC/ml< 103 UFC/ml

JerarquizarNo jerarquizar

Descartada flora de piel

Jerarquizar 1 UFC

ECNP. acnes

Difteroides (excepto C. urealyticum)

- Urocultivo chorro medio (al acecho) - Monomicrobiano

Niños

<103 UFC/ml 103-104 UFC/ml > 104 UFC/ml Con reacción inflamatoria

No jerarquizar

Evaluar contexto clínico Jerarquizar

Sin reacción inflamatoria No jerarquizar Evaluar nueva

muestra

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Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología – Área Defensa 2016 – Laboratorio 4 - Urocultivo en paciente sondado permanente (> 3días) – Paciente sintomático

JerarquizarEvaluar el contexto clínico

NOSI

No jerarquizar

10-15% polimicrobianasEvaluar cada morfotipo

Hasta 3 microorganismos>102 ufc/ml?

Reacción inflamatoria?

NOSI

ERRORES COMUNES EN UROCULTIVOS (desde el laboratorio microbiológico)

• Fallas en la preparación del paciente (puede llevar a menor recuento UFC/ml o falso negativo) - Escaso tiempo de retención urinaria - Bajo tratamiento antimicrobiano - Medicación con acción bacteriostática (ácido acetil salicílico, ácido ascórbico). - Diuréticos.

• Fallas en la recolección de la orina - Uso de bolsitas recolectoras en lactantes (falso positivo, lo más factible polimicrobiana) - Higiene inadecuada (falso positivo, lo más factible polimicrobiana) - Contaminación de la muestra con antisépticos o desinfectantes (falso negativo o menor

recuento de UFC/ml de orina) - No recurrir a PSP cuando no corresponde (neonatos, lactantes graves).

• Fallas del laboratorio - Aceptar muestras que no se hayan refrigerado (falso positivo ó mayor recuento de

UFC/ml) - Dejar la muestra a temperatura ambiente durante tiempos prolongados (falso positivo

ó mayor recuento de UFC/ml) - No observar el sedimento, pH, etc. (falso positivo ó negativo - No se evalúa la reacción

inflamatoria) • Fallas en la interpretación de los cultivos

- No correlacionar los datos de pH con el de los aislamientos (Proteus mirabilis y pH ácido).

- No jerarquizar el sedimento urinario (falsos positivos ó negativos) - Valoración inadecuada del recuento de UFC: descartar recuentos de 103 – 104 ó

aseverar que existe una infección por el sólo hecho de obtener un recuento ≥ 105. 10

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Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología – Área Defensa 2016 – Laboratorio 4 - Identificación del germen patógeno Lo habitual en los laboratorios de microbiología clínica, es realizar la biotipificación de las bacterias mediante la utilización de pruebas metabólicas convencionales en macro o microescala con paneles cromogénicos (Laboratorio de Habilidades N° 3 – Área Injuria 2016). En laboratorios de mayor complejidad y cantidad de muestras se están incorporando en la actualidad técnicas moleculares, que estudian el perfil de las proteínas característico de cada genero y especie bacteriana por espectrometría de masas (MALDI-TOF) agrupadas en las que dimos en llamar “las omicas” (Proteómica - Laboratorio de Habilidades N° 5 – Área Injuria 2016). La bacteria Escherichia coli es la más frecuentemente aislada de muestras provenientes de orina. - Pruebas de sensibilidad antimicrobiana (Laboratorio de Habilidades N° 4 – Área Injuria 2016). Se realiza por método de difusión en agar ó Kirby Bauer, utilizando monodiscos o tabletas de antimicrobianos. Una vez efectuada la siembra y la colocación de los monodiscos de antimicrobianos, las placas se incuban en estufa de cultivo a 37ºC, en atmósfera aerobia durante 18- 24 hs. Se retiran las placas, se leen los halos de inhibición de cada antimicrobiano y se confronta con las tablas y recomendaciones del CLSI. Se interpretan los halos como sensible, intermedio o resistente, para luego elaborar el informe final con todos los datos obtenidos.

Con este laboratorio de habilidades N° 4 damos por finalizados los encuentros de Defensa 2016. Deseamos de corazón haber logrado cubrir tus expectativas y ser facilitadores de tu aprendizaje.

Tenés a disposición muchos horarios de consulta en la Cátedra de Microbiología (CUAS IV ala Norte) con diferentes docentes para aclarar tus dudas o ayudarte en la comprensión de los distintos temas que consideres necesarios.

Todo el material del presente año queda disponible en la página web www.microfcmunr.com.ar hasta el inicio del próximo ciclo lectivo (abril 2016). También podés informarte en ella los horarios de consulta, las presentaciones de los seminarios disciplinares dados con una pregunta indicadora para que te evalúes y además con las aclaraciones necesarias que despejarán si queda alguna duda en las respuestas, etc, etc, etc.

También podrás mantenerte al día con las novedades en nuestra cuenta de Twitter (@microfcmunr).

El desafío que emprendimos en la reformulación del dictado de la materia en el 2016, creemos que valió el esfuerzo empleado en ello.

Deseamos para todos un BUEN EXAMEN y buen camino hacia la meta. Cuerpo Docente Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología – 2016

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