Escherichia coli, una vieja amigacon nuevos trucos

Dr. Rafael Camacho-Carranza

Facultad de Ciencias-UNAM, 20 de enero de 2011

Planteamiento del Problema

Ancestro

Escherichia coli

Salmonella typhimurium

100-150 x 10 años6

m in 50

m in 25m in 75

m in 100/0

thrA 0araA 1.5

lon 9.8

aroA 20.5

potA 25.5

pnc A 39

dadA 26.6

dif 34.2

guaA 56.5

oriC 84.5

glyT 89.9

tdcB 70.3

rec A 60.8

m in 50

m in 25m in 75

m in 100/0

thrA 0araA 2.4

lon 11

aroA 19.9

potA 27.3

pnc A 28.9

dadA 41.1

dif 34.6

guaA 54.4

oriC 84.9

glyT 84.9

tdcB 70.9

rec A 62.2

51 52% GC

lac

cob

VS

7.8 Eco

43.7 Sty

INV

28.5

41.2

Planteamiento del Problema

Perseverancia de la estructura genómica, no de la secuencia

Sin embargo, los mecanismos recombinogénicos para lograr rearreglos en el cromosoma están presentes.Con peculiaridades

Science. 1988 Sep 9;241(4871):1314-8

Segall A, Mahan MJ, Roth JR.

Mapa de rearreglos con un punto fijo

Primer Hipótesis: Letalidad

La inversión de los diferentes intervalos no permisivos es letal

Ori

No Permisivo

Permisivo

NP

Los limites de la inversión del cromosoma

Ori

84.8’

Terminus

TER 35’

his 44.6’ trp 38.1

No permisivo

Posic ión de his-trp, intervalo no permisivo

Fra g m ent 1 Fra g m ent 2

Fra g m ent 2 Fra g m ent 1

Cepa donadora

Cepa receptora

Cepa invertida

a b c d e f

b c d e fa

b c d e fa

b c d e fa

bcde fa

inverted interval

Eventos transducc ionales

Forzando la inversión

Genetics. 1994 Aug;137(4):919-32.

Miesel L, Segall A, Roth JR.

Letalidad no es la explicación

Segunda Hipótesis: Mecánica

La inversión es no permisiva por un mecanismo que la evita

Si Natura no responde; muta

La nitrosoguanidina es tu amiga

Ori

84.8’

Terminus

TER 35’

his 44.6’ trp 38.1

No permisivo

Posic ión de his-trp, intervalo no permisivo

Permisivo

pin

¿Quien es ?pin

Mapeo de tus por ligamiento y posterior secuencia

Ori

84.8’

Terminus

TER 35’

his 44.6’ trp 38.1

No permisivo

Posic ión de his-trp, intervalo no permisivo

Permisivo

pin

¿Quien es ?pin

tus 31.3’

TerA ATTAA TA AAGCG TGTTGTAACTA

Tus

Horquillas de replicac ión

OriTER

¿Que rayos hace Tus?

Ori

TER

?

SOS

Tiempo generacional

Medios

Hipermutac ión

5’

¿Cuál es el fenotipo del su mutación?

¿Por qué tus?

Herramientas de trabajo

DEL lacZ'

Tn10d-tet

lacAYZ

p-trp

p-his

min 44.6

min 38

Fabricando inversiones

D’ G OE IlacZ’ trp

Mu ’d

his reg ion

P’ hisD'EA B C D'E

trp lac Z Y A am p

Mu Ad

trp reg ion

p’ trp

Tn dTc10

Antes de la inversion

ED' C B AE IlacZ’ trp

Mu ’d

his reg ion

P’ his

D'EO G D' trp lac Z Y A am p

Mu Ad

trp reg ion

p’ trp

Tn dTc10

Despues de la inversion

Lac -

Lac +

his reg iontrp reg ion

¿Un mecanismo que involucre a Tus?

Sitios ter

Ori

84.8’

Terminus

TER 35’

his 44.6’ trp 38.1

No permisivo

Posic ión de his-trp, intervalo no permisivo

Siti

o t

er

en

am

yA

Inserciones en región fli

His amyA trp

NP-INV

P-INV

42.5’

ter-amyA, el portero de las inversiones

540pb 1172pb

Letalidad

¿Realmente descartada?

¿Selección espontánea de tus-?

Experimento de inversión bloqueada

D’ G OE Ilac Z’ trp

Mu ’d

his reg ion

P’ h isD'EA B C D'E

trp lac Z Y A am p

Mu Ad

trp region

p ’ trp

Tn d Tc10

75%

ED' C B AE Ilac Z’ trp

Mu ’d

his reg ion

P’ h is

D'EO G D'trp lac Z Y A am p

Mu Ad

trp region

p ’ trp

Tn d Tc10

Inverted strain

Lac -

Lac +

his reg iontrp region

D’ G OE Ilac Z’ trp

Mu ’d

his reg ion

P’ h isD'EA B C D'E

trp lac Z Y A am p

Mu Ad

trp region

p ’ trp

Tn d Tc10

25%

Lac -

flip-back

D’ G OE Ilac Z’ trp

Mu ’d

his region

P’ hisD'EA B C D'E

trp lac Z Y A am p

Mu Ad

trp region

p’ trp

Tn dTc10

ED' C B AE Ilac Z’ trp

Mu ’d

his region

P’ his

D'EO G D' trp lac Z Y A am p

Mu Ad

trp region

p’ trp

Tn dTc10

Lac-

Lac+

his regiontrp region

Kn

tonB

Kn

tonB? ?

DEL1956; DEL1957

Before inversion

After inversion

and Bochner selection

Poniendo un candado a la inversión

Primeras observaciones:

La letalidad del evento no explica la restricción en la inversión

Existe un sistema mecánico involucrado que requiere a la proteína Tus

La construcción de un modelo

Tres conceptos para un marco teorico

Gary Smith

Andre Kuzminov

Tokio Kogoma

Ori PriA

Chi 9:1

Recombinación replicativa

de largo alcance

Direccion de la reparación

del colapso de la replicación

Nuevo replicosoma en

condiciones de estres,

priA un puente en

replicación y recombinación

Annu Rev Genet. 2001;35:243-74.

Smith GR.

Mol Microbiol. 1995 May;16(3):373-84.

Kuzminov A.

9:1 en dirección a terminus las secuencias Chi

Replicación estable

Microbiol Mol Biol Rev. 1997 Jun;61(2):212-38.

Kogoma T.

J Mol Biol. 1970 Sep 14;52(2):143-64.

Kogoma T, Lark KG.

Poniendo reglas al juego

Hacia un modelo

A) Los rompimientos de cadenas, con la consecuente invasión a segundas cadenas,

induce crecimientos replicativos de largo alcance

B) Las nuevas horquillas de replicación se desplazan en dirección Ori-TER, por lo cual,

en un rompimiento de cadena el extremo 3’ del lado cercano a Ori, es el extremo

caliente para invadir, mientras que el extremo 3’ del lado de TER es el extremo frio.

C) La horquilla replicativa-recombinogénica es mas susceptible a Tus-ter que la

horquilla replicativa proveniente de Ori.

D) La invasión de cadenas induce un rompimiento que a su ves inicia una segunda

invasión reciprocua.

Modelando una explicación

Lo que falta

¿Donde se localizan los sitios ter?, ¿y sus derivados?

¿Todos los sitios ter ac túan con la m isma eficienc ia?

En sentido contrario, his-Ori, ¿funciona Tus?

¿Se pueden generar nuevas fronteras?

¿Tenemos dos diferentes horquillas?

Demasiadossitios ter

Primeras aproximaciones

Busqueda de nuevos sitios ter

Ori nadB cysA nuo glpT his

NP

P- tus- dependiente

Mismos números

pero colonias enfermas, o sanas

según el estatus de tus.

¿Como estudiar a un moribundo?

Captura con recA

ca mR

Resistenc ia a cloramfenic ol

ter-amyA

Construcción de un transposón derivado de Tn10dGn-teramyA-Cm

Cadáveres en el armario

Efecto de tus en eventos entre secuencias repetidas directas

Como funciona la replicación estable en presencia de Tus

Tendencia a la reversión de la inversión

“Free variability is found only in a limited portion of the genotype. Most genes are tied together into balanced complexes that resist change. The fitness of genes tied up in these complexes is determined far more by the fitness of the complex as a whole than by any functional qualities of individual genes”.

Ernst Mayr

Dos caras de un mismo problema

La inestabilidad de la duplicación: una herramienta

Segregación de la duplicacion

MudA

Segregante

Perdida de la amplificación

Funcionamiento del sistema de segregac ión

Mud AleuA'leuA'

Mud AnadC'nadC'

min 3.6

min2.9

Donadores

leuA'leuA'

leuA nadC

leuA nadC

nadC'

Mud A

leuA'

leuA nadCnadC' leuA'

Mud A

Receptor

Rep licación

Transd ucción P22

Producto amplificado

Resolución

Construcc ión de la amplificac ión cromosomal