PRUEBAS DE PRUEBAS DE

RESISTENCIA RESISTENCIA

BACTERIANABACTERIANABUSQUEDA Y BUSQUEDA Y

CONFIRMACIONCONFIRMACIONGLORIA D. PACHECO S.

Especialista de Producto BD Diagnosticsgloria_pacheco@bd.com

Cel: 315-7920177

BACILOS GRAM BACILOS GRAM

NEGATIVOSNEGATIVOS

BGNBGN

ESBLsESBLsββ-Lactamasas de Espectro -Lactamasas de Espectro

ExtendidoExtendido Inicialmente se encontraron:Inicialmente se encontraron:

Klebsiella, E. coliKlebsiella, E. coli También se encuentran en:También se encuentran en:

Proteus, SerratiaProteus, Serratia Enterobacter, SalmonellaEnterobacter, Salmonella MorganellaMorganella, etc., etc.

Son inhibidas por el Ácido Clavulanico Son inhibidas por el Ácido Clavulanico y Tazobactam (menos por Sulbactam).y Tazobactam (menos por Sulbactam).

ESBLsESBLsββ-Lactamasas de Espectro -Lactamasas de Espectro

ExtendidoExtendido

Principales Familias de ESBLsPrincipales Familias de ESBLs

TEM-3, 4 …………………. 137TEM-3, 4 …………………. 137 SHV-2, 3 …………………. 54SHV-2, 3 …………………. 54 CTX-M-1, 2 ……………… 37CTX-M-1, 2 ……………… 37 Otras Familias y ESBLs individualesOtras Familias y ESBLs individuales

Por quPor quéé la Prueba de la Prueba de ββ--Lactamasas? Lactamasas?

Terapia CorrectaTerapia Correcta Los puntos de corte no detectan con Los puntos de corte no detectan con

seguridad nuevas seguridad nuevas ββ-Lactamasas-Lactamasas Control de la InfecciónControl de la Infección Identificar las Drogas que causan Identificar las Drogas que causan

ResistenciaResistencia

DETECCION DE ESBLsDETECCION DE ESBLsDOS ENFOQUESDOS ENFOQUES

Pruebas de Screening y Pruebas Pruebas de Screening y Pruebas Confirmatorias para Screen PositivosConfirmatorias para Screen Positivos

Pruebas ConfirmatoriasPruebas Confirmatorias

DETECCION DE ESBLsDETECCION DE ESBLs

PRUEBAS DE SCREENINGPRUEBAS DE SCREENING

Ventajas:Ventajas: Menos TrabajoMenos Trabajo EconómicaEconómica

Desventajas:Desventajas: Sensibilidad < 100%Sensibilidad < 100% Demoran la ConfirmaciónDemoran la Confirmación Se deben reportar Screen positivos?Se deben reportar Screen positivos?

PRUEBA CONFIRMATORIA CLSIPRUEBA CONFIRMATORIA CLSIKlebsiella, E. coli y P. mirabilisKlebsiella, E. coli y P. mirabilis

Prueba MIC:Prueba MIC: Cefotaxime y Ceftazidime +/- 4 Cefotaxime y Ceftazidime +/- 4 μμg/ml g/ml

Clavulanato:Clavulanato: Disminución de Disminución de >> 3 doble diluciones de 3 doble diluciones de

cualquiera de los dos antibióticos.cualquiera de los dos antibióticos. e.j.: Cefotaxime e.j.: Cefotaxime 8 8 μμg/mlg/ml Cefotaxime + Clavulanato Cefotaxime + Clavulanato 1 1 μμg/mlg/ml

Prueba de Disco:Prueba de Disco: Cefotaxime y Ceftazidime +/- 10 Cefotaxime y Ceftazidime +/- 10 μμg Clavulanatog Clavulanato Incremento en el halo de inhibición de Incremento en el halo de inhibición de >> 5 mm. 5 mm.

Método de Disco

Método de Doble Disco

CLSI – RECOMENDACIONES CLSI – RECOMENDACIONES EL REPORTEEL REPORTE

Confirmar ESBLs:Confirmar ESBLs: E. coli, Klebsiella, P. mirabilisE. coli, Klebsiella, P. mirabilis

Reportar Resistente:Reportar Resistente:

Todas las PenicilinasTodas las Penicilinas

CefalosporinasCefalosporinas

Aztreonam Aztreonam

Independiente del resultado “Independiente del resultado “in vitroin vitro””

Excepto Cefamicinas (e.j.: Cefoxitina, Excepto Cefamicinas (e.j.: Cefoxitina, Cefotetan) Cefotetan)

ESBLs en microorganismos diferentes ESBLs en microorganismos diferentes

de: de:

Klebsiella, E. coli y P. mirabilisKlebsiella, E. coli y P. mirabilis

La mayoría de Laboratorios no intentan La mayoría de Laboratorios no intentan detectar ESBLs en microorganismos detectar ESBLs en microorganismos diferentes de diferentes de E. coliE. coli y y KlebsiellaKlebsiella

Dos indicaciones para la prueba de ESBLs en Dos indicaciones para la prueba de ESBLs en otros microorganismos:otros microorganismos: ESBLs detectada en ESBLs detectada en Klebsiella, E. coli y P. mirabilisKlebsiella, E. coli y P. mirabilis Fenotipo sospechosoFenotipo sospechoso

Cual prueba?Cual prueba? Usar una prueba especifica (confirmatoria)Usar una prueba especifica (confirmatoria)

DIFICULTADES EN LA DIFICULTADES EN LA PRUEBA DE ESBLsPRUEBA DE ESBLs

EFECTO DEL INOCULOEFECTO DEL INOCULOMICs en MICs en g/ml: SHV-3 producida por g/ml: SHV-3 producida por Citrobacter freundiiCitrobacter freundiiInocul.Inocul.

CFU/mlCFU/mlCefotaximeCefotaxime CeftazidimeCeftazidime AztreonamAztreonam CefepimeCefepime

5 x 105 x 1055 22 11 0.50.5 0.50.5

(CLSI breakpoint 8 g/ml)

DIFICULTADES EN LA PRUEBA DIFICULTADES EN LA PRUEBA DE ESBLsDE ESBLs

EFECTO DEL INOCULOEFECTO DEL INOCULO

MICs en MICs en g/ml: SHV-3 producida por g/ml: SHV-3 producida por Citrobacter freundiiCitrobacter freundiiInocul.Inocul.

CFU/mlCFU/mlCefotaximeCefotaxime CeftazidimeCeftazidime AztreonamAztreonam CefepimeCefepime

5 x 5 x 101055

22 11 0.50.5 0.50.5

5 x 5 x 101077

256256 3232 3232 >1024>1024

(CLSI breakpoint 8 g/ml)

DIFICULTADES EN LA DIFICULTADES EN LA PRUEBA DE ESBLsPRUEBA DE ESBLs

Recomendación Recomendación ((nono Aprobadas por Aprobadas por CLSICLSI):): Extender la recomendación de Extender la recomendación de reporte del CLSI a todos los reporte del CLSI a todos los microorganismos productores de ESBLsmicroorganismos productores de ESBLs

Reportar todos microorganismos Reportar todos microorganismos productores de ESBLs por la misma vía: productores de ESBLs por la misma vía: resistente a todas las Penicilinas, resistente a todas las Penicilinas, Cefalosporinas y AztreonamCefalosporinas y Aztreonam

DIFICULTADES LA PRUEBA DIFICULTADES LA PRUEBA DE ESBLsDE ESBLs

Alto nivel de expresión of AmpC puede Alto nivel de expresión of AmpC puede impedir el reconocimiento de una ESBLsimpedir el reconocimiento de una ESBLs

Problema in especies que producen Problema in especies que producen ββ--lactamasa AmpC inducible codificada lactamasa AmpC inducible codificada cromosómicamente (e.j. cromosómicamente (e.j. Enterobacter, Enterobacter, Serratia, Providencia, etc.)Serratia, Providencia, etc.)

Problema en Problema en E. coliE. coli y y K. pneumoniaeK. pneumoniae que que adquiere plasmidos de AmpCadquiere plasmidos de AmpC

Clavulanato puede actuar como un inductor de Clavulanato puede actuar como un inductor de alto nivel de AmpC e incrementar resistencia a alto nivel de AmpC e incrementar resistencia a las drogas de screening dando las drogas de screening dando falsos falsos negativosnegativos en la prueba confirmatoria - ESBL en la prueba confirmatoria - ESBL

ββ--Lactamasa AmpC Lactamasa AmpC

SPACE

- Serratia- Providencia/P. aeruginosa- Aeromonas- Citrobacter freundii- Enterobacter, Hafnia

• CefalosporinasaCefalosporinasa

• Hidroliza todos los antibióticos Hidroliza todos los antibióticos ββ--lactlactáámicos micos excepto Carbapenems y Cefepimeexcepto Carbapenems y Cefepime

• No son Inhibidos por Clavulanato y SulbactamNo son Inhibidos por Clavulanato y Sulbactam

• Algunas son induciblesAlgunas son inducibles

• Características de ciertos géneros:Características de ciertos géneros:

AmpCs Mediada por AmpCs Mediada por PlPláásmidossmidos

Klebsiella, E. coli, Salmonella, P. mirabilisKlebsiella, E. coli, Salmonella, P. mirabilisMuchas enzimas, algunas son induciblesMuchas enzimas, algunas son induciblesPrevalencia es baja pero se esta Prevalencia es baja pero se esta incrementandoincrementando Aprox. 1/3 de laboratorios U.S.Aprox. 1/3 de laboratorios U.S. 3.3 – 8.5% 3.3 – 8.5% K. pneumoniae K. pneumoniae en USAen USA

DIFICULTADES EN LA DIFICULTADES EN LA PRUEBA DE ESBLsPRUEBA DE ESBLs

Abordaje en la detección ESBL en Abordaje en la detección ESBL en cepas productoras de AmpCcepas productoras de AmpC Uso Tazobactam o Sulbactam en lugar de Uso Tazobactam o Sulbactam en lugar de

Clavulanato en Prueba Confirmatoria ESBL Clavulanato en Prueba Confirmatoria ESBL porque hay menos probabilidad de inducir porque hay menos probabilidad de inducir producción AmpCproducción AmpC

Incluir Cefepime como antibiótico de screening Incluir Cefepime como antibiótico de screening porque a alto nivel de expresión de AmpC tiene porque a alto nivel de expresión de AmpC tiene un efecto mínimo en la actividad de Cefepimeun efecto mínimo en la actividad de Cefepime

Incluir Cefamicinas (Cefoxitina) como Incluir Cefamicinas (Cefoxitina) como antibiótico de screening porque las Cefamicinas antibiótico de screening porque las Cefamicinas son hidrolizadas por AmpCs pero no por ESBLsson hidrolizadas por AmpCs pero no por ESBLs

Diferencias entre Diferencias entre ββ-- Lactamasas Lactamasas

ESBLs y AmpCESBLs y AmpCResultados Prueba ESBL AmpCInhibida Clavulanato Si No

Hidroliza: -Cefalosporinas Si (R) Si (R)

-Cefamicinas No (S) Si (R)

-Cefepime Si (R) No (S)

Cuando Sospechar AmpC Cuando Sospechar AmpC PlasmídicaPlasmídica

Prueba de Disco para β-lactamasa AmpC debe ser Prueba de Disco para β-lactamasa AmpC debe ser realizada en aislamientos derealizada en aislamientos de E. coli, Klebsiella spp, E. coli, Klebsiella spp, P. mirabilis, SalmonellaP. mirabilis, Salmonella positivos en alguno de los positivos en alguno de los siguientes screens:siguientes screens: Cefoxitina-no susceptible (i.e. I o R)Cefoxitina-no susceptible (i.e. I o R)

Screen ESBL - positivo pero prueba confirmatoria ESBL es Screen ESBL - positivo pero prueba confirmatoria ESBL es

negativa negativa

Ceftazidima y Cefoxitina I o R (e.j. MIC Ceftazidima y Cefoxitina I o R (e.j. MIC >> 16 µg/ml para 16 µg/ml para

ambas drogas) y prueba confirmatoria ESBL negativa ambas drogas) y prueba confirmatoria ESBL negativa

(este Screen puede tener buena especificidad)(este Screen puede tener buena especificidad)

Como determinar si ambas: Como determinar si ambas: AmpC y ESBL están AmpC y ESBL están

presentespresentes

Prueba de Difusión de Doble Prueba de Difusión de Doble DiscoDisco Mirar el tipo de patrón AmpC mMirar el tipo de patrón AmpC máás s

el efecto del Ácido Clavulanicoel efecto del Ácido Clavulanico

E. coli con E. coli con AmpC mediada AmpC mediada por por plasmidosplasmidos

Prueba de Disco - AmpCPrueba de Disco - AmpC

Cultivo :Cultivo : E. coli E. coli ATCC 25922ATCC 25922

Microorganismo a EnsayarMicroorganismo a Ensayar en discoen disco

S. marcescens con S. marcescens con AmpC AmpC CromosomalCromosomal y ESBLy ESBL

Recomendaciones para el LaboratorioRecomendaciones para el Laboratorio• Los Laboratorios deben marcar todos organismos Los Laboratorios deben marcar todos organismos

conocidos que poseen conocidos que poseen ß-ß-lactamasas inducibles (S/IB)lactamasas inducibles (S/IB)• Ejemplo de Pie de nota: Ejemplo de Pie de nota:

“ “Este microorganismo se conoce que poseen Este microorganismo se conoce que poseen ß-ß-

lactamasas inducibles. Estos aislamientos pueden lactamasas inducibles. Estos aislamientos pueden desarrollar resistencia a todas las cefalosporinasdesarrollar resistencia a todas las cefalosporinas después de iniciar la terapia. después de iniciar la terapia. Evitar el uso de antibioticos Evitar el uso de antibioticos ß-lactamicos.”ß-lactamicos.”

Bush Group 1 o AmpCBush Group 1 o AmpC ββ--Lactamasas InduciblesLactamasas Inducibles

Cto. deCto. de: : Enterobacter cloacaeEnterobacter cloacae – – Este Este microorganismo se conoce que posee microorganismo se conoce que posee ß-ß-lactamasas inducibles. Los aislamientos puede lactamasas inducibles. Los aislamientos puede comenzar a presentar resistencia a todas las comenzar a presentar resistencia a todas las CefalosporinasCefalosporinas después de iniciar la terapia. después de iniciar la terapia. Evitar el uso de antibióticos ß-lactamicos.Evitar el uso de antibióticos ß-lactamicos.

AmikacinaAmikacina SS AmpicilinaAmpicilina RR CefazolinaCefazolina RR CeftazidimaCeftazidima SS CefepimeCefepime SS CeftriaxonaCeftriaxona SS GentamicinaGentamicina SS LevofloxacinaLevofloxacina SS

AmpC Cromosomal queAmpC Cromosomal que nono Expresa Alto Nivel de Expresa Alto Nivel de

ResistenciaResistencia

Cto. deCto. de: : Enterobacter cloacaeEnterobacter cloacae - - Este Este microorganismo se conoce que posee microorganismo se conoce que posee ß-ß-lactamasas inducibles. Los aislamientos puede lactamasas inducibles. Los aislamientos puede comenzar a presentar resistencia a todas las comenzar a presentar resistencia a todas las CefalosporinasCefalosporinas después de iniciar la terapia. después de iniciar la terapia. Evitar el uso de antibióticos ß-lactamicos.Evitar el uso de antibióticos ß-lactamicos.

AmikacinaAmikacina SS AmpicilinaAmpicilina RR CefazolinaCefazolina RR CeftazidimaCeftazidima RR CefepimeCefepime SS CeftriaxonaCeftriaxona RR GentamicinaGentamicina SS LevofloxacinaLevofloxacina SS

AmpC Cromosomal queAmpC Cromosomal que sisi Expresa Alto Nivel ResistenciaExpresa Alto Nivel Resistencia

Growth ofGrowth of: : Enterobacter cloacaeEnterobacter cloacae

AmikacinaAmikacina SS AmpicilinaAmpicilina RR CefazolinaCefazolina RR CeftazidimaCeftazidima RR CefepimeCefepime SS CeftriaxonaCeftriaxona RR GentamicinaGentamicina SS Levofloxacina Levofloxacina SS

AmpC Cromosomal queAmpC Cromosomal que sisi Expresa Alto Nivel ResistenciaExpresa Alto Nivel Resistencia

Growth ofGrowth of: : Enterobacter cloacae Enterobacter cloacae

AmikacinaAmikacina SS AmpicillinAmpicillin RR CefazolinCefazolin RR CeftazidimeCeftazidime II CefepimeCefepime SS CeftriaxoneCeftriaxone SS GentamicinGentamicin SS Levofloxacin Levofloxacin SS

AmpC Cromosomal queAmpC Cromosomal que eses Sospechosa de ESBLsSospechosa de ESBLs

E. cloacae con E. cloacae con AmpCAmpC Cromosomal y ESBLCromosomal y ESBL

Cto. deCto. de: : Enterobacter cloacaeEnterobacter cloacae – – Este Este microorganismo posee una ESBL. Se microorganismo posee una ESBL. Se rquiere Aislamiento de Contacto.rquiere Aislamiento de Contacto. AmikacinaAmikacina SS CefazolinCefazolin RR AmpicillinAmpicillin RR CeftazidimeCeftazidime RR CefepimeCefepime RR CeftriaxoneCeftriaxone RR GentamicinGentamicin SS Levofloxacin Levofloxacin SS

AmpC Cromosomal que AmpC Cromosomal que eses Sospechosa de ESBLSospechosa de ESBL

K. pneumoniae con ESBL, AmpC y K. pneumoniae con ESBL, AmpC y CarbapenemasaCarbapenemasa

Microorganismos intrínsicamente Microorganismos intrínsicamente menos susceptiblesmenos susceptibles – – Acinetobacter Acinetobacter spp., P. aeruginosaspp., P. aeruginosa

Alta AmpC + permeabilidad reducidaAlta AmpC + permeabilidad reducidaClase A carbapenemasas (KPC,…)Clase A carbapenemasas (KPC,…)Clase B metalo-β-lactamasas (IMP,…)Clase B metalo-β-lactamasas (IMP,…)

Resistencia a Resistencia a CarbapenemsCarbapenems

COCOS GRAM COCOS GRAM POSITIVOSPOSITIVOS

CGPCGP

Staphylococcus aureusStaphylococcus aureus Meticilina Resistente Meticilina Resistente

(MRSA)(MRSA) Incidencia incrementando en Incidencia incrementando en

hospitales especialmente en ICU o en hospitales especialmente en ICU o en pacientes con quimioterapiapacientes con quimioterapia

Están comenzando a aparecer cepas Están comenzando a aparecer cepas Vancomicina Intermedia y ResistenteVancomicina Intermedia y Resistente

Esta Emergiendo MRSA adquirido en Esta Emergiendo MRSA adquirido en la comunidad (CA-MRSA) que aparece la comunidad (CA-MRSA) que aparece susceptible a muchos agentes oralessusceptible a muchos agentes orales

El nuevo El nuevo Staphylococcus Staphylococcus aureusaureus Meticilino Meticilino

Resistente Adquirido en Resistente Adquirido en la Comunidad la Comunidad

CA-MRSACA-MRSA

Propiedades Distintivas CA-Propiedades Distintivas CA-MRSAMRSA

Resistente solamente a Meticilina Resistente solamente a Meticilina con Resistencia cruzada solamente a con Resistencia cruzada solamente a otros otros ßß-lactamicos-lactamicos

Asoc. con Síndromes semejando a los Asoc. con Síndromes semejando a los causados por MSSAcausados por MSSA

Puede causar Infecciones Serias Puede causar Infecciones Serias (fatales)(fatales)

Mongkolrattanothai K et al. CID 37:1050, 2003 Hiramatsu K, Daum R: ICCAC (48) CA-MRSA: A Worldwide Reality?, 2003

Propiedades del CA-Propiedades del CA-MMRSARSA Susceptibles a mas antibióticos que HA-MRSASusceptibles a mas antibióticos que HA-MRSA SCCmec IV o V (raramente que el I-III)SCCmec IV o V (raramente que el I-III)

PequeñosPequeños Mas móvilMas móvil

Muchos aislamientos expresan Panton-Valentine Muchos aislamientos expresan Panton-Valentine Leukocidin (PVL)Leukocidin (PVL) Potente toxina asociada con furunculosisPotente toxina asociada con furunculosis

No se conocen factores de riesgo en personal de No se conocen factores de riesgo en personal de cuidado de la saludcuidado de la salud

Es mas común las Infecciones de Piel y Tejidos Es mas común las Infecciones de Piel y Tejidos blandos, ocasionalmente neumonía necrotizanteblandos, ocasionalmente neumonía necrotizante

Manifestaciones CA-Manifestaciones CA-MRSAMRSA

Neumonía Necrotizante Neumonía Necrotizante OsteomielitisOsteomielitis AbscesosAbscesos EmpiemaEmpiema Fascitis NecrotizanteFascitis Necrotizante Tromboflebitis SépticaTromboflebitis Séptica Sepsis SeveraSepsis Severa

Clindamicina - Oral es el agente que se ha Clindamicina - Oral es el agente que se ha redescubierto para Infecciones por CA-MRSA redescubierto para Infecciones por CA-MRSA

CA-MRSA la prueba es usualmente susceptible CA-MRSA la prueba es usualmente susceptible a Clindamicinaa Clindamicina

El problema es cuando el microorganismos El problema es cuando el microorganismos tiene una prueba de susceptibilidad: tiene una prueba de susceptibilidad: Eritromicina-R y Clindamicina-SEritromicina-R y Clindamicina-S

Algunas cepas pueden tener Resistencia Algunas cepas pueden tener Resistencia InducibleInducible

CA-MRSA Opciones de CA-MRSA Opciones de TratamientoTratamiento

Eritromicina / Eritromicina / ClindamicinaClindamicina

MecanismoMecanismo DeterminaDeterminantente

EritroEritro ClindaClinda

EflujoEflujo msrmsrAA RR SS

Alteración Alteración RibosomalRibosomal

ermerm RR SS**

Alteración Alteración RibosomalRibosomal

ermerm RR RRconstitutivaconstitutiva

msrA = Resistencia a Macrólidos y Streptograminaerm = Eritromicin-metilasa ribosomal* Exige Inducción para mostrar la resistencia

Staphylococcus spp. Staphylococcus spp. Staphylococcus spp. Staphylococcus spp.

Staphylococcus Staphylococcus aureusaureus

ClindamicinaClindamicina SS

Eritromicina R

OxOxacilinaacilina RR

PenicilinaPenicilina R R

VancomicinaVancomicina S S

Si Clindamicina - S y Eritromicina - R, No se debe reportar Clindamicina - S sin realizar el “Test D”

Estrategia Opcional de Estrategia Opcional de InformeInforme

Staphylococcus aureus

EritromicinaEritromicina R R

OxacilinaOxacilina R R

Penicilina Penicilina R R

Vancomicina Vancomicina SS

““Contactar al Laboratorio si se necesita el resultado de Clindamicina””

““Test D” –Test D” – Reacción Reacción PositivaPositiva

15 - 26 mm

Resistencia Inducible a Clindamicina (mediada-erm)

Antibiograma por Difusión de Disco:

Colocar discos de 2 g Clindamicina y 15 g Eritromicina a una distancia de borde a borde de 15 mm a 26 mm.

““Test D” Positivo -Test D” Positivo - Comentario opcionalComentario opcional

Staphylococcus aureus

Clindamicina R Eritromicina R

Oxacilina R Penicilina R Vancomicina S

“ Este S. aureus se presume ser resistente, basado en la detección de Resistencia Inducible a Clindamicina ”.

““Test D” –Test D” – Reacción Reacción NegativaNegativa

NO hay Inducción

(Resistencia a Eritromicina:

Mediada por gen msrA)

““Test D” Negativo -Test D” Negativo - Comentario opcionalComentario opcional

Staphylococcus aureusClindamicina S

Eritromicina R Oxacilina R Penicilina R Vancomicina S

“Este S. aureus NO demuestra Resistencia Inducible in vitro a Clindamicina.”

Problemas con la Problemas con la Detección de MRSA en el Detección de MRSA en el

LaboratorioLaboratorio Sistemas Automatizados no siempre son confiablesSistemas Automatizados no siempre son confiables Se recomienda la placa de Oxacilina Screening Se recomienda la placa de Oxacilina Screening

para realizar en todos los Staphylococcus aureus para realizar en todos los Staphylococcus aureus identificados en Sistemas Automatizadosidentificados en Sistemas Automatizados

Método de Difusión de Disco pueden aparecer Método de Difusión de Disco pueden aparecer como susceptibles (zona de inhibición alrededor como susceptibles (zona de inhibición alrededor del disco de Oxacilina)del disco de Oxacilina) Se debe examinar muy bien para estar seguros de que Se debe examinar muy bien para estar seguros de que

no hay crecimiento de colonias pequeñas o un no hay crecimiento de colonias pequeñas o un crecimiento tenue dentro del halo de inhibición. crecimiento tenue dentro del halo de inhibición.

Métodos Recomendados Métodos Recomendados para la Detección de para la Detección de

MRSAMRSA

Realizar pruebas de Realizar pruebas de mecmecA o PBP 2a, A o PBP 2a, refiere discrepancias (costosas, refiere discrepancias (costosas, técnicamente difícil) técnicamente difícil)

Realizar Prueba modificada de disco Realizar Prueba modificada de disco de Cefoxitina (2004)de Cefoxitina (2004)

MIC (µg/ml): S I

RS. aureus 2 - 4CoNS 0.25 - 0.5

DD (mm): R I S

S. aureus 10 11-12 13

CoNS 17 - 18

M100-S17(M2, M7); Table 2C

StaphylococcusStaphylococcus spp. - spp. - OxacilinaOxacilina

StaphylococcusStaphylococcus spp. - spp. - OxacilinaOxacilina

RESISTENCIA A RESISTENCIA A

OXACILINAOXACILINA

Método: Oxacillin Screen AgarMétodo: Oxacillin Screen Agar Agar Mueller Hinton con 4% de NaCl y Agar Mueller Hinton con 4% de NaCl y

66g/ml de Oxacilina. g/ml de Oxacilina. Suspensión bacteriana 0.5 McFarland, Suspensión bacteriana 0.5 McFarland,

de esta dilución se toma 10 de esta dilución se toma 10 l para l para sembrar sobre el agar.sembrar sobre el agar.

No se recomienda para Estafilococos No se recomienda para Estafilococos Coagulasa Negativa.Coagulasa Negativa.

STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Staphylococcus Staphylococcus spp.spp.

• ““Los resultados de la Prueba de Los resultados de la Prueba de

Difusión de Disco Difusión de Disco concon Cefoxitina de 30 g

debe ser usados para predecir la debe ser usados para predecir la

Resistencia mediada porResistencia mediada por gen mecA

– en – en StaphylococcusStaphylococcus.”.”

M100-S17(M2, M7); Table 2CM100-S17(M2, M7); Table 2C

Disco de Cefoxitina – Detección Disco de Cefoxitina – Detección

de gen mecA de gen mecA - Staphylococcus - Staphylococcus

spp.spp.Mecanismo de R a Mecanismo de R a OxacilinaOxacilina

S. S. aureusaureus

SCoNSCoN

Producción de PBP Producción de PBP 2a (gen mecA)2a (gen mecA)

++ ++

HiperproduciHiperproducióón de n de Beta-LactamasaBeta-Lactamasa

++ --

Alteración de PBPs Alteración de PBPs preexistentespreexistentes

++ --

Screen - Difusión de Disco para Screen - Difusión de Disco para

Resistencia Resistencia

mediada por gen mediada por gen mecmecA en A en

StaphylococcusStaphylococcus:: Reemplazar disco de Oxacilina por disco Reemplazar disco de Oxacilina por disco

de Cefoxitinade Cefoxitina Realizar Método Estándar de Difusión de Realizar Método Estándar de Difusión de

Disco con disco deDisco con disco de Cefoxitina Cefoxitina (30 (30 g).g). Incubar por 24 h. Los resultados pueden Incubar por 24 h. Los resultados pueden

ser reportados después de 18 h, si ser reportados después de 18 h, si sonson resistenteresistentes.s.

Reportar el resultado para Reportar el resultado para OXACILINAOXACILINA, no , no para Cefoxitina.para Cefoxitina.

Screen – Screen – DiluciónDilución (MIC) para (MIC) para

ResistenciaResistencia

mediada por gen mediada por gen mecmecA en A en

StaphylococcusStaphylococcus:: Continuar usando Oxacilina y sus puntos de Continuar usando Oxacilina y sus puntos de corte:corte: S. aureus (S ≤ 2 y R ≥ 4)S. aureus (S ≤ 2 y R ≥ 4) SCoN (S ≤ 0.25 y R ≥ 0.5)SCoN (S ≤ 0.25 y R ≥ 0.5)

En SCoN de Infecciones severas:En SCoN de Infecciones severas: Si MIC =0.5 – 2 Si MIC =0.5 – 2 g/mL – Realizar prueba por g/mL – Realizar prueba por

difusion con Disco Cefoxitina (30 difusion con Disco Cefoxitina (30 g), si la g), si la cepa es sensible a Cefoxitina informar el cepa es sensible a Cefoxitina informar el resultado como S a resultado como S a OXACILINAOXACILINA, no para , no para Cefoxitina.Cefoxitina.

Screen - Difusión de Disco para Resistencia Screen - Difusión de Disco para Resistencia

mediada por gen mediada por gen mecmecA en StaphylococcusA en Staphylococcus::

Cefoxitina zona (mm)

S. aureus y 21* 22**

S. lugdunensis

CoNS 24* 25**

* Reportar como Oxacilina resistente

** Reportar como Oxacilina Susceptible

CoNS: Estafilococos Coagulasa Negativa

M100-S17 (M2, M7); Table 2C

Reporte de Resultados del MIC - Reporte de Resultados del MIC - OxacilinaOxacilina Estafilococos Coagulasa-Estafilococos Coagulasa-

Negativa Negativa **

**Probar con cepas diferentes de Probar con cepas diferentes de S. epidermidisS. epidermidis de sitios estériles de sitios estériles

MIC Oxacilina (g/ml)

0.5 - 2

>=4

ReportarOxacilina Susceptible

RealizarPrueba mecA o PBP 2a

Negativa

Positiva

Reportar Oxacilina Susceptible

ReportarOxacilina Resistente

Reportar Oxacilina Resistente

Reporte de Resultados DD - Reporte de Resultados DD - OxacilinaOxacilina

Estafilococos Coagulasa-Estafilococos Coagulasa-Negativa Negativa **

* Probar con cepas diferentes de S. epidermidis de sitios estériles

Oxacilina zona (mm)

<=17

ReportarOxacilina Susceptible

Realizar La Prueba mecA o PBP 2a

Negativa

Positiva

ReportarOxacilina Susceptible

Reportar Oxacilina Resistente

El Problema - CríticoEl Problema - Crítico

Vancomicina sigue siendo una droga Vancomicina sigue siendo una droga importante por no sólo tratar importante por no sólo tratar Infecciones por Staphylococcus Infecciones por Staphylococcus aureus, Staphylococcus Coagulasa-aureus, Staphylococcus Coagulasa-negativa, Neumococos, y una variedad negativa, Neumococos, y una variedad de otros organismos Gram Positivos.de otros organismos Gram Positivos.

Es Es muy importantemuy importante descubrir la descubrir la Resistencia Emergente a Vancomicina.Resistencia Emergente a Vancomicina.

Criterios de Interpretación de la Criterios de Interpretación de la CLSICLSI Vancomicina y Vancomicina y Staphylococcus sppStaphylococcus spp..

Vancomicina Susceptible Intermedio Resistente

MIC (μg/ml) Disco (30 g)

4

15 mm

8 – 16

ND

32

ND

ND= no definido

VISA VRSA

Criterio 2006 <2 4 - 8 >16

VISA Fenotipo vs. VRSA VISA Fenotipo vs. VRSA GenotipoGenotipo

Las cepasLas cepas VISAVISA representan un frepresentan un fenotipoenotipo que que probablemente resulta de mutaciones en varias vías probablemente resulta de mutaciones en varias vías genéticas, que bajo larga presión con Vancomicina genéticas, que bajo larga presión con Vancomicina produce:produce: Paredes celulares alteradas, Paredes celulares alteradas, Cambios en las vías metabólicas, Cambios en las vías metabólicas, Lento crecimiento.Lento crecimiento.

En las cepasEn las cepas VRSAVRSA hay un cambio en el hay un cambio en el genotipogenotipo donde las cepas adquieren el gen de resistencia donde las cepas adquieren el gen de resistencia vanAvanA, muestra una pequeña perdida de amplitud, y , muestra una pequeña perdida de amplitud, y pueden transferirpueden transferir la resistencia de Vancomicina a la resistencia de Vancomicina a otros organismosotros organismos

QC MICH N J JAPAN

232,000 x Magnificación

Características de la Características de la Pared Celular VISAPared Celular VISA

VISA en Agar SangreVISA en Agar Sangre

Múltiples Tipos de Múltiples Tipos de

ColoniasColonias

Colonias grandes, Colonias pequeñas, que crecen lentamente,

son todas S. aureus mostrando el fenotipo VISA

QC MICH N J JAPAN

Patrón de Crecimiento de Patrón de Crecimiento de VISA –VISA –

Tiras de Etest de Tiras de Etest de VancomicinaVancomicina

Crecimien-to al final de la Elipse

Vanco MIC

(µg/ml) 1.5 8 8 8

Resistencia a Vancomicina – Resistencia a Vancomicina – Enterococcus spp.Enterococcus spp.

Fenotipos más comunes:Fenotipos más comunes: Resistencia AdquiridaResistencia Adquirida

Van A:Van A: Fenotipo de alto nivel de Fenotipo de alto nivel de resistencia a Vancomicina y resistencia a Vancomicina y Teicoplanina.Teicoplanina.

Van B:Van B: Bajo a alto nivel de resistencia Bajo a alto nivel de resistencia solo a Vancomicina.solo a Vancomicina.

Resistencia IntrínsecaResistencia Intrínseca

Van C: Van C: Fenotipo asociado a bajo nivel de Fenotipo asociado a bajo nivel de resistencia a Vancomicina.resistencia a Vancomicina.

Detección VISA en el Detección VISA en el

LaboratorioLaboratorio MICs de Vancomicina de métodos automatizados MICs de Vancomicina de métodos automatizados

están mejorando pero no son perfectos.están mejorando pero no son perfectos. La Prueba de Difusión de Disco de Vancomicina no La Prueba de Difusión de Disco de Vancomicina no

se debe trabajarse debe trabajar Solución:Solución: adicionar Placa de Agar Screen adicionar Placa de Agar Screen

Vancomicina (preferiblemente preparado Vancomicina (preferiblemente preparado comercialmente) por lo menos a Staphylococcus comercialmente) por lo menos a Staphylococcus aureus por métodos manuales o automatizadosaureus por métodos manuales o automatizados

Para Etest, usar un inóculo estándar (0.5 Para Etest, usar un inóculo estándar (0.5 McFarland) y Agar Mueller-Hinton.McFarland) y Agar Mueller-Hinton.

Procedimiento: A. Screen Procedimiento: A. Screen

VancomicinaVancomicina Usar Placas de agar preparado Usar Placas de agar preparado

comercialmentecomercialmente Preparar una suspensión con 4 a 5 colonias Preparar una suspensión con 4 a 5 colonias

en caldo o solución salina a 0.5 McFarland, en caldo o solución salina a 0.5 McFarland, mezclar en vortex.mezclar en vortex.

Usar asa calibrada de 1 o 10-Usar asa calibrada de 1 o 10-µl o pipeta µl o pipeta para inocular en la placa (hasta 6 para inocular en la placa (hasta 6 cepas/placa)cepas/placa)

Procedimiento: A. Screen Procedimiento: A. Screen

VancomicinaVancomicina Dejar que el inóculo se absorba.Dejar que el inóculo se absorba. Invertir las placas e incubar a 35ºC en Invertir las placas e incubar a 35ºC en

ambiente aeróbicoambiente aeróbico Examinar después de 16-18 hrs. de Examinar después de 16-18 hrs. de

incubación; si no hay crecimiento, re-incubación; si no hay crecimiento, re-incubar y examinar 24 horas después.incubar y examinar 24 horas después.

Crecimiento >1 colonia es positivo para Crecimiento >1 colonia es positivo para VISA/VRSAVISA/VRSA

Confirmar identificación; no realizar MIC Confirmar identificación; no realizar MIC automatizadoautomatizado

Función del Lab de Función del Lab de MicrobiologíaMicrobiología

““Cada laboratorio debe tener a un miembro de su Cada laboratorio debe tener a un miembro de su personal con el tiempo, interés, y especialización personal con el tiempo, interés, y especialización para la dirección en las pruebas de susceptibilidad y para la dirección en las pruebas de susceptibilidad y resistencia. resistencia.

Esta persona debe estar leyendo las publicaciones Esta persona debe estar leyendo las publicaciones pertinentes, conectarse una red con otros pertinentes, conectarse una red con otros laboratorios, y evaluar las pruebas potencialmente laboratorios, y evaluar las pruebas potencialmente útiles para descubrir nuevos mecanismos de útiles para descubrir nuevos mecanismos de resistencia antes de que CLSI recomiende nuevas resistencia antes de que CLSI recomiende nuevas pruebas disponiblespruebas disponibles””

Ken Thomson, Emerging Infect. Dis., 2001Ken Thomson, Emerging Infect. Dis., 2001