Producción In vitro de Resveratrol y empleo de Tecnologías de ADN recombinante para la

expresión de la hTOPO I

Estructura química de Resveratrol

• Es un compuesto polifenólico (3,5,4´-trihidroxiestilbeno) encontrado en gran variedad de plantas.

• Está conformado por un doble enlace, lo que significa que existe en dos isoformas, trans-resveratrol y cis-resveratrol.

• El isómero trans- es la forma más estable.

Fuentes naturales de procedencia• Se encuentra en altas concentraciones en la piel de las uvas

tintas, pero también está presente en maníes, moras, piñas y extractos de raíces de Poligonum cuspidatum (Ko-jo-kon).

• La piel de las uvas frescas contiene 50-100 μg/g de Resveratrol aprox.

• Sin embargo, existen varios factores que provocan un aumento en su concentración, por ejemplo, el estrés ambiental debido a la radiación UV, la presencia de metales pesados, como así también, las condiciones ambientales en que fueron crecidas las uvas.

• En vino, las concentraciones de Resveratrol van desde valores mínimos de 0,2 mg/L hasta valores máximos de 10,6 mg/L.

• Hoy en día, mayores niveles de este compuesto son conseguidos mediante técnicas de ingeniería genética.

´Biosíntesis de Resveratrol: Ruta de los fenilpropanoides

Rol biológico de Resveratrol en las plantas

• La producción de varios tipos de fenilpropanoides es inducida tanto por factores abióticos como bióticos, siendo por esto último clasificados como fitoalexinas.

• La resistencia a patógenos combina respuestas defensivas tanto constitutivas como inducidas. En el caso de los estilbenos, en la respuesta se combinan contenidos elevados pre-existentes además de los que son alcanzados luego del ataque microbiano.

• Estos compuestos ejercen diversas funciones en las plantas: antimicrobianas, nematicidas, insecticidas, antifúngicas y deterrentes frente a herbívoros. Además, pueden actuar como aleloquímicos, inhibiendo el desarrollo y la fotosíntesis de plantas aledañas. Esto indica que los estilbenos actúan como señales químicas entre las diversas especies de plantas.

Propiedades terapéuticas de Resveratrol

Desde la identificación de los efectos beneficiosos en la salud relacionados con Resveratrol y dada su gran

abundancia en ciertas plantas y comidas, el descubrimiento de nuevos estilbenos de ocurrencia natural, como así también de análogos modificados químicamente, está

siendo esperado.

Secuestrador de

radicales libres

Actividades antioxidantes Inhibidor de la

agregación plaquetaria

Modulador de la

producción de NO

Inhibidor del

citocromo P450Modulador de

receptores de

estrógeno

Remodelador de

la cromatina

Moderador en la

transducción de señales

Neuroprotector

Preventivo del cáncer

Pero además, Resveratrol cuenta con otra gran cantidad de propiedades quimiopreventivas, entre las que podemos nombrar:

Objetivos

• Establecer la línea celular de Vitis vinífera.

• Obtener la producción In vitro de Resveratrol.

• Obtener derivados químicos de Resveratrol y de trans-estilbeno.

• Lograr la expresión de la enzima Topoisomerasa I humana (hTopo I).

• Evaluar las propiedades antitumorales de los estilbenos comerciales además de los derivados obtenidos químicamente.

Obtención de línea celular deVitis vinífera L.

HOJAS

TALLOS

• Hipoclorito de sodio

• Agua destilada

Desdiferenciación de

los cultivos

Cultivos sumergidos:

obtención de

metabolitos secundarios

Extracción y metilación de medio de

crecimiento, análisis GC

Variedad Red Globe

Preparación de medio Murashige --Skoog (MS)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5

1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0

PATRON DE

RESVERATROL

PATRON +

MEDIO DE

CRECIMIENTO

Toposisomerasa I humana (hTopo I)• La Topoisomerasa humana (hTopo) es una enzima nuclear

que cataliza cambios topológicos en el ADN realizando rupturas transitorias sobre las hebras, las que luego son unidas por la misma enzima.

• Existen dos tipos de Topoisomerasas:

- Topoisomerasa I: provoca la ruptura de una hebra de ADN y luego la une sin utilizar ATP;

- Topoisomerasa II: cataliza la ruptura sobre la doble hebra de ADN; posteriormente la une utilizando ATP.

Por las actividades que desempeñan, las Topoisomerasas

actúan en procesos tales como la replicación, la

transcripción y la recombinación del ADN, es por esto que

se convierten en un blanco excepcional para probar la

eficacia de compuestos con posibles propiedades

antitumorales.

Estructura de la hTopo I• La hTopo I es una proteína de 91 kDa de 765 aa;

estructuralmente puede dividirse en cuatro dominios:

- N-terminal (1-195)

- core (196-651)

- linker (652-691)

- C-terminal (691-751)

Aplicación de Tecnologías de ADN recombinante : Ingeniería Genética

1)Hallar una fuente que me permita aislar el gen de la hTopo I

2)Búsqueda de la secuencia del cDNA para hTopo I

>gi|19913404|ref|NM_003286.2| Homo sapiens topoisomerase (DNA) I (TOP1), mRNA

CAAATGCGAACTTAGGCTGTTACACAACTGCTGGGGTCTGTTCTCGCCGCCCGCCCGGCAGTCAGGCAGCGTCGCCGCCGTGGTAGCAGCCTCAGCCGTTTCTGGAGTCTCGGGCCCACAGTCACCGCCGCTTACCTGCGCCTCCTCGAGCCTCCGGAGTCCCCGTCCGCCCGCACAGGCCGGTTCGCCGTCTGCGTCTCCCCCACGCCGCCTCGCCTGCCGCCGCGCTCGTCCCTCCGGGCCGACATGAGTGGGGACCACCTCCACAACGATTCCCAGATCGAAGCGGATTTCCGATTGAATGATTCTCATAAACACAAAGATAAACACAAAGATCGAGAACACCGGCACAAAGAACACAAGAAGGAGAAGGACCGGGAAAAGTCCAAGCATAGCAACAGTGAACATAAAGATTCTGAAAAGAAACACAAAGAGAAGGAGAAGACCAAACACAAAGATGGAAGCTCAGAAAAGCATAAAGACAAACATAAAGACAGAGACAAGGAAAAACGAAAAGAGGAAAAGGTTCGAGCCTCTGGGGATGCAAAAATAAAGAAGGAGAAGGAAAATGGCTTCTCTAGTCCACCACAAATTAAAGATGAACCTGAAGATGATGGCTATTTTGTTCCTCCTAAAGAGGATATAAAGCCATTAAAGAGACCTCGAGATGAGGATGATGCTGATTATAAACCTAAGAAAATTAAAACAGAAGATACCAAGAAGGAGAAGAAAAGAAAACTAGAAGAAGAAGAGGATGGTAAATTGAAAAAACCCAAGAATAAAGATAAAGATAAAAAAGTTCCTGAGCCAGATAACAAGAAAAAGAAGCCGAAGAAAGAAGAGGAACAGAAGTGGAAATGGTGGGAAGAAGAGCGCTATCCTGAAGGCATCAAGTGGAAATTCCTAGAACATAAAGGTCCAGTATTTGCCCCACCATATGAGCCTCTTCCAGAGAATGTCAAGTTTTATTATGATGGTAAAGTCATGAAGCTGAGCCCCAAAGCAGAGGAAGTAGCTACGTTCTTTGCAAAAATGCTCGACCATGAATATACTACCAAGGAAATATTTAGGAAAAATTTCTTTAAAGACTGGAGAAAGGAAATGACTAATGAAGAGAAGAATATTATCACCAACCTAAGCAAATGTGATTTTACCCAGATGAGCCAGTATTTCAAAGCCCAGACGGAAGCTCGGAAACAGATGAGCAAGGAAGAGAAACTGAAAATCAAAGAGGAGAATGAAAAATTACTGAAAGAATATGGATTCTGTATTATGGATAACCACAAAGAGAGGATTGCTAACTTCAAGATAGAGCCTCCTGGACTTTTCCGTGGCCGCGGCAACCACCCCAAGATGGGCATGCTGAAGAGACGAATCATGCCCGAGGATATAATCATCAACTGTAGCAAAGATGCCAAGGTTCCTTCTCCTCCTCCAGGACATAAGTGGAAAGAAGTCCGGCATGATAACAAGGTTACTTGGCTGGTTTCCTGGACAGAGAACATCCAAGGTTCCATTAAATACATCATGCTTAACCCTAGTTCACGAATCAAGGGTGAGAAGGACTGGCAGAAATACGAGACTGCTCGGCGGCTGAAAAAATGTGTGGACAAGATCCGGAACCAGTATCGAGAAGACTGGAAGTCCAAAGAGATGAAAGTCCGGCAGAGAGCTGTAGCCCTGTACTTCATCGACAAGCTTGCTCTGAGAGCAGGCAATGAAAAGGAGGAAGGAGAAACAGCGGACACTGTGGGCTGCTGCTCACTTCGTGTGGAGCACATCAATCTACACCCAGAGTTGGATGGTCAGGAATATGTGGTAGAGTTTGACTTCCTCGGGAAGGACTCCATCAGATACTATAACAAGGTCCCTGTTGAGAAACGAGTTTTTAAGAACCTACAACTATTTATGGAGAACAAGCAGCCCGAGGATGATCTTTTTGATAGACTCAATACTGGTATTCTGAATAAGCATCTTCAGGATCTCATGGAGGGCTTGACAGCCAAGGTATTCCGTACATACAATGCCTCCATCACGCTACAGCAGCAGCTAAAAGAACTGACAGCCCCGGATGAGAACATCCCAGCGAAGATCCTTTCTTATAACCGTGCCAATCGAGCTGTTGCAATTCTTTGTAACCATCAGAGGGCACCACCAAAAACTTTTGAGAAGTCTATGATGAACTTGCAAACTAAGATTGATGCCAAGAAGGAACAGCTAGCAGATGCCCGGAGAGACCTGAAAAGTGCTAAGGCTGATGCCAAGGTCATGAAGGATGCAAAGACGAAGAAGGTAGTAGAGTCAAAGAAGAAGGCTGTTCAGAGACTGGAGGAACAGTTGATGAAGCTGGAAGTTCAAGCCACAGACCGAGAGGAAAATAAACAGATTGCCCTGGGAACCTCCAAACTCAATTATCTGGACCCTAGGATCACAGTGGCTTGGTGCAAGAAGTGGGGTGTCCCAATTGAGAAGATTTACAACAAAACCCAGCGGGAGAAGTTTGCCTGGGCCATTGACATGGCTGATGAAGACTATGAGTTTTAGCCAGTCTCAAGAGGCAGAGTTCTGTGAAGAGGAACAGTGTGGTTTGGGAAAGATGGATAAACTGAGCCTCACTTGCCCTCGTGCCTGGGGGAGAGAGGCAGCAAGTCTTAACAAACCAACATCTTTGCGAAAAGATAAACCTGGAGATATTATAAGGGAGAGCTGAGCCAGTTGTCCTATGGACAACTTATTTAAAAATATTTCAGATATCAAAATTCTAGCTGTATGATTTGTTTTGAATTTTGTTTTTATTTTCAAGAGGGCAAGTGGATGGGAATTTGTCAGCGTTCTACCAGGCAAATTCACTGTTTCACTGAAATGTTTGGATTCTCTTAGCTACTGTATGCAAAGTCCGATTATATTGGTGCGTTTTTACAGTTAGGGTTTTGCAATAACTTCTATATTTTAATAGAAATAAATTCCTAAACTCCCTTCCCTCTCTCCCATTTCAGGAATTTAAAATTAAGTAGAACAAAAAACCCAGCGCACCTGTTAGAGTCGTCACTCTCTATTGTCATGGGGATCAATTTTCATTAAACTTGAAGCAGTCGTGGCTTTGGCAGTGTTTTGGTTCAGACACCTGTTCACAGAAAAAGCATGATGGGAAAATATTTCCTGACTTGAGTGTTCCTTTTTAAATGTGAATTTTTATTTCTTTTTAATTATTTTAAAATATTTAAACCTTTTTCTTGATCTTAAAGATCGTGTAGATTGGGGTTGGGGAGGGATGAAGGGCGAGTGAATCTAAGGATAATGAAATAATCAGTGACTGAAACCATTTTCCCATCATCCTTTGTTCTGAGCATTCGCTGTACCCTTTAAGATATCCATCTTTTTCTTTTTAACCCTAATCTTTCACTTGAAAGATTTTATTGTATAAAAAGTTTCACAGGTCAATAAACTTAGAGGAAAATGAGTATTTGGTCCAAAAAAAGGAAAAATAATCAAGATTTTAGGGCTTTTATTTTTTCTTTTGTAATTGTGTAAAAAATGGAAAAAAACATAAAAAGCAGAATTTTAATGTGAAGACATTTTTTGCTATAATCATTAGTTTTAGAGGCATTGTTAGTTTAGTGTGTGTGCAGAGTCCATTTCCCACATCTTTCCTCAAGTATCTTCTATTTTTATCATGAATTCCCTTTTAATCAACTGTAGGTTATTTAAAATAAATTCCTACAACTTAATGGAAA

3)Diseño de primers

www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html

4)Amplificación del cDNA de hTopo I

Primers ForwardBam HI

5´- GGA TCC ATG AGT GGG GAC

CAC CTC – 3´

5´- GGA TCC AAA CCC AAG AAT

AAA GAT AAA GAT AAA - 3´

Primers ReverseEco RI

5´ GAA TTC CTA AAA CTC ATA

GTC TTC ATC AGC 3´

5)Clonado en vector de pTrcHis Topo

6)Transformación de bacterias de la cepa TOP10 mediante

el método de shock térmico.

7)Minipreparación de ADN plasmídico (MINIPREP) mediante

el método de lisis alcalina.

8)Digestión con enzimas de restricción para verificar

orientación del fragmento clonado (Bam HI o Eco RI).

P 1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 10

9)Digestión del fragmento con Bam HI + Eco RI.

10)Ligación en alguno de los siguientes vectores de expresión: pRSET A o pGEM-T.

11)Transformación de la cepa BL21 para expresión.

12)Inducción de la expresión utilizando IPTG como inductor.

13)Identificación de la proteína por Western Blot .