Facultad de Qumica C/ Profesor Garca Gonzlez, 1

41071 Sevilla Spain

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PRCTICAS DE BIOQUMICA

DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA VEGETAL

Y BIOLOGIA MOLECULAR

PRCTICA 1.4. AISLAMIENTO Y ANLISIS DE CIDOS NUCLEICOS FUNDAMENTO TEORICO:

El objetivo de esta prctica es extraer DNA total de E. coli tras rotura de las clulas por choque osmtico

y lisis alcalina , seguido de eliminacin del DNA cromosmico para recuperar la fraccin de DNA de plsmidos

y RNA solubles, que se sometern a una electroforesis en gel de agarosa.

PARTE EXPERIMENTAL:

1. Inocular dos cultivos de 50 ml de medio lquido en erlenmeyers de 250 ml conteniendo L-Broth + 100

g/ml ampicilina, uno a partir de una placa original de una cepa de E. coli que contenga algn plsmido

recombinante (ej. plsmido pUC hecho por ingeniera gentica que contiene un trozo de DNA adicional

al suyo propio; p.ej. de una planta) y otro con una cepa con el mismo plsmido pero sin inserto.

Cultivar toda la noche a 37 C en el shaker a 200 rpm.

L-Broth: Para 1 l: 10 g Bacto-Tryptona

5 g Bacto-extracto de levadura

5 g NaCl

Autoclavar

Aadir ampicilina cuando el medio est fro.

2. Centrifugar dos alcuotas de 1,5 ml del cultivo sucesivamente en el mismo tubo eppendorf, escurriendo

bien el sobrenadante en la ltima centrifugacin.

3. Aadir 180 l de solucin I fra (sacarosa 50 mM en Tris HCl 25 mM, pH 8,0 y 10 mM EDTA) y

resuspender el pellet con la punta. Con este paso se consigue romper la pared celular de las bacterias.

4. Aadir 300 l de solucin II (NaOH 0,2 N + SDS 1 %, recin preparada), invertir para mezclar y dejar

exactamente 5 min a 0 C (en hielo). Con este paso se consigue desnaturalizar el DNA. Si el tratamiento

alcalino se prolongase la desnaturalizacin sera irreversible; por eso es fundamental el tiempo. Tras este

paso debe haberse completado la rotura de las clulas por lo que la disolucin debe quedar ms

tranparente; de no ser as quiere decir que no se ha roto bien o hay demasiadas clulas.

5. Aadir 100 l de solucin III fra (Na Ac 3M, pH 5,2) para renaturalizar el DNA plasmdico (consigue

fijar el pH a 7-8). El DNA cromosmico no debe entrar en la fase, por lo que debe seguir

desnaturalizado, quedando como un precipitado mucoso. Agitar 5 s en el vortex y dejar 5 min en hielo.

El NaAc adems de servir para la renaturalizacin del DNA plasmdico, servir despus para ayudar en

la precipitacin del DNA.

6. Centrifugar a 13.000 rpm durante 15 min en fro. Recoger el sobrenadante en otro tubo eppendorf (unos

600 l).

7. Hacer dos extracciones con fenol/cloroformo como sigue:

1. Aadir 0,5 vol. fenol (300 l) y 0,5 vol. cloroformo (300 l de una mezcla cloroformo/isoamlico

24:1) y agitar 30 s en el vortex.

2. Centrifugar 5 min y recuperar la fase acuosa (superior) descartando la interfase.

3. Repetir los pasos anteriores otra vez.

8. Extraccin con cloroformo:

1. Aadir 1 vol. de cloroformo (600 l). Agitar en el vortex 30 s.

2. Centrifugar 5 min y recuperar la fase acuosa.

9. Precipitar con 0,8 vol. isopropanol:

1. Aadir 480 l isopropanol; agitar y dejar 10 min a temperatura ambiente ( toda la noche

a -20C).

2. Centrifugar a 13.000 rpm durante 15 min, descartando el sobrenadante.

3. Lavar el sedimento con 1,0 ml de Etanol al 75 % (en fro) sin necesidad de resuspender. Volver a

centrifugar y descartar el sobrenadante apurando al mximo.

4. Dejar secar el sedimento unos 10 min a temperatura ambiente.

5. Resuspender el sedimento final en 20 l TE (10 mM TRIS pH 8,0 + 1 mM EDTA).

10. Aplicar a un gel de agarosa al 1,2 % en tampn TAE (40 mM Tris-acetate + 1 mM EDTA). Para ello:

1. Para un gel grande: Disolver en autoclave 2,16 g agarosa + 180 ml tampn TAE (100 ml 10 x

TAE + 900 ml agua) (Pasar al punto 11).

(Para un gel pequeo: 0,5 g de agarosa en 50 ml tampn TAE (50 ml 10 x TAE + 450 ml agua)

2. Preparar el gel.

3. Aplicar las muestras aadiendo a cada tubo 3,6 l de 6 x cocktail de muestras con sacarosa (40 %

sacarosa + 0,25 % azul de bromofenol + 50 mM EDTA, pH 8,0)

11. Mientras se prepara el gel, aprovechar para hacer un espectro de absorcin desde 200 a 350 nm,

haciendo uso de 2 l de cada preparacin, y estimar la calidad de la preparacin (a partir de la relacin

de absorbancias a 260 y 280 nm; debe estar en torno a 1,8) y la cantidad de nucleico total (g/ml = A260 x

40). El 5-10 % aprox. de esta cantidad es plsmido, y el resto mayormente RNA. (Volver al punto 10.1).

12. Correr la electroforesis a 20 mA toda la noche junto con marcadores de peso molecular (2 g de

fragmentos de DNA en escalera: 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,65, 0,85, 1, 1,65, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11 y 12

kb) y 1 g de un control de plsmido digerido con una enzima de restriccin (linealizado). El azul de

bromofenol debe alcanzar aproximadamente la mitad del recorrido del gel.

13. Teir el gel con 1 g/ml de bromuro de etidio (30 l de una solucin 10 mg/ml en 300 ml agua) durante

20 min, y desteir el agua durante 30 min.

14. Visualizar en el transiluminador las bandas correspondientes a las diferentes estructuras del plsmido y

hacer un esquema de las mismas especificando a qu se corresponde cada una. El DNA superenrollado,

suele ser la banda de movilidad ms alta; DNA circular, la siguiente, con posibilidad de alguna fraccin

de multmeros y DNA lineal, que seran bandas adicionales. La banda superior de menor movilidad sera

la contaminacin posible con DNA cromosmico. La zona inferior del gel (mayor movilidad

electrofortica) debe tener gran intensidad de tincin y se corresponde con la fraccin de RNA, muy

abundante.. Comprobar cmo las bandas de plsmido tienen menos movilidad que el control del

plsmido sin inserto y sin cortar (lo que quiere decir que realmente deben tener un trozo de DNA

adicional que las haga mayores de tamao y por consiguiente con menor movilidad electrofortica).

Calcular el tamao de la banda (lineal) del plsmido digerido control y plsmido digerido con inserto GS

mediante interpolacin en la representacin del log tamao (kb) frente a la movilidad electrofortica

determinada a partir de la escalera de fragmentos de DNA patrn.

Banda (kb) log Kb (cm)

12

11

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1,6

1

0,85

0,65

0,50

0,40

0,30

0,20

0,10

plsmido digerido

(control)

plsmido digerido (con

inserto GS)