Practicas de bioquimica 2

17/12/08Título de la práctica:Determinación cuantitativa de fosfatasa ácida (FAC)Fundamento de la práctica:Método Hillmann: La fosfatasa ácida a pH 5.0 hidroliza el α-naftilfosfato o fosfato inorgánico a α-naftol.

α-naftilfosfato + H2O FAC α-naftol + fosfato

α-naftol + Fast Red TR Azo Dye El α-naftol se hace reaccionar con un cromógeno diazotado formando un compuesto coloreado con pico de absorción a 405 nm.Materiales:REACTIVOS R 1 Tampón

Citrato sódico pH 5,2 50 mmol/L

R 2 Sustrato

α-Naftil fosfato Fast Red TR

10 mmol/L 6 mmol/L

R 3 Tartrato Tartrato sódico 2 mmol/L

R 4 Ácido acético 0,5 mol/L

Espectrofotómetro o analizador para lecturas a 340 nm. Baño termostatable a 25ºC, 30ºC ó 37ºC (± 0,1ºC) Cubetas de 1,0 cm de paso de luz. Equipamiento habitual de laboratorio. Tubos de plástico Suero o plasma. Estabilidad de la muestra: 7 días a 2-8ºC.

Procedimiento:

1. Preparación del reactivo de trabajo: Disolver (→) un comprimido de R2 Sustrato en un vial de R1. Tapar y mezclar suavemente hasta disolver su contenido. Estabilidad: 2 días a 2-8ºC o 6 horas a temperatura ambiente. R 3 y R 4: Listo para su uso. (R4 Incluido en Ref:1001121). 2. Revisar el programa del fotocolorímetro3. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada o aire.4. Pipetear en una cubeta:

5. Mezclar, incubar 5 minutos. 6. Leer la absorbancia (A) inicial de la muestra, poner en marcha el cronometro y leer la absorbancia cada minuto durante 3 minutos. 7. Calcular el promedio del incremento de absorbancia por minuto (ΔA/min).

FAC Total (T) FAC No Prostática (No P)

RT (mL) 1,0 1,0 R 3 (μL) -- 10

Muestra (μL) 100 100

Resultados:Las absorvancias obtenidas son las siguientes:Abs1= 0,809Abs2= 0,887Abs3= 0,958Abs4=1,030

55,2 U/l de FAC

Delta1= 0,078Delta2=0,071Delta3= 0,071Interpretación clínica de los resultados:Las fosfatasas ácidas son enzima que se encuentran presentes en casi todos los tejidos del organismo, siendo particularmente altas en próstata, estómago, hígado, músculo, bazo, eritrocitos y plaquetas. Niveles elevados de fosfatasas ácidas se encuentra en alteraciones prostáticas como hipertrofia, prostatitis o carcinoma, en enfermedades hematológicas, óseas (enfermedad de Paget) o hepáticas. Niveles bajos de fosfatasa ácida no tiene significado clínico. El diagnostico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

17/12/08Título de la práctica:Determinación cuantitativa de fosfatasa álcalina (ALP)Fundamento de la práctica:La fosfatasa alcalina (FAL) cataliza la hidrólisis del p-nitrofenilfosfato (pNPP) a pH 10,4 liberando p-nitrofenol y fosfato, según la siguiente reacción:

p-Nitrofenilfosfato + H2O ALP p-Nitrofenol + Fosfato La velocidad de formación del p-Nitrofenol, determinado fotométricamente, es proporcional a la concentración catalítica de fosfatasa alcalina en la muestra ensayada1,2.Materiales:REACTIVOS

Espectrofotómetro o analizador para lecturas a 340 nm. Baño termostatable a 25ºC, 30ºC ó 37ºC (± 0,1ºC) Cubetas de 1,0 cm de paso de luz. Equipamiento habitual de laboratorio. Tubos de plástico Suero o plasma. Estabilidad de la muestra: 7 días a 2-8ºC.

Procedimiento:

1. Preparación del reactivo de trabajo:

R 1 Tampón

Dietanolamina (DEA) pH 10,4 Cloruro de magnesio

1 mmol/L 0,5 mmol/L

R 2 Substrato

p-Nitrofenilfosfato (pNPP) 10 mmol/L

Disolver (→) una tableta de R2 Sustrato en un vial de R1 tampón. Tapar y mezclar suavemente hasta disolver su contenido. Estabilidad: 21 días a 2-8ºC o 5 días a temperatura ambiente. 2. Revisar el programa del fotocolorímetro3. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada o aire.4. Pipetear en una cubeta:

RT (mL) 1,2 Muestra (μL) 20



284 U/l de FAC

Delta1= 0,083Delta2=0,093Delta3= 0,082Interpretación clínica de los resultados:Las fosfatasas alcalinas son enzimas que se encuentran presentes en casi todos los tejidos del organismo, siendo particularmente alta en huesos, hígado, placenta, intestinos y riñón. Tanto el aumento como la disminución de los niveles en plasma, tienen significado clínico. Causas más probables de aumento del nivel de FAL: Enfermedad ósea de Paget, obstrucciones hepáticas, hepatitis, hepatotoxicidad por medicamentos y osteomalacia. Causas más probables de disminución del nivel de FAL: Cretinismo y déficit de vitamina C El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

9/1/08Título de la práctica:

Determinación cuantitativa de Lactato deshidrogenasa (LDH)Fundamento de la práctica:La lactato deshidrogenasa (LDH) cataliza la reducción del piruvato por el NADH, según la siguiente reacción: Piruvato + NADH + H+ LDH L-lactato + NAD+

La velocidad de disminución de la concentración de NADH en el medio determinado fotometricamente, es proporcional a la concentración catalítica de LDH en la muestra ensayada.Materiales:REACTIVOS

R 1 Tampón

Imidazol Piruvato

65 mmol/L0,6 mmol/L

R 2 Substrato

NADH 0,18 mmol/L

PREPARACIÓN Reactivo de trabajo (RT): Disolver (→) 1 tableta de R2 en un vial de R1. Tapar y mezclar suavemente hasta disolver su contenido. Estabilidad: 2 días a 2-8ºC o 12 horas a temperatura ambiente (15-25ºC).MATERIAL ADICIONAL

- Espectrofotómetro o analizador para lecturas a 340 nm. - Baño termostatable a 25ºC, 30ºC ó 37ºC (± 0,1ºC) - Cubetas de 1,0 cm de paso de luz. - Equipamiento habitual de laboratorio. Procedimiento:1. Condiciones del ensayo: Longitud de onda: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .340 nm Cubeta:. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 cm paso de luz Temperatura constante . . . . . . . . . . .25ºC / 30ºC / 37ºC 2. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada o aire. 3. Pipetear en una cubeta:

25º - 30ºC 37ºC RT (mL) 3,0 3,0 Muestra (μL) 100 50

4. Mezclar, incubar 1 minuto. 5. Leer la absorbancia (A) inicial de la muestra, poner en marcha el cronómetro y leer la absorbancia cada minuto durante 3 minutos. 6. Calcular el promedio del incremento de absorbancia por minuto (ΔA/min). Resultados:Las absorvancias obtenidas son las siguientes:Abs1= 1,631Abs2= 1,589Abs3= 1,555Abs4=1,525

341 U/l de FAC A 37ºC

VN A 37ºC 230-460 U/l Valores aceptados por el Spintrol 282-408 Interpretación clínica de los resultados:La lactato deshidrogenasa (LDH) es una enzima, distribuida por todo el organismo humano. Las mayores concentraciones de LDH se encuentran en el hígado, corazón, riñón, músculo esquelético y eritrocitos. El nivel de LDH en suero esta elevado en pacientes con enfermedades del hígado, infartos de miocardio, alteraciones renales, distrofias musculares y anemias. El diagnostico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

Título de la práctica:Determinación cuantitativa de Fosfatasa ácida no prostática (FAC no prostática)Fundamento de la práctica:Método Hillmann: La fosfatasa ácida a pH 5.0 hidroliza el α-naftilfosfato o fosfato inorgánico a α-naftol. α-naftilfosfato + H2O FAC α-naftol + fosfato α-naftol + Fast Red TR Azo Dye

El α-naftol se hace reaccionar con un cromógeno diazotado formando un compuesto coloreado con pico de absorción a 405 nm.Materiales:REACTIVOS R 1 Tampón

Citrato sódico pH 5,2 50 mmol/L

R 2 Sustrato

α-Naftil fosfato Fast Red TR

10 mmol/L 6 mmol/L

R 3 Tartrato Tartrato sódico 2 mmol/L

R 4 Ácido acético 0,5 mol/L

PREPARACION - Reactivo de trabajo (RT): Ref: 1001121 Disolver (→) un comprimido de R2 Sustrato en un vial de R1. Ref.: 1001122 Disolver () un comprimido de R2 Sustrato en 15 mL de R1. →Tapar y mezclar suavemente hasta disolver su contenido. Estabilidad: 2 días a 2-8ºC o 6 horas a temperatura ambiente. - R 3 y R 4: Listo para su uso. (R4 Incluido en Ref:1001121).

CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD Todos los componentes del kit son estables, hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, cuando se mantienen los frascos bien cerrados a 2-8ºC, protegidos de la luz y se evita su contaminación. No usar los comprimidos si aparecen fragmentados. No usar reactivos fuera de la fecha indicada. Indicadores de deterioro de los reactivos:

- Presencia de partículas y turbidez. - Absorbancias del Blanco (A) a 405 nm > 0,44.

MATERIAL ADICIONAL - Espectrofotómetro o analizador para lecturas a 405 nm. - Baño termostatable a 30ºC ó 37ºC (± 0,1ºC) - Cubetas de 1,0 cm de paso de luz. - Equipamiento habitual de laboratorio. MUESTRAS Suero. Usar suero libre de partículas y hemólisis, separado de los hematies lo antes posible. No usar plasma. La fosfatasa ácida en suero es muy inestable, estabilizar mediante la adición de 50 μL de ácido acético (R4) por cada mL de muestra. Estabilidad: 7 días a 2-8ºC.Procedimiento:PROCEDIMIENTO

1. Condiciones del ensayo: Longitud de onda: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .405 nm Cubeta:. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 cm paso de luz Temperatura constante . . . . . . . . . . . . . . . .. . . 30ºC / 37ºC 2. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada o aire. 3. Pipetear en una cubeta:

FAC Total (T) FAC No Prostática (No P)

RT (mL) 1,0 1,0 R 3 (μL) -- 10 Muestra (μL) 100 100


Resultados:FAC Total- FAC no prostática= Fac prostática55,2-30,4= 24,8 U/lInterpretación clínica de los resultados:Las fosfatasas ácidas son enzima que se encuentran presentes en casi todos los tejidos del organismo, siendo particularmente altas en próstata, estómago, hígado, músculo, bazo, eritrocitos y plaquetas. Niveles elevados de fosfatasas ácidas se encuentra en alteraciones prostáticas como hipertrofia, prostatitis o carcinoma, en enfermedades hematológicas, óseas (enfermedad de Paget) o hepáticas. Niveles bajos de fosfatasa ácida no tiene significado clínico. El diagnostico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.


Determinación cuantitativa de Creatin quinasa (CK-Total)Fundamento de la práctica:La creatina quinasa (CK) cataliza la transferencia reversible de un grupo fosfato de la fosfocreatina al ADP. Esta reacción se acopla con otras catalizadas por la hexoquinasa (HK) y por la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6F-DH): Fosfocreatina + ADP CK Creatina + ATP

ATP + Glucosa HK ADP + Glucosa-6-fosfato

Glucosa-6-fosfato + NADP+ G6F- DH 6-Fosfogluconato + NADPH + H+

La velocidad de formación de NADPH, determinado fotometricamente, es proporcional a la concentración catalítica de CK en la muestra ensayadaMateriales:REACTIVOS

R 1 Tampón

Imidazol pH 7,0 Glucosa Acetato de magnesio EDTA

100 mmol/L20 mmol/L10 mmol/L 2 mmol/L

R 2 Substrato

ADP AMP di-Adenosina-5- pentafosfato NADP+ Hexoquinasa (HK) Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6F-DH) N-acetilcisteína Fosfato de creatina

2 mmol/L 5 mmol/L

10 mmol/L 2 mmol/L2500 U/L1500 U/L

20 mmol/L 30 mmol/L

PREPARACIÓN Reactivo de trabajo (RT): Ref: 1001050 Disolver (→) una tableta de R 2 en un vial de R 1. Ref: 1001051 Disolver (→) una tableta de R 2 en 15 mL de R 1. Tapar y mezclar suavemente hasta disolver su contenido. Estabilidad: 5 días a 2-8ºC o 24 horas a temperatura ambiente (15-25ºC). CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD Todos los componentes del kit son estables, hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, cuando se mantienen los frascos bien cerrados a 2-8ºC, protegidos de la luz y se evita su contaminación. No usar las tabletas si aparecen fragmentadas. No usar reactivos fuera de la fecha indicada. Indicadores de deterioro de los reactivos: - Presencia de partículas y turbidez. - Absorbancias del Blanco a 340 > 1,60. MATERIAL ADICIONAL - Espectrofotómetro o analizador para lecturas a 340 nm. - Baño termostatable a 25ºC, 30ºC ó 37º C (± 0,1ºC). - Cubetas de 1,0 cm de paso de luz. - Equipamiento habitual de laboratorio. MUESTRAS Suero o plasma. Estabilidad: 7 días a 2-8ºC, protegida de la luz. La actividad de la creatin quinasa disminuye un 10% tras 1 día a 2-5ºC ó tras 1 hora a 15-25ªC.Procedimiento:

1. Condiciones del ensayo:

Longitud de onda: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .340 nm Cubeta:. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 cm paso de luz Temperatura constante . . . . . . . . . . .25ºC / 30ºC / 37ºC 2. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada o aire. 3. Pipetear en una cubeta:

25-30ºC

37ºC

RT (mL) 1,0 1,0 Muestra (μL) 40 20

4. Mezclar, incubar 2 minutos. 5. Leer la absorbancia (A) inicial de la muestra, poner en marcha el cronometro y leer la absorbancia cada minuto durante 3 minutos. 6. Calcular el promedio del incremento de absorbancia por minuto (ΔA/min). Resultados:Las absorvancias obtenidas han sido las siguientes:Abs1: 0,838Abs2: 0,850Abs3: 0,879Abs4:0,908

Delta1:0,012Delta2:0,029Delta3: 0,029Concentración: 191U/l.VN= 378-542 El valor no está dentro de los valores normales. La causa es que está caducado Interpretación clínica de los resultados:La creatina quinasa es una enzima intracelular, distribuida por todo el organismo humano. Su función fisiológica esta asociada con la adenosina trifosfato (ATP) producida cuando el músculo se contrae. El nivel de CK en suero esta elevado en pacientes con alteraciones del músculo esquelético y en infartos de miocardio. El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

12/1/09Título de la práctica:Determinación cuantitativa de Creatin quinasa (CK-Total)Fundamento de la práctica:La creatina quinasa (CK) cataliza la transferencia reversible de un grupo fosfato de la fosfocreatina al ADP. Esta reacción se acopla con otras catalizadas por la hexoquinasa (HK) y por la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6F-DH): Fosfocreatina + ADP CK Creatina + ATP


Glucosa-6-fosfato + NADP+ G6F- DH 6-Fosfogluconato + NADPH + H+

La velocidad de formación de NADPH, determinado fotometricamente, es proporcional a la concentración catalítica de CK en la muestra ensayadaMateriales:REACTIVOS

R 1 Tampón

Imidazol pH 7,0 Glucosa Acetato de magnesio EDTA

100 mmol/L20 mmol/L10 mmol/L 2 mmol/L

R 2 Substrato

ADP AMP di-Adenosina-5- pentafosfato NADP+ Hexoquinasa (HK) Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6F-DH) N-acetilcisteína Fosfato de creatina

2 mmol/L 5 mmol/L

10 mmol/L 2 mmol/L2500 U/L1500 U/L

20 mmol/L 30 mmol/L

PREPARACIÓN Reactivo de trabajo (RT): Ref: 1001050 Disolver (→) una tableta de R 2 en un vial de R 1. Ref: 1001051 Disolver (→) una tableta de R 2 en 15 mL de R 1. Tapar y mezclar suavemente hasta disolver su contenido. Estabilidad: 5 días a 2-8ºC o 24 horas a temperatura ambiente (15-25ºC). CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD Todos los componentes del kit son estables, hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, cuando se mantienen los frascos bien cerrados a 2-8ºC, protegidos de la luz y se evita su contaminación. No usar las tabletas si aparecen fragmentadas. No usar reactivos fuera de la fecha indicada. Indicadores de deterioro de los reactivos: - Presencia de partículas y turbidez. - Absorbancias del Blanco a 340 > 1,60. MATERIAL ADICIONAL - Espectrofotómetro o analizador para lecturas a 340 nm. - Baño termostatable a 25ºC, 30ºC ó 37º C (± 0,1ºC). - Cubetas de 1,0 cm de paso de luz. - Equipamiento habitual de laboratorio. MUESTRAS Suero o plasma. Estabilidad: 7 días a 2-8ºC, protegida de la luz. La actividad de la creatin quinasa disminuye un 10% tras 1 día a 2-5ºC ó tras 1 hora a 15-25ªC.Procedimiento:

1. Condiciones del ensayo: Longitud de onda: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .340 nm Cubeta:. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 cm paso de luz Temperatura constante . . . . . . . . . . .25ºC / 30ºC / 37ºC 2. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada o aire. 3. Pipetear en una cubeta:

25-30ºC

37ºC

RT (mL) 1,0 1,0 Muestra (μL) 40 20

4. Mezclar, incubar 2 minutos. 5. Leer la absorbancia (A) inicial de la muestra, poner en marcha el cronometro y leer la absorbancia cada minuto durante 3 minutos. 6. Calcular el promedio del incremento de absorbancia por minuto (ΔA/min). Resultados:Las absorvancias obtenidas han sido las siguientes:Abs1: 0,838Abs2: 0,850Abs3: 0,879Abs4:0,908

Delta1:0,012Delta2:0,029Delta3: 0,029Concentración: 191U/l.VN= 378-542 El valor no está dentro de los valores normales. La causa es que está caducado Interpretación clínica de los resultados:La creatina quinasa es una enzima intracelular, distribuida por todo el organismo humano. Su función fisiológica esta asociada con la adenosina trifosfato (ATP) producida cuando el músculo se contrae. El nivel de CK en suero esta elevado en pacientes con alteraciones del músculo esquelético y en infartos de miocardio. El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

12/1/09Título de la práctica:Determinación cuantitativa de Creatin quinasa CK-MB (CK-MB)Fundamento de la práctica:El anticuerpo anti CK-M inhibe completamente la actividad de la CK-MM y la subunidad (M) de la CK-MB. La actividad de la CK-B no inhibida se determina según la siguientes reacciones:

Fosfocreatina + ADP CK Creatina + ATP


Glucosa-6-fosfato + NADP+ G6F-DH 6-Fosfogluconato + NADPH + H+

La velocidad de formación de NADPH, determinado fotometricamente, es proporcional a la concentración catalítica de CK-B en la muestra ensayada CK HK DHF6G

Materiales:REACTIVOS R 1 Tampón Imidazol pH 6,7 100 mmol/L 20

Glucosa Acetato de magnesio EDTA

mmol/L 10 mmol/L 2 mmol/L

R 2 Anti CK-M *Anti CK-M ADP AMP di-Adenosina-5- pentafosfato NADP+ Hexoquinasa (HK) Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6F-DH) N-acetilcisteína Fosfato de creatina

2000 U/L 2 mmol/L 5 mmol/L 10 mmol/L 2 mmol/L 2500 U/L 1500 U/L 20 mmol/L 30 mmol/L

*Anti CK-M suficiente para inhibir hasta 2000 U/L de CK – MM Opcional CK-Nac / CK-MB CONTROL

Suero humano liofilizado

Ref: 1002260

PRECAUCIONES CK-NAC / CK-MB CONTROL Todos los componentes de origen humano han resultado ser negativos para el antígeno HBs, HCV y para el anti-HIV (1/2). Sin embargo, deben tratarse con precaución como potencialmente infecciosos. PREPARACIÓN - Reactivo de trabajo (RT) Disolver (→) una tableta de R 2 en un vial de R 1. Tapar el vial y mezclar suavemente hasta disolver su contenido. Estabilidad: 8 días a 2-8ºC o 24 horas a 15-25ºC. - CK-Nac / CK-MB CONTROL Reconstituir (→) el contenido de un vial con 2 mL de agua destilada. Tapar el vial y mezclar suavemente hasta disolver su contenido. Estabilidad: 3 días a 2-8ºC o 4 semanas a -25ºC – -15ºC. CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD Todos los componentes del kit son estables, hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, cuando se mantienen los frascos bien cerrados a 2-8ºC, protegidos de la luz y se evita su contaminación. No usar las tabletas si aparecen fragmentadas. No usar reactivos fuera de la fecha indicada. Indicadores de deterioro de los reactivos: - Presencia de partículas y turbidez. - Absorbancias (A) del Blanco a 340 > 1,60. MATERIAL ADICIONAL - Espectrofotómetro o analizador para lecturas a 340 nm. - Baño termostatable a 25ºC, 30ºC ó 37ºC ( 0,1ºC) - Cubetas de 1,0 cm de paso de luz. - Equipamiento habitual de laboratorio. MUESTRAS Suero o plasma. Estabilidad: 7 días a 2-8ºC, protegida de la luz. La actividad de la CK-MB en el suero disminuye un 10% tras 24 horas a 4ºC o tras 1 hora a 25ºC.Procedimiento:1. Condiciones del ensayo: Longitud de onda: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . 340 nm Cubeta:. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . .1 cm paso de luz Temperatura constante . . . . . . . . . . . . . . . 25ºC / 30ºC / 37ºC 2. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada o aire. 3. Pipetear en una cubeta: RT (mL) 1,0 Muestra (L)

40

4. Mezclar. Incubar 10 minutos. 5. Leer la absorbancia (A1) inicial de la muestra, poner en marcha el cronometro y leer la absorbancia de nuevo a los 5 minutos (A2). 6. Calcular la diferencia de absorbancias: A= A2 – A1 . Resultados:

Se inhibe la fracción M y queda la B (50% cardíaca). Realmente se mide la CK-B que es la mitad de la CK-MB cardíaca.Abs1:0,682Abs2:0,717Concentración: 576U/l.

Interpretación clínica de los resultados:La CK-MB es una enzima compuesta de dos subunidades, la subunidad M expresada en el músculo y la subunidad B, expresada en las células nerviosas. La CK-MB se encuentra en el suero en concentraciones bajas, se incrementa como consecuencia de un infarto de miocardio y después desciende a niveles normales. Puede incrementarse, más raramente, en traumatismos del músculo esquelético. El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.


Estudio completo del semen (ahora se irá mencionando cada una de las técnicas utilizadas, a continuación se mostrarán los resultados y las fotografías de todas las muestras de semen analizadas en el aula).

Título de la práctica:Examen macroscópicoMaterialTubo graduadoPipeta Pasteur, chupete.Papel indicador universal de pHProcedimiento:Los parámetros que se van a estudiar varían con el tiempo, por lo cual deberán valorarse a la recepción de la muestra del mismo modo que la motilidad.

Licuefacción. Al recibir la muestra generalmente se ha completado. Volumen . Se mide vaciando la muestra completamente en un tubo de centrífuga graduado y leyendo directamente el volumen ocupado por la misma.Viscosidad. Se evalúa introduciendo la punta de una pipeta Pasteur en la muestra y observando la longitud del filamento que se forma al retirarla. Si este excede los 2 cm de longitud, la viscosidad está aumentada. También puede apreciarse cuando se vierte el semen desde el recipiente de recogida al tubo graduado observando si cae gota a gota, en cuyo caso será normal.Aspecto y color.

pH . Se realiza con papel indicador, introduciendo un fragmento en la muestra y comparando con la escala de colores,Aglutinación espontanea de los espermatozoides, Se observa la presencia de aglutinación visible.

Título de la práctica:Estudio de la movilidad en cámara de contaje MaterialCámarasPipetasPortaobjetos, cubreobjetos Tampón PBS (Si se requiere) MicroscopioTécnicaLa muestra debe estar totalmente licuada (dejar unos 30 minutos a temperatura ambiente) luego mezclar bien.Preparación de la muestra.

Colocar 10u1 de muestra entre porta y cubreobjetos para observar la concentración espermática y ver si se precisa diluir la muestra.

Si la concentración espermática estimada es muy elevada, diluir con PBS, agitar la mezcla y anotar la dilución efectuada (vol. muestra : vol. PBS). Las diluciones más usuales son:

50:50 50:20050:100 50:25050:150 50:300.

Si la concentración de espermatozoides es muy baja (1 o 2 espermatozoides por campo) se colocan 500 μL de la muestra en un Eppendorf y se centrifuga a 3500 RPM 5 minutos. Se decanta el sobrenadante y se homogeneiza el botón celular.Llenado de la cámara.

Depositar 5 μL de muestra licuada en las zonas de carga (1 ó 2) de la cámara. Permitir el llenado por capilaridad. Retirar el exceso de muestra de la zona de carga después de haberse llenado totalmente la cámara. La muestra esta lista para el análisis 10 segundos después del llenado y permanece estable al menos 30 minutos a temperatura ambiente.

Determinación de la motilidad Contar los espermatozoides móviles N1 de las celdillas y registrar ese número Contar en las mismas celdillas sólo los espermatozoides inmóviles N2. Sumar el número de móviles e inmóviles para obtener el valor N (n° espermatozoides contados)

% de motilidad (M) = (N1 / N ) x 100También debe hacerse un estudio cualitativo de la motilidad clasificando los espermatozoides móviles según presenten movilidad activa (avanzan) o pasiva (se mueven pero no avanzan).

Título de la práctica:Test de la vitalidadFundamentoEsta técnica consiste en añadir a la muestra de semen eosina, sólo los espermatozoides muertos se colorean debido a la alteración de su membrana que la hace permeable al colorante, mientras que los vivos permanecerán sin teñir. Opcionalmente puede añadirse nigrosina que proporcionará el contraste adecuado para facilitar la observación. (Técnica de Williams — Pollack)

MaterialPortaobjetosExtensoresTubo EpendorffPipetas Pasteur, chupetesMicroscopioReactivosEosina al 0, 5% en suero fisiológicoNigrosina al 0,10% en suero fisiológicoAceite de inmersiónTécnica

Se coloca en un Ependorff una gota de líquido seminal y una gota de eosina. Se mezcla y se espera 1 minuto. .

Se añade una gota de solución de nigrosina . Se homogeneiza y se espera 1 minuto.

Se extiende la muestra con ayuda de un extensor haciendo un frotis fino. Se deja secar y se observa con objetivo de inmersión o con 40x. Se observan

varios campos microscópicos y se realiza un recuento sobre 100 espermatozoides teniendo en cuenta que:

Rojos espermatozoides vivosBlancos Espermatozoides muertos

Título de la práctica:Recuento de espermatozoides en cámara CellvisionFundamentoEl cálculo del número de espermatozoides en la muestra seminal puede realizarse de forma automática con contadores electrónicos o manualmente. El método manual es similar al recuento de células sanguíneas y consiste en que después de la licuefacción del semen, los espermatozoides pueden contarse en un hemocitómetro tras la dilución inicial de la muestra.MaterialCámara de Neubauer o CelivisionPipeta cuentaglóbulos, boquilla, tubo aspiración. Placa PetriMicroscopioCubeta linfáticaTécnicaLa muestra debe estar totalmente licuada.

Llenado de la cámara. Depositar 5 μL de muestra licuada ,diluida o no, en las zonas de carga (1 ó 2) de la cámara Permitir el llenado por capilaridad. Retirar el exceso de muestra de la zona de carga después de haberse llenado totalmente la cámara. La muestra esta lista para el análisis 10 segundos después del llenado y permanece estable al menos 30 minutos a temperatura ambiente.

Cálculo de la concentración Seleccionar aleatoriamente un campo para el análisis que esté cerca del centro de la placa. Contar los espermatozoides y el número de celdillas contadas . Anotar ambos datos. Se recomienda contar de 100 a 200. Hay que tener en cuenta que la seguridad para la determinación de la concentración es proporcional al número de celdillas contadas. Obtener la media del n° de espermatozoides por celdilla

Aplicar la fórmula:Concentración de espermatozoides ( C )= N x F (millones/ml)

N=nº de espermatozoidesF= factor de calibrado obtenido anteriormente para es microscopio y objetivo

Título de la práctica:Fórmula espermática (Espermiocitograma)FundamentoEl conocimiento de las características morfológicas de los espermatozoides es fundamental para valorar el potencial fecundativo de una muestra, junto con el número total de espermios y su motricidad. La morfología del espermatozoide se valora mediante recuentos diferenciales de los tipos de espermatozoides morfológicamente normales y anormales en extensiones teñidas. También se observan las células de espermiogénesis que pueden aparecer.MaterialPortaobjetos y cubreobjetosExtensoresMicroscopioReactivosAlcohol metilicoSolución de May GrumwaldSolución de GiemsaAgua de phi 7,2 Aceite de inmersiónTécnica

Extensión de la muestra. Sobre un portaobjetos de forma similar a la de un frotis sanguíneo. Si el recuento es bajo, se hará una extensión más gruesa que asegure suficientes formas para el recuento Fijación, Se cúbre la extensión con alcohol metílico durante 5 minutos, renovando el alcohol, fuera necesario y se deja secar al aire o en estufa a 37 °C. Tinción. May Grumwald-Giemsa (examen de rutina)

Cubrir la preparación con solución May-Grümwald durante 4 minutos.Diluir con la misma cantidad de gotas de agua de pH 7,2 durante 4 minutos.Decantar y lavar con agua destilada suavemente.

Cubrir la extensión con una dilución de Giemsa diluido (3 gotas de colorante por ml. de agua de pH 7,2) durante 12 minutosLavarDejar secar al airé.• Observación Se deben estudiar con el objetivo de inmersión al menos 200 espermatozoides y registrar el porcentaje de formas anormales encontradas de cada tipo. Además, se observará la presencia de hematíes, leucocitos y células espermáticas.Resultados obtenidosInformeSe registran los porcentajes de espermatozoides normales y anormales, y dentro de estos últimos se especifica el tipo de anomalía encontrada y su proporción (anomalías en cabeza, cuello y cola). También se informa de la presencia de células de espermiogénesis y teratógenas, células sanguíneas, de descamación y de cualquier otro tipo que se puedan observar

A continuación se expresan todos los resultados obtenidos en tablas, cada tabla corresponde a una de las técnicas descritas anteriormente:

Examen macroscópico:Nº Muestra

Licuefacción (completa o

no)

Volumen Color Viscosidad Filancia pH

140101 totalmente 3 ml. blanquecino Gota a gota

Normal 8-9

190101 totalmente 2,4 ml. blanquecino Gota a gota

Normal 8-9

190102 totalmente 2,5 ml. Blanco-gris Poca No presenta

9

210101 totalmente 2,7 ml. blanquecino Poca No presenta

8

260101 totalmente 2,4 ml. blanco aumentada Normal 8

020201 totalmente 2 ml. blanquecino normal Menos de 1 cm.

8

MovilidadNº Muestra

A B C D

140101 24% 6% 10% 60%

190101 93% 3% 0% 4%

190102 71% 17% 4% 8%

210101 79% 11% 5% 5%

260101 68% 17% 7% 8%

020201 72% 14%. 8% 6%

Test de vitalidadNº Muestra Vivos Muertos

140101 62% 38%

190101 73% 27%

190102 65% 35%

210101 80% 20%

260101 87% 13%

020201 77% 23%.

Recuento de espermatozoides en cámaraNº Muestra Recuento

140101 28.500.000

190101 2.700.000

190102 48.300.000

210101 58.500.000

260101 98.300.000

020201 109.600.000

Fórmula espermáticaNº Muestra

Normales A. cabeza

A. Segmento

A. Cola

140101 75% 15% 3% 7%

190101 92% 5% 1% 2%

190102 84% 12% 4% 0%

210101 81% 11% 5% 3%

260101 88% 10% 2% 0%

020201 95% 4%. 1% 0%

A continuación se presentan algunas fotografías tomadas en el aula de las muestras de semen analizadas:Muestra 140101:

Muestra 190101 y 190102:

Muestra 210101:

Fotos semen 260101:

Muestra de semen 020201:

30/01/09Título de la práctica:Determinación cuantitativa de fosfatasa ácida (FAC)Fundamento de la práctica:La α-amilasa hidroliza el 2-cloro-4-nitrofenil-α-D-maltotriósido (CNPG3) a 2-cloro-4-nitrofenol (CNP) y forma 2-cloro-4-nitrofenil-α-D-maltoside (CNPG2), maltotriosa (G3) y glucosa (G), según la siguiente reacción: 10 CNPG3 Amilasa 9 CNP + 1 CNPG2 + G3 + G

La velocidad de formación de 2-cloro-4-nitrofenol, determinado fotométricamente, es proporcional a la concentración catalítica de α-amilasa en la muestra ensayada.Materiales:REACTIVOS

R

MES pH 6,0 CNPG3 Cloruro sódico Acetato cálcico Tiocianato potásico Ácida sódica

100 mmol/L2,25 mmol/L350 mmol/L

6 mmol/L900 mmol/L

0,95 gr/L

PREPARACIÓN Reactivo listo para su uso. CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD

Todos los componentes del kit son estables, hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, cuando se mantienen los frascos bien cerrados a 2-8ºC, protegidos de la luz y se evita su contaminación. No usar reactivos fuera de la fecha indicada. Una vez abierto el reactivo es estable 60 días, si se cierra inmediatamente después de su uso y se conserva a 2-8ºC. Indicadores de deterioro de los reactivos: - Presencia de partículas y turbidez. - Absorbancias del Blanco a 405 > 0,50. MATERIAL ADICIONAL - Espectrofotómetro o analizador para lecturas a 405 nm. - Baño termostatable a 37ºC (Nota 1). - Cubetas de 1,0 cm de paso de luz. - Equipamiento habitual de laboratorio(Nota 2). MUESTRAS - Suero o plasma, separado lo antes posible de los hematies. Como anticoagulante se recomienda la heparina. - Orina, ajustar el pH aproximadamente a 7,0 antes de conservar. Estabilidad: 1 mes a 2-8ºC.Procedimiento:1. Condiciones del ensayo: Longitud de onda: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .405 nm Cubeta:. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 cm paso de luz Temperatura constante . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37ºC 2. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada. 3. Pipetear en una cubeta:

Suero o plasma Orina R (mL) 1,0 1,0 Muestra (μL)

20 10

4. Mezclar, incubar 30 segundos. 5. Leer la absorbancia (A) inicial de la muestra, poner en marcha el cronometro y leer la absorbancia cada minuto durante 3 minutos. 6. Calcular el promedio del incremento de absorbancia por minuto (ΔA/min).


Delta1= 0,025Delta2=0,032Delta3=0,023

Concentración= 105 U/l

Rango de Spintrol: 154-220

Interpretación clínica de los resultados:La α-amilasa (AMS) es una enzima que ayuda a digerir el glucógeno y el almidón. Se produce principalmente en las glándulas salivales y el páncreas exocrino. Su determinación se realiza principalmente para diagnosticar o controlar enfermedades del páncreas como pancreatitis crónica o aguda. Puede reflejar también enfermedad de la vesícula biliar, algunos problemas gastrointestinales y otros trastornos. El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

30/01/09Título de la práctica:Determinación cuantitativa de bilirrubinaFundamento de la práctica:La bilirrubina se convierte en azobilirrubina mediante el ácido sulfanílico diazotado midiéndose fotométricamente. De las dos fracciones presentes en suero, bilirrubin-glucurónido y bilirrubina libre ligada a la albúmina, sólo la primera reacciona en medio acuoso (bilirrubina directa) precisando la segunda la solubilización con cafeína para que reaccione (bilirrubina indirecta). En la determinación de la bilirrubina indirecta se determina también la directa, correspondiendo el resultado a la bilirrubina total. La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de bilirrubina presente en la muestra ensayada.Materiales:REACTIVOS

R 1 Ácido sulfanílico Ácido clorhídrico

30 mmol/L400 mmol/L

R 2 Sodio nitrito 50 mmol/LR 3 Cafeína 100 mmol/LOpcional BILIRUBIN CAL Ref:1002250

PREPARACIÓN Todos los reactivos están listos para su uso.

CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD Todos los componentes del kit son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del vial, cuando se mantienen los viales bien cerrados a 2-8ºC, protegidos de la luz y se evita la contaminación durante su uso. No usar reactivos fuera de la fecha indicada. Indicadores de deterioro de los reactivos: - Presencia de partículas y turbidez. - Desarrollo de color en el R 2. MATERIAL ADICIONAL - Espectrofotómetro o analizador con cubeta para lecturas a 540 nm. - Cubetas de 1,0 cm de paso de luz. - Equipamiento habitual de laboratorio. MUESTRAS Suero o plasma libre de hemólisis. Proteger de la luz. Estabilidad de la muestra: 4 días a 2-8ºC o 2 meses a –20ºC.

Procedimiento:1. Condiciones del ensayo: Longitud de onda: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 540 nm Cubeta:. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. .1 cm paso de luz Temperatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15-25ºC 2. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada. 3. Pipetear en una cubeta:

B. Total B. Directa Blanco R 1 (μL) 200 200 200 R 2 (gotas) 1 1 -- ClNa 9 g/L (mL) -- 2,0 2,0 R 3 (mL) 2,0 -- -- muestra / Calibrador (μL)

200 200 200

4. Mezclar e incubar exactamente 5 minutos a 15-25ºC. 5. Leer la absorbancia (A). Resultados:

Concentración día 4/2= 1,67 mg/dl.Concentración día 6/2 (suero patológico)= 1,67 mg/dl VN hasta 2,8 mg/dlConcentración día 11/2=1,29 mg/dl.Rango de Spintrol Normal= 1,33-1.91 mg/dl.

Interpretación clínica de los resultados:La bilirrubina se origina por la degradación de la hemoglobina. Es transportada del bazo al hígado y se excreta en la bilis. La hiperbilirrubinemia es el resultado de un incremento de la bilirrubina en plasma. Causas más probables de la hiperbilirrubinemia: Bilirrubina Total: Aumento de la hemólisis, alteraciones genéticas, anemia neonatal, alteraciones eritropoyéticas, presencia de drogas. Bilirrubina Directa: Colestasis hepática, alteraciones genéticas y alteraciones hepáticas.

El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

16/2/09

Título de la práctica:Determinación cuantitativa de urea

Fundamento de la práctica:La ureasa cataliza la hidrólisis de la urea, presente en la muestra, en amoníaco (NH3) y anhídrido carbónico (CO2). El amoníaco formado se incorpora al α-cetoglutarato por acción de la glutamato deshidrogenasa (GLDH) con oxidación paralela de NADH a NAD+: Urea + H2O + 2 H+ Ureasa 2 NH3 + CO2

2 NH3 + α-Cetoglutarato + NADH GLDH H2O + NAD+ + L-Glutamato

La disminución de la concentración de NAD+ en el medio es proporcional a la concentración de urea de la muestra ensayada-

Materiales:

R 1 Tampón TRIS pH 7,8 α-Cetoglutarato

80 mmol/L 6 mmol/L

R 2 Enzimas Ureasa Glutamato deshidrogenasa (GLDH) NADH

3750 U/L 6000 U/L 0,32 mmol/L

UREA CAL Patrón primario acuoso de Urea 50 mg/dL

Espectrofotómetro o analizador para lecturas a 505 nm. Cubetas de 1,0 cm de paso de luz. Micropipetas (10-1.000 μl.) Tubos de plástico Suero o plasma heparinizado: No usar sales de amonio o fluoruro como

anticoagulantes. Orina: Diluir la muestra al 1/50 con agua destilada. Mezclar. Multiplicar el

resultado obtenido por 50 (factor de dilución); Evitar el crecimiento bacteriano, manteniendo el pH < 4.

La urea es estable 5 días a 2-8ºC.

Procedimiento:1. Revisar la programación en el fotocolorímetro.2. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a aIire. 3. Pipetear en una cubeta:

Blanco Patrón Muestra R (mL) 1,0 1,0 1,0 Patrón (μL)

-- 10 --

Muestra (μL)

-- -- 10

4. Mezclar y leer las absorbancias a los 30 s (A1) y a los 90 s (A2). Resultados:Se ha obtenido un valor de 151 mg/dl.Los valores del spintrol aceptados van entre 111-153 mg/dl.

Interpretación clínica de los resultados:La urea es el resultado final del metabolismo de las proteínas; se forma en el hígado a partir de su destrucción. Puede aparecer la urea elevada en sangre (uremia) en dietas con exceso de proteínas, enfermedades renales, insuficiencia cardiaca, hemorragias gástricas, hipovolemia y obstrucciones renales. El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.Valores normales:Suero: de 15 a 45 mg/dL (2.49-7.49 mmol/L)

Orina: de 20 a 35 gr/24 horas Estos valores son orientativos.

La técnica se ha realizado correctamente y los resultaos obtenidos son fiables.

Título de la práctica:Determinación cuantitativa de ácido úricoFundamento de la práctica:El ácido úrico es oxidado por la uricasa a alantoína y peróxido de hidrógeno (2H2O2) que en presencia de peroxidasa (POD), 4-aminofenazona (4-AF) y 2-4 Diclorofenol Sulfonato (DCPS) forma un compuesto rosáceo:

Ácido úrico + 2H2O + O2 Uricasa Alantoína + CO2 + 2H2O2

2H2O2 + 4-AF + DCPS POD Quinonaimina + 4H2O

La intensidad de quinonaimina roja formada es proporcional a la concentración de ácido úrico presente en la muestra ensayadaMateriales:

ReactivoR 1 Tampón Fosfatos pH 7,4 2-4

Diclorofenol Sulfonato (DCPS)

50 mmol/L 4 mmol/L

R 2 Enzimas Uricasa Peroxidasa (POD) Ascorbato oxidasa 4 - Aminofenazona (4-AF)

60 U/L 660 U/L 200 U/L 1 mmol/L

URIC ACID CAL Patrón primario acuoso de Ácido úrico 6 mg/dL

Cubetas de 1,0 cm de paso de luz. Equipamiento habitual de laboratorio. Tubos de plástico Suero o plasma1: Estabilidad 3-5 días a 2-8ºC y 6 meses a –20ºC. Orina (24 h): Estabilidad 3 días a temperatura ambiente a pH > 8. Diluir la

muestra al 1/50 en agua destilada. Mezclar. Multiplicar el resultado obtenido por 50 (factor de dilución); Si la muestra es turbia, calentarla a 60ºC 10 min. para disolver los precipitados de urato y ácido úrico. No refrigerar.

Procedimiento:1. Revisar el programa del fotocolorímetro2. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada. 3. Pipetear en una cubeta:

Blanco Patrón Muestra RT (mL) 1,0 1,0 1,0 Patrón (L) -- 25 -- Muestra (L) -- -- 25

4. Mezclar e incubar 5 minutos a 37ºC o 10 min. a temperatura ambiente. 5. Leer la absorbancia (A) del Patrón y la muestra, frente al Blanco de

reactivo. El color es estable como mínimo 30 minutos.

Resultados:

Se obtuvo un resultado de 5,16 mg/dl en suero normal, el rango de valores que ofrece la marca es de 4,02- 5,42 mg/dl. Por lo tanto el resultado obtenido está dentro de esos límites.

Interpretación clínica de los resultados:El ácido úrico y sus sales son el producto final del metabolismo de las purinas. En una insuficiencia renal progresiva hay una retención en sangre de

urea, creatinina y ácido úrico. Niveles altos de ácido úrico son indicativos de patología renal y generalmente se asocia con la gota. El diagnostico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.Los valores considerados como normales para este parámetro por spinreact son:

Suero o plasma: Mujeres 2,5 - 6,8 mg/dL 149 – 405

mol/L Hombres 3,6 - 7,7 mg/dL 214 – 458

mol/L Orina: 250 - 750 mg/24 h 1,49 -

4,5 mmol/24 h

11 y 16 de eneroTítulo de la práctica:Determinación cuantitativa de creatininaFundamento de la práctica:El ensayo de la creatinina esta basado en la reacción de la creatinina con el picrato alcalino descrito por Jaffé. La creatinina reacciona con el picrato alcalino formando un complejo rojizo. El intervalo de tiempo escogido para las lecturas permite eliminar gran parte de las interferencias conocidas del método. La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de creatinina en la muestra ensayada

Materiales:REACTIVOS R 1 Reactivo Pícrico Ácido pícrico 17,5 mmol/L

R 2 Reactivo Alcalinizante

Hidróxido sódico 0,29 mol/L

CREATININE CAL Patrón primario acuoso de Creatinina 2 mg/dL

PRECAUCIONES R1(Ácido pícrico):Corrosivo (C): R35: Provoca quemaduras graves. R2(NaOH): Irritante (Xi): R36/38: Irrita ojos y la piel. S26: En caso de contacto con los ojos, lavar de inmediato con abundante agua y acudir al medico. S37/39: Usar guantes adecuados y proteger cara y ojos. S45: En caso de accidente o malestar, acudir inmediatamente al médico. PREPARACIÓN Reactivo de trabajo (RT): Mezclar volúmenes iguales de R 1 Reactivo Pícrico y de R 2 Reactivo Alcalinizante. Estabilidad del reactivo de trabajo: 10 días a 15-25ºC.

CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD Todos los componentes del kit son estables, hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, cuando se mantienen los frascos bien cerrados a 2-8ºC, protegidos de la luz y se evita su contaminación. No usar reactivos fuera de la fecha indicada. Indicadores de deterioro de los reactivos: - Presencia de partículas y turbidez. - Absorbancia (A) del Blanco a 492 nm 1,80. MATERIAL ADICIONAL - Espectrofotómetro o analizador para lecturas a 492 nm. - Cubetas de 1,0 cm de paso de luz. - Equipamiento habitual de laboratorio. MUESTRAS - Suero o plasma heparinizado1. Estabilidad de la creatinina: al menos 24 horas a 2-8ºC. - Orina: Diluir la muestra al 1/50 con agua destilada. Mezclar. Multiplicar el resultado obtenido por 50 (factor de dilución) Estabilidad de la creatinina: 7 días a 2-8ºC.

Procedimiento:1. Condiciones del ensayo: Longitud de onda: . . . . . . . . . . . . . . . 492 nm (490-510) Cubeta:. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. .1 cm paso de luz Temperatura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37ºC / 15-25ºC 2. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada. 3. Pipetear en una cubeta:

Blanco Patrón Muestra RT (mL) 1,0 1,0 1,0 Patrón (Nota1,2) (L)

-- 100 --

Muestra (L)

-- -- 100

4. Mezclar y poner en marcha el cronómetro. 5. Leer la absorbancia (A1) al cabo de 30 segundos y al cabo de 90 segundos (A2) de la adición de la muestra. 6. Calcular: A= A2 – A1 .

Resultados:En suero:B- 0,000S- 0,011M pat- 0,103Concentración: 3,77 mg/dl. VN pat.= 2,71- 3,89 mg/dl.B- 0,000S- 0,017M pat.$- 0,235Concentración: 4,92 mg/dl. En orina:

3,51 mg/dl.

Interpretación clínica de los resultados:El ácido úrico y sus sales son el producto final del metabolismo de las purinas. En una insuficiencia renal progresiva hay una retención en sangre de

urea, creatinina y ácido úrico. Niveles altos de ácido úrico son indicativos de patología renal y generalmente se asocia con la gota. El diagnostico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.Los valores considerados como normales para este parámetro por spinreact son:

Suero o plasma: Mujeres 2,5 - 6,8 mg/dL 149 – 405

mol/L Hombres 3,6 - 7,7 mg/dL 214 – 458

mol/L Orina: 250 - 750 mg/24 h 1,49 -

4,5 mmol/24 h

Resultado de las tiras de proteinograma patológico:

QM- 16% 0,022LDL-25% 0,034VLDL-39% 0,025HDL-18% 0,024

Título de la práctica:Estudio del sedimento de orinas de hospital

Fundamento de la práctica:El estudio del sedimento urinario comprende la investigación, hallazgo e interpretación de una serie de elementos o estructuras, del más variado origen y composición, que aparecen suspendidas en la orina y que proporcionan ayuda para el diagnóstico y evolución de las enfermedades renales, del aparato genitourinario, así como otras que puedan repercutir en la alteración de la formación de la orina.

Materiales: Muestra de orina fresca Centrífuga Tubos de centrífuga Pipeta Pasteur Portaobjetos Cubreobjetos

Microscopio

Procedimiento:Siempre que sea posible, la muestra debe examinarse antes de transcurridas 3-4

horas desde su recogida ya en algunas estructuras presentes (células, cilindros, etc.) se lisan fácilmente.

Obtención del sedimento:1. Homogeneizar bien la muestra.2. Colocar unos 10 mL de orina, en un tubo de centrífuga (preferiblemente

de fondo cónico).3. Centrifugar a 2.000 r.p.m. durante 5 minutos.4. Decantar "completamente" el sobrenadante.5. Resuspender el sedimento residual.6. Montar una preparación "en fresco" del sedimento (una gota entre porta y

cubreobjetos).Es muy importante evitar la formación de burbujas.7. Observar, sin demora, al microscopio (40x) con intensidad lumínica

media y condensador a media altura.

Resultados:Se presentan las fotografías junto al junto al informe del citómetro y las tiras reactivas.

Este estudio se ha llevado a cabo los días 27-2, 4-3,6-3,9-3 y 18-3

27/2/09

4/3/09

6/3/09

Practicas de bioquimica 2

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