Universidad AutónomaDe Baja California

Facultad de Ciencias Marinas

Extracción e Identificación de glucógeno

Romina Preciado Pérez23 de abril del 2013

Resumen: Se analizó la presencia de glucógeno en los tejidos de músculo e hígado del pez Oreochromis niloticus). La presencia de este solo se presentó en el músculo en el tubo de ensayo MB. El resultado se atribuye a el estrés que pasó el pez ya sea en el medio en el que se desarrollaba (alta salinidad) y al momento en el que se le dio muerte que ocasionó la baja o nula concentración de glucógeno en el tejido hepático y por el estrés la presencia de este en el músculo.

Introducción.-

El glucógeno es el polisacárido de reserva más importante en las células animales. Al igual que la amilopectina, el glucógeno es un polímero con subunidades de glucosa unidas por enlaces (α 1 → 4¿ y ramificaciones del tipo (α 1 → 6¿, pero el glucógeno está más ramificado (una ramificación cada 8 a 12 residuos) y es más compacto que el almidón. El glucógeno es especialmente abundante en el hígado, donde puede llegar a representar el 7% de su peso; también se encuentra en el músculo esquelético. Algunos gránulos de glucógeno contienen también, íntimamente unidos, los enzimas responsables de su síntesis y degradación. Puesto que cada rama de estos termina con un azúcar no reductor (que no posee carbono anomérico libre), estos polímeros tienen tantos extremos no reductores como ramas, pero únicamente un extremo reductor. Cuando el glucógeno se emplea como fuente de energía las unidades de glucosa son eliminadas de una en una a partir de los extremos no reductores. Dada la naturaleza ramificada de la amilopectina y el glucógeno, los enzimas degradativos (que actúan en los extremos no reductores) pueden trabajar simultáneamente en muchos extremos, aumentando la velocidad de conversión del polímero en monosacáridos (Lehninger et al, 2005).

La D- glucose es el principal combustible de la mayoría de organismos y ocupa una posición central en el metabolismo. Es relativamente rica en energía potencial; su oxidación completa a dióxido de carbóno y agua transcurre con una variación de energía libre estándar de -2.840 kJ/mol. Almacenando la glucosa en forma de polímero de elevada masa molecular, una célula puede apilar grandes cantidades de unidades de hexosa al tiempo que mantiene una osmolaridad citosólica relativamente baja. Cuando aumenta de una manera súbita las necesidades energéticas de la célula, la glucosa se puede liberar rápidamente a partir de estos polímeros de almacenamiento intracelular (Lehninger et al, 2005).

En la glucólisis (del griego glykys, que significa “dulce” y lysis , que significa “romper”) lo que sucede es que se degrada una molécula de glucosa en una serie de reacciones catalizadas enzimáticamente, dando dos moléculas de piruvato. Durante la secuencia de reacciones parte de la energía libre cedida por la glucosa se conserva en forma de ATP. La glucólisis fue la primera ruta metabólica elucida y es probablemente la que se conoce mejor, mientras que la gluconeogenesis es la síntesis de la glucosa a partir del piruvato y el lactato. Para la síntesis de un mol de glucosa son necesarios 4 moles de ATP y 2 moles de GTP (ó ITP) a partir de 2 moles de piruvato y/o lactato. El camino que lleva la glucogenesis es basicamente el inverso del de la glucólisis excepto por 3 pasos especificos entre la glucosa y glucosa-6-fosfato, fructosa-6-fosfato y fructosa-1,6-bifosfato, and fosfoenolpiruvato (PEP) y piruvato . Esta tiene su lugar principalmente en el hígado y su misión es proporcionar glucosa para exportarla a otros tejidos cuando se han agotado otras fuentes de glucosa. (Hayashi, 2008).

Objetivo.- Extraer e identificar el glucógeno de dos distintos tejidos (higado y músulo) de Oreochromis niloticus .

Metodología.-

1. A partir de un pez (Oreochromis niloticus) sacrificados obtener muestras de hígado

y musculo, enseguida pesar por duplicado 1.5 g de hígado y 3 g de músculo.

2. Homogeneizar las muestras de tejidos con 4 ml de KOH al 30%.

3. Calentar los homogenizados en un baño de agua a ebullición por 15 minutos, agitar

ocasionalmente.

3. Centrifugar los homogenados a 3000 rpm por 5 minutos, separar la capa de

sobrenadante y colocarla en tubo de ensayo, añadir 6 ml de etanol y agitar.

4. Reposar los tubos con la mezcla en baño de hielo por 5 minutos.

5. Centrifugar los tubos 5 minutos a 3000 rpm, desechar el sobrenadante y separar el

glucógeno precipitado.

6. Hidrólisis ácida del glucógeno: Al precipitado de glucógeno obtenido añadir 1 ml

de H2SO4 5N y calentar en baño de agua a 100°C por 25 minutos. Usar lentes de

seguridad y proceder con suma precaución en esta etapa para evitar salpicaduras de

ácido.

7. Al término de la hidrólisis enfriar los tubos, adicionar 2 ml con agua destilada a

cada tubo y 3 gotas de fenolftaleína, añadir gota a gota NaOH 5N con agitación

hasta el vire del indicador (pH 8 o superior).

8. Identificación del contenido de glucosa en el hidrolizado de glucógeno: Colocar

0.5 ml del hidrolizado de glucógeno y añadir 0.5 ml de Cu2SO4 1%, la presencia

de glucosa se denota por la aparición de turbidez debido a la insolubilidad del

Cu2O formado.

Resultados y Discusión.-

Figura 1.- Medición del glucógeno en diferentes tejidos de Oreochromis niloticus. Los dos primeros tubos de ensayo contienen hígado y los dos siguientes musculo.

En los resultados observamos la turbidez solamente en el tubo de ensayo en donde se encontraba parte de un tejido del músculo del pez (Oreochromis niloticus).Para discutir los resultados se tomar en consideración que aproximadamente el 10% del peso del hígado es glucógeno mientras que el 1-2% del peso del músculo es de glucógeno. En este caso cabe destacar que se desconoce cuando fue la última ingesta de alimento del pez por lo que esta razón como se sabe el pez degrada el glucógeno en periodos de ayuno lo cual pudo haber ocurrido. Así mismo se sabe que al momento que se dio muerte al pez este pasó por mucho estrés ya que no fue rápido y posiblemente sufrió. Tras una intensa actividad muscular, la respiración se mantiene profunda por un cierto tiempo. La mayor parte del O 2

que se obtiene de esta forma se utiliza para la producción de ATP por fosforilación oxidativa en el hígado.

La concentración de salinidad en la que se encontraba el pez (Oreochromis niloticus) pudo tener efecto en la baja concentración de glucógeno en el hígado ya que este es un índice de estrés fisiológico , ya que el estrés causa un rango acelerado de hidrólisis enzimática del glucógeno hepático( Hayashi, 2008).

Preguntas a resolver:

¿Cuál es el mecanismo síntesis de glucógeno en los tejidos animales?

La síntesis del glucógeno tiene lugar virtualmente en todos los tejidos animales, pero es

especialemente importante en el hígado y el músculo esquelético.

En los animales y en algunos microorganismos, el exceso de glucosa disponible de los glúcidos de la dieta o de la gluconeogénesis se almacena en forma de glucógeno. La síntesis de glucógeno tiene lugar virtualmente en todos los tejidos animales, pero es especialmente importante en el hígado y en el músculo esquelético. El hígado, el glucógeno sirve de depósito de glucosa rápidamente convertible en glucosa sanguínea para su distribución a oros tejidos, mientras que en el músculo, el glucógeno se degrada vía glucólisis para proporcionar energía en forma de ATP para la contracción muscular. El punto de inicio de la síntesis de glucógeno es la glucosa-6-fosfato. Esta puede provenir de la glucosa libre por la reacción de la hexoquinasa (en el hígado; glucoquinasa en el músculo):

D−Glucosa+ ATP→ D−Glucosa−6−fosfato+ADPSin embargo, gran parte de la glucosa ingerida durante una comida va a parar al glucógeno por una vía menos directa. Es captada primeramente por los eritrocitos en el torrente circulatorio convirtiéndose glucolíticamente en lactato; éste es a continuación captado por el hígado y convertido en glucosa-6-fosfato mediante gluconeogénesis.Para iniciar la síntesis de glucógeno, la glucosa-6-fosfato se convierte reversiblemente en glucosa-1-fosfato por la fosfoglucomutasa:

Glucosa−6−fosfato⇄ g lucosa−1−fosfato

La formación de UDP-glucosa por acción de la UDP-glucosa pirofosforilasa es una reacción clave en la biosíntesis del glucógeno:

Glucosa−1−fosfato+UTP→ UDP−glucosa+PPi

Esta reacción transcurre en la dirección de formación de la UDP-glucosa debido a que el pirofosfato se hidroliza rápidamente a ortofosfato por la pirofosfato inorgánico hidrolasa (ΔGº=−25 kJ /mol ¿ .

2. ¿Cuáles son las funciones y vías metabólicas del glucógeno hepático y del muscular?Glucógeno muscular: Su metabolismo está especializado en producir ATP como fuente inmediata de energía. Este se encuentra adaptado para satisfacer las necesidades energéticas de forma intermitente según la demanda de energía. Pueden formar cuerpos cetónicos, glucosa o ácidos grasos libres como combustible, dependiendo del grado de actividad muscular que se precise. En el músculo en reposo los principales combustibles son los ácidos grasos que vienen del tejido adiposo y los cuerpos cetónicos que vienen del hígado. Estos compuestos oxidan y se degradan para dar acetil-CoA, que entra en el ciclo del ácido cítrico para ser oxidado hasta CO 2. La transferencia de electrones al O2 que resulta de este proceso proporciona energía para la síntesis de ATP por fosforilación oxidativa. La glucosa se forsforila, a través de la glucólisis se degrada hasta piruvato y éste a su vez se convierte en acetil-CoA y se oxida por la vía del ciclo del ácido cítrico. Bajo condiciones de músculos muy activos , el glucógeno almacenado en el músculo se degrada hasta lactato por fermentación, proporcionando dos moléculas de ATP por

cada unidad de glucosa degradada. La utilización de la glucosa de la sangre y del glucógeno muscular como combustibles de emergencia para la actividad muscular se incrementa de forma importante por la secreción de adrenalina, que estimula la formación de glucosa en sangre a partir del glucógeno hepático y la degradación del glucógeno del tejido muscular. El glucógeno muscular está, por lo tanto, enteramente dedicado al suministro de energía en el músculo a través de la degradación glucolítica. Glucógeno hepático; Es para todo el organismo, de manera que el hígado degradará ese glucógeno cuando el nivel de G en sangre baje, fundamentalmente en períodos de ayuno, de manera que en el ayuno entre comidas o ayuno nocturno el hígado va degradando su glucógeno.En condiciones normales no hay mas que para un día de reserva es por eso que existe la gluconeogénesis ya que los niveles se disminuyen al parar la ingesta de alimentos.El glucógeno se almacena después de ingerir alimentos, aún más tras una dieta rica en HC. El glucógeno en el hígado mantiene la homeostasis de glucosa en sangre, es decir, mantener siempre una [glucosa] constante en sangre, lo que resulta vital para la vida, pues la glucosa es la fuente principal de energía de todos los órganos, y en especial del cerebro y de los glóbulos rojos o eritrocitos, ya que constituye su única fuente de energía. El glucógeno del hígado se “rompe” en situación de ayuno (Ø de glucosa en sangre) ≈ expresión de su función de reserva de energía.

Conclusiones.-La presencia y ausencia de glucógeno en los tejidos de musculo e hígado respectivamente se pudo deber al estrés al que había sido sometido el pez (Oreochromis niloticus) por salinidad del agua o el momento en el que se le dio muerte.

Referencias.-

Hayashi, S., Kumagai, A. (2008) Studies on eel liver functions using perfused liver and primary cultured hepatocytes. Aqua-BioSci. Monogr. 1(2):1-57.

Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M., 2005. Principios de Bioquímica. Ediciones Omega, S.A. Segunda Edicion. España. 1152

Orji R.C.A Effect of Transportation Stress on Hepatic Glycogen of Oreochromis niloticus (L.) Naga, The ICLARM Quarterly (http://www.worldfishcenter.org/Naga/na_2279.pdf).