PONTIFICIA UNIVERISAD JAVERIANA FACULTAD DE …

PONTIFICIA UNIVERISAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS CON PRESUNTIVO

POTENCIAL PROBIOTICO A PARTIR DE HECES DE ANIMALES DE PRODUCCION

INDUSTRIAL

JORGE ENRIQUE RODRÍGUEZ OGLIASTRI

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcial para optar al título de

Microbiólogo Industrial

Directora

ANDREA CAROLINA AGUIRRE

Codirectora

SANDRA JANETH SANTOS

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTÁ, D.C.

2011



INDUSTRIAL


APROBADO



2011

Dra. INGRID SCHULER GARCÍA Ph.D Decana académica

Dra. JANETH ARIAS PALACIOS M.Sc-M.Ed

Directora de carrera



INDUSTRIAL


ANDREA CAROLINA AGUIRRE M.Sc Directora

SANDRA JANETH SANTOS Codirectora

LUIS DAVID GÓMEZ M.Sc Jurado



2011

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en

sus trabajos de tesis. Sólo velará por qué no se publique nada contrario al dogma y a la

moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona

alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.

Artículo 23 de la Resolución No 13 de Julio de 1946.

AGRADECIMIENTOS

A Andrea Aguirre, Carval de Colombia, Sandra Janeth Santos, al laboratorio de Biotecnología

Aplicada de la Pontificia Universidad Javeriana y en su nombre, Balkys Quevedo, por su ayuda, sin

la cual este proyecto no hubiera sido posible.

TABLA DE CONTENIDO

Página

1. RESUMEN 7

2. INTRODUCCIÓN 8

3. MARCO TEÓRICO 9

4. JUSTIFICACIÓN Y PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN 11

5. OBJETIVOS 12

5.1 OBJETIVO GENERAL 12

5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 12

6. METODOLOGÍA 12

6.1 RECOLECCIÓN DE MUESTRAS 12

6.2 MUESTREO INICIAL 12

6.3 PROCESAMIENTO DE MUESTRAS 13

6.4 CONSERVACIÓN INICAL DE CEPAS 13

6.5 IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA 14

6.6 CONSERVACIÓN FINAL DE CEPAS 14

7. RESULTADOS 15

7.1 MUESTREO INICIAL 15

7.2 MUESTREOS 16

7.2.1 RECUENTO DE MUESTREOS 16

7.2.2 COLORACIONES DE GRAM 20

7.3 IDENTIFICACIONES BIOQUÍMICAS 22

8. DISCUSIÓN 26

9. CONCLUSIONES 33

10. RECOMENDACIONES 34

11. BIBLIOGRAFÍA 35

12. ANEXOS 40

1. RESUMEN

Los probióticos han entrado en auge en los últimos años por su aplicación como medicina

preventiva y en el campo agrícola se ha buscado reducir el uso de antibióticos promotores de

crecimiento (APCs), mejorar la alimentación de los animales y también, evitar las enfermedades

causadas por patógenos entéricos. En este estudio se aplicaron metodologías para el aislamiento

de microorganismos con presuntiva capacidad probiótica a partir de heces de vertebrados como

aves (gallinas de engorde), ganado porcícola (cerdos de engorde), ganado vacuno (rumiantes de

engorde) y caninos (como mascotas domésticas). Se identificaron un total de 60 microorganismos

mediante pruebas bioquímicas usando baterías API (Biomerieux®) obteniendo bacterias Ácido

Lácticas como Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactobacillus rhamnosus, L. pentosus, L. paracasei ssp.

paracasei y L. brevis. Bacilos esporulados como Bacillus subtilis/amyloliquefaciens, B. megaterium

y B. licheniformis. Se identificaron levaduras sin reportes bibliográficos encontrados en cuanto a

probiosis Geotrichum sp., Kloeckera sp., Cryptococcus terreus y varias especies de Candida. Los

resultados obtenidos son preliminares para la futuros estudios que permitan la evaluación de la

capacidad probiótica de estas cepas tanto in vitro como In vivo.

2. INDTRODUCCIÓN

Los probióticos son microorganismos vivos que, cuando son suministrados en cantidades

adecuadas, confieren un beneficio sobre el huésped (1). Dentro de las aplicaciones que se les ha

dado a estos productos están medicinales como antialérgicas (2), contra la diarrea, contra

infecciones urinarias, contra el cáncer de colon, entre otras (3).

Quizá la aplicación más estudiada y comercial es la de colonización intestinal para la defensa

contra patógenos entéricos como Shigella, Salmonella y Escherichia coli. Existen productos

derivados de la leche, como el yogurt, que contienen Bacterias Ácido Lácticas como las

Bifidobacterias y Lactobacilos que al colonizar el tracto digestivo humano, previenen

enfermedades causadas por ciertos patógenos (4).

Se ha sugerido que le eficiencia en la nutrición animal se debe principalmente a los

microorganismos nativos del tracto digestivo (5). Se han descrito dos mecanismos de acción

principales que emplean los probióticos responsables del beneficio para el huésped animal y

humano: 1) El efecto nutricional caracterizado por la reducción de reacciones metabólicas que

producen sustancias tóxicas, estimulación de enzimas propias del huésped, producción de

vitaminas y minerales y secreción de antimicrobianos. 2) El efecto de salud distinguido por el

incremento en la resistencia de colonización contra patógenos mediante la competencia de

adhesión a la superficie intestinal, competencia por sustrato, secreción de bacteriocinas y

estimulación de la respuesta inmune (5, 6).

Los probióticos son común denominador en dietas recomendadas por nutricionistas y ahora se

conoce que consumir productos a base de microorganismos estudiados con fines probióticos

optimizan las funciones que ejerce el aparato digestivo, bien sea de humanos o de animales. El

futuro de los probióticos está direccionado hacia el mercado del cuidado personal y de la salud

animal. Se busca que éstos puedan ser usados en la prevención o alivio de síntomas o

enfermedades específicas, especialmente para la población de recién nacidos, la tercera edad o

personas inmunosuprimidas (2).

En el presente estudio se tuvo como objetivo aislar e identificar bioquímicamente

microorganismos con potencial de capacidad probiótica presuntiva (Bacterias Ácido Lácticas,

Levaduras y Bacilos esporulados) a partir de muestras fecales de animales de interés agroindustrial

y doméstico.

3. MARCO TEÓRICO

3.1 Probióticos

Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), los probióticos son microorganismos vivos que

cuando son suministrados en cantidades adecuadas, confieren un efecto benéfico sobre el

huésped (1). El concepto de probiosis también abarca la exclusión competitiva para mejorar una

ecología microbiana específica. Existen diferentes tipos de microorganismos que son considerados

probióticos; entre ellos están las bacterias Ácido Lácticas, los bacilos formadores de espora

(Bacilos Esporulados) y las levaduras (7, 8).

Estos microorganismos se le han atribuido también efectos de estimulación en la digestión y

mantenimiento en la flora intestinal tanto de humanos como animales. De esta manera ayudan a

contrarrestar el estrés causado por cambios en la dieta y proveen una línea de defensa contra

patógenos.

Ciertos microorganismos probióticos secretan enzimas, vitaminas y otras sustancias consideradas

como factores de crecimiento que llevan a aumentas la eficiencia en la producción animal (9). Se

ha estudiado la capacidad de estos microorganismos de producir sustancias antimicrobianas

conocidas como bacteriocinas, que inhiben el crecimiento y reproducción de patógenos entéricos

(10).

3.2 Bacterias Ácido Lácticas

Son denominadas de ésta manera por su capacidad de producir ácido láctico a partir de

carbohidratos como la glucosa, fructosa, manosa, etc. Tienen morfología microscópica cocoíde o

bacilar y reaccionan positivamente ante los colorantes de Gram (8). Entre las bacterias de este

tipo, las más reportadas y comúnmente empleadas están: Lactobacillus acidophilus, L. casei, L.

crispatus, L. gasseri, L. paracasei, L. reuteri y L. rhamnosus (3).

3.3 Bacilos esporulados

Existen bacterias capaces de formar una estructura denominada espora que le permite asegurar

su supervivencia en condiciones adversas o extremas como insuficiencia de agua o nutrientes,

temperaturas elevadas, niveles de pH ácidos o alcalinos, etc. Presentan morfología bacilar al

microscopio y reacción positiva a los colorantes de Gram (3). Estos microorganismos, aunque

existen especies consideradas patógenas, también existen otros con reportes y usos por sus

capacidades probióticas. El más ampliamente conocido en este campo es Bacillus subtilis (5).

3.4 Levaduras

Ciertos hongos presentan una morfología llamada levaduriforme. Esta se caracteriza por ser de

mayor tamaño que las bacterias y presenta una reacción positiva ante los colorantes de Gram,

aunque a diferencia de las bacterias, esta se debe por la afinidad al colorante Cristal Violeta y no

por la presencia de peptidoglicano en la pared como ocurre en las bacterias Gram positivas (8).

Saccharomyces cerevisiae y S. boulardii se han usado durante muchos años como suplemento

alimenticio por su alto contenido proteico, además ser utilizado como agente anti diarreico en

humanos.

Las características atribuidas a estos microorganismos para ser utilizados en animales son: su

producción de minerales, vitaminas hidrosolubles y enzimas; mejora en la eficiencia alimentaria

dada por la mejora en la absorción de nutrientes en el huésped (por el control de la diferenciación

y proliferación de células epiteliales en el intestino), control la flora intestinal y reducción de

olores en las excretas (9).

3.5 Mecanismos de acción implicados en la probiosis

Principalmente, los probióticos son conocidos como una línea de defensa contra patógenos

causantes de enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs) (10) por varias razones: su adhesión

a las células del intestino causa una competencia por espacio y nutrientes contra los patógenos,

producción de bacteriocinas que afectan el crecimiento de éstos, modulación de la respuesta

inmune causada como respuesta a la pared de las bacterias Ácido Lácticas (ácido lipoteícoico) que

ayuda a los antígenos de membranas celulares de las células epiteliales causando una interacción

que desencadena una producción de citoquinas, proliferación de células mononucleares,

macrófagos y células NK (natural killers) (3).

Bajo estas razones es que se hace interesante el uso de estos microorganismos como sustitución a

la terapia antibiótica en animales por terapias probióticas, puesto que tienen efectos similares en

cuanto a la defensa del animal y su crecimiento saludable, sin embargo, los probióticos ofrecen

una mejor alternativa por menores costos de producción y salubridad tanto humana como del

animal.

4. JUSTIFICACIÓN Y PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN

4.1 JUSTIFICACIÓN

Los probióticos han entrado en auge en los últimos años con ventas de preparados a base de leche

con adición de una carga de Bifidobacterias, Lactobacilos y Lactococos con los cuales se busca la

colonización del tracto digestivo, eviten la enfermedad de patógenos entéricos y ayuden a regular

el metabolismo (7-10). Esto ha sido aplicado, en gran parte para humanos, sin embargo, en

Colombia no ha habido grandes estudios respecto a la producción de biopreparados para la

industria agropecuaria.

Se ha encontrado que en la producción industrial de animales, como la avicultura y la porcicultura,

ocurren condiciones en donde los mayores costos y pérdidas económicas son causados por

infecciones con virus, bacterias, hongos y protozoos y por la inversión de antibióticos profilácticos

y como factor de crecimiento empleados (7). Los antibióticos promotores del crecimiento (APC) se

usan para aumentar la eficiencia en la absorción de nutrientes en las aves y para el aumento en

peso corporal. Bajo reglamentación, se establece que los APC no deben causar daño al consumidor

y no deben dejar residuos de compuestos relacionados bien sea en la carne o en los huevos. Sin

embargo, no se conoce un estudio fiable que cuantifique con exactitud dichos compuestos (8, 9).

El uso de los APC ha llevado a una pérdida del balance de la flora intestinal y desarrollo de

resistencias a antibióticos por parte de los microorganismos que pueden ser patógenos para

animales o humanos (5). Con la tendencia global a evitar consumir lo que se ha inundado con

químicos, en este caso siendo los APC, los productos a base de probióticos como Bactocell® (7, 11)

son una alternativa que puede proveer nuevas tendencias en la agricultura.

En la industria de ganado vacuno, se ha encontrado que los antibióticos suministrados a estos

animales reducen de manera drástica la población microbiana en el intestino inferior lo que causa

dificultades en asimilación de nutrientes para el animal y establecimiento de patógenos (12). Se

conoce que para la digestión de nutrientes en estos animales se necesitan de microorganismos, en

especial para la degradación de celulosa (13)

Es por esto que es adecuado aplicar métodos para el aislamiento de microorganismos con

capacidad probiótica presuntiva para su posterior caracterización e implementación en el mercado

agropecuario.

4.2 Pregunta de investigación

¿Es posible aislar géneros de microorganismos de presuntiva capacidad probiótica a partir de

heces de ganado bovino, porcícola, avícola y de caninos?

5. OBJETIVOS

5.1 Objetivo general:

Aislar e identificar microorganismos con capacidad probiótica presuntiva a partir de muestras

fecales de animales de producción industrial y de comercio agrícola.

5.2 Objetivos específicos:

- Aislar microorganismos a partir de heces bovinas, avícolas, porcícolas y caninas.

- Identificar bioquímicamente los microorganismos previamente aislados

6. METODOLOGÍA

6.1 Recolección de muestras

Se recolectaron muestras de:

- Heces caninas

- Heces bovinas

- Heces porcícolas

- Heces avícolas

Las muestras provinieron de granjas ubicadas en el Valle del Cauca, Colombia. Se enviaron para su

procesamiento en refrigeración bajo correo certificado.

6.2 Muestreo inicial

Previo al muestreo se realizó un estudio para tener una aproximación a la población microbiana

capaz de crecer en los medios MRS, YGC y Plate Count. Es este último se dio un tratamiento

térmico para así limitar el crecimiento a microorganismos esporulados (80°C durante 10 minutos y

choque en frío a 20°C durante 10 minutos) (14).

Se procesaron muestras de cada animal al momento de la recepción de cada una. Se realizaron

diluciones seriadas en base 10, hasta obtener una dilución correspondiente a 10-15. Se sembraron

todas las diluciones por superficie (0.1mL) y se incubó a 37°C para bacterias (medios MRS y Plate

Count) y 30°C para levaduras (medio YGC), durante 48 horas.

También se realizó un estudio para evaluar si las condiciones aeróbicas afectaban el crecimiento

de los microorganismos crecidos en el medio de cultivo MRS.

A partir de los resultados del muestreo inicial, se tomaron las muestras que arrojaron el recuento

mayor contable y se sembraron las diluciones 10-5 y 10-6 por duplicado, incubando un duplicado en

condiciones de microaerofilia, generado por el sistema GENEBOX de Biomerieux® y el otro en

condiciones aeróbicas.

6.3 Procesamiento de muestras

De cada muestra se pesaron 10 gramos que fueron diluidos en 90mL de agua peptonada. Se

realizaron diluciones seriadas en base 10 hasta 10-8 tomando como referencia los resultados del

muestreo inicial realizado previamente. Se sembró 0,1 mL por en agar MRS, YGC y Plate Count. En

este último se le dio un tratamiento térmico para así limitar el crecimiento a microorganismos

esporulados (80°C durante 10 minutos y choque en frío a 20°C durante 10 minutos) (13). Se

incubó a 37°C para bacterias (medios MRS y Plate Count) y 30°C para levaduras (medio YGC),

durante 48 horas.

A cada morfotipo de colonia crecida se le realizó coloración de Gram y se purificaron según los

siguientes criterios (anexo 2, tabla VII):

Colonias crecidas en MRS: cocos o bacilos Gram positivos

Colonias crecidas en YGC: levaduras ligeramente ovoides de gemación única

Colonias crecidas en Plate Count: bacilos Gram positivos esporulados

6.4 Conservación inicial de las cepas

Las colonias aisladas se conservaron realizando repiques cada 30 días en los medios originales para

posteriores trabajos y conservación de las mismas (8).

Se realizó un banco de transporte correspondiente a 3 viales por microorganismo purificado,

creciendo las colonias en tubos de 13x100 con 5mL del medio de cultivo correspondiente, 100rpm,

37°C para bacterias y 30°C para levaduras por 16 horas. Posterior al crecimiento se agregaron con

un volumen final de 1mL a un tubo eppendorf con glicerol para obtener una concentración final de

glicerol al 10% (v/v). Los viales se conservaron a -70°C y se reactivaron una semana después de

preparado el banco, en el mismo medio en donde originalmente ser aisló cada microorganismo.

6.5 Identificación bioquímica

Los microorganismos se identificaron mediante las pruebas de API 50 CHL (para colonias crecidas

en agar MRS), API 20C AUX (para colonias crecidas en agar YGC) y API 50 CHB (para colonias

crecidas en Plate Count), siguiendo las instrucciones y protocolos de la casa comercial Biomerieux®

y se ingresaron al software APIWEB de la misma casa comercial para su identificación.

6.6 Conservación final de las cepas

Aquellos microorganismos cuyo perfil bioquímico resultado de API arrojó la identificación de

género referenciado en literatura como posible microorganismo probiótico fue conservado en

glicerol al 10% (v/v) siguiendo la siguiente metodología:

A partir de una colonia pura, se sembró en caldos MRS, YPG o Plate Count (para bacterias aisladas

de MRS, YGC o Plate Count respectivamente). Se incubó a 37 o 30°C para bacterias y levaduras

respectivamente, por 16 horas a 100 rpm (15).

Posterior al periodo de incubación, se realizaron dos lavados celulares usando agua destilada

estéril. Finalizado los lavados celulares, se resuspendió el pellet en glicerol al 10% y se congeló a

-20°C.

7. RESULTADOS

7.1 Muestreo inicial

A partir de las muestras recibidas, se obtuvieron diferentes recuentos que principalmente

variaron por el medio de cultivo utilizado para la siembra. A excepción de la muestra de heces

porcícolas, en MRS se obtuvieron recuentos del mismo orden logarítmico de 107 (Tabla 1). La

mayoría de otros crecimientos se encontraron en concentraciones suficientes para continuar con

el estudio.

Tabla I: Recuento en placa de muestreo inicial de heces de diferentes animales.

Procedencia de la Muestra

Medio de cultivo

Recuento (UFC/g)

Heces bovinas

MRS 6,50E+07

Plate Count 1,50E+05

YGC 2,30E+04

Heces porcícolas

MRS 3,10E+09


YGC 4,00E+07

Heces avícolas

MRS 3,60E+07


YGC 3,40E+06

Heces caninas

MRS 1,80E+08


YGC 1,10E+04

Fuente: elaboración propia

Figura I: Gráfico de barras del logaritmo natural de los recuentos iniciales en LN UFC/g.


Los resultados de los crecimientos de microaerofilia y aerobiosis fueron en ambos casos, mayor a

2,60E+8 lo que indicó que no había interferencias en cuanto a densidad microbiana en los

resultados por condiciones de oxígeno en la incubación.

7.2 Muestreos

7.2.1 Recuento de muestreos

Los resultados obtenidos para recuento en placa de las muestras analizadas fueron coherentes con

el muestreo inicial en tanto que dieron cerca del mismo valor logarítmico (Anexo 2, Tabla XI)

(Figuras II, III, IV, V, VI, VII y VIII). Sugiero mostrar la grafica y poner en anexos las tablas.

Se procesaron 10 muestras de cada vertebrado seleccionado separado en dos grupos de 5

exceptuando canes, para lo que se procesaron solamente 5 en total.

0

5

10

15

20

25

Heces bovinas

Heces porcícolas

Heces avícolas

Heces caninas

LN U

FC/g

Muestra

Recuento de muestreo inicial

MRS

Plate Count

YGC

Figura II: Gráfico de resultados de recuentos de recuento en placa de 5 muestras fecales avícolas

(M1, M2, M3, M4 y M5). Fuente: elaboración propia

Figura III: Gráfico de resultados de recuentos de recuento en placa de 5 muestras fecales avícolas


0

5

10

15

20

M1 M2 M3 M4 M5

LN U

FC/g

Número de muestra

Población microbiana crecida en Heces Avícolas 1

MRS

Plate Count

YGC

0

5

10

15

20

25

M1 M2 M3 M4 M5

LN U

FC/g

Número de muestra

Población microbiana crecida en Heces Avícolas 2

MRS

Plate Count

YGC

Figura IV: Gráfico de resultados de recuentos de recuento en placa de 5 muestras fecales

porcícolas (M1, M2, M3, M4 y M5). Fuente: elaboración propia

Figura V: Gráfico de resultados de recuentos de recuento en placa de 5 muestras fecales


0

5

10

15

20

25

M1 M2 M3 M4 M5

LN U

FC/g

Número de muestra

Población microbiana crecida en Heces Porcícolas 1

MRS

Plate Count

YGC

0

5

10

15

20

25

M1 M2 M3 M4 M5

LN U

FC/g

Número de muestra

Población microbiana crecida en Heces Porcícolas 2

MRS

Plate Count

YGC

Figura VI: Gráfico de resultados de recuentos de recuento en placa de 5 muestras fecales caninas


Figura VII: Gráfico de resultados de recuentos de recuento en placa de 5 muestras fecales bovinas


0

2

4

6

8

10

12

14

16

M1 M2 M3 M4 M5

LN U

FC/g

Número de muestra

Población microbiana crecida en Heces Caninas

MRS

Plate Count

YGC

0

5

10

15

20

25

M1 M2 M3 M4 M5

LN U

FC/g

Número de muestra

Población microbiana crecida en Heces Bovinas 1

MRS

Plate Count

YGC

Figura VIII: Gráfico de resultados de recuentos de recuento en placa de 5 muestras fecales


7.2.2 Coloraciones de Gram

Las morfologías y reacciones ante los colorantes de Gram se observan en la tabla II. Aunque el

medio YGC contiene un antimicrobiano de amplio espectro, se observaron morfologías de

bacterias como bacilos y cocos Gram negativos

Tabla II: Coloraciones de Gram de la diferentes morfologías macroscópicas observadas en las siembras en placa. M(#): Muestra, BGP: Bacilo Gram Positivo, BGPE: Bacilo Gram Positivo Esporulado, BGN: Bacilo Gram Negativo, CGP: Coco Gram Positivo, CGN: Coco Gram Negativo, LS: Levadura Silvestre, LGM: Levadura ovoide con Gemación Múltiple, LGU: Levadura ovoide con Gemación Única, C(#): Colonia *Repicada. Muestra

MRS Plate Count YGC

M1 M2 M3 M4 M5 M1 M2 M3 M4 M5 M1 M2 M3 M4 M5

Heces

avícolas 1

C1:

BGP

*

C2:

CGP

C3:

BGP

*

C1:

BGP*

C2:

BGP*

*

C1:

CGN

C2:

BGN

C1:

BGN

C2:

BGN

C1:

CGN

C2:

CGN

C1:

BGN

C2:

BGP

C1:

BGPE

*

C2:

BGN

C3:

BGN

C1:

BGPE

*

C2:

BGP

C1:

BGPE

*

C2:

BGN

C3:

CGP

C1:

BGPE*

C2:

CGP

C3:

CGP

C1:

LS

C2:

LS

C1:

LS

C2:

BGN

C3:

LS

C1:

LS

C2:

LGU

*

C1:

LS

C2:

LS

C3:

LS

C4:

C1:

BGN

C2:

LS

C3:

LS

0

5

10

15

20

M1 M2 M3 M4 M5

LN U

FC/g

Número de muestra

Población microbiana crecida en Heces Bovinas 2

MRS

Plate Count

YGC

C4:

BGP

BGN

Heces

avícolas 2

C1:

BGP

*

C2:

BGN

C1:

BGP*

*

C2:

CGN

C1:

BGN

C1:

CGN

C2:

BGN

C1:

CGN

C2:

BGN

C3:

BGP

*

C4:

BGN

C5:

BGN

C1:

BGP

C2:

BGN

C3:

BGN

C1:

BGN

C2:

BGN

C1:

BGP

C2:

BGPE

*

C3:

BGPE

*

C1:

BGPE

*

C2:

BGP

C1:

BGPE*

C2:

BGPE*

*

C3:

BGPE*

C1:

BGN

C2:

LS

C1:

LS

C1:

LGM

C2:

LS

C3:

LS

C1:

BGP

C2:

LGM

C1:

LGM

C2:

LS

Heces

porcícola

s 1

C1:

BGN

C2:

BGN

C3:

CGN

C1:

CGP*

C2:

BGN

C1:

CGN

C2:

BGN

C1:

BGP

*

C2:

BGN

C3:

BGN

C1:

BGN

C2:

BGN

C3:

BGN

C1:

BGPE

*

C2:

BGP

C3:

BGPE

*

C4:

BGN

C1:

BGPE

*

C2:

BGP

C3:

BGPE

*

C4:

BGP

C5:

BGP

C6:

BGN

C1:

BGN

C2:

BGN

C3:

BGPE

*

C1:

BGP

C2:

BGPE

*

C3:

BGP

C4:

BGP

C1:

BGPE*

C2:

BGPE*

C3:

BGP

C1:

LS

C2:

LS

C3:

LGU

*

C1:

LG

M

C2:

LG

M

C1:

LGM

C1:

LS

C2:

BGN

C1:

LS

C2:

LS

C3:

LGU

*

C4:

LS

C5:

LGM

Heces

porcícola

s 2

C1:

BGN

C2:

BGN

C3:

BGP

*

C4:

BGN

C5:

BGP

*

C6:

CGN

C1:

BGP*

C2:

BGN

C1:

BGN

C2:

BGN

C3:

BGN

C4:

BGP

*

C1:

BGN

C2:

BGP

*

C1:

BGN

C2:

BGN

C3:

CGN

C1:

BGPE

*

C2:

BGN

C3:

CGP

C1:

BGPE

*

C2:

BGPE

*

C3:

BGPE

*

C4:

BGP

C5:

BGN

C6:

BGP

C1:

BGN

C2:

BGN

C3:

BGP

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BGP

C1:

BGPE

*

C2:

BGN

C3:

BGP

C4:

BGPE

*

C1:

BGPE*

C2:

BGP

C3:

BGN

C4:

BGN

C1:

LS

C2:

BGN

C3:

LS

C4:

LS

C5:

LGU

*

C1:

LG

M

C2:

LS

C3:

LS

C1:

LS

C1:

LS

C2:

LS

C3:

LS

C4:

BGN

C1:

LS

C2:

LS

C3:

LS

C4:

BGN

C5:

LGU

*

Heces

caninas

C1:

BGN

C2:

C1:

BGN

C2:

C1:

CGN

C2:

C1:

CGN

C2:

C1:

BGP

*

- - - - - - - - - -

CGP

*

C3:

BGP

*

BGN

BGN BGN

Heces

bovinas 1

C1:

BGN

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LS

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1

-

C1:

LS

C2:

LS

-


7.3 Identificación bioquímica

La identificación de los microorganismos purificados se llevo a cabo mediante las baterías de API

(Biomerieux®). Se organizaron según el tipo de microorganismo (Bacterias Ácido Lácticas, Bacilos

Esporulados y Levaduras) su procedencia para tener claridad del ambiente en donde se

encontraban los microorganismos.

Tabla III: Resultados de las identificaciones bioquímicas mediante el uso de la técnica API 50CHL (para microorganismos obtenidos en MRS).

Bacterias Ácido Lácticas

Microorganismo Procedencia

Lactococcus lactis ssp. lactis Heces bovinas

Lactobacillus pentosus Heces bovinas

Lactobacillus paracasei ssp. paracasei Heces avícolas

Lactobacillus paracasei ssp. paracasei Heces bovinas

Lactobacillus brevis Heces bovinas

Lactobacillus pentosus Heces avícolas


Lactococcus lactis ssp. lactis Heces caninas



Lactobacillus paracasei ssp. paracasei Heces porcícolas

Lactobacillus rhamnosus Heces porcícolas

Lactobacillus rhamnosus Heces bovinas



Lactobacillus rhamnosus Heces avícolas

Lactobacillus rhamnosus Heces caninas

Lactobacillus paracasei ssp. paracasei Heces porcícolas

Lactococcus lactis ssp. lactis Heces porcícolas




Lactobacillus rhamnosus Heces avícolas

Lactobacillus rhamnosus Heces caninas

Lactobacillus pentosus Heces porcícolas

Lactobacillus paracasei ssp. paracasei Heces avícolas

Bacilos esporulados


Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Heces bovinas

Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Heces avícolas



Bacillus pumilus Heces porcícolas

Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Heces porcícolas

Tabla IV: Resultados obtenidos de identificaciones mediante la técnica API

50CHB® (para microorganismos obtenidos en Plate Count).

Tabla V: Resultados de las identificaciones bioquímicas mediante el uso de la técnica API 20C AUX® (para levaduras obtenidas en YGC). Fuente: Elaboración propia

Fuente: Elaboración propia

En las figuras IX, X y XI se resume las identificaciones obtenidas por las diferentes pruebas API®,

diferenciando entre tipo de microorganismo obtenido (según el medio de cultivo utilizado para su

aislamiento).













Bacillus megaterium Heces porcícolas



Bacillus licheniformis Heces porcícolas


Bacillus licheniformis Heces porcícolas




Levaduras


Candida zeylanoides Heces porcícolas

Candida dubliniensis Heces porcícolas

Kloeckera sp. Heces bovinas

Candida rugosa Heces bovinas

Cryptococcus terreus Heces porcícolas

Candida parapsilosis Heces Avícola

Geotrichum sp. Heces porcícolas

Figura IX: Nombre y cantidad de microorganismos identificados mediante el uso de la técnica API 50CHL® (para bacterias obtenidas en MRS). Fuente: Elaboración propia.

Figura X: Nombre y cantidad de microorganismos identificados mediante el uso de la técnica API 50CHB® (para bacterias esporuladas obtenidas en Plate Count). Fuente: Elaboración propia

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Nú

mer

o d

e ce

pa

s

Microorganismos

Bácterias Ácido Lácticas identificadas

Lactobacillus rhamnosus

Lactobacillus pentosus

Lactococcus lactis ssp. lactis

Lactobacillus paracasei ssp. paracasei

Lactobacillus brevis

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Nú

mer

o d

e ce

pa

s

Microorganismos

Bacterias esporuladas identificadas

Bacillus subtilis / amyloliquefaciens

Bacillus pumilus

Bacillus licheniformis

Bacillus megaterium

Figura XI: Nombre y cantidad de microorganismos identificados mediante el uso de la técnica API 20C AUX® (para levaduras obtenidas en YGC). Fuente: Elaboración propia.

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2 N

úm

ero

de

cep

as

Microorganismos

Levaduras identificadas

Candida parapsilosis

C. rugosa

C. dubliniensis

C. zeylanoides

Kloeckera sp.

Geotrichum sp.

Cryptococcus terreus

8. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

En cuanto a la prueba de crecimiento de microorganismos obtenidos en el medio de cultivo MRS

bajo las diferentes condiciones de oxígeno (aerobiosis y microaerofilia), se encontró que los

recuentos fueron muy parejos y las características microscópicas y macroscópicas fueron muy

similares (resultados no escritos). Las bacterias Ácido Lácticas son generalmente anaeróbicas

facultativas o microaerofílicas, lo que les permite crecer tanto en condiciones de anoxia o en la

presencia de oxígeno (8, 14, 15). Por esta razón se decidió continuar el estudio en condiciones

aeróbicas para todos los muestreos. Diversos autores han trabajado en condiciones de

anaerobiosis estrictas para el aislamiento de este tipo de microorganismos; esto puede ser una de

las razones que expliquen que la diversidad microbiana encontrada fue diferente de la que se halló

en este estudio, además de la diversidad microbiana atribuida a geografía y/o alimentación del

animal huésped (4, 5, 12, 16).

Los recuentos encontrados para las muestras sembradas en MRS de este estudio (7 – 9 unidades

logarítmicas) son similares a las reportadas en bibliografía (12, 14, 16, 17), lo cual indica una

metodología de siembras apropiadas (Tabla 1 y 2).

Ningún medio de cultivo utilizado en este estudio fue selectivo para microorganismos probióticos;

se usaron medios de cultivo referenciados en bibliografía (8, 14, 15) para el aislamiento de

microorganismos con capacidades de probiosis presuntivas a partir de las muestras procesadas.

Por esta razón es que se encontraron una gran variedad de morfologías tanto microscópicas como

macroscópicas (morfologías macroscópicas no tabuladas). El medio MRS es un medio enriquecido

que favorece el crecimiento de bacterias Ácido Lácticas, pero no tiene inhibidores de flora

acompañante, el medio Plate Count es un medio enriquecido, sin embargo, el tratamiento térmico

dado a las muestras sembradas en este medio, limita (hasta cierto punto) el crecimiento de

microorganismos no termoresistentes; B. subtilis (microorganismo de interés) es un

microorganismo capaz de tolerar temperaturas elevadas (como a la cual fue expuesto) gracias a su

característica de ser una bacteria esporulada. El medio YGC tiene 0.1 g/L de cloranfenicol, que

ayuda a eliminar la flora acompañante de bacterias tanto Gram positivas como Gram negativas,

pues este se une a la subunidad 50s del ribosoma bacteriano impidiendo así la síntesis proteica

(18). De esta manera se logran obtener principalmente hongos levaduriformes en el medio. Como

fue mencionado anteriormente, el criterio de selección inicial para la purificación de

microorganismos fue su morfología microscópica y la reacción en su pared celular ante los

colorantes de Gram.

Bajo el contexto explicado de los medios de cultivo utilizados para el procesamiento de las

muestras, se entiende la razón por la cual las morfologías microscópicas que presentaron los

microorganismos crecidos en los nuestros fueron tan diversas. Con lo anterior mencionado, cabe

resaltar de nuevo que los microorganismos de interés para este estudio tenían características

específicas microscópicas (colonias crecidas en MRS: cocos o bacilos Gram positivos; Plate Count:

bacilos Gram Positivos esporulados y YGC: levaduras ligeramente ovoides de gemación única).

Estas características fueron el criterio de selección para la purificación de los mismos.

Las identificaciones de los microorganismos aislados mediante las pruebas bioquímicas se

muestran en la tabla 4. Se identificaron un total de 60 microorganismos: 26 a partir de bacterias

aisladas del medio de cultivo MRS, 27 a partir de bacterias aisladas del medio de cultivo Plate

Count (muestras con tratamiento térmico) y 7 levaduras a partir del medio de cultivo YGC.

A partir de las colonias obtenidas en el procesamiento de todas las muestras en el medio de

cultivo MRS, se obtuvieron un total de 26 microorganismos: 5 cepas de Lactococcus lactis ssp.

Lactis: 3 de heces bovinas, 1 de heces porcícolas y 1 una de heces caninas; 8 cepas de Lactobacillus

rhamnosus: 3 de heces bovinas, 1 de heces porcícolas, 2 de heces caninas y 2 de heces avícolas; 5

cepas de L. paracasei ssp. paracasei: 1 de heces bovinas, 3 de heces porcícolas y 1 de heces

avícolas; 7 cepas de L. pentosus: 3 de heces bovinas, 1 de heces porcícolas y 3 de heces avícolas; y

1 cepa de L. brevis a partir de heces bovinas. En su mayoría, los perfiles bioquímicos de las aquellas

cepas encontradas, fueron diferentes, incluyendo aquellas que arrojaron la misma identificación

(resultados no mostrados).

Diversos autores han realizado trabajos con estas cepas, tanto en el campo de probióticos, como

en alimentos como quesos madurados, procesos de extracción, purificación, identificación y

evaluación de bacteriocinas y extracción de proteinasas (15 - 17, 19 - 23).

Para que un microorganismo se considere probiótico a escala in vitro debe cumplir ciertas

características que se evalúan mediante pruebas de laboratorio entre las cuales están: tolerancia a

sales biliares que son moléculas anfipáticas que emulsifican grasas y de esta manera alteran la

tensión superficial, en especial la de las paredes celulares de bacterias (24), dada por la actividad

bilis hidrolasa que detoxifica la acción de las sales biliares y aumenta la supervivencia y

persistencia intestinal (16). Deben ser capaces de tolerar pHs bajos y concentraciones de jugos

gástricos para también asegurar su transición del estomago al intestino y una vez se encuentre en

el intestino, tenga la capacidad de adherirse a las células epiteliales (14, 15).

De los microorganismos identificados, quizá el más estudiado para aplicaciones probióticas es L.

rhamnosus (19), además de ser uno de los cuatro Lactobacilos autorizados en la legislación

europea (Directive 70/524/EEC, JLO 297:15/11/2001) (25). Guo y colaboradores en su estudio del

2010 mostraron que de las cepas aisladas a partir de heces porcícolas, aquellas que obtuvieron

mejores resultados en cuanto a características probióticas in vitro fueron las identificadas como L.

rhamnosus (identificada mediante API 50CHL y corroboradas secuenciando la subunidad 16s

ribosomal) obteniendo tolerancias a concentraciones de sales biliares de 0.3 y 1.0 % (m/v),

supervivencia a pH de 2 durante 3 horas (sin disminución de unidad logarítmica poblacional) (16).

Bernardeau y colaboradores en su estudio del 2002 también concluyeron que esta bacteria (L.

rhamnosus) tenía un gran potencial probiótico, sin embargo, abordado desde otro ángulo: “Las

cepas L. MA27/6B y MA27/6R (dos cepas de L. rhamnosus) son no patógenas y seguras para el

consumo animal y tienen un efecto benéfico sobre el crecimiento en ratones (17, 26).

Los autores mencionados concluyen que estos microorganismos tienen diversas aplicaciones como

su uso en la industria porcícola como aditivos en la alimentación del animal, por sus tolerancias a

factores adversos encontrados en el tracto gastrointestinal y actividad antimicrobiana (16). Otros

sugieren profundización en estudios, en cuanto a consorcios y pruebas in vivo por los resultados in

vitro obenidos (17) y no sólo se demostró la bioseguridad en cuanto al consumo de éstos

microorganismos usando ratones, sino también la mejora en el crecimiento (26).

Otro de los microorganismos identificados en este estudio que está actualmente siendo objeto de

estudio para aplicaciones probióticas es Lactobacillus brevis. Entre las características probióticas

demostradas para este microorganismo están la adherencia fuerte a células Henle o Caco-2 (lo que

permite inferir que podrían adherirse al intestino del huésped), viabilidad estable a pH de 4,

tolerancia a concentraciones de sales biliares de 1.0 % (m/v) en un periodo de 4 horas y actividad

antimicrobiana efectiva contra patógenos como Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida

albicans (27, 28). Además de estas características, existe una cepa de este microorganismo en la

lista GRAS (generalmente reconocido como seguro): L. brevis KB290 (de la International Patent

Organism Despositary Accession Number, FERM BP-4693) lo cual incrementa el interés por

implementar este microorganismo en dietas (29).

Lactobacillus paracasei ssp. paracasei ha sido estudiado por autores como Maragkoudakis y

colaboradores en el 2006 encontrando que de 29 cepas de Lactobacilos aisladas en investigación,

una sub especie de este microorganismo se destacó frente a los demás en cuanto a las pruebas

probióticas in vitro, como tolerancia a pHs de 1 y 2 , teniendo una ligera disminución poblacional,

no obstante dicha disminución fue menor con respecto a los demás microorganismos evaluados

(entre los cuales estaban varias cepas de L. acidophilus y L. plantarum), tolerancia a pepsina

(componente de sales biliares) a pH 2, inmunomodulación (estimulación de producción de

interluquinas 10 y 12, TNFα e interferón γ) e inhibición destacada contra patógenos entéricos

como E. coli y Salmonella sp. (17).

Por otro lado, Lactococcus lactis ssp. lactis ha tenido un enfoque de estudio diferente al campo

probiótico. Este microorganismo ha tenido aplicaciones en la industria de alimentos para la

maduración de quesos y extracción de proteinasas específicas de cisteína para el mejoramiento de

textura y sabor de quesos duros y semi-duros (22, 30). Sin embargo, una aplicación interesante en

el campo de antimicrobianos, más específicamente, las bacteriocinas. Estos compuestos han sido

definidos como proteínas o complejos proteicos antagónicos a bacterias estrechamente

relacionadas genéticamente al organismo productor. Investigadores han reconocido a L. lactis ssp.

lactis como productor de nisina Z (bacteriocina). Rilla y colaboradores (2003) evaluaron la

capacidad de éste microorganismo para inhibir al patógeno Clostridium tyrobutyricum. Los autores

señalan que la inhibición se debe gracias a la bacteriocina producida puesto que evaluaron tanto el

extracto crudo de la bacteria sembrada en pozos en agar con C. tyrobutyricum como la bacterias

enfrentadas en queso evaluando la viabilidad de cada microorganismo (23).

Además de L. lactis ssp. lactis, la bacteria Lactobacillus pentosus también se le ha atribuido la

producción de bacteriocinas. Liv en su estudio sobre bacteriocinas (2008) y Delgado en su estudio

del aislamiento de L. pentosus a partir de aceitunas (2007) concluyeron que este microorganismo

es el responsable de la producción de la bacteriocina capaz de inhibir un amplio espectro de

bacterias como Listeria monocytogenes, L. ivanovii, L. inocua, E. coli, Staphylococcus aureus y

Bacillus cereus (6, 22).

En el caso de las bacterias aisladas en el medio de cultivo Plate Count, se obtuvieron un total de 27

bacterias: 19 cepas de Bacillus subtilis/amyloliquefaciens (las pruebas bioquímicas no diferencian

estas dos especies) provenientes de: 4 de heces bovinas, 9 de heces porcícolas y 4 de heces

avícolas; 5 cepas de B. pumilus todas aisladas a partir de muestras de heces porcícolas; 2 cepas de

B. licheniformis a partir de heces porcícolas y 1 de B. megaterium de heces porcícolas (tabla 4).

Para diferenciar entre la identificación de B. subtilis/amyloliquefaciens con precisión, se sugieren

pruebas moleculares como secuenciación de la subunidad 16S del mRNA.

Las especies de Bacillus han sido usados como suplementos alimentarios hace más de 50 años con

el producto italiano Enterogermina® (31). Entre las especies más estudiadas están B. subtilis, B.

clausii, B. coagulans y B. licheniformis (32 - 34). Las esporas de estos bacilos le otorgan una ventaja

sobre las bacterias Ácido Lácticas por su estructura de resistencia, pues ayuda la supervivencia en

el tracto gastrointestinal confiriéndole tolerancias a pH bajos y tensores como las sales biliares.

Esta estructura también otorga un interés comercial, pues una vez el preparado haya sido

desecado no hay pérdidas de viabilidad aun si se almacena en temperatura ambiente, ahorrando

costos de refrigeración que pueden tener los demás biopreparados (31).

Algunos de los productos más comercializados que contienen esporas de B. subtilis son: Bio-Kult®,

biopreparado comercializado en el Reino Unido, Biosporin® de Ucrania, Medilac-Vita® de China y

Primal Defense de los Estados Unidos (31).

En Japón se comercializa un producto de la fermentación de soja conocida como Natto. Este

alimentos se ha caracterizado por tener esporas viables de una cepa de B. subtilis con la que se

han realizado estudios revelando que tiene la capacidad de reducir la coagulación de la sangre por

fibrilosis causada por la secreción de la enzima Natoquinasa (enzima reconocida como GRAS en los

Estados Unidos) (35).

Para la agricultura, este microorganismo está teniendo gran auge pues se ha demostrado que

reduce la infección en cerdos y aves de Salmonella enterica, Clostridium perfringes y E. coli

078:K80 por competencia de espacio y nutrientes (36, 37), además de producir Amicoumacina, un

antibiótico con actividad demostrada in vitro contra el patógeno tropical Helicobacter pylori (38).

Por otro lado, se ha cuestionado mucho la capacidad de estos microorganismos de ser probióticos,

puesto que se conoce que en ciertas bacterias, la espora es un factor de patogenicidad como en

especias de Clostridium. Especies de Bacillus como las aisladas en este estudio (B. licheniformis y B.

pumilus) han tenido recientes estudios en cuanto a su toxicidad en la veterinaria. Nieminen y

colaboradores (2007) encontraron 4 bacterias que pertenecían a las especias de B. pumilus y B.

licheniformis produjeron toxinas termo estables no proteicas en la leche bovina. Mencionaron que

las cepas de B. licheniformis eran similares genéticamente (en genes codificando para la

producción de toxinas) a B. cereus productor de toxina entérica termo estable causante de

diarreas y vómitos (39, 40).

Sin embargo, no todas las bacterias esporuladas aisladas en este estudio diferentes de B. subtilis

son reportados como patógenos; B. megaterium tiene aplicaciones agrícolas de gran interés

diferentes de probiosis. Padgham y Sikora en el 2007, Kildea y colaboradores en el 2008 y Kong y

colaboradores en el 2010 han demostrado que este microorganismo puede ser usado como

biocontrolador en diferentes cultivos contra fitopatógenos. Padgam y Sikora encontraron que B.

megaterium tiene actividad antagónica contra Meloidogyme gramicola, nematodo que afecta

cultivos de arroz aerobios (no inundados), reduciendo la atracción del nematodo a penetrar las

raíces del cultivo previniendo así la infección (41). Kildea y colaboradores revelaron que B.

megaterium también puede ser usado para reducir la enfermedad del trigo conocida como

Septoriosis que evidenciada por manchas en el área foliar. En el estudio mostraron como la

mancha foliar se reducía inoculando al bacilo Esporulado en plantas infectadas con el fitopatógeno

Mycosphaerella graminícola (42). En China, Kong y colaboradores (2010) mostraron que otro

fitopatógeno (Aspergillus flavus) se veía inhibido tanto in vitro como in vivo por B. megaterium

reduciendo la incidencia de la enfermedad causada por A. flavus en los granos de maní (43).

En cuanto a levaduras, el microorganismo objetivo eran especies de Saccharomyces, más

específicamente S. boulardii o Saccharomyces cerevisiae. Por el contrario, sólo se identificaron

levaduras de los géneros Candida, Geotrichum, Kloeckera y Cryptococcus. Esto se debe

principalmente a que las levaduras no son microorganismos propios del intestino animal, sino que

generalmente su presencia es transitoria dependiendo de la dieta suministrada.

Ninguna de las cepas identificadas en este estudio ha tenido reportes de capacidad o aplicabilidad

probiótica. La gran mayoría son objeto de estudio clínico, pues se consideran patógenos, o

patógenos oportunistas (44, 45).

Candida dubliniensis ha sido asociada a estomatitis protésica (proceso inflamatorio de la mucosa

oral asociada a especies de Candida) junto con C. albicans (44). C. parapsilosis es la segunda

levadura más comúnmente aislada en muestras de sangre en hospitales de Estados Unidos,

Canadá y América Latina. A pesar de su baja patogenicidad, este microorganismo tiene capacidad

de destrucción de tejidos epidérmicos y orales (45).

Otros géneros de levaduras también considerados patógenos aislados e identificados en este

estudio son Geotrichum y Cryptococcus. El primero está asociado a infecciones sistémicas que

resultan graves especialmente para la población inmunosuprimida con una tasa de mortalidad

entre el 60 y el 80% de la población infectada en condiciones de baja inmunidad. Cryptococcus es

una levadura encapsulada sin discriminación en huéspedes de infección (40).

Kloeckera es junto con Saccharomyces cerevisiae la levadura que se encuentra más

frecuentemente en los mostos para la producción del vino. Está relacionada con fermentaciones

no deseables en la bebida alcohólica puesto que produce muchos ácidos volátiles (46).

Por otro lado, ciertas levaduras aisladas en este estudio tienen aplicación industrial como es el

caso de Candida rugosa. Domínguez de María y colaboradores (2006) publicaron un reporte en

cuanto a las lipasas producidas por esta levadura. Estas lipasas han sido ampliamente usadas en

tecnologías de fermentaciones, ensayos biocatalíticos, detergentes y solventes (47).

Levaduras ampliamente reportadas en el campo probiótico son Saccharomyces cerevisiae y S.

boulardii. Ortiz y Reuto en su estudio del 2007 mostraron mediante la evaluación in vitro de S.

cerevisiae su capacidad de tolerancia a sales biliares desde 0.5% hasta 3.0%, estabilidad ante

enfrentamiento a jugos gástricos, reducción de 54% de colesterol en 12 horas y adherencia celular

con la línea celular Caco-2 (48).

De manera similar, Le Bon y colaboradores en el 2010 investigaron la influencia de S. cerevisiae

ssp. boulardii en la salud intestinal de cerdos de edad temprana enfocado a los valores de

producción animal en cuanto al destete del cerdo. Encontraron que la adición de este

microorganismo en la dieta del animal beneficia a la flora de las bacterias Ácido Lácticas y reduce

la población de E. coli (49).

9. CONCLUSIONES

Las muestras procesadas presentaron una alta carga microbiana, especialmente la

evidenciada en el medio de cultivo MRS (entre 104 y 108 UFC/mL) mostrando un amplio

potencial para el trabajo con estos microorganismos hacia el beneficio de la industria

agropecuaria.

Se aislaron bacterias Ácido Lácticas reportadas con capacidad probiótica (8 Lactobacillus

rhamnosus, 7 Lactobacillus pentosus, 5 Lactococcus lactis ssp. lactis y 5 Lactobacillus

paracasei ssp. paracasei)

Se aislaron bacterias Esporuladas reportadas con capacidad probiótica (19 Bacillus subtilis

/ amyloliquefaciens)

No se hallaron géneros de levaduras reportadas como probióticas.

10. RECOMENDACIONES

Para dar continuación al proyecto se sugieren pruebas de capacidad probiótica in vitro

como adhesión celular, producción de bacteriocinas, tolerancia a pH, tolerancia a sales

biliares, tolerancia a jugos gástricos, reducción de colesterol y antagonismo contra

patógenos.

Con el fin de tener una mayor precisión en cuanto a la identificación de los

microorganismos, se sugiere la secuenciación de la subunidad 16s del RNA.

Si se desea obtener una variedad mayor de bacterias Ácido Lácticas se sugiere el uso de

cámaras de anaerobiosis para el aislamiento de microorganismos con el fin de obtener

aquellos que sean anaerobios estrictos.

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11. ANEXOS

Anexo 1:

Tabla VI: Resultados de recuento en placa de las muestras analizadas. M(#): Muestra. Fuente:

Elaboración propia Muestr

a

MRS Plate Count YGC

M1 M2 M3 M4 M5 M1 M2 M3 M4 M5 M1 M2 M3 M4 M5

Heces

avícolas

1

5,2E

7

8,2E

7

9,8E

6

2,1E

7

4,8E

7

5,2E

3

1,8E

3

8,0E

3

7,9E

2

2,7E

3

4,7E

5

5,8E

5

2,7E

5

5,1E

6

8,6E

5

Heces

avícolas

2

3,9E

7

4,9E

8

1,1E

8

2,5E

8

4,3E

7

4,5E

4

5,9E

4

6,2E

3

5,2E

4

8,2E

3

2,9E

5

9,6E

4

5,6E

4

4,9E

5

6,6E

5

Heces

porcícol

as 1

2,2E

9

5,8E

8

2,9E

8

6,9E

9

4,1E

9

5,9E

5

4,1E

3

8,6E

5

3,2E

4

4,8E

3

8,5E

6

6,0E

5

1,9E

6

9,2E

5

9,8E

6

Heces

porcícol

as 2

8,9E

8

4,6E

8

2,9E

9

5,5E

8

1,2E

9

2,5E

3

6,5E

4

2,4E

4

5,8E

3

3,0E

4

2,8E

7

4,5E

7

9,2E

7

5,0E

6

4,7E

7

Heces

caninas

6,9E

5

1,6E

4

1,6E

6

4,1E

5

2,0E

6

<1,0

E1

<1,0

E1

<1,0

E1

<1,0

E1

<1,0

E1

<1,0

E1

<1,0

E1

<1,0

E1

<1,0

E1

<1,0

E1

Heces

bovinas

1

9,0E

5

9,6E

6

1,1E

7

2,9E

6

6,3E

9

1,2E

6

7,0E

4

8,9E

4

3,8E

5

3,2E

5

4,0E

4

6,2E

3

7,4E

3

2,0E

4

7,7E

3

Heces

bovinas

2

1,3E

8

5,5E

7

5,1E

7

1,3E

8

4,4E

7

1,2E

6

7,1E

4

4,9E

5

1,3E

5

3,2E

5

4,0E

3

1,2E

4

2,1E

4

5,6E

4

2,2E

3

Anexo 2

Tabla VII: Ejemplos de criterios de selección según morfologías y coloraciones de Gram para la purificacion de microorganismos obtenidos en los muetreos.

Tipo de microorganismo Morfología

Bacteria Ácido Láctica

Bacilo Gram Positivo

Coco Gram Positivo

Bacteria Esporulada

Bacilo Gram Positivo con espora central

Levadura

Levadura ligeramente ovoíde de gemación única

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