ORGANIZACIÓN DEL CEPARIO DE MICROORGANISMOS …

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ORGANIZACIÓN DEL CEPARIO DE MICROORGANISMOS RIZOSFÉRICOS DE CULTIVOS DE VID, Vitis vinífera L.

VARIEDAD Riesling x Sylvaner.

GLORIA PATRICIA MUÑOZ FIGUEROA MAGDA JULIANA RODRIGUEZ RODRIGUEZ

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGIA CARRERA DE BACTERIOLOGIA

Santa Fe de Bogotá, D.C. 2000.

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__________________ Marcela Franco C.

Directora.

________________ David Gómez

Asesor.

__________________ Ximena Sanchez

Asesora.



Santa Fe de Bogotá, D.C 2000.

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TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial

Para optar el título de

BACTERIOLOGAS




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________________________ Doctor. Hernando Valencia Docente del departamento de Biología. Universidad Nacional.

________________________ Doctora Myriam de Rico Docente del departamento de Microbiología. Universidad Javeriana.




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________________________ Doctor. Carlos Corredor Ph.D Decano académico Facultad de Ciencias Básicas.

________________________ Doctora Aura Rosa Manascero Directora de Carrera Bacteriología.




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LOS CRITERIOS EXPUESTOS, LAS OPINIONES EXPRESADAS Y LAS CONCLUSIONES ANOTADAS SON

RESPONSABILIDAD DE LOS AUTORES Y NO COMPROMETEN EN NADA A LA PONTIFICIA UNIVERSIDAD

JAVERIANA.

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1. INTRODUCCION

En la historia se ha evidenciado que el cultivo de Vitis vinífera L. se convirtió

en un factor económico importante especialmente en los países

mediterráneos, puesto que no sólo el fruto producido por esta planta puede

ser consumido en estado fresco y seco, sino así mismo puede ser procesado

de tal forma que se generen vinos de óptima calidad (CHAUVET & REYNIER

1984).

Debido a esta clase de beneficios, actualmente existen otros países

localizados en Centro y Sur América que se han encargado de desarrollar

cultivos de Vid para no sólo mejorar su nivel económico, sino así mismo crear

nuevas fuentes de trabajo. Vale la pena mencionar a México, Perú,

Argentina, Chile y, sin lugar a dudas Colombia; teniendo en cuenta que éste

último inició su producción de uva hace setenta y un años en el

departamento del Valle del Cauca, zona tropical, sin importar que esta

especie es originaria de la zona templada del Asia Occidental, desde donde

se ha empezado a expandir la producción de Vid, debido a que en este

momento se pueden encontrar viñedos en otros departamentos del país

como lo son, Santander y Boyacá (MARRO, 1989).

El nivel rizosférico, es aquella porción del suelo sobre la cual influyen física,

química y biológicamente las raíces de las plantas. Desde el punto de vista

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agrícola, esta zona es de gran interés porque en ella se producen las

interacciones de los microorganismos y las plantas.

La microbiología del suelo, tiene como objetivo principal el estudio de la

población microscópica del suelo, las propiedades fisiológicas y bioquímicas

de los microorganismos, la participación que tienen en las numerosas

transformaciones para aumentar la fertilidad del suelo, el desarrollo de las

plantas, el rendimiento de las cosechas y la importancia que tiene esa

población para la nutrición de las plantas (HARVEY, 1976).

Cada suelo tiene su microflora y microfauna característica, correspondiente a

las cualidades de su entorno. El clima predominante y la especie de planta

cultivada también influyen notablemente en la naturaleza; y a su vez

aumentan o no la diversidad microbiana.

Las características del suelo para el cultivo de Vitis vinífera L. son de gran

interés para obtener excelentes recolecciones de frutos que beneficien a los

cultivadores, tanto en cantidad como en calidad, por lo tanto es de

importancia contar con estudios que evalúen y analicen el número de

variedades comerciales que predominan y las causas de enfermedades que

éstas pueden padecer.

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Por el interés de conocer los microorganismos rizosféricos que prevalecen en

los cultivos de vid de la variedad Riesling X Sylvaner, se introduce a la

elaboración de un cepario de microbiología, que permita a los estudiantes la

manipulación experimental de estos organismos y con el tiempo aumenten

las expectativas en el estudio no sólo de los microorganismos rizosféricos de

la vid, sino de otros cultivos relacionados con los microorganismos

involucrados en esta investigación.

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2. MARCO TEORICO.

2.1 CULTIVO VID.

La Vid pertenece a la familia Vitaceae, la cual reúne los arbustos trepadores

con zarcillos rameales, hojas alternas, flores pequeñas, inflorescencia en

racimo compuesto, fruto en baya, semillas de cubierta dura y albumen

carneo. Esta familia comprende 14 géneros entre los cuales se puede

mencionar el de Vitis.

Las plantas de vid cultivadas corresponden a variedades de la especie Vitis

vinífera L.; cada variedad se distingue por la morfología de sus órganos y

particularmente por la vellosidad, la forma y el color de la sumidad, de las

hojas jóvenes, de las hojas adultas y de los racimos (CHAUVET & REYNIER,

1984).

2.2 CULTIVO VID EN COLOMBIA

La vid fue introducida en Colombia posiblemente durante los años de

expansión de los cultivos en América (1920-1930); en 1925 se introdujeron

las primeras plantas por Don Inocencio Franco, al Valle del Cauca, años más

tarde se fue diseminando el cultivo por todo el país, entonces se

establecieron plantaciones en la hoya del río Tequendama; región

comprendida entre Cúcuta y San Antonio, en Villeta y la Mesa

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(Cundinamarca), en poblaciones de los departamentos de Atlántico y Bolívar,

en poblaciones del departamento de Antioquia y recientemente en el Valle de

Sogamoso en Boyacá (RUIZ, 1976).

El cultivo se encuentra principalmente en explotaciones pequeñas ocupando

buena cantidad de mano de obra; el Valle del Cauca, zona tropical, es el

departamento número uno en producción de uva en Colombia, con más de

300 hectáreas cultivadas desde hace 61 años, destacándose los municipios

de Bolívar, Roldanillo, la Unión, Toro, Tulúa, Guacarí, Ginebra y Cerrito.

(BAYONA & SANCHEZ, 1992)

En el Valle del Cauca, la vid crece, se desarrolla y produce bien entre los 800

y 1600 metros sobre el nivel del mar a condiciones tropicales, cada planta

produce dos cosechas al año, gracias a la intervención del hombre por medio

de la poda, con la que rompe el descanso que aproximadamente es de dos

meses, situación favorable para exportar fruta tanto en el hemisferio norte

como al hemisferio sur, con grandes ventajas comparativas y competitivas

por la época y la calidad de la fruta.

2.2.1 CULTIVO VID EN BOYACÁ.

Entre 1926 y 1930, fueron introducidas las primeras vides al departamento de

Boyacá, por la comunidad de los jesuitas en la hacienda de la “Compañía” en

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el municipio de Firavitoba, con el fin de obtener el vino que utilizan para

consagrar en las ceremonias religiosas, porque les resultaba más fácil

producirlo que traerlo de España; esta actividad se mantuvo hasta la

expulsión de la comunidad de los Jesuitas, por Carlos III, quien también

ordenó erradicar los viñedos. Algunos vestigios de vides, posiblemente de

las mismas variedades, sobreviven hoy en los patios de casas en Firavitoba,

Iza, Tibasosa, Monguí, Corrales, Tuta, Sogamoso entre otros, que se han

mantenido por muchos años sin ningún tipo de cuidado, ni labor cultural.

Otras evidencias de existencia de viticultura en la zona, en tiempos pasados,

es la decoración con hojas de vid y racimos de uvas de las cúpulas de las

iglesias de Monguí, Oicatá y Santo Domingo de Tunja.

Boyacá tiene un gran potencial para la viticultura de alta calidad; cuenta con

los tres factores más importantes que son clima, suelo y variedades de uva

(REVISTA CARTA GANADERA, 1984.)

2.2.2 CULTIVO VID EN LA FLORESTA.

A comienzos de 1998, el alcalde de la Floresta, Ingeniero Hernando

Salamanca Álvarez manifestó interés por adelantar un programa de

viticultura en el municipio, fue así como se concretó la siembra de 11.000

plantas de vid, las que fueron distribuidas entre 23 agricultores cuya cantidad

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oscilaba entre 200 y 1000, de algunas de esas plantas ya se obtuvo la

primera cosecha.

La finca del Señor Próspero Naranjo donde se realizó el presente estudio,

inició con 260 plantas, pertenecientes al programa adelantado por el alcalde

del municipio. Observando buena adaptación y desarrollo, aumentó el

viñedo a 500, continuando con 100 más y en este momento cuenta con 900

vides, de las cuales las primeras que son objeto del presente trabajo ya

dieron la primera cosecha.

Actualmente observando los resultados obtenidos el interés tanto del alcalde

como de los viticultores es ampliar el número de vides (REVISTA CARTA

GANADERA, 1984).

2.3 CARACTERÍSTICAS CLIMÁTICAS.

Para el óptimo desarrollo de la vid y de su producto, la uva, se necesitan

prolongadas estaciones de verano, calientes y secas, e inviernos fríos. Estas

condiciones, propias de los países con clima sub-tropical pero no de países

del trópico, donde la temperatura es similar durante todo el año.

La temperatura es un factor primordial, dependiendo de esta se puede

presentar una alta o baja incidencia de enfermedades fungosas; como es el

caso de las variedades que han logrado adaptarse en climas tropicales, la

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alta humedad relativa que impera en esas regiones (clima tropical) permite la

alta incidencia de enfermedades fungosas limitando en forma considerable el

cultivo.

Los fenómenos meteorológicos, ejercen su influencia en la vida y desarrollo

de la vid, es decir que el ciclo vital de la planta depende principalmente de la

temperatura, la cual regula las épocas de brotación, floración, envero, entre

otros. Se deduce que la vid no vivirá igualmente en todos los climas, sino

que existirán climas que serán más favorables para su desarrollo y habrán

otros en los cuales no puede vivir.

A condiciones climáticas favorables, condiciones del sub-trópico, las plantas

comienzan a crecer en la primavera, inmediatamente la temperatura media

alcanza los 10 ºC. Anterior a este periodo las plantas han descansado por 3

meses en invierno, a –10ºC. Por el contrario, para el desarrollo de las

plantas y la maduración de sus frutos, se necesitan temperaturas mayores a

18ºC hasta 25ºC (RUIZ, 1976).

La temperatura ejerce gran influencia en los factores que afectan la calidad,

como contenido de acidez y azúcar y la coloración externa.

No todas las variedades de Vitis vinífera L. se comportan o responden de

igual forma al factor climático; distribución de las lluvias, insolación y

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temperaturas, pero la mayoría se comportan de modo similar (MARRO,

1989).

Las investigaciones y experiencias que se han desarrollado a través de los

años, la gran adaptación a variaciones de temperatura le han permitido vivir a

la vid en los países de clima templado, lo mismo en Europa que en América,

lo mismo que en Africa en Asia, Francia o Grecia, Argelia o Turquía,

Rumania o Chile, Argentina o Colombia, ya sean selectos productores de

ricos vinos o de excelentes uvas de mesa (HARVEY, 1976).

2.4 CARACTERÍSTICAS DEL SUELO.

Comercialmente, las vides se cultivan en el mundo entero, lo cual demuestra

que crecen en muchos y diferentes tipos de suelos; que varían desde los

arenosos hasta los arcillosos, desde los poco profundos hasta los muy

profundos y desde los muy fértiles hasta los de baja fertilidad (CHAUVET &

REYNIER 1984).

La vid prefiere los suelos de tipo medio, aquellos que se caracterizan por

presentar una capa arable y un subsuelo bien aireado. Los suelos arenosos,

sueltos, poco fértiles asimilan bien los abonos químicos u orgánicos que se

les apliquen (CHAUVET & REYNIER 1984).

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Los suelos destinados a la viticultura deben ser mas bien pobres, de poca

fertilidad, con texturas que van de francoarcillosa a francoarenosa y pH de

5.3 a 7.0 (MARRO, 1989).

Los terrenos arcillosos, se mantienen fértiles pero no son de fácil manejo, por

esto son poco recomendados para la vid. Los suelos areno-arcillosos, dan

mejores resultados para el desarrollo de vid; si encuentra suficiente humedad

y poca sal. El problema de fertilidad del suelo en sí no es un problema serio,

debido a que el hombre puede cambiar ciertas características de éste, las

prácticas de cultivo y la maquinaria, pero no puede modificar el clima, la

altitud, ni la exposición al sol, condiciones naturales que influyen de manera

irreversible en la calidad de la uva o del vino que se produzca (MARRO,

1989).

Para obtener los mejores resultados en los cultivos de las vides es necesario

evitar suelos muy pesados, poco profundos, con altas concentraciones de sal

y mal drenaje. Se recomiendan terrenos con buenas propiedades físicas,

livianos, pedregosos, de grano fino, textura media, profundos, permeables,

con buen drenaje, suficiente materia orgánica y buena capacidad de

retención de agua que faciliten la aireación y el descenso de las aguas;

evitando ambientes húmedos, favorables para enfermedades fungosas

(MARTIN, 1980).

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2.5 EL SUELO Y SUS PRINCIPALES MICROORGANISMOS.

Un suelo maduro es el resultado de una mezcla compleja de compuestos

orgánicos e inorgánicos, la combinación de la roca madre, topografía, clima,

tiempo y actividad biológica. En un buen terreno agrícola la materia mineral

procedente de las rocas erosionadas normalmente alcanza el 50% del

volumen, la fracción orgánica derivada de las plantas, animales y

microorganismos, el 10 – 15%. En su gran mayoría el volumen restante está

ocupado por aire y por agua, encajados en un sistema de poros y canales en

donde la relación entre aire y poros está en función del contenido del agua

del suelo. Los organismos vivos ocupan menos del 1% del volumen total; las

diferentes clases de microorganismos se relacionan con los diferentes tipos

de suelo, las diferencias estacionales del mismo suelo, la profundidad de sus

perfiles y demás. Se ha concretado que el número de microorganismos se

relaciona con la humedad, el pH, el contenido orgánico y la temperatura. Así

los suelos neutros fértiles en áreas relativamente cálidas y lluviosas tienden a

presentar las cifras más elevadas de microorganismos. La correlación

particularmente significativa entre el contenido orgánico y los recuentos

microbianos se evidencia por el número incrementado de microorganismos

en la rizosfera y la asociación de estos con las capas de humus en los

perfiles de suelo. Así, el recuento mayor se halla en el estrato superior,

correspondiente al horizonte A, rico en humus, apareciendo un segundo pico

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de recuento en los podsoles dentro del estrato superior rico en humus del

horizonte B. Existen estimaciones para varios tipos de microorganismos

determinados por el procedimiento del recuento de gérmenes. Tabla 1.

(GRANT, 1989).

Tabla 1. Estimaciones de varios tipos de microorganismos determinados por el procedimiento de recuento de gérmenes viables (10 –3 g).

Horizonte Bacterias Aerobias

Actinomycetos Bacterias Anaerobias

Hongos

Tierras marrones A (Superior) A (Inferior) B (Superior) B (Inferior)

9.500 2.000

10 1

1.800 150

0 0

2.000 400

0 0

400 50

6 3

Podsoles A (Superior) A (Inferior) B (Superior) B (Inferior)

5.200 1.800 2.900

80

600 50

180 40

1.000 10

100 10

580 230 400

10

(GRANT, 1989).

El suelo se desarrolla cuando la roca sufre cambios conocidos como erosión

atmosférica. La roca madre se disgrega en pequeños fragmentos por las

oscilaciones térmicas, la acción del agua, alcalinidad o acidez extremas y

otras acciones químicas producidas por la actividad biológica. Los elementos

que más abundan en el suelo son Si, Al, Fe y O, básicamente en forma de

silicatos; por otra parte se encuentran fósforo orgánico el cual es difícilmente

asimilable por las plantas, polisacáridos como: celulosa, peptinas y

hemicelulosas y humus, que constituye la mayor parte de la materia orgánica

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de los suelos y es un residuo pardo insoluble en ácidos (MAYEA & NOVO,

1991).

El suelo es un gran depósito para los organismos, y casi todos los seres.

Con respecto a las bacterias, el aislamiento y la identificación dependen de la

capacidad de cultivar el microorganismo y de las técnicas empleadas. En

general la mayoría de la población bacteriana organotrófica aerobia de gran

parte de los suelos está compuesta por géneros Gram positivos; no sería

extraño encontrar que hasta el 70% de la totalidad de los aislamientos

bacterianos del suelo pertenezcan al género Arthrobacter, siendo la mayoría

de la microflora aerobia restante Bacillus sp. y Micrococcus sp. La población

Gram negativa en su mayor parte se compone por Pseudomonas sp. y

Flavobacterium sp (GRANT, 1989).

El género más representativo de los actinomycetes es Streptomyces, a estos

procariotas se debe el olor característico a tierra húmeda generado por la

producción de geosminas (GRANT, 1989).

Los hongos imperfectos de los géneros Penicillium sp., Aspergillus sp.,

Cephalosporium sp., Cladosporium sp. son aptos para ser aislados, porque

las conidias son producidas abundantemente. Existen muchos ascomycetes

y basidiomycetes diferentes presentes en el suelo que muestran una

distribución geográfica destacada, a diferencia de la mayoría de los hongos

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imperfectos. Lo más probable es que los hongos imperfectos constituyan el

grupo principal, especialmente en condiciones de sequía. Es necesario tener

en cuenta que el suelo contiene un gran grupo de hongos de micorriza no

cultivables, que incluye los arbusculares.

En los últimos años los investigadores se han preocupado por el aislamiento,

identificación y descripción de los microorganismos del suelo, entre los

cuales se pueden mencionar: los actinomycetes, las bacterias y los hongos,

teniendo en cuenta que éstos han influido en numerosos procesos que son

de considerable importancia a nivel rizosférico (MARTIN, 1980)

Con el análisis del suelo se estudia la población microscópica que habita en

éste, logrando obtener resultados que beneficien a las plantas, para que así,

las cosechas tengan un óptimo rendimiento, puesto que en éste se sustenta

la vida vegetal (ALEXOPOULOS, 1976).

2.5.1 BACTERIAS.

2.5.1.1 BACTERIAS NO FILAMENTOSAS

Las bacterias son los organismos más abundantes en el suelo, su presencia

se ha detectado en los más diversos ecosistemas y regiones del planeta.

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Las formas más comunes que se hallan en el suelo son los bacilos, los cocos

y los espirilos. El número de las células bacterianas en suelo es grande pero

estas son muy pequeñas en tamaño, difícilmente miden unos cuantos

micrómetros de longitud. A esto se debe que las bacterias representen

mucho menos de la mitad de la masa celular microbiana total (NOVO &

MAYEA, 1991).

Los hongos y las bacterias prevalecen en suelos poco aireados, pero estas

últimas tiene la capacidad de generar todos los cambios químicos y

biológicos en ambientes que poseen niveles bajos de oxígeno, o que no

existe la presencia de éste.

Las bacterias del suelo se dividen en dos grandes grupos: las especies

nativas o autóctonas, estos son residentes verdaderos, se pueden presentar

en estados resistentes y perduran por largos periodos sin tener alguna

actividad metabólica, en un momento determinado estas formas nativas

proliferan y participan en las funciones bioquímicas de la comunidad

(MARTIN, 1980) y los organismos invasores o alóctonos, que no participan

de manera significativa en las actividades de la comunidad. Por medio de la

precipitación entran en tejidos enfermos, estiércol o aguas negras y pueden

permanecer por algún tiempo como formas inactivas e incluso crecen por

periodos cortos.

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La cantidad y el tipo de bacterias se determinan en gran medida por el tipo

de suelo y las prácticas de cultivo. La abundancia aumenta conforme se va

de zonas más frías a zonas más cálidas. El contenido de materia orgánica

del hábitat influye en gran parte sobre la densidad bacteriana, esto nos indica

que el número de bacterias es mayor en zonas cultivadas que en zonas

vírgenes (ALEXOPOULOS, 1976).

Entre los géneros más comúnmente aislados de diferentes suelos se

encuentran: Acinetobacter sp., Agrobacterium sp., Alcaligenes sp.,

Arthrobacter sp., Bacillus sp., Brevibacterium sp., Caulobacter sp.,

Cellulomonas sp., Clostridium sp., Corynebacterium sp., Pedomicrobium sp.,

Pseudomonas sp., Sarcina sp., Staphylococcus sp., Streptococcus sp. Y

Xanthomonas sp. (NOVO & MAYEA 1991).

2.5.1.2 ACTINOMYCETES.

Los actinomycetes son bacterias filamentosas Gram positivas, abundantes y

ampliamente distribuidas en el suelo, en las aguas de charcos, lodos y

abonos orgánicos. Son organismos de nutrición heterótrofa, con

requerimientos nutricionales muy variados, porque son capaces de utilizar

una amplia diversidad de fuentes de carbono entre los que se hallan

azúcares simples, proteínas, ácidos orgánicos y una significativa colección

23

de sustratos complejos como celulosa, lignina, quitina y parafinas (MAYEA &

NOVO, 1991).

Abundan más en los suelos secos que en los húmedos, así como se

desarrollan también en suelos alcalinos, el pH óptimo para su crecimiento es

el neutro. Son microorganismos que producen filamentos delgados que

pueden ser bastante largos, aunque en algunas ocasiones son cortos, y

pueden fragmentarse en muchas unidades más pequeñas; también, son

ramificados y se desarrollan en un micelio en todos los géneros del suelo.

Muchos de los actinomycetes forman sobre sus filamentos propágulos

asexuales, los cuales son comúnmente conocidos como conidias, aisladas,

en pares o formando cadenas, mientras que otros habitantes rizosféricos

producen los propágulos en una estructura especializada conocida como

esporangio (ALEXOPOULOS, 1976).

Las conidias indican la resistencia de estas estructuras a condiciones

ambientales nocivas, es decir que desempeñan una función de

sobrevivencia. Muchas cepas tienen propágulos resistentes a la desecación;

estas conidias permanecen por muchos años en suelos secos (MARTIN,

1980).

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En relación con las bacterias, en algunas ocasiones existe la presencia de

flagelos semejantes a los de bacterias verdaderas, relación en la

composición de la pared celular y la sensibilidad a inhibidores antibacterianos

y no a inhibidores antifúngicos. Además, son semejantes en cuanto a la

morfología y el tamaño de los filamentos, las conidias y los fragmentos

individuales de las especies cuyo micelio sufre segmentación. Se debe tener

en cuenta, que como se mencionó anteriormente existen algunos

actinomycetes que producen micelio aéreo, lo cual los hace bastante

semejantes a los Mycobacterium y a las bacterias corineformes en su

morfología general; también, en los métodos de tinción, debido a que

reaccionan con el método de Gram y en cuanto a la fisiología (NOVO &

MAYEA, 1991).

Existen medios de cultivo que son óptimos para el crecimiento de los

actinomycetes, uno de estos es el Agar Avena, en el cual se pueden

desarrollar perfectamente colonias macroscópicamente distintas a las

colonias bacterianas, desarrollando masa de filamentos ramificados que se

originan de un fragmento de micelio; estas colonias pueden tener una

consistencia firme y se pueden adherir fuertemente al sustrato solidificado;

en algunos actinomycetes la superficie parece pulverulenta y con frecuencia

llega a pigmentarse, en algunos casos se desarrolla un micelio sencillo

dando a las colonias una consistencia harinosa. (NOVO & MAYEA, 1991).

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Es importante recordar, que las bacterias son derivadas por una sola célula

por fisión binaria, pero los actinomycetes por el contrario, antes de la

esporulación, constan de un organismo, un micelio derivado de una sola

unidad de propagación (FARB, 1965).

Para los actinomycetes, la materia orgánica, el pH, la humedad y la

temperatura son los determinantes ecológicos principales. Estos

microorganismos no toleran valores bajos de pH; en cuanto a la humedad,

cuando existen condiciones de inundación o los niveles de agua sobrepasan

entre un 80 a 100% estos microorganismos aparecen muy raramente. Lo

anterior es debido a que en algunas especies de actinomycetes comunes de

suelo tienen metabolismo aeróbico, y por lo tanto son incapaces de

desarrollarse cuando el O2 es relativamente escaso; en cuanto a los estados

de sequedad, estos microorganismos no se ven afectados debido a que

favorece a los grupos filamentosos en su desarrollo vegetativo como en la

formación de conidias. (WILLIAMS, 1984).

De los géneros, el más común es Streptomyces. La mayoría de los

estreptomycetes aislados del suelo presentan la gran capacidad de producir

antibióticos de importancia médica e industrial, tales como: Estreptomicina,

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Cloramfenicol, Tetraciclina, Neomicina, Nistatina y otros, bajo condiciones de

laboratorio y a nivel comercial (BALOWS, 1991).

Los antibióticos en el suelo, son capaces de controlar enfermedades de

plantas mediante la acción directa sobre el patógeno, actuando en el

hospedero, provocando transformaciones de sustancias sin la participación

de la planta, neutralizando toxinas secretadas por el patógeno o una

combinación de dos o más de uno de estos efectos (NOVO & MAYEA, 1991).

2.5.2 HONGOS.

Los hongos se reconocen como los microorganismos que hacen parte de

una significativa cantidad de biomasa en el suelo, debido al diámetro de sus

filamentos y a la extensa red de micelio que forman; la cual está constituida

por cadenas de hifas independientes. Estos microorganismos predominan

en el lecho en descomposición, en general, son los principales agentes de

descomposición en los ambientes ácidos (ALEXOPOULOS, 1989).

Algunos hongos presentan septos en su micelio, que en compañía con las

paredes transversales hacen que éste pueda subdividirse en células

individuales. Una de las diferencias de los hongos frente a los actinomycetes

es la existencia de hifas más anchas para los hongos, además, las que no

poseen septos son continuas y multinucleadas sin la presencia de las

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paredes transversales. Las hifas individuales pueden ser vegetativas o

fértiles, cuando son fértiles tienen la capacidad de producir las esporas

sexuales que no son muy comunes y su micelio es incoloro en medios de

cultivo; o asexuales que son abundantes y están bastante diseminadas,

además en medios de cultivo su micelio es bastante coloreado (NOVO &

MAYEA, 1991)

Para el estudio de los hongos, la técnica que se ha usado con mayor

frecuencia es aquella donde la muestra de suelo es suspendida en agua

estéril, y después de una completa homogenización se procede a realizar

una serie de diluciones que van a ser suspendidas en un medio de cultivo

donde no se puedan desarrollar las bacterias, es por esto, que los primeros

microbiólogos resolvieron el problema acidificando el medio de cultivo a pH

4.0. Otra forma que idearon para inhibir el crecimiento de bacterias es

adicionándole al Agar antibióticos, como: Penicilina, Novobiocina,

Vancomicina y Estreptomicina (MARTIN, 1980).

El desarrollo de un microorganismo depende del hábitat en que éste se

encuentre; existen diferentes características ambientales que benefician a la

comunidad de los hongos incluyendo el estado de la materia orgánica,

concentración del ión hidrógeno, fertilizantes orgánicos e inorgánicos, el nivel

de humedad, aireación, temperatura, estación del año y la composición de la

vegetación (MARGALEF, 1995).

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La temperatura es uno de los factores físicos limitantes dentro del ambiente y

desempeña un papel decisivo en la distribución de los seres vivos. La

mayoría de los hongos son mesófilos en sus requerimientos de temperatura

para el crecimiento, con un mínimo entre 5 y 10ºC y un máximo entre 30 y

40ºC. Algunos hongos resisten temperaturas entre 40 y 50ºC (GRANT,

1989).

La nutrición de los hongos es heterótrofa y ni la luz solar, ni la oxidación de

sustancias inorgánicas proporcionan a estos microorganismos la energía

necesaria para su crecimiento, por lo cual se infiere la importancia que para

su desarrollo tiene la presencia de materia orgánica. Una gran variedad de

sustancias orgánicas naturales son descompuestas por los hongos del suelo,

entre las que se encuentran azúcares simples, alcoholes, aminoácidos y

polímeros como la lignina, celulosa, hemicelulosa, proteínas y los ácidos

nucléicos (MARGALEF, 1995).

El número de hongos filamentosos en el suelo varía directamente con el

contenido de materia orgánica utilizable; sin embargo, este grupo microbiano

se encuentra aún en áreas de bajo nivel de materia orgánica. Mejorando los

niveles nutricionales mediante la incorporación de restos de cultivo, abonos

verdes u otros materiales carbonados en el suelo, se incrementa el tamaño

de la comunidad. Al mismo tiempo, la aplicación de sustratos orgánicos

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altera la composición de la flora y se afecta marcadamente el dominio relativo

de géneros como Penicillium, Trichoderma, Aspergillus, Fusarium y Mucor

(NOVO & MAYEA, 1991).

Muchas especies pueden desarrollarse dentro de un amplio intervalo de pH,

desde el extremo ácido al alcalino. En cultivo no es rara la capacidad de

crecer a valores de pH tan bajos como 2.0 – 3.0 y muchas cepas son aún

activas a pH de 9.0 o más. La sensibilidad al pH puede ser de gran

importancia para los agentes patógenos de las plantas que se originan en el

suelo, las cuales, como consecuencia del intervalo de pH en el cual se

desarrollan, pueden ser más destructivos en reacción ácida, neutra o alcalina

(GILMAN, 1988).

El agua es requerida para todos los seres vivos, es por esto que ésta tiene

un valor considerable sobre la abundancia y las funciones de los hongos. El

mejoramiento en la humedad del medio ambiente favorece al número de

hongos de modo que a niveles subóptimos de agua, su cifra está

correlacionada positivamente con la humedad. Sin embargo, estos

organismos pueden persistir en condiciones relativamente semiáridas y

pueden ser metabólicamente activos en lugares con bajo contenido de agua

(ALEXOPOULOS, 1989).

30

Los hongos filamentosos son aerobios estrictos aunque existen algunas

excepciones y algunas especies consideradas comúnmente como aerobias

obligadas, crecen en cierta medida cuando el O2 no está presente por más

tiempo. Sin embargo, aun entre los aerobios obligados parte del micelio

puede penetrar en lugares donde no hay O2 pero gran parte de la masa de

las hifas debe tener fácil acceso al aire (KORMONDY, 1978).

En cuanto a las estaciones climáticas, el calor de la primavera resulta

beneficioso en una región tropical la cual es más apta para los cultivos vid

en cuanto numero de cosechas al año; pero los periodos de sequía en

verano o el frío del invierno cobran sus víctimas. La disponibilidad de materia

orgánica está influenciada notablemente por la estación y los nutrientes

carbonados son abundantes en el otoño; lo cual significa que el número de

organismos tiende a elevarse durante el otoño y la primavera y

frecuentemente disminuye en los periodos secos del verano.

2.6 CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS.

El objetivo de la preservación de microorganismos en cultivo, es mantener

como referencia organismos vivos, libres de contaminación y sin variaciones

por mutación.

31

Se han empleado muchos métodos de preservación, pero no todas las

especies responden de manera similar, de hecho algunas cepas de la misma

especie responden diferente frente al mismo procedimiento (DAGUET, 1977).

La preservación de un cultivo depende del medio que se emplea; el

procedimiento, la edad y el tiempo de preservación que se requiera y son

particularmente acertados cuando se trabaja con bacterias que contienen

plásmidos o DNA recombinante, o que pueden presentar partes de

crecimiento como formación de esporas (DAGUET, 1977).

Tabla 2. Métodos de conservación de microorganismos a corto plazo.

a. Subcultivo. c. Congelación.

b. Inmersión en aceite mineral. d. Desecación.

(DAGUET, 1977)

Tabla 3. Métodos de conservación de microorganismos a largo plazo.

a. Liofilización. c. Altacongelación.

b. Criofijación.

(DAGUET, 1977)

32

2.6.1 CONSERVACION DE MICROORGANISMOS A CORTO PLAZO.

La preservación se efectúa por métodos muy rápidos, que muchas veces no

dan buenos resultados. Se logran mantener los microorganismos, utilizando

pequeños volúmenes repartidos sobre una gran superficie, por pocos meses

o años (DAGUET, 1977).

2.6.1.1 SUBCULTIVO.

El tradicional método de cultivo para preservación de microorganismo es muy

importante porque es altamente sensible y porque produce un gran número

de microrganismos vivos que brindan valiosa colaboración en estudios de

patogenicidad, sensibilidad a fármacos y otras propiedades biológicas del

microorganismo (KIRSOP, 1983).

El intervalo entre transferencias depende del organismo, del medio de cultivo

y la temperatura de almacenamiento, a alta contaminación no se puede

aplicar el subcultivo en áreas rurales debido a que se hace necesario el uso

de medios de cultivo fresco y preferiblemente simple ya que puede prolongar

la tasa de crecimiento del microorganismo por período entre fases (KIRSOP,

1983).

33

2.6.1.2 INMERSION EN ACEITE MINERAL.

Muchas especies pueden ser preservadas por meses e incluso años por un

medio relativamente simple y económico, la inmersión en aceite mineral.

Cuando se obtiene crecimiento en medio de cultivo apropiado y se está en

fase logarítmica o en la formación de esporas y/o conidias se procede a

agregar al medio inclinado una cantidad de 2 ml de aceite mineral estéril,

para prevenir la deshidratación y reducir la actividad metabólica y de

crecimiento del cultivo (KIRSOP, 1983).

2.6.1.3 CONGELACION.

Se recomienda evaluar diferentes temperaturas. Los daños o problemas que

pueden causar los cristales formados por las bajas temperaturas a las células

en congelación se pueden disminuir con la utilización de un agente

crioprotector como el DIMETIL SULFOXIDO (DMSO) y el glicerol que hace

por presión osmótica que el agua del interior de la célula migre al exterior

evitando así la cristalización del citoplasma (KIRSOP, 1983).

2.6.1.4 DESECACION.

Muchos cultivos mueren en ausencia de agua. Sin embargo, algunos en

especial bacterias esporo-formadoras pueden preservarse por años, por su

34

resistencia a la desecación, se pueden llevar a cabo con tiras de papel

impregnadas con el microorganismo y mantenidas en tubos tapa rosca,

gelatina a –20ºC o a temperatura ambiente, silica gel estéril o con perlas de

porcelana para la preservación de cultivos a temperatura ambiente

(DAGUET, 1977).

2.6.2 CONSERVACION DE MICROORGANISMOS A LARGO PLAZO.

Estos métodos actualmente dan los mejores resultados, logran mantener

los microorganismos por muchos años; manteniendo intacto la morfología y

comportamiento de las especies (DAGUET, 1977).

2.6.2.1 LIOFILIZACION.

Método más común de preservación de cultivos bacterianos usado por

muchos años; la liofilización consiste en la remoción de agua de la

suspensión bacteriana por sublimación a baja presión, así que el agua se

evapora sin pasar por fase líquida y las células liofilizadas pueden vivir en

ausencia de oxígeno y en la oscuridad y pueden ser fácilmente rehidratadas

para luego ser liofilizadas sin evidencia del traumatismo (FERNANDEZ,

1988).

Los cultivos liofilizados se pueden almacenar de 2 ºC a 8 ºC prolongándose

el promedio de vida de –30 ºC a -70 ºC pudiéndose rehidratar con la adición

35

de un caldo de cultivo e incubandolo por tiempo relativamente corto para ver

si se quiere volver a liofilizar (KIRSOP, 1983).

La liofilización es un método de conservación, que actualmente da los

mejores resultados, consiste en una desecación al vacío de los

microorganismos congelados y del líquido que los baña (FERNANDEZ,

1988).

La liofilización exitosa es posible para hormonas, péptidos, enzimas,

esteroides, ácidos nucleicos, antibióticos, vacunas, bacterias, virus y tejidos

biológicos. La estabilidad y el largo tiempo de almacenaje de estos

materiales es la principal ventaja del proceso de liofilización, por lo tanto, se

previene o limita la descomposición de la sustancia en solución acuosa, la

disminución de la actividad de componentes activos y la reacción química

entre dos o más de los componentes en la misma solución.

El proceso de liofilización se divide en tres partes principales:

• Congelación del producto en solución.

• El secado primario (sublimación)

• El secado secundario (post-secundario). (FERNANDEZ, 1988).

36

2.6.2.1.1 CONGELACIÓN.

Durante la congelación de una solución acuosa binaria diluida consistente de

un soluto en agua, el hielo puro se separa y la solución residual (fluido

intersticial), se vuelve más concentrada con respecto al soluto, hasta que se

forma una composición en la cual el agua y el soluto se solidifican. La

temperatura a la cual ocurre la solidificación final se le llama “temperatura

eutéctica”; esta es la temperatura más baja a la cual el material no congelado

existe en equilibrio con el material congelado (KIRSOP, 1983).

En un ciclo normal de liofilización, el material se enfría alrededor de 5ºC a

10ºC por debajo del punto eutéctico y se mantiene a ésta temperatura por lo

menos dos o tres horas con el fin de asegurar la completa solidificación,

elevando después la temperatura hasta la temperatura de secado

(sublimación); en esta etapa es importante que el agua esté completamente

congelada. La descongelación del agua causa el colapso de la pastilla, si

ésta contiene humedad (agua líquida por descongelación), o no puede

permanecer rígida como el soporte dado a ella por la masa congelada la cual

es removida por el proceso de liofilización. Si la liofilización es exitosa, en la

pastilla liofilizada al hacer cortes transversales, se observan perfectamente

los pequeños canales por donde sublima el agua. En caso de colapso, la

pastilla pierde su estructura porosa, bloquea el paso de vapor de agua y evita

37

el enfriamiento evaporativo, lo cual causaría una fusión total o parcial del

material remanente congelado (FERNANDEZ, 1988).

2.6.2.1.2 SECADO PRIMARIO.

Durante el secado primario (sublimación), el solvente (vapor) es extraído

directamente del material (congelado).

El secado empieza siempre por la parte superior del material congelado

(cuando se trata de masas congeladas en recipientes como ampolletas o

viales), o bien de la superficie exterior (cuando la masa congelada está en

forma esférica u otra semejante). En los lugares en donde sublima el hielo

se forman pequeños orificios que no se perciben fácilmente a primera vista;

para verlos con claridad, es necesario cortar la pastilla ya liofilizada

(FERNANDEZ, 1988).

A través de estos pequeños orificios, el agua en forma de vapor escapa de

las capas cada vez más bajas o profundas de la masa congelada. El grosor

de la capa seca, aumenta gradualmente durante el proceso de secado y el

vapor de agua experimenta un aumento de resistencia a escapar en la capa

seca. De este modo, la velocidad de sublimación va disminuyendo durante el

proceso. En general el flujo de vapor de agua se impide por tres tipos de

resistencia:

38

• Resistencia de la capa de producto seco.

• Resistencia del tapón de hule (si lo hay).

• Resistencia de la cámara de Liofilización.

El suministro de calor al nivel de sublimación es un factor determinante para

conseguir una velocidad óptima en esta etapa del proceso. La temperatura

de sublimación debe alcanzar lo más alto posible, sin permitir la fusión de la

masa congelada (que todavía tiene hielo), a modo de obtener la mayor

diferencia de temperatura, así como la máxima diferencia de presión de

vapor de agua; entre el producto y el condensador de hielo cuya presión se

encuentra alejada lo más posible del producto en proceso, denominada

“fuerza impulsora de sublimación” (KIRSOP, 1983).

El calor se aplica durante esta fase para suministrar el “calor latente en

sublimación” y de este modo mantener la velocidad de secado.

La capa seca se enfría al escapar el vapor de agua, hasta que el hielo ha

sido sublimado completamente del producto. Cuando la sublimación ha

terminado, el producto adopta la temperatura del anaquel (o el de la charola

cuando se trata de liofilización a granel). Si el proceso de sublimación se

39

detiene demasiado pronto, antes de que todo el hielo se haya sublimado, la

“matriz” puede sufrir colapso cuando el vacío se interrumpe (KIRSOP, 1983).

El punto final de sublimación y la iniciación del secado secundario, puede

apreciarse automáticamente por medio de mediciones de temperatura

barométrica, con el uso de un dispositivo microprocesador (FERNANDEZ,

1988).

2.6.2.1.3 SECADO SECUNDARIO.

Después del secado primario, la remoción de la humedad residual de la

pastilla porosa, depende de la naturaleza del material, de la temperatura del

producto y de la presión de vapor. El contenido de humedad residual

dependerá de la efectividad de secado del anaquel. En las partes laterales

externas del anaquel el secado es más efectivo (FERNANDEZ, 1988).

Si la cantidad de humedad residual disminuye obteniéndose un producto

estable, aún después de liofilizar, el secado secundario es necesario para

remover el agua absorbida intermolecularmente. Para el secado secundario

se elegirá una temperatura más alta, la presión dentro de la cabina tenderá

siempre a ser más baja. El secado secundario es muy importante en el

proceso de liofilización; sin embargo, no siempre es adecuado porque se

disminuye el contenido de humedad al máximo. Varias sustancias son más

40

estables cuando están totalmente secas por ejemplo las proteínas (BRAVO,

1988).

El control del proceso se realiza para obtener una pastilla liofilizada con

contenido óptimo de humedad; con el fin de descubrir qué tanto debe

aumentar la presión en un tiempo fijo y a cuál secado secundario puede

ejecutarse (BRAVO, 1988).

2.6.2.2 CRIOFIJACION.

Es un mecanismo de preservación en frío cuyo objetivo es congelar la

muestra tan rápido como sea posible para reducir la formación de cristales y

poder preservar la estructura de la célula por posteriores análisis

micróscopicos (DAGUET, 1977).

2.6.2.3 ALTA CONGELACION.

La preservación por largo tiempo de cultivos de referencia de

microorganismos se ha hecho en congelación a –196ºC y a –70ºC siendo

métodos altamente costosos.

Las sustancias crioprotectoras son de dos tipos, agentes como el glicerol al

10% (v/v) y dimetil sulfoxido al 5 % (v/v) que pasan a través de la membrana

41

brindando protección intra y extracelular contra la congelación, y agentes

como el dextran, glucosa, lactosa, manitol, sucrosa con efectos externos a la

membrana celular.

Se emplean cultivos que se encuentran en la mitad de la fase de crecimiento,

la descongelación rápida de los cultivos ejerce importancia sobre la cantidad

de células que se pueden recuperar para esto se hace necesario llevar los

cultivos en agitación moderada a 37 ºC hasta que desaparezca el hielo y

para el transporte; mejor en estado de liofilización.

2.7 CEPARIO.

Así como la química y la bioquímica cesarían actividades sin un

abastecimiento de químicos, de igual forma, la microbiología necesita de la

disponibilidad de cepas puras logrando establecer que mientras la mayoría

de los químicos son fácilmente almacenados, las cepas microbianas son

altamente vulnerables y pueden contaminarse, sufrir o morir; a menos que se

disponga de asistencia técnica experta para prevenir esto (KIRSOP, 1983).

Es necesario mantener una librería de trazas que produce reacciones típicas,

porque es de importancia para los laboratorios industriales y taxonomistas,

que necesitan mantener trazas de producción a grandes cantidades para ser

usadas en programas de muestreo y en estudios comparativos; los

42

laboratorios de investigación requieren cepas puras para muchos propósitos,

como erradicación de microorganismos patógenos tratados en control

biológico.

El Cepario constituye un conjunto ilimitado de especies microbianas

identificadas y organizadas cada una bajo su género. En un laboratorio, en

principio estas cepas pueden provenir de grandes centros nacionales o

internacionales especializados; o como es el caso, se puede dar origen a un

Cepario de Microbiología de Suelos y tener a disposición un cierto número de

especies microbianas conservadas; con el fin de guardar intacto el conjunto

de sus caracteres y poder ser llevados a las clases prácticas de laboratorio

en la Pontificia Universidad Javeriana.

Las especies microbianas de un Cepario deben ser conservadas con el fin de

mantenerlas por mucho tiempo respetando sus caracteres morfológicos,

bioquímicos y eventualmente su virulencia, de igual forma evitando

contaminaciones fatales. Existen varios métodos para la conservación de

microorganismos, uno de estos y el más utilizado es la liofilización.

43

3. JUSTIFICACION

El Departamento del Valle del Cauca fue el primer cultivador de Vid y desde

hace algunos años existe una nueva región cultivadora en el Departamento

de Boyacá. Las plantaciones se han expandido por toda la zona, tomando

como referencia el valle de Sogamoso, donde hoy existen 20 hectáreas

cultivadas en el municipio de la Floresta; donde colaboran en este proyecto

personas de escasos recursos que han centrado todas sus esperanzas en

ver salir adelante esta empresa, como una nueva opción económica, debido

a que los cultivos tradicionales en esta zona no les están produciendo las

ganancias suficientes para el sostenimiento de sus familias, al no conocerse

el comportamiento microbiológico en estos suelos (REVISTA CARTA

GANADERA, 1984).

El principal factor de índole económico que se debe considerar en la

plantación de Vid, es la selección del terreno y sus características

ambientales, porque es allí de donde proviene un buen desarrollo vegetativo

de la planta, altos rendimientos, buena calidad, bajos costos de

mantenimiento y permanente producción de las parras.

El propósito de esta investigación es ayudar al conocimiento y análisis de la

microflora normal del suelo, como un aporte al conocimiento de esta

población de organismos en suelos pobres y ácidos del municipio de la

44

Floresta, en el Departamento de Boyacá, diferenciándola de

microorganismos patógenos causantes de pérdidas fatales para los

cultivadores. Además, se pretende iniciar un banco de cepas de

Microbiología de Suelos; organizando bacterias, actinomycetes y hongos;

indicando la morfología macroscópica y microscópica con su respectivo

comportamiento bioquímico, basado en un índice fotográfico de cada grupo

de microorganismos.

45

4. OBJETIVOS.

4.1 OBJETIVO GENERAL

Aislar, identificar, caracterizar y conservar microorganismos rizosféricos en la

variedad Riesling x Sylvaner de cultivos de vid de Vitis vinífera L. en el

Municipio de Floresta, (Boyacá); organizando un cepario en el Departamento

de Microbiología de la Pontificia Universidad Javeriana.

4.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS

ð Aislar e identificar los microorganismos (hongos, bacterias y

actinomycetes) rizosféricos, presentes en plantaciones de vid, variedad

Riesling X Sylvaner.

ð Reportar los microorganismos aislados e identificados (actinomycetes,

bacterias y hongos), a nivel rizosférico en la variedad Riesling X Sylvaner

de cultivos de vid de Vitis vinífera L., conociendo según bibliografía la

población patógena.

ð Caracterizar los microorganismos identificados, organizando un cepario

general de la población rizosférica predominante; presente en los suelos

rizosféricos del municipio de la Floresta, sembrados con la variedad

Riesling X Sylvaner de Vitis vinífera L.

ð Determinar la densidad poblacional de los microorganismos

caracterizados a nivel rizosférico en la variedad Riesling X Sylvaner de

Vitis vinífera L.

46

5. MATERIALES Y METODOS.

5.1 DESCRIPCION DEL AREA.

La estación “Horno y Vivas”, donde se encuentra el viñedo estudiado está

ubicada en el municipio de la Floresta, departamento de Boyacá, a una

altura de 2.450 msnm y a una presión atmosférica de 764 mv. Figura 1.

5.2 FASE DE CAMPO.

Las muestras rizosféricas fueron tomadas adoptando la metodología del

muestreo aleatorio simple, en un viñedo conformado por 260 plantas de la

variedad Riesling X Silvaner de Vitis vinífera L., sembrado en 7 filas, cada

una aproximadamente con 37 plantas. Las muestras se tomaron por sorteo

a las diferentes filas; quedando cada planta marcada con su respectiva

ubicación; este proceso se realizó igualmente en los tres muestreos llevados

a cabo durante los meses de marzo, abril y mayo, tomándose muestras de

suelo a 26 plantas en estadio nouvason (formación de frutos). Figura 2.

Además se realizaron análisis informales de pH con cinta y de humedad por

el método de peso seco en horno, este último tomando 10 g de suelo

secándolo a 350 ºC durante 5 horas, procedimiento que se hizo después de

cada muestreo.

47

Figura 1. Vereda Horno y Vivas, Municipio de la Floresta, 1998 Agustin codazzi.

Figura 2. Muestreo cultivo vid.

Cultivo VID

MUNICIPIO LA FLORESTA (BOYACA)

48

5.2.1 TRANSPORTE

Las muestras fueron transportadas con las precauciones necesarias desde el

municipio de la Floresta a Santa Fe de Bogotá, en un tiempo no mayor de 5

horas. Cada muestra de suelo rizosférico fue colocada en bolsas plásticas

cuidadosamente rotuladas para evitar confusiones y luego fueron

introducidas en una nevera de icopor, cuidando que ésta conservara los

12ºC, temperatura óptima para este tipo de muestras.

5.3 FASE DE LABORATORIO.

En el laboratorio de Microbiología de Suelos de la Pontificia Universidad

Javeriana se manipularon las muestras rizosféricas procedentes de la vereda

“Horno y Vivas”, municipio de la Floresta. El primer paso fue pesar 1 gramo

de cada una de las muestras individuales para obtener finalmente una

muestra homogénea de 26 gramos. De este pool se pesaron 11 gramos que

fueron disueltos en 99 mililitros de agua destilada estéril, el cual se agitó por

más de 10 minutos hasta lograr disolver la muestra rizosférica.

49

5.3.1 PREPARACION DE DILUCIONES DE MUESTRAS RIZOSFÉRICAS.

De la suspensión homogénea, se lograron obtener las siguientes diluciones

seriadas 10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7,10-8,10-9 de la siguiente manera:

1 ml

5.3.2 CULTIVO.

Se midieron 0.1 mililitro de cada una de estas diluciones y se inocularon por

duplicado para cada uno de los muestreos en las cajas de petri con los

medios de cultivo para cada microorganismo: Agar Nutritivo (AN); (Anexo

A) para bacterias totales, Agar Avena (AAv); (Anexo B) para actinomycetes y

Agar Papa Dextrosa (PDA); (Anexo C) para hongos. Las cajas de petri con

AAv y PDA, fueron incubadas a temperatura ambiente de 7 a 9 días, las

cajas de petri con AN, se incubaron a 35ºC de 24 a 48 horas, en el

Laboratorio de Microbiología de Suelos.

1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9

99 ml de agua destilada estéril. 11 gr muestra Rizosferica. 10-1

9 ml agua

destilada estéril

9 ml agua

destilada estéril

9 ml agua

destilada estéril

9 ml agua

destilada estéril

9 ml agua

destilada estéril

9 ml agua

destilada estéril

9 ml agua

destilada estéril

9 ml agua

destilada estéril

50

5.3.2.1 RECUPERACION DE BACTERIAS.

5.3.2.1.1 RECUPERACION DE BACTERIAS NO FILAMENTOSAS.

Se sembraron 0.1 ml de las diluciones 10-7, 10-8 y 10-9 por duplicado en

cajas de petri con AN para bacterias totales con un pH de 7.0.

Las cajas se marcaron con las letras A y B diferenciándose una de la otra por

la dilución inoculada. Para finalizar, se incubaron a 35ºC de 24 a 48 horas,

siendo revisadas continuamente, con el fin de repicar las cepas obtenidas.

Luego de haber recuperado un número determinado de bacterias, se

mantuvieron en AN por medio de continuos repiques; evitando así

contaminaciones y aumentando las posibilidades de mantener cepas

jóvenes.

5.3.2.1.2 RECUPERACION DE ACTINOMYCETES.

Se sembró 0.1 ml de las diluciones 10-4, 10-5, 10-6 y 10-7, por duplicado en

cajas de petri con AAv pH 7.2, preparado en el laboratorio. Cada caja

marcada con las letras A y B diferenciándose cada una de estas por la

dilución inoculada. Estas cajas se incubaron a temperatura ambiente por 7

días revisadas diariamente; con el fin de hacer repiques tan pronto crecían

51

los microorganismos evitando crecimiento masivo y así mantener cepas

puras.

Luego de haber recuperado un número determinado de actinomycetes, se

mantuvieron en AAv por medio de continuos repiques; evitando así


jóvenes.

5.3.2.2 RECUPERACION DE HONGOS.

Se sembraron 0.1 ml de las diluciones 10-4, 10-5,10-6 y 10-7 por duplicado en

cajas de petri con PDA, a pH 6.5, para evitar el crecimiento de bacterias. Las

cajas se marcaron con las letras A y B diferenciándose una de la otra por la

dilución inoculada. Para finalizar, se incubaron a temperatura ambiente de 7

a 9 días siendo revisadas continuamente, con el fin de repicar las cepas

obtenidas.

Luego de haber recuperado un número determinado de hongos, se

mantuvieron en PDA por medio de continuos repiques; evitando


jóvenes.

52

5.4 IDENTIFICACION DE MICROORGANISMOS.

5.4.1 IDENTIFICACION DE BACTERIAS.

5.4.1.1 IDENTIFICACION DE BACTERIAS NO FILAMENTOSAS.

Luego de los continuos repiques se recuperaron las diferentes colonias

bacterianas; realizándose una descripción macroscópica y microscópica. La

descripción macroscópica, se elaboró en términos físicos de las colonias:

talla, aspecto, elevación, borde, color, apariencia, densidad y consistencia.

En cuanto a la descripción microscópica, se utilizó la técnica tradicional de la

tinción de Gram (Anexo D) y la coloración de Wayson (Anexo E), llevando

acabo la precisión de los tiempos de exposición de los colorantes frentes al

extendido microbiano.

Por consiguiente, después de tener las bacterias puras, identificadas macro y

microscópicamente se procedió a la identificación de especie de cada una de

éstas; por medio de pruebas bioquímicas.

Se montaron para bacterias Gram positivas pruebas bioquímicas por el

método de BBL CRYSTAL Identification Systems Rapid Gram-Positive ID Kit

(Anexo F), este es un método de identificación en miniatura que utiliza

sustratos convencionales, fluorogénicos y cromogénicos modificados. Para

53

bacterias Gram negativas se montó el api 20 E (Anexo G) Sistema de

Identificación de Enterobacterias y otros Bacilos Gram negativos, este es un

sistema que utiliza 23 tests bioquímicos estandarizados y miniaturizados. Se

montaron pruebas bioquímicas adicionales como: D-xylosa, D-fructosa e

Inositol.

5.4.1.2 IDENTIFICACION DE ACTINOMYCETES.

Luego de los continuos repiques se recuperaron las diferentes colonias de

actinomycetes; realizándose una descripción macroscópica y microscópica.

La descripción macroscópica, se elaboró en términos físicos de las colonias:

tamaño, forma, elevación, borde, color, apariencia, densidad y consistencia

(ROMANO, 1989).

En cuanto a la descripción microscópica, se utilizó la técnica tradicional de la

tinción de Gram (Anexo H) y la coloración de Ziehl Nielsen (Anexo I). Una

minuciosa revisión a estos extendidos microbianos y la utilización de

referencias como Bergey`s nos condujo al género de cada actinomycete

(WILLIAMS, 1984).

Por consiguiente, después de tener los actinomycetes puros, identificados

macro y microscópicamente se procedió a la identificación de especie de

cada uno de éstos; por medio de pruebas bioquímicas.

54

Se montaron pruebas bioquímicas por el método de BBL CRYSTAL

Identification Systems Rapid Gram Positive ID Kit, este es un método de

identificación en miniatura que utiliza sustratos convencionales, fluorogénicos

y cromogénicos modificados los cuales dan un resultado más preciso y

amplio para la identificación de especies microbianas. Adicionalmente se

realizaron pruebas de D-xylosa, D-fructosa e Inositol.

5.4.2 IDENTIFICACION DE HONGOS.

Luego de los continuos repiques se recuperaron los diferentes hongos;

realizándose una descripción macroscópica y microscópica. La descripción

macroscópica, se elaboró en términos físicos de las colonias: aspecto, color,

borde, crecimiento, exudación, reverso, pigmento y olor. En cuanto a la

descripción microscópica, se utilizó la técnica tradicional de la tinción de Azul

de Lactofenol (Anexo J) (GILMAN, 1991).

A diferencia de los actinomycetes y bacterias, los hongos pueden ser

identificados mediante observación al microscópio alternada con la ayuda

comparativa de claves especializadas, como la clave de Barnett

(ALEXOPOULOS, 1989).

55

5.5 PROCESO DE LIOFILIZACION.

La preparación del inóculo, se considera el punto crítico principal del proceso

de liofilización, pues deben tenerse todas las condiciones de esterilidad para

que garanticen que al realizar la recuperación de los liofilizados, sólo se va a

obtener el microorganismo deseado, libre de contaminantes (BRAVO, 1998).

Este proceso se llevó a cabo en el Laboratorio de Microbiología Ambiental de

la Pontificia Universidad Javeriana. El esquema utilizado en el método de

liofilización para la conservación de microorganismos fue el siguiente:

• Preparación del inóculo para liofilizar.

a) Se esteriliza adecuadamente el material que se va a utilizar, se rotulan los

frascos con el nombre completo del microorganismo y se parte de un

cultivo axénico ya sea de hongos miceliales y bacterias.

b) Si son bacterias, con un asa redonda se toma una colonia aislada del

cultivo y se emulsiona en el frasco de vidrio correspondiente, en 4 ml. de

agua estéril.

c) Para hongos miceliales; se toma con una pipeta 4 ml. de la muestra

(suspensión de conidias en caldo Papa Dextrosa) y se lleva al frasco

estéril correspondiente.

56

d) Para hongos miceliales y bacterias; se toma 1 ml. del frasco con el

inóculo y se lleva a otro frasco que está destinado para la toma de la

muestra del conteo en cámara de Neubauer.

e) Se adiciona a cada muestra de 2 a 3 ml de leche descremada al 15%

que ha sido previamente esterilizada, y se lleva a precongelar a -70ºC

ubicando los frascos oblicuamente.

f) Para validar este método, se realizan los liofilizados por duplicado de

cada microorganismo y se recupera uno de los mismos para verificar que

se halla el microorganismo deseado en el inóculo que se preparó así

como la viabilidad del mismo (BRAVO, 1998).

• Liofilización

a) Precongelamiento de la muestra

b) Precalentamiento del liofilizador (se utilizó un liofilizador LABCONCO,

MODELO 77500-00P, SERIE 708245).

c) Se llevan las muestras precongeladas a – 70ºC.

d) Se conecta las muestras al liofilizador.

e) Tiempos (bacterias y actinomycetes 12 horas), (hongos 15 horas)

f) Se cierra la válvula de las muestras a retirar.

g) Se apaga la bomba de vacío, desocupando el contenido de las

mangueras.

57

h) Los cultivos liofilizados, son estables por unas semanas a temperatura

ambiente, para conservarlas de 6 a 8 meses se deben mantener de 4 a

6 ºC y por más tiempo a -20 ºC (BRAVO, 1998).

5.6 ORGANIZACIÓN DEL CEPARIO.

El Cepario ha sido organizado con el fin de otorgar al departamento de

Microbiología y a los estudiantes de la Pontificia Universidad Javeriana la

facilidad de poder adquirir las cepas de los diferentes microorganismos que

predominan en los suelos de los cultivos de vid de Vitis vinífera L. de la

variedad Riesling X Sylvaner.

En este banco de cepas, cada una de éstas ha sido ordenada por medio de

un código de dos letras, donde la primera de éstas es mayúscula y la

segunda es minúscula, de la siguiente manera:

♦ Para las bacterias es Bt.

♦ Para los actinomycetes es Ay.

♦ Para los hongos el código es Hn.

58

Después de ser clasificado por letras a cada microorganismo, se le ha

otorgado un número secuencial de tal forma que a través del tiempo se siga

este orden evitando confusiones y repeticiones.

Finalmente, se creó un manual para el cepario con el registro de cada una de

las cepas, con su respectivo índice fotográfico.

5.7 ANALISIS ESTADISTICO.

En esta etapa del estudio se hizo un análisis de distribución porcentual de la

densidad microbiológica utilizando los recuentos, para posteriormente

realizar una comparación con los porcentajes normales de la carga

microbiana en muestras de suelo.

59

6. RESULTADOS Y DISCUSIONES.

Como resultado de los métodos empleados en el transcurso de este estudio

para el aislamiento, identificación y caracterización de los microorganismos a

nivel rizosférico del cultivo de vid Vitis vinífera L. sembrados con la variedad

Riesling x Sylvaner se obtuvo una diferencia en los recuentos realizados.

Tabla 4.

Tabla 4. Recuentos microbiológicos de los tres muestreos en el cultivo vid.

CULTIVO VID Agar nutritivo Agar Avena Agar Papa dextrosa

Muestreo 1 12 x 109 UFC 22 x 107 UFC 21 x 107 UFC



Los resultados de los recuentos microbiológicos, permiten deducir que no se

encuentran grandes diferencias en los tres muestreos, indicando que las

condiciones ambientales prevalecieron durante el periodo estudiado. Para el

óptimo desarrollo de la vid y de su producto, la uva, se necesitan

prolongadas estaciones de verano, calientes y secas, e inviernos fríos. Estas

condiciones, propias de los países con clima sub-tropical pero no de países

del trópico, donde la temperatura es similar durante todo el año.

60

Por consiguiente se deduce que la ubicación respecto al cultivo vid

estudiado, cumple con las características de un clima variable dentro del

rango de sus largos periodos de verano e invierno. Colombia

meteorológicamente hablando posee gran variedad de climas y cambios

repentinos, asegurando un desarrollo propio y óptimo en el cultivo vid de la

vereda “Horno y Vivas”. Estudios realizados en el departamento de Boyacá

(MARTINEZ, 1989) revelan que a lo largo del año es impredecible referirse al

verano o invierno, solamente en el momento en que se presentan.

La temperatura es un factor primordial, dependiendo de esta se puede

presentar una alta o baja incidencia de enfermedades fungosas; como es el

caso de las variedades que han logrado adaptarse a climas tropicales, la alta

humedad relativa que impera en esas regiones (clima tropical) permite la alta

incidencia de enfermedades fungosas limitando en forma considerable el

cultivo. Los fenómenos meteorológicos, ejercen su influencia en la vida y

desarrollo de la vid, es decir que el ciclo vital de la planta depende

principalmente de la temperatura, la cual regula las épocas de brotación,

floración, envero, etc. Se deduce que la vid no vivirá igualmente en todos los

climas, sino que existirán climas que serán más favorables para su desarrollo

y habrán otros en los cuales no podrá vivir (MARRO, 1989).

En este caso referirse al clima en el departamento de Boyacá comprueba

que la vida larga de un cultivo vid depende de esos cambios atmósfericos

61

típicos y representativos de Colombia, gracias a la ubicación tropical que

posee, razón por la que el estudio se realiza en las mismas plantas para

llegar a datos más precisos.

6.1 DESCRIPCION MACROSCOPICA.

Observando las características morfológicas de las colonias sobre las placas

de Agar se inició la identificación de microorganismos en el estudio.

En este procedimiento se obtuvieron 6 diferentes colonias para bacterias,

14 para actinomycetes y 16 para hongos. Tablas 5, 6 y 7 respectivamente.

(Figuras 3 , 4 y 5 respectivamente).

Tabla 5. Descripción macroscópica de Bacterias.

BACTERIAS

MORFOLOGIA AGAR NUTRITIVO

Colonia 1 Colonia 2 Colonia 3 Colonia 4 Colonia 5 Colonia 6

Tamaño Grandes Medianas Medianas Medianas Pequeñas Pequeñas

Aspecto Rizoides Circulares Circulares Circulares Circulares Circulares

Elevación Planas Convexas Convexas Convexas Convexas Convexas

Borde Irregulares Regulares Regulares Regulares Regulares Regulares

Color Blancas Blancas Blancas Blancas Crema Amarillas

Apariencia Cremosas Lisas Cremosas Lisas Cremosas Cremosas

Densidad Opacas Opacas Brillantes Opacas Opacas Brillantes

Consistencia Membranosas Membranosas Viscosas Membranosas Viscosas Viscosas

62

Bt. 1 Bt. 2

Bt. 3 Bt. 4

Bt. 5 Bt. 6

Figura 3. Macroscopía Bacteriana. Agar Nutritivo. 24-48 horas. 35ºC.

63

Tabla 6. Descripción macróscopica de Actinomycetes.

ACTINOMYCETES

AGAR AVENA

PAUTAS Tamaño Forma Elevación Borde Color

directo reverso

Densidad Consistencia

Colonia 1 Medianas Irregulares Umbilicadas Ondulado Café Café

Opacas Pulverulentas

Colonia 2 Grandes Circular Convexas Entero Crema Blanco


Colonia 3 Grandes Irregulares Monticulares Ondulado Rosado Crema


Colonia 4 Medianas Irregulares Umbilicadas Ondulado Crema Blanco


Colonia 5 Medianas Irregulares Convexas Ondulado Rosado Rosado


Colonia 6 Grandes Irregulares Monticulares Ondulado Rosado Crema


Colonia 7 Pequeñas Irregulares Umbeliformes Ondulado Rosado Rosado


Colonia 8 Medianas Irregulares Umbilicadas Ondulado Rosado Gris


Colonia 9 Pequeñas Circulares Convexas Entero Violeta Café

Opacas Membranosas

Colonia 10 Grandes Irregulares Monticulares Ondulado Gris Café


Colonia 11 Medianas Irregulares Umbilicadas Ondulado Gris Café


Colonia 12 Pequeñas Irregulares Convexas Entero Rosado Rosado


Colonia 13 Grandes Irregulares Monticulares Ondulado Gris Café


Colonia 14 Pequeñas Irregulares Convexas Entero Blanco Crema


De la anterior tabla las colonias que presentaron pigmento difusible al medio

fueron: Ay. 1 color rosado, Ay. 3 color café, Ay. 7 color rosado.

64

Ay. 1 Ay. 2 Ay. 3 Ay. 4

Ay. 5 Ay. 6 Ay. 7 Ay. 8

Ay. 9 Ay. 10 Ay. 11 Ay. 12

Ay. 13 Ay. 14

Figura 4. Macroscopia de Actinomycetes. Agar Avena. 7-9 días. Temperatura ambiente.

65

Tabla 7. Descripción macroscópica de Hongos.

HONGOS

AGAR PAPA DEXTROSA

Colonias Aspecto Color Borde Crecimiento Exudación Reverso Pigmento Difusible

Olor

Colonia 1 Pulverulentas Verde olivo Definido Radial No produce Sin color No produce No presenta

Colonia 2 Lanosas Café-negro Definido Radial No produce Negro cordones

miceliales

No produce No presenta

Colonia 3 Algodonosas Rosado Definido Radial No produce Rosado No produce No presenta

Colonia 4 Algodonosas Curuba Definido Radial No produce Amarillo-

curuba

No produce Dulce

Colonia 5 Algodonosas Rosado Definido Radial Pequeñas de

color rosado

Durazno-

rosado

No produce Dulce

Colonia 6 Lanosas Blanco

verdoso

Definido Radial No produce Blanco No produce No presenta

Colonia 7 Lanosas Rosado

grisáceo

Definido Radial No produce Blanco No produce No presenta

Colonia 8 Algodonosas Amarillo-

rosado

Definido Radial No produce Rosado-rojo No produce Mohoso

Colonia 9 Pulverulentas Amarillo-

rosado

Irregular Radial Granulacion

rosada

Rosado-rojo Rosado-rojo No presenta

Colonia 10 Pulverulentas Verde

oscuro

Irregular Circular

pequeñas

Verde claro Blanco No produce No presenta

Colonia 11 Lanosas Amarillo

verdoso

Definido Radial No produce Sin color No produce Dulce

Colonia 12 Pulverulentas Amarillo

verdoso

Definido Radial No produce Rosado-rojo No produce Pronunciado

a tierra

Colonia 13 Pulverulentas Verde olivo Definido Radial Incoloras Sin color No produce Pronunciado

a tierra

Colonia 14 Algodonosas Blanco Definido Radial No produce Blanco No produce No presenta

Colonia 15 Lanosas Blanco Definido Radial Amarillo Blanco No produce No presenta

Colonia 16 Algodonosas Blanco-

amarillo

pálido

Irregular Radial No produce Sin color No produce No presenta

66

Hn. 1 Hn. 2 Hn. 3 Hn. 4

Hn. 5 Hn. 6 Hn. 7 Hn.8

Hn. 9 Hn. 10 Hn. 11 Hn. 12

Hn. 13 Hn. 14 Hn. 15 Hn. 16

Figura 5. Macroscopía de Hongos. Agar Papa Dextrosa. 7-9 días. Temperatura ambiente.

67

6.2 DESCRIPCION MICROSCOPICA

Para continuar la caracterización de las colonias, la coloración de Gram

reconoció las características bioquímicas de la pared celular microbiana,

facilitando la clasificación morfológica. Adicionalmente la coloración de

Wayson ratificó la presencia de esporas en el género Bacillus, esto en cuanto

bacterias. Tabla 8.

Referido a actinomycetes complementaria a la coloración de Gram se realizó

la coloración de Zielh Nielsen evidenciando la presencia del género Nocardia.

Tabla 9. En cuanto los hongos su morfología fue evidenciada con la

coloración de Azul de Lactofenol. Tabla 10. Figuras (6,7 y 8).

Tabla 8. Caracterización microscópica por coloración de Gram y Wayson (Bacterias).

BACTERIAS

Colonia 1 Bacilos Gram positivos. Espora cilíndrica terminal

Colonia 2 Bacilos Gram positivos. Espora oval terminal

Colonia 3 Bacilos Gram positivos

Colonia 4 Bacilos Gram positivos

Colonia 5 Bacilos Gram negativos

Colonia 6 Cocos Gram positivos

68

Bt. 1 Bt. 2

Bt. 3 Bt. 4

Bt. 5 Bt. 6

Figura 6. Microscopía Bacteriana. En aumento de 100X con aceite de inmersión.

69

Tabla 9. Caracterización microscópica por coloración de Cristal Violeta y Ziehl Nielsen (Actinomycetes).

ACTINOMYCETES

Colonia 1 Hifas septadas Gram positivas, ácido alcohol resistentes

Colonia 2 Hifas septadas Gram positivas, ácido alcohol resistentes

Colonia 3 Hifas delgadas Gram positivas, ácido alcohol resistentes

Colonia 4 Hifas delgadas Gram positivas, ácido alcohol resistentes

Colonia 5 Hifas irregulares septadas Gram positivas

Colonia 6 Hifas septadas Gram positivas esporulada

Colonia 7 Hifas irregulares septadas multiesporuladas Gram positivas

Colonia 8 Hifas cortas septadas esporuladas Gram positivas

Colonia 9 Hifas cortas septadas esporuladas en espiral Gram positivas

Colonia 10 Hifas largas septadas, espiraladas, esporuladas Gram positivas

Colonia 11 Hifas escasas cortas, septadas Gram positivas



Colonia 14 Hifas largas septadas, multiesporuladas Gram positivas

70

Ay. 1 Ay. 2 Ay. 3 Ay. 4

Ay. 5 Ay. 6 Ay. 7 Ay. 8

Ay. 9 Ay. 10 Ay. 11 Ay. 12

Ay. 13 Ay. 14 Figura 7. Microscopía de Actinomycetes. En aumento de 100X con aceite de inmersión.

71

Tabla 10. Caracterización microscópica por coloración de Azul de lactofenol (Hongos).

HONGOS

Colonia 1 Conidióforo largo terminado en gran vesícula en forma de clava, presenta cadena de conidios

esféricos.

Colonia 2 Hifas septadas de color amarillo castaño, conidiofóros doblados y engrosados en los puntos de

unión con los conidios, macroconidios divididos en cuatro células por septos transversales

apariencia curvada.

Colonia 3 Hifas hialinas septadas, notoria clamidospora, macroconidios multicelulares en forma de

banana.

Colonia 4 Hifas septadas y ramificadas conidias cilíndricas

Colonia 5 Hifas hialinas septadas, conidioforo ramificado en forma de pincel, conidios ovales que parten

de esterigmas largos.

Colonia 6 Hifas hialinas septadas, conidióforo ramificado en forma de pincel, conidios ovales que parten


Colonia 7 Hifas hialinas septadas, conidióforo ramificado en forma de pincel, conidios ovales que parten


Colonia 8 Hifas hialinas, septadas, conidioforos con fiálides ramificadas en forma de pincel, conidios

esféricos en cadenas.

Colonia 9 Hifas hialinas, septadas, conidios en forma de globo, fiálide en forma de frasco.

Colonia 10 Hifas hialinas, septadas, conidioforos con fiálides cilíndricas, conidios esféricos en cadenas.

Colonia 11 Hifas hialinas, septadas, conidióforos ramificando de tres a seis fiálides, conidios subglobosos

esféricos en cadenas.

Colonia 12 Hifas hialinas, septadas, conidióforos ramificando fiálides, conidios s esféricos en cadenas.

Colonia 13 Hifas finas, ramificadas, tabicadas irregularmente, partes filamentosas, esféricas.

Colonia 14 Hifas finas, ramificadas, tabicadas irregularmente, partes filamentosas, esféricas.

Colonia 15 Hifas largas delgadas, franjas combinadas poco septada.

Colonia 16 Hifas septadas, conidiófors erectos septados o ramificados, ramas verticiladas.

72

Hn. 1 Hn. 2 Hn. 3 Hn. 4

Hn. 5 Hn. 6 Hn. 7 Hn. 8

Hn. 9 Hn. 10 Hn. 11 Hn. 12

Hn. 13 Hn. 14 Hn. 15 Hn. 16

Figura 8. Microscopía de Hongos. En aumento de 40 X.

73

6.3 PROMEDIO GENERAL DE LOS MICROORGANISMOS

ENCONTRADOS

La distribución microbiana se encontró en una proporción porcentual donde

el estudio inferencial adoptó el muestreo aleatorio simple para la estimación

de la prevalencia de cada microorganismo, (Anexo K) evidenció el 16.7%,

38.9 % y el 44.4 % para bacterias, actinomycetes y hongos respectivamente.

Figura 9.

Figura 9. Distribución porcentual según Microorganismos.

Esta prevalencia microbiana permite inferir que la comparación de los

microorganismos con el entorno, depende de las características propias del

suelo refiriéndonos exclusivamente a las características de las muestras

extraídas del cultivo vid.

Por lo que se deduce, que la acidez del suelo hace que la manifestación

bacteriana sea en menor proporción relacionada con los otros

DISTRIBUCION PORCENTUAL SEGUN TIPO DE MICROORGANISMO

38.9%

16.7 %

44.4 %

Actinomycetes

Bacterias

Hongos

74

microorganismos, debido a que la pared celular es atacada líticamente

usufructuando al peptidoglicano el cual es responsable de la resistencia

mecánica de la pared, dejando a las bacterias en una forma hipertónica; y de

esta forma las únicas bacterias capaces de resistir, son aquellas que crean

estructuras o interrelaciones microbianas para aceptar los cambios en el

entorno donde estas participan (ALEXOPOULOS, 1976).

Por ser un microorganismo intermedio entre bacterias y hongos, los

actinomycetes pueden resistir rangos amplios de pH, gracias a la creación de

mecanismos como sus conidias, este comportamiento en el presente estudio

se manifiesta ayudado por la humedad que el suelo del cultivo vid tiene

como característica en las zonas tropicales (STANLEY, 1994) .

Haciendo referencia a los hongos, el suelo de cultivos vid cumple las

características principales en cuanto acidez y humedad, por lo que estos

microorganismos se encuentran en mayor proporción coherentemente con

los resultados obtenidos (NOVO & MAYEA 1991). La acidez en los tres

muestreos mostró un rango entre 5.5 y 5.7 en el cultivo vid y la humedad en

un 40 % frente al peso seco de 10 g de suelo analizado en cada muestreo.

Cabe mencionar que la interrelación microbiana puede ser un punto

desfavorable para la reproducción de bacterias, donde los actinomycetes y

75

los hongos inducen reacciones adversas; por la producción de antibióticos y

enzimas que ataquen a estos microorganismos (ROMANO, 1989).

6.4 CARACTERIZACION BIOQUIMICA

Para corroborar la clasificación taxonómica de nuestro grupo de

microorganismos la serie de bioquímicas realizadas se muestran en las

tablas 11, 12 y 13., para bacterias y actinomycetes.

Tabla 11. Bioquímicas para Bacterias Gram positivas.

BIOQUÍMICAS Bt.1 Bt.2 Bt.3 Bt.4 Bt.6

Arginina Débil Neg. Neg. Neg. Débil

Fosfato Pos. Pos. Pos. Pos. Pos.

L – Valina – AMC Neg. Neg. Neg. Neg. Neg.

L – arabinosa Neg. Neg. Neg. Neg. Neg.

D – manitol Neg. Neg. Neg. Neg. Pos.

Trehalosa Neg. Neg. Neg. Pos. Neg.

o–nitrofenil-β-D-galactósido (ONPG) y p–nitrofenil-β-D-glucósido Neg. Débil Neg. Neg. Pos.

p-nitrofenil-β-D-glucósido Neg. Neg. Neg. Pos. Pos.

Úrea Neg. Neg. Neg. Neg. Neg.

4MU-β-D-glucósido Neg. Neg. Neg. Pos. Neg.

Na Neg. Pos. Neg. Pos. Pos.

L-ácido piroglutámico-AMC Pos. Neg. Neg. Neg. Neg.

L-Fenilalanina-AMC Neg. Neg. Neg. Neg. Pos.

Maltosa Neg. Neg. Débil Pos. Neg.

– galactosa Neg. Neg. Neg. Neg. Neg.

Manosa Neg. Neg. Neg. Pos. Pos.

p-nitrofenil-α-D-glucósido Pos. Neg. Neg. Pos. Pos.

p-nitrofenil-fosfato Pos. Pos. Neg. Pos. Pos.

Esculina Neg. Pos. Neg. Pos. Neg.

Prolina-AMC Neg. Neg. Neg. Neg. Pos.

4MU-β-D-celobiósido Neg. Neg. Neg. Pos. Neg.

Triptófano-AMC Neg. Neg. Neg. Neg. Pos.

D – glucosa Neg. Neg. Pos. Pos. Neg.

Dextrina Neg. Neg. Neg. Neg. Neg.

N-acetil-D-glucosamina Neg. Neg. Neg. Neg. Neg.

Maltotriosa Neg. Neg. Neg. Neg. Neg.

p-nitrofenil-β-D-celobiósido Neg. Neg. Neg. Neg. Neg.

p-nitrofenil-β-D-galactósido y p-nitrofenil-α-D-galactósido Neg. Neg. Neg. Neg. Pos.

Ornitina Pos. Pos. Pos. Pos. Pos.

D- xylosa Neg. Neg. Neg. Neg. Neg.

D – fructosa Neg. Neg. Pos. Pos. Pos.

Inositol Débil Neg. Neg. Neg. Neg.

76

Tabla 12. Bioquímicas para Bacterias Gram negativas.

BIOQUÍMICAS Bt.5

Arginina Positivo

Lisina Positivo

Ornitina Positivo

Citrato – sódico l Débil

Tiosulfato sódico Débil

Úrea Débil

Triptófano Débil

Triptófano indol Débil

Piruvato sódico Débil

Hidrólisis de gelatina Positivo

Glucosa Positivo

Manitol Positivo

Inositol Positivo

Sorbitol Positivo

D – ribosa Negativo

Sacarosa Positivo

Melibiosa Positivo

Arabinosa Positivo

Amigdalia Positivo

78

En cuanto a los hongos, la clave de Barnett y la clave de Hoekstra identifica a

estos por su morfología. Consta de un estudio minucioso de las estructuras

fructíferas ayudado microscópicamente. Con solo su morfología es mas

complejo determinar las especies con excepción del género Penicillium,

pues este cumple requisitos en sus formas dentro de la clave de Barnett,

dando como única opción a los restantes Hongos encontrados, la clásica

descripción sp.

Tabla 14.

Tabla 14. Descripción de Hongos para identificación de especies dentro del género Penicillium .

HONGO DESCRIPCIÓN MICROSCÓPICA

Hn.8 Estructuras conidiógenas, conidioforos de dos a tres niveles de ramificación , metula dando lugar

3 a 6 fiálides en forma de frasco con cuellos pequeños. Conidias en cadenas enredadas,

globosas y subglobosas, hialino ligeramente verde.

Hn.9 Conidioforos ramificadaos. Fiálides en forma de botella. Conidias producidas en columnas de

forma globosa y subglobosa.

Hn.10 Fiálides en forma de frasco. Conidias subglosas elipsoidales, lisas.

Hn.11 Conidioforo hialino de dos a tres ramas, con las ramas usualmente presionadas sobre el eje

principal, paredes lisas, algunas asperas, fiálides cilíndricas con cuello corto pero distinguido,

conidias verdes, de paredes lisas, globosas, subglobosas y elipsoidales.

Hn.12 Conidioforo surgiendo de hifas aéreas en una sola rama,formados por una pared lisa que termina

en un conjunto de tres a cinco metulas, terminando de tres a seis fiálides. Conidios subglobosos,

elipsoidales, lisos.

Hn. 13 Conjunto de conidioforos mezclados con conidioforos fasciculados, producidos en áreas

marginales, color verde oscuro. El micelio aéreo vegetativo ausente. Conidioforo de dos a tres

ramas, paredes ásperas, fiálides en forma de frascos, con cuellos cortos pero distintos. Conidias

globosas, subglobosas y elipsoidales.

79

Al evidenciar bioquímicamente a las bacterias y a los actinomycetes se

ratifica la similitud que hay entre estos dos microorganismos, pues las

pruebas demuestran que estos pueden compartir un mismo hábitat y

simultáneamente llevar relaciones mutuas como antagonismo o

protocooperación, beneficiándose entre ellas o beneficiando el entorno; sin

excluir el alto porcentaje de hongos encontrado, el cual debe estar en la

misma circunstancia formándose un consorcio microbiano dentro del cultivo

vid. Lo único que se puede encontrar como desventaja entre los

microorganismos es la competencia por el sustrato haciendo que unos de

ellos se adapten y otros mueran.

6.5 MICROORGANISMOS CARACTERIZADOS.

Al cumplir la metodología se encuentra un listado de géneros microbianos y

sus especies; esto respecto a bacterias (tabla 15) y actinomycetes (tabla 16)

con ayuda de las pruebas bioquímicas y para hongos con la clave de Barnett.

(Tabla 17).

80

6.5.1 BACTERIAS

6.5.1.1 BACTERIAS NO FILAMENTOSAS.

Tabla 15. Caracterización de Bacterias.

COLONIA BACTERIAS

1 Bacillus azotoformans

2 Bacillus subtillis

3 Lactobacillus fructivorans

4 Lactobacillus minor

5 Pseudomonas mallei

6 Staphylococcus capitis

6.5.1.2 ACTINOMYCETES

Tabla 16. Caracterización de Actinomycetes

COLONIA ACTINOMYCETES

1 Nocardia asteroides

2 Nocardia autotrophica

3 Nocardia brasiliensis

4 Nocardia carnea

5 Streptomyces cinnamonensis

6 Streptomyces gobitricini

7 Streptomyces laurentii

8 Streptomyces lavendofoliae

9 Streptomyces mauvecolor

10 Streptomyces nojiriensis

11 Streptomyces pulveraceus

12 Streptomyces roseoflavus

13 Streptomyces sannanensis

14 Streptomyces somaliensis

81

6.5.2 HONGOS.

Tabla 17. Caracterización de Hongos.

COLONIA HONGOS

1 Aspergillus sp.

2 Curvularia sp.

3 Fusarium sp.

4 Geotrichum sp.

5 Paecilomyces sp.1

6 Paecilomyces sp.2

7 Paecilomyces sp.3

8 Penicillium camemberty

9 Penicillium citrium

10 Penicillium corylophilum

11 Penicillium expansum

12 Penicillium funiculosum

13 Penicillium verrucosum

14 Pythium sp.

15 Sclerotium sp.

16 Verticillium sp.

82

6.6 DISTRIBUCION PORCENTUAL DE LOS GENEROS DE CADA

MICROORGANISMO

Determinadas las especies de las bacterias, actinomycetes y hongos (figuras

10, 11 y 12 respectivamente) nos inferimos en la comparación en cuanto a la

frecuencia en que se presenta cada uno (Anexos L, M y N); involucrando las

características del hábitat estudiado.

6.6.1 BACTERIAS NO FILAMENTOSAS Y ACTINOMYCETES.

Figura 10. Promedio porcentual de Bacterias no filamentosas.

DISTRIBUCION PORCENTUAL SEGUN EL TIPO DE BACTERIA

Bt.126%

Bt.212%

Bt.38%

Bt.424%

Bt.518%

Bt.612%

DISTRIBUCION PORCENTUAL SEGUN TIPO DE ACTINOMYCETE

Ay.148%

Ay.16%

Ay.27%

Ay.37%

Ay.47%

Ay.512%

Ay.65%Ay.7

7%

Ay.126%

Ay.135%

Ay.811 %

Ay.118 %

Ay.105%

Ay.96%

83

Figura 11. Promedio porcentual de Actinomycetes.

6.6.2 HONGOS

Figura 12. Promedio porcentual de Hongos

Se sabe que en un 80% las enfermedades de las plantas son causadas por

hongos, y a pesar del uso de fungicidas y otros métodos de control, la

pérdida económica debida a la actividad de los hongos sigue siendo enorme.

Por otro lado, las pérdidas de cosechas causadas por bacterias fitopatógenas

son de menor importancia que las causadas por hongos, ya que la densidad

poblacional de los hongos fue mayor en este estudio.

Cualquiera que sea el agente etiológico causante de la enfermedad es fácil

reconocerlo debido a la gran diferencia de cada uno en la manifestación de

los síntomas, evolución de la enfermedad y órganos que afecta.

DISTRIBUCION PORCENTUAL SEGUN TIPO DE HONGO

Hn.165%

Hn.154%

Hn.117%

Hn.124%

Hn.136%

Hn.146%

Hn.102%

Hn.915%

Hn.89%

Hn.66%

Hn.55%

Hn.413%

Hn.36%

Hn.25%Hn.1

5%

Hn.72%

84

Se considera de gran importancia tener claro cuáles microorganismos

(bacterias y hongos) podrían ocasionar enfermedades en las plantas para

tomar medidas preventivas que aseguren el futuro de los cultivos vid, con el

fin de obtener frutos sanos; materia prima para la elaboración final del

producto.

En este estudio se resalta la microflora que allí habita, los beneficios que

puede brindar al cultivo, o si por el contrario en un momento dado causaría

daño a las plantaciones.

Se obtienen microorganismos aislados e identificados preliminarmente,

donde se encontró por revisión bibliográfica que muchos de estos pueden

estar relacionados con alteraciones de la fisiología normal de las plantas;

afectando diversos órganos vitales para su desarrollo (ALEXOPOULOS,

1989)

Algunas especies de Pythium y Fusarium (representados en el promedio

porcentual de este estudio en 5% para los dos) producen podredumbre por

exceso de humedad en las semillas; esto puede ocurrir antes o después de

emerger la planta. En el primer caso, las plantas no consiguen emerger del

suelo, mientras que en las infecciones que se producen después de emerger,

las plantas se colapsan justo por encima de la superficie del suelo. En

ambos casos los hongos consiguen que la planta se pudra, debido a la

85

producción de enzimas pépticas (ALEXOPOULOS, 1989) por tal razón se

encuentran algunos frutos reportados con estas características de

podredumbre.

Ciertas especies de los géneros Verticillium y Fusarium , (cuyos promedios

son 5% para los dos en este estudio) causan graves enfermedades en

plantas debido a la capacidad de bloquear los vasos del xilema conductores

del agua (ALEXOPOULOS, 1989) estos patógenos infectan un amplio rango

del cultivo vid. Casi siempre las esporas de los hongos son transmitidas por

un escarabajo vector, y tanto las esporas como el micelio bloquean los vasos

e impiden el flujo de agua, conduciendo así a la desecación y muerte de la

corteza, seguida de una infección generalizada y por último la muerte. Estos

vectores naturales se encuentran no de una forma masiva, pero si en una

cantidad donde algunas plantas se ven afectadas por falta del consumo del

agua, esta principal característica se notó por la resequedad de sus raíces y

tallos (HARVEY, 1976).

Varias especies de Aspergillus (cuyo porcentaje es de 5%) producen

sustancias tóxicas (micotoxinas) que pueden ocasionar daños a un nivel

sistémico. Las especies de Aspergillus son más importantes en medicina

porque causan enfermedades de órganos internos denominadas

colectivamente aspergilosis. Hay infección de los pulmones y produce

síntomas muy similares a los de la tuberculosis, anteriormente las infecciones

86

causadas por este hongo fueron diagnosticadas incorrectamente como

tuberculosis y se trataron con agentes antibacterianos, consiguiendo

resultados fatales. Desde el punto de vista médico nos referimos a las

posibles enfermedades que pueden contraer las personas que están en

contacto directo con las plantaciones vid, los “recolectores”, a pesar que no

se han encontrado casos de estas enfermedades en el hábitat trabajado,

cabe recomendar los posibles riesgos a los que pueden estar expuestas

estas personas.

Por otro lado, está la importancia de los hongos como agentes de biocontrol

potencialmente ideales. Muchas especies saprófitas antagonizan

representantes de todos los organismos de las plagas, incluyendo los

organismos patógenos de las plantas. Ciertas especies de Gliocladium,

producen gliotoxinas y pueden ser utilizadas para proteger las plantas contra

especies patógenas de Fusarium y Verticillium, así como contra especies de

Diplodia. Un auténtico control empleando micoparasitismo puede ser

conseguido utilizando Pythium nunn el cual ataca miembros patógenos del

mismo género como Pythium ultimum.

Gracias al interés cada vez mayor de obtener métodos no químicos para

llevar a cabo el control de los patógenos de plantas, se han realizado un sin

número de investigaciones consiguiendo muy buenos resultados. En el caso

del cultivo vid no se han hecho estudios específicos, pero la importancia de

87

reconocer los patógenos ayuda a la intervención del control biológico y

ampliar nuevos estudios para el mejoramiento de estos cultivos.

En el caso de las bacterias, ciertas cepas de Bacillus subtillis (12%)

producen un metabolito termoestable que muestra un amplio espectro de

actividad antifúngica. La actividad de este metabolito se compara

favorablemente con los fungicidas que hay en el mercado. La acción de los

microorganismos usados en biocontrol se debe a la capacidad para producir

metabolitos con actividad biocida. Este es el caso de muchas especies de

Streptomyces (69 %) de estos se obtienen sustancias altamente eficientes

que ayudan a controlar enfermedades en las plantas, producidas por hongos

y bacterias patógenas (LESKIW, 1999).

Hay otras bacterias que pueden estar afectando los suelos de cultivos vid

contrarrestando el fosfato necesario para el desarrollo de las plantas como el

Bacillus azotoformans (26%) el cual mineraliza el fosfato en vez de

solubilizarlo. La solución biológica a este problema se realizaría efectuando

relaciones antagónicas con otras bacterias para insertarlas en el cultivo, este

grupo de bacterias son las llamadas Bacterias Fosfato Solubilizadoras; ya

que según los resultados arrojados, el porcentaje encontrado de hongos y

actinomycetes no afectan la participación de estas bacterias (ENSING,

1990).

88

Al igual sucede con las bacterias del género Lactobacillus (32%) referido a

las relaciones antagónicas, estas bacterias son de gran desventaja en cuanto

su aspersión en un cultivo vid, fermentando el fruto antes de su

procesamiento, ya que estos microorganismos son activos a pH 5.5

característica principal en el suelo estudiado (GRANT, 1989).

En cuanto a los actinomycetes, se deduce que la capacidad de distribución

en la naturaleza, especialmente en el suelo, hace que secundariamente se

encuentren en el 38.9 % en este estudio; lo resaltante es el 69% del género

Streptomyces encontrado, pues es de gran importancia debido a que se

caracteriza por ser productor potencial de antibióticos y otros metabolitos

antagonistas. Siendo un grupo heterogéneo en el que la pared celular esta

compuesta por ácido diaminopimélico y glicina, utilizan un amplio rango de

compuestos orgánicos como fuente de carbono y energía, para el

crecimiento aéreo extensivo con largas cadenas de esporas ( CROSS, 1989).

Lo cual nos introduce a evidenciar que este género reduce la actividad

bacteriana, ocupando esta el último lugar de los microorganismos

encontrados, donde las bacterias que pueden estar erradicando en los

cultivos vid son aquellas que ataquen más gravemente los cultivos. Por tal

motivo se puede decir que indirectamente los actinomycetes están actuando

como control biológico en el cultivo vid.

89

Actualmente no se puede hablar de desventajas que conlleven al daño de

suelos o de cosechas de cultivos vid, causadas por actinomycetes, lo único

que haría una evidencia de esto, es el estudio antagónico de los

microorganismos frente a minerales útiles para las plantas, pues ya

refiriéndonos a nivel inorgánico estos microorganismos se han catalogado

como biodegradadores y biorremediadores ante compuestos tóxicos como

benceno, xileno, y algunos metales pesados como cromo y mercurio

(GONZALEZ, 1999), (CALDERON, 1999).

La participación de los microorganismos restantes los cuales no presentan un

resultado representativo, conllevan a concluir que su densidad poblacional se

ve afectada por la producción de metabolitos y otros compuestos que los

microorganismos más representativos segregan en los suelos de cultivos vid.

6.7 ORGANIZACIÓN DEL CEPARIO.

Con la creación del cepario, no sólo se está ofreciendo facilidades para los

estudiantes, sino a la vez se les está estimulando para que indaguen más

sobre los suelos, mejorando las condiciones agronómicas y previniendo

enfermedades y plagas que pueden generar daños de considerable

importancia en los cultivos.

90

Se debe tener en cuenta que con la identificación de cada uno de los

microorganismos se logra tener una visión más clara de éstos, lo cual es de

considerable importancia debido a que día a día se van conociendo los pro y

contras que pueden afectar o no las cosechas.

91

7. CONCLUSIONES

§ De acuerdo con los parámetros respecto a la densidad poblacional de

microorganismos en el suelo, el promedio presentó el 16.7 % para

bacterias, el 38.9 % para actinomycetes y 44.4 % para hongos, es

importante tener en cuenta que el promedio de hongos es superior dado a

las características del suelo del cultivo vid, y acorde con las referencias

de estudios hechos en suelos.

§ A partir de las muestras evaluadas fueron aisladas cepas

correspondientes a cada género donde las pruebas bioquímicas y las

claves de identificación para hongos caracterizaron en mayor porcentaje a

Lactobacillus con un 36 % dentro de las bacterias, a Streptomyces con un

69 % dentro de actinomycetes y a Penicillium con un 40% dentro de los

hongos.

§ Los mejores promedios por género y especie identificados fueron

Lactobacillus minor con un 24%, Streptomyces cinnamonensis con un

11% y Penicillium citrium con un 15%, corroborando que los hongos

representados por este último persisten en cuanto densidad poblacional.

§ Probablemente las lesiones encontradas en el cultivo vid de La Flo resta

son ocasionadas por los microorganismos identificados como

Fusarium sp., y Pythium sp. Los cuales están referenciados como

responsables de podredumbre en los frutos y sequedad de las plantas. Y

en cuanto su fermentación antes de la colecta, es posible que su principal

protagonista sea Lactobacillus, acompañando también a los Bacillus en la

mineralización de fosfato en el suelo.

92

§ Aunque el crecimiento microbiano patógeno encontrado en el cultivo

ocasionen algunas lesiones, es importante mencionar que se identificaron

otros microorganismos benéficos posiblemente contrarrestando la acción

de los primeros, gracias a la producción de antibióticos y otros

metabolitos. Estos microorganismos pueden ser de los géneros

Streptomyces y Penicillium, desarrollando un “control biológico” en el

cultivo.

§ A partir del aislamiento, la identificación y la caracterización de los

microorganismos involucrados con la rizosfera del suelo en los cultivos

vid, se organiza un cepario con su registro y manual en el Departamento

de Microbiología, contribuyendo a próximos estudios.

93

8. RECOMENDACIONES.

§ Evaluar la interrelación de los microorganismos encontrados mediante

pruebas antagónicas para futuros trabajos de control biológico.

§ Utilizando la misma metodología empleada en este estudio realizar

diagnósticos frente agentes entomopatógenos que puedan estar

influyendo en los cultivos vid.

§ Sería importante realizar este estudio a nivel foliar; de tal forma que se

integre el sistema vegetativo de la planta, conociendo los diferentes

microorganismos que allí están presentes, y de esta forma llegar a

nuevas conclusiones que complementen esta investigación.

§ Se recomienda realizar este mismo estudio en diferentes regiones de

Colombia para así conocer la microflora normal de los diversos cultivos

vid a nivel Nacional.

§ Se aconseja realizar una identificación a nivel molecular, proporcionando

datos precisos que confirmen los resultados expuestos en este estudio.

§ Se considera de gran importancia crear una base de datos de

microorganismos de suelo del departamento de Boyacá, con el fin de

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conocer la microflora que predomina en los diferentes cultivos vid de esta

región, incrementando la información del cepario elaborado en este

estudio.

§ Mediante un estudio epidemiológico evaluar el riesgo del personal que

está en contacto con los cultivos de vid contaminados, para evitar

patologías.

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