Obtención de la fracción proteínica 7S proveniente de soya germinada y sin germinar y su efecto en las propiedades reológicas de harina para panificación.

Clave del Proyecto: 20060453 RESUMEN El proyecto presenta un 40% de avance con respecto a lo programado. Lo anterior obedece principalmente a la adquisición de reactivos ya que el presupuesto se liberó a mediados de 2006 y muchos de los materiales se recibieron hasta el mes de noviembre. Se presentan los avances según las metas programadas: Meta 1: Obtención de información. Esta se realizó durante todo el año. Al final del informe se presenta la bibliografía con la que se cuenta y que se ha utilizado (5%). Meta 2: Obtención de harinas de germinado y de soya integral. Esta meta se cumplió en su totalidad. A la fecha se cuenta ya con la materia prima (harinas de soya) necesaria para el proceso de extracción (15%). Meta 3: Obtención de la fracción 7S de soya germinada y sin germinar. Esta meta es una en la que se tiene mayor atraso, ya que ha sido necesario ir ajustando la metodología de extracción tal como se muestra en la parte de resultados y discusión. A la fecha sigue a nivel laboratorio y falta únicamente de ajustar el paso de precipitación con sulfato de amonio, ya que las últimas pruebas mostraron aún contaminación con la fracción 11S (8%) Meta 4: Caracterización de la proteína mediante electroforesis, enfoque isoeléctrico y coeficiente de sedimentación. Esta actividad se ha corrido de forma paralela con la actividad 3 (ver informe) donde se escogió como método de evaluación el análisis electroforético desnaturalizante por dar los mejores resultados. La prueba de coeficiente de sedimientación no podrá llevarse a cabo, ya que la ultracentrífuga de la Central de Instrumentación donde se iba a llevar a cabo el ensayo no alcanza las revoluciones necesarias (7%) Meta 5: Esta meta también se ha desarrollado en forma parcial. Se tiene toda la información reológica para los testigos (mezclas con harinas de soya integral y germinada). Además se probaron niveles de sustitución de las harinas de soya a fin de tener más información y se llevaron a cabo pruebas de panificación (ver informe). A la fecha se sigue trabajando en la obtención de la fracción de proteína 7S de la mayor pureza posible y en cantidad suficiente para poder terminar con las actividades programadas. El proyecto fue sometido a recurrencia. (5%). El proyecto tiene como productos principales la participación de 4 tesistas de licenciatura, de los cuales dos tienen terminado y escrito su trabajo que deben de entregarlo a en el mes de febrero y dos tesistas en proceso, que son los que están desarrollando la metodología de extracción. Además se tiene una alumna que cursará octavo semestre quién está trabajando en la caracterización estructural mediante microscopia electrónica de barrido de los cambios que provoca la adición de soya a las masas.

INTRODUCCION.

La búsqueda de un mejor estado de salud para la población en general, ha guiado a los

organismos públicos a buscar soluciones preventivas. Una de ellas ha sido la utilización de

los alimentos de consumo masivo en cada población como vehículos para aportar

nutrientes, buscando disminuir los problemas de desnutrición y ayudar en la prevención de

enfermedades.

En esta búsqueda, muchos estudios se han realizado, dando como resultado productos que

ya se comercializan y que son aceptados por el consumidor. Como ejemplos se pueden citar

a la sal iodatada, los cereales para desayuno vitaminados, la harina de trigo adicionada con

ácido fólico y hierro, productos lácteos bajos en grasa, productos de panificación o

elaborados con cereales con alto contenido de fibra. etc.

En panificación se han llevado a cabo muchos estudios para tratar de mejorar el contenido y

la calidad de la proteína del producto, integrando harinas diferentes a la de trigo, como

habas, frijol, lenteja, chícharos, triticale, cebada, girasol, garbanzo, semilla de calabaza,

amaranto, cacahuate, lupinus y soya. La mayoría de estos estudios han mostrado la

posibilidad de adición de estas harinas en niveles variables de sustitución, dependiendo de

las características de la harina adicionada y del tipo de producto a elaborar (Ranhotra y

Loewe, 1974; Fleming y Sosulski, 1977; Fleming y Sosulski, 1978; Calderón-Domínguez,

1987; López y col., 1998; Doxastakis y col., 2002; Hallen y col., 2004).

Como parte de los estudios de mejoramiento de la calidad de proteína en productos de

panificación se han buscado alternativas tecnológicas. En este aspecto se ha propuesto

utilizar harinas obtenidas de granos germinados. Las investigaciones realizadas sobre este

tema muestran que las harinas provenientes de granos germinados presentan valores

mayores en digestibilidad de proteína y en la razón de eficiencia proteica, mientras que

disminuyen la proporción de factores antinutricionales (Ariahu y col. 1999; El-Adawy y

col., 2003; Giami, 2003a ). Sin embargo su nivel de adición a harina para productos de

panificación no podría ser demasiado alto, ya que tiende a modificar las características

reológicas de la masa y la calidad del producto (Giami, 2003b; Hallen y col., 2004; Dervas

y col., 1999; Doxastakis y col., 2002; Güemez-Vera y col., 2004). Esto ha hecho que su uso

aún no se haya extendido como vehículo mejorador y mantiene la necesidad de búsqueda

de otras alternativas.

Para poder elaborar un pan de buena calidad se requiere de una harina que al mezclarse con

agua genere una masa con propiedades viscoelásticas que le permita incrementar su

volumen y rendir por cocción un producto esponjado y suave. Esta característica

únicamente la presente el trigo y en menor proporción el centeno y el triticale. Estas

propiedades viscoelásticas se atribuyen principalmente a las proteínas del trigo y en

específico a las del gluten: las gliadinas y las gluteninas.

De la información publicada se sabe que el proceso de mezclado modifica la estructura de

la glutenina por la asociación de estas moléculas para formar una estructura de película y

que el contenido de agua libre y la fuerza con que se unen las fibras de proteína determinan

las características viscoelásticas de la masa (Tipples y Kilborn, 1975, 1977, 1979; Tu y

Tsen; 1978; Endo y col., 1984). También se ha reportado que durante el proceso de

mezclado, las subunidades de glutenina se asocian, para formar la red de proteína,

disgregándose cuando la masa inicia su colapsamiento y formando agregados de menor

peso molecular, con una pobre capacidad de retención de gas (Paredes-López y Bushuk,

1983). Aussenac y col.,(2001 )confirman un proceso de depolimerización y

repolimerización debido al mezclado.

Considerando que la formación de la malla de gluten es un proceso de agregación

molecular, la presencia de otro tipo de proteínas diferentes a las del gluten podría disminuir

la capacidad de formación de esta malla. Güemez-Vera y col, (2004) reportan que al

adicionar lupinus mutabilis como fuente de proteína a una harina de trigo la malla de gluten

se encuentra menos interconectada con respecto a la muestra sin adicionar. También

mientras más grande sea la proteína adicionada, mayor será el impedimento para la

formación de la malla de gluten, ya que estos dos tipos de proteína no tienden a

interaccionar (Hyder y col., 1974; Fleming y Sosulski, 1978; Silaula y col., 1989)

El poder adicionar concentrados proteínicos de menor peso molecular, que puedan formar

parte de la malla de gluten sin detrimento a sus características viscoelásticas, y que además

aporten aminoácidos para mejorar la calidad de proteína o generen algún otro tipo de

beneficio a la salud del consumidor es una alternativa que debe considerarse. Lampart-

Szczapa y Jankiewicz (1982, 1983) evaluaron los cambios que sufre la proteína de la masa

de trigo cuando se adiciona la globulina 11 S de soya, observando la formación de un

complejo con las gliadinas, y reportando que las harinas de menor calidad de panificación

fueron afectadas en mayor proporción por la globulina de la soya. Ryan y col. (2002)

reportan la interacción de las proteínas del gluten con las de soya, sin un cambio en el

contenido de grupos sulfihidrilo, lo que indica que las interacciones entre ambas proteínas

no son a través de los enlaces disulfuro que ayudan en la formación de la malla de gluten.

Por otro lado, Lovati y col (1992, 1996) demostraron que las globulinas 7S estinulan la

expresión de receptores de lipoproteínas de baja densidad y en 1993, Sirtori y col.

mostraron que cuando se alimentan ratas con globulina 7S se reduce el colesterol

plasmático en una concentración del 35%.

La adición de materias primas diferentes a las convencionales en la elaboración de un

alimento procesado puede afectar las características del producto, de forma tal que éste no

resulte con la calidad que pide el consumidor. Por otro lado, las etapas de procesamiento,

mecánicas o térmicas, a las que se someten las materias primas tienen un impacto en la

calidad nutricional del producto. Estos dos aspectos deben ser abordados cuando se

pretende incluir un nuevo material a un alimento. En panificación, una forma de

determinar si una nueva harina tiene posibilidades de ser utilizada es mediante la

realización de pruebas reológicas, ya sean empíricas o fundamentales y pruebas de

panificación, ya que permiten conocer como se comportará el nuevo material durante el

proceso, por lo que en este trabajo se pretende evaluar el efecto de la adición de la fracción

proteíca 7S de soya germinada y sin germinar sobre las características reológicas de masas

para panificación.

METODOS Y MATERIALES

MATERIALES

Materia Prima

Se utilizó semilla de soya de la variedad Hutchenson de Sonora ciclo 2005, así como

también harina refinada de trigo de marca comercial, libre de aditivos y apropiada para ser

mejorada.

Ingredientes para la formulación

Azúcar refinada, Leche en polvo, Sal refinada iodatada, Manteca vegetal, Levadura seca,

todas de marca comercial.

Material

Material común de laboratorio, Algodón plisado, Charolas de plástico , Tinta y papel para

Farinógrafo y Extensógrafo marca BRABENDER, Coladores de plástico

Equipo

Parrilla de agitación magnética marca CORNING, Estufa de convección marca PROPIA,

Balanza marca BOECO GERMANY, Farinógrafo marca BRABENDER, Extensógrafo

marca BRABENDER, Molino tipo martillo marca MAZAL,

Secador de columna fluidizada marca PRL, Secador-ahumador marca AFOS MINI KLIN.

Gabinete adaptada para fermentador marca PRECISION SCIENTIFIC Co. Horno de

columpios marca HENRY SIMON Ltd, Mezcladora Minimorpin de espigas planetarias

marca HENRY SIMON Ltd.

MÉTODOS

Acondicionamiento de materia prima

• Acondicionamiento de la semilla de soya para la obtención de harina integral. Se lavó

la semilla de soya con agua corriente durante medio minuto aproximadamente y se puso

a escurrir en coladores para eliminar el exceso de agua.

• Acondicionamiento de la semilla de soya para germinación. Se pesaron 120g de semilla

de soya. Se lavó con agua corriente por medio minuto; posteriormente se sumergió en

una solución de hipoclorito de sodio al 0.5% manteniéndose en agitación por 15

minutos. Al termino del paso anterior, se enjuagó con agua corriente hasta eliminar el

olor a cloro, y por último se hizo un enjuague con agua destilada. La semilla se colocó

en coladores para eliminar el exceso de agua.

Proceso de germinación

En las charolas previamente lavadas con solución de benzal al 0.1% y una solución de

hipoclorito de sodio al 0.5%, se repartió una cantidad total de 130g de algodón plisado y

400 mL de agua destilada estéril en cada charola, así como los 120g de semilla de soya

previamente lavada. Las semillas se incubaron a 32ºC por 72 horas. La cosecha se llevó a

cabo seleccionando las semillas germinadas y sin contaminación microbiana aparente. La

semilla germinada se colocó en un secador de columna fluidizada marca PRL durante 3

horas, y después se secó en un horno AFOS MINI KLIN a 24ºC durante una noche para

eliminar por completo la humedad.

Proceso de Molienda

Tanto la semilla germinada como la destinada para hacer harina integral se pesaron y

después se molieron en un molino de martillos marca MAZAL, se tamizaron a través de un

tamiz de 25 hilos por pulgada ( tamaño de partícula ≤ 710 μ ), empleando únicamente la

harina que pasó a través de dicho tamiz .

Desgrasado

La harina (integral ó germinada) se suspendió en hexano (relación 1:5 p/v). La mezcla se

dejó en agitación durante 1 hora a temperatura ambiente. Para separar el extracto graso se

dejó sedimentar durante 1 hora y posteriormente se decantó, volviendo a adicionar hexano

limpio y repitiendo el proceso de extracción hasta obtener un contenido de grasa de 1.0% o

menos. Finalmente la harina se extendió en una charola para eliminar el hexano remanente

a temperatura ambiente en una campana de extracción.

Caracterización de Materia Prima

Análisis Químico Proximal

• Determinación de humedad. Método del fabricante (OHAUS MB 200)

• Determinación de cenizas. (AOAC 923.03)

• Determinación de extracto etéreo. Método de Soxhlet ( AOAC 920.39)

• Determinación de proteína. Método de Kjeldahl, Gunning, Arnold modificado.

(%Nx6.25) (AOAC 998.05)

Análisis Reológicos.

Humedad: Para poder llevar a cabo todas las pruebas reológicas se determinó la humedad

de la harina. Se utilizó el método descrito en análisis químico proximal.

Ensayo Farinográfico:

Los ensayos se realizaron en un Farinógrafo de Brabender donde 300 g de las muestras, se

homogeneizaron durante un minuto en la mezcladora del Farinógrafo, al término del cual se

agregó agua destilada a 30ºC. La cantidad de agua a adicionar fue la necesaria para centrar

la curva en la línea de 500 Unidades Brabender o Farinográficas (UB). La gráfica completa

y centrada en la línea de 500 UB da información sobre la resistencia a la deformación que

presenta la masa al estar sometida a un esfuerzo mecánico de cizallamiento en el mezclado.

Esta gráfica se denomina farinograma. Los ensayos se realizaron por triplicado y se siguió

el método del fabricante. Los parámetros que se obtienen de este esquema son: porcentaje

de absorción de agua que representa la cantidad de agua que debe de adicionarse a la harina

para alcanzar una consistencia de 500 UB. Esta cantidad se expresa por cada 100g de harina

base 14% de humedad; tiempo pico que es el tiempo necesario para alcanzar el punto de

máxima consistencia. Está representado en la gráfica como el tiempo requerido para

alcanzar la máxima altura de la figura y se mide en minutos. Este tiempo está considerado

como el de óptimo desarrollo de la masa. En ocasiones, dependiendo del tipo de harina

empleado, se pueden presentar dos máximos en la curva (dos tiempos pico). Al primero se

le denomina como “Tiempo Pico Falso”, mientras que el segundo se denomina

simplemente como “Tiempo Pico”. El valor que debe de utilizarse es este último.

El tiempo de máxima consistencia, está representado como el punto en el cual la curva

cambia de pendiente, es decir el momento antes de que la masa comience a decaer. Se

expresa en minutos. Dependiendo del tipo de harina, en ocasiones el tiempo pico y el de

máxima consistencia son iguales; estabilidad, es el intervalo de tiempo durante el cual la

masa conserva las propiedades adecuadas para la panificación y se mide como el tiempo

que se mantiene la curva sobre la línea de 500 UB. (Tiempo desde que la curva entra a las

500 UB y sale de ella); tiempo de decaimiento, es el tiempo en que tarda en bajar la curva

30 UB después que ha salido de la línea de 500 UB.

Ensayo extensográfico: Se siguió el método del fabricante. En la amasadora del

Farinógrafo Brabender, se mezclaron 300g de la mezcla de harinas (trigo-soya) durante 60s,

transcurrido este tiempo se adicionó una solución preparada con 6 g de cloruro de sodio

disueltos en la cantidad de agua calculada en los ensayos farinográficos menos 2% de agua

y se amasó por espacio de 60s. Posteriormente se dejó reposar por 5 min, continuando el

amasado por 2 min más. La consistencia de la masa debía tener 500 UB. Los 300 g de masa

se dividieron en dos porciones, se bolearon y se formaron dos cilindros en los aditamentos

especiales del Extensógrafo de Brabender. Los cilindros fueron colocados en soportes

dejándolos reposar a diferentes tiempos (45, 90 y 135min) dentro de una cámara presente

en el mismo equipo cuyas condiciones de temperatura y humedad permanecieron

constantes (30ºC y 80%HR). Al término de estos tiempos el soporte que contenía el

cilindro de masa fue colocado en el dispositivo de extensión y con velocidad constante se

bajó la palanca de extensión, con esto la masa se estiró hasta romperse. Al mismo tiempo el

equipo graficó una curva en donde se determinaron los siguientes parámetros: elasticidad

(T); resistencia máxima a la extensión (Tmáx), extensibilidad (L), y relación (L/T). Este

procedimiento se realizó tres veces para cada muestra.

Prueba de panificación

Para la elaboración de pan se siguió el método 10-10B reportado por la AACC (2000) con

ligeras modificaciones. La formulación empleada por cada 100 g de harina de trigo o

mezclas de harinas de trigo-soya fue: sal refinada iodatada (1.5g), azúcar estándar (6g),

leche en polvo descremada (4g), manteca vegetal(3g) y levadura seca (2.5g). Todos los

ingredientes secos se mezclaron por 60s en una mezcladora Minimorpin de espigas

planetarias de 70 g de capacidad; después se adicionó la cantidad de agua calculada para

cada muestra en los ensayos farinográficos previamente realizados. Se continuó el proceso

de mezclado hasta alcanzar el punto de óptimo desarrollo de gluten, determinado por los

ensayos farinográficos (tiempo de máxima consistencia). El tiempo de mezclado se

controló a todo lo largo del proceso con un cronómetro. Una vez obtenida la masa se

pesaron 30g y se procedió al proceso de fermentación, el cual se dividió en cuatro etapas.

La primera fue de 80 minutos. Al término de este tiempo, la masa se boleó y se dejó

nuevamente en reposo por otro periodo de 40 min. Pasado este segundo tiempo, la masa

nuevamente fue boleada y puesta en la cámara por otro nuevo intervalo de 25 min. Al

término del tercer tiempo de reposo, la masa fue pesada, boleada, formada y colocada en

moldes por un último periodo de fermentación de 55 minutos. Cumplido este tiempo, la

masa se sometió a proceso de horneado. La cámara de fermentación fue un gabinete de

temperatura controlada marca Precision Scientific Co. y el horno fue un tipo rotatorio

marca Henry Simón. La temperatura de reposo fue de 32º C y la humedad relativa de 85%.

El producto se horneó a 220º C por 20 minutos. La muestra fue pesada inmediatamente a la

salida del horno.

Parámetros evaluados en la prueba de panificación.

A cada uno de los productos de panificación obtenidos se les evaluó su calidad, mediante la

determinación del volumen específico (cm3/ml), características de miga, color, textura y

aceptación del producto. Los métodos utilizados para la evaluación de estos parámetros se

describen a continuación.

.

Volumen Específico: Este parámetro se evaluó mediante la relación volumen sobre peso.

Para determinar el volumen se utilizó la técnica de desplazamiento de semilla. En esta

técnica primero se midió el volumen que presenta un recipiente vacío, en el cual se puede

acomodar el producto y aun queda espacio disponible, sobre todo en lo que respecta a la

altura. Este volumen se determina llenando el recipiente con semilla de nabo,

comprimiendo y dejando al ras la semilla. Esta se vacía a una probeta y se lee el volumen.

Una vez conocido el volumen del recipiente vacío, el producto se acomoda y nuevamente

se adiciona la semilla de nabo, la cual otra vez se comprime y deja al ras. Realizado lo

anterior, el producto se retira y la cantidad de semilla se mide en una probeta, El volumen

del pan se determina como la diferencia entre el volumen vacío y el volumen con producto.

Calidad de la miga: A cada una de las muestras se les determinó la calidad de la miga

mediante análisis de imágenes. Cada una de las muestras fue rebanada transversalmente

utilizando un cuchillo eléctrico y obteniendo únicamente dos rebanadas del mismo grosor

(2.5 cm cada una). De estas rebanadas, se capturaron imágenes de la miga usando un

scanner marca HP Deskjet F380, ajustando para la captura de imagen a una resolución de

300 DPI, color real (RGB, 256 millones de colores), almacenando las imágenes en

formato de mapa bits (bmp). Una vez obtenida la imagen de la muestra completa, ésta se

sometió a varias transformaciones, para lo cual se utilizaron los programas Image J y

SigmaScan Pro 5.0 (Systat Software Inc.).

Las modificaciones mencionadas se realizaron utilizando el programa Image J y

consistieron en seleccionar de la imagen original el tamaño de la sección a evaluar, que

corresponde al campo de visión o FOV por sus siglas en inglés. El tamaño seleccionado fue

de 420 x 420 pixeles, el cual se mantuvo constante para todas las muestras. La imagen a

color se duplicó y posteriormente se transformó a escala de grises con una resolución de 8

bits. Esta imagen se segmentó ( “Thershold” ) con el algoritmo Otsu y fue guardada para

su análisis posterior con el programa SigmaScan Pro 5.0, con el cual se determinarán el

número de poros, el área de los poros y el factor de forma.

Color: El color se evaluó tanto en la miga como en la corteza, utilizando para ello un

espectrofotómetro Color-mate-HDS, con una fuente de iluminación D65 y un ángulo de

observación de 10°. Se tomaron 5 lecturas por muestra en diferentes puntos tanto en miga

como en corteza, tratando de abarcar para ambos casos las partes centrales y los extremos,

sin alcanzar las orillas. Los datos que se obtuvieron fueron luminosidad (L) y cromaticidad

(±a y ±b) (Calderón y col., 2004).

Textura: Para este análisis se utilizó un texturómetro Texture Analyzer-TX2. El ensayo

consistió en una prueba de doble compresión al 50%, utilizando una placa cilíndrica de 4cm

de diámetro que abarcaba casi la totalidad de la superficie a comprimir del producto. La

velocidad de cabezal fue de 18cm/min.

Para el ensayo, al producto se le eliminó la corteza buscando obtener una muestra de 4cm

de altura. Esta se colocó en la placa de sujeción del equipo. El cabezal con la placa de

compresión fue bajado hasta tocar el producto sin deformarlo. Este procedimiento permitió

fijar la altura máxima del producto y por ende el desplazamiento para obtener el 50% de

compresión para la altura original. Una vez fijadas dichas alturas, el producto fue

comprimido y una vez alcanzado el 50% de compresión la placa subió automáticamente

hasta dos centímetros por arriba de su altura original (6 cm), volviendo nuevamente a bajar

y produciendo de esta forma una doble compresión en las muestras. Este proceso genera

una gráfica que evalúa la fuerza suministrada contra velocidad.

La fuerza de compresión al 50% representa la fuerza necesaria, medida en Kgf., para

comprimir el producto a un determinado valor de su altura original. En este trabajo se

comprimió el producto hasta el 50%. Se mide directamente la altura máxima de la primera

curva. La firmeza representa la fuerza necesaria para que el producto se empiece a

deformar. Se mide la altura de la primera curva en el punto cuando esta cambia de

pendiente (primera inflexión) y el equipo lo reporta directamente en kilogramos fuerza. El

área bajo la primera curva de compresión representa el trabajo necesario para comprimir el

producto; el equipo lo reporta directamente en Joules.

Extracción de la fracción 7s

El procedimiento para la extracción de la fracción 7s se observa en la Fig. 1 de una manera

resumida y está basado en la metodología propuesta por Carbonaro et al (2004). Este

procedimiento fue analizado por etapas debido a que cuando se realizó de forma completa,

no se obtuvo el rendimiento esperado. Debido a lo anterior se tomó la determinación de

rehacerlo identificando los puntos críticos, y de esta forma optimizar la extracción. Estos se

muestran a continuación con el nombre de “Etapas”

ETAPA 1

Para la etapa 1 se varió el tiempo de extracción a temperatura ambiente, que en base a los

resultados obtenidos fue el que proporcionó la mayor solubilización de proteínas. Se

planteó probar desde 2 hasta 18 horas. En esta etapa también se modificaron el número de

extracciones, es decir, las veces que se volvió a realizar la solubilización de los precipitados

obtenidos de la primera centrifugación.

ETAPA 2

En la etapa 2 de estudio se realizaron experimentos donde los valores de pH se modificaron

para determinar en qué valor se precipitaba la mayor proporción de fracción protéica que se

está buscando. Se planteó experimentar en un intervalo de pH de 4.3 hasta 5.8. Se evaluó el

contenido de proteína soluble mediante la metodología de Lowry.

ETAPA 3

En esta etapa se volvió a probar con los diferentes pH evaluados en la etapa anterior, pero

además resolubilizando la muestra después de la segunda centrifugación en 4 diferentes

solventes (Tris-HCl 0.2M pH 8, Tris-Gly, Agua y NaCl 0.5M). La solubilización se llevó a

cabo mezclando el sobrenadante de la segunda centrifugación con el solvente en una

proporción muestra solvente 1:1.

El proyecto se lleva avanzado hasta esta etapa en cuanto a la extracción.

Fig. 1 Extracción de la fracción 7s (Método Carbonaro et al, 2004)

Para la obtención se utilizaron 5g de harina de soya germinada o integral desengrasada, y

Tris (F-8404 Mínimo 99.9% de Sigma)-HCl 0.2M pH 8 en relación 1:15 (p/v) con respecto

a la harina, en una botella de polipropileno de 250mL (Beckman Coulter). Esta mezcla se

homogenizó (biohomogenizador Fisher Scientific; capacidad de operación 5 a 200mL) a 10

000 rpm, durante 3 minutos. La muestra se mantuvo en agitación constante con ayuda de un

agitador magnético (Mistral Pyro Multi-stirrer, a velocidad media propia de este aparato)

según el tiempo de evaluación (etapa 1). Posteriormente el homogenizado se centrifugó

(centrífuga refrigerada Beckman Avanti J-15) durante 45 minutos a 35000*g. Tanto el

sobrenadante como el pellet se guardaron a -18°C, para realizarles posteriormente pruebas

de:

a) electroforesis (PAGE-SDS) y humedad al precipitado,

b) proteína soluble (Bradford) y electroforesis (PAGE-SDS) al sobrenadante.

Después, el sobrenadante fue ajustado a distintos pHs (3.59, 4.3, 4.5, 4.8, 5.0, etapa 2),

utilizando HCl 0.1M, para lo cual se utilizó un potenciómetro (Potenciómetro Corning);

una vez ajustado el pH a los valores seleccionados cada una de las muestras se volvió a

centrifugar a 12000*g por 30 minutos. Tanto al precipitado como al sobrenadante se les

volvió a realizar las mismas pruebas efectuadas en la primera centrifugación.

El precipitado fue resuspendido en los diferentes solventes (Tris-HCl 0.2M pH 8, Tris-Gly,

Agua y NaCl 0.5M) en relación 1:1 (v/v) (etapa 3) y analizado nuevamente en cuento a

proteína soluble y caracterización electroforética.

A la fecha se están llevando a cabo las pruebas correspondientes a la etapa 4 que consistirá

en la determinación de la cantidad de sulfato de amonio necesaria para precipitar la mayor

cantidad de proteína posible y la etapa 5 que consistirá en la determinación del tiempo de

diálisis y los cambios de agua para lograr la mejor extracción (etapa 5).

Proteína soluble. Método de Lowry.

Se preparó un patrón de seroalbúmina bovina (Gibco BRL) con concentración de

400μg/mL, a partir de él se realizó la curva tipo en un intervalo de proteína de 50 a

400μg/mL. Tanto para las muestras como para el estándar la cantidad de volumen de

trabajo fue de 1 mL, completando con agua destilada para obtener tal volumen.

Posteriormente a cada estándar y muestra se les adicionó 0.1 mL de DOC al 15%

(deoxicolato de sodio con un mínimo de 97% de pureza, marca Sigma); este reactivo

elimina la interferencia que ocasiona el Tris durante la determinación de proteína por este

método. A continuación se adicionó 0.1 mL de TCA al 72% (Acido tricloroacético reactivo

grado electroforético 99% mínimo de Sigma). Después la curva y las muestras fueron

centrifugadas por 10 minutos en una microcentrífuga (eppendorf 54158D) a su máxima

velocidad (12 000 rpm). En este paso se obtuvieron 2 partes: un sobrenadante y un

precipitado, el sobrenandante fue desechado y al precipitado se le adicionó 1 mL del

reactivo de Lowry, se agitaron y la mezcla fue trasvasada a tubos de ensayo. Después a los

tubos de microcentrífuga se les adicionó 1 mL de agua destilada para enjuagarlos. Este

lavado también es vertido en los tubos de ensayo anteriormente mencionados. Al líquido

obtenido se le dejó reposar por 20 minutos a temperatura ambiente, transcurrido este

tiempo se le adicionó 0.5 mL del reactivo de Folin-Ciocalteu (marca Sigma 2N, especial

para esta determinación) y se dejaron 30 minutos para el desarrollo del color. La curva y

las muestras se leyeron en un espectrofotómetro Spectronic a 500nm.

Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)

SDS-PAGE se llevó a cabo de acuerdo con la técnica de Laemmli, en un gel separador

(11%) de poliacrilmida en presencia de β-mercaptoetanol. También incluía un gel

concentrador al 5%. Dependiendo del estado de agregación de la muestra, se siguieron 2

procedimientos: si la muestra era líquida se tomaron 500μL y se le adicionó 500 μL de

buffer de muestra (Tris HCl, pH 8.3, SDS 20%, glicerol 2%, 0.02% de azul de bromofenol

BioRads Laboratories), pero si era sólida se pesó la cantidad necesaria para tener una

solución con concentración de muestra de 1mg/mL, y a 500 μL de ésta también se le

adicionó 500 μL de buffer de muestra. Las muestras se agitaron con ayuda de un vórtex

(Maxi Mix IIIM37615) por 30 segundos y después se pusieron en un baño de agua en

ebullición por 5 minutos. De nuevo fueron agitados por 10 segundos en el vórtex y se

dejaron enfriar para la inyección en el gel concentrador. Se inyectaron de 5 a 15μL en cada

pozo. Después de la corrida electroforética (110V, 2h), el gel fue teñido con azul de

Coomasie R-250.

El marcador de bajo peso molecular (LMW) fue obtenido de Amersham Biosciences, cuya

composición es: fosforilasa b (97 000Da), albúmina (66 000Da), ovoalbúmina (45 000Da),

anhidrasa carbónica (30 000Da), inhibidor de tripsina (20 100Da) y α-lactoalbúmina (14

400Da). El marcador fue preparado de acuerdo con las indicaciones del proveedor,

adicionándole 200μL de buffer de muestra a cada vial para reconstituirlo. A partir de aquí

se hizo el mismo procedimiento térmico mencionado anteriormente para las muestras. De

esta mezcla se tomaron de 2-8 μL, que es la cantidad recomendada por el proveedor para

inyectar en el pozo del gel.

Niveles de sustitución de harinas de soya para las pruebas reológicas de las muestras patrón. Se trabajó con harinas de soya germinada y sin germinar desgrasadas. Para todos los

ensayos se trabajaron tres niveles de adición buscando incorporar 0.5, 1.0 y 1.5 % proteína

de cada tipo de harina y se compararon con un testigo de harina de trigo sin adicionar. La

selección de estos valores se basó en los resultados obtenidos por Gûemes-Vera (2004).

Los ensayos para cada harina se hicieron independientes, todos ellos por triplicado. (Cuadro

1)

Cuadro 1. Nivel de adición de harinas de soya a harina de trigo.

% de proteína g harina soya desgrasada / 100 grs. de

mezcla

de soya

adicionada Sin germinar Germinada

0.0 (Testigo) 0.0 0.0

0.5 1.2 1.2

1.0 2.4 2.4

1.5 3.7 3.7

Análisis estadístico de resultados.

Todos los resultados se evaluaron estadísticamente mediante análisis de varianza y prueba

de Tukey, utilizando un nivel de confianza del 95%.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Caracterización de materias primas Análisis fisicoquímico en harinas En el cuadro 2 se presentan los resultados del contenido de humedad, proteína y cenizas

realizado en la muestra de harina de trigo, así como también en las de harinas de soya, tanto

germinada como sin germinar. Los resultados obtenidos para harina de trigo se comparan

con los estipulados por la Norma de Comercialización para Harina de Trigo semifina (Tipo

II). (SECOFI,1982). No se encontró norma para las harinas de soya.

Cuadro 2. Composición química de la harina de soya.

MUESTRA % HUMEDAD % PROTEÍNA (bs) % CENIZAS (bs)

% EXTRACTO ETEREO (bs)

INTEGRAL 7.9 ± 0.2 38.5 ± 0.3 5.9 ± 0.2 17.05 ± 0.4 GERMINADA 8.3 ± 0.1 39.6 ± 0.3 6.0 ± 0.04 17.12 ± 0.3

TRIGO 12.4 ± 0.05 9.4 ± 0.2 0.6 ± 0.03 - - - - NORMA* Máx. 14.0 Min. 9.0 Máx. 0.72 - - - -

Donde: bs, base seca. * Harina de trigo, Norma de comercialización para Harina de Trigo semifina. Integral: harina de soya integral. Germinada: harina de soya germinada. Los resultados son el promedio de tres repeticiones + el error estándar

De los resultados mostrados en el cuadro 2 se puede observar que el contenido de proteína

y de cenizas no varía en las harinas de soya germinada e integral. Ukwuru (2003) reporta

valores de proteína para harina de soya integral sin germinar más altos (45.3 – 46.8%) y en

cenizas más bajos (3.0 – 4.2%) comparados con los obtenidos en este trabajo. Lo anterior

podría ser debido al tipo de molienda y a las variedades de soya utilizadas. En cuanto al

contenido de grasa el autor mencionado reporta valores similares a los obtenidos en este

trabajo. Los valores obtenidos en la harina de trigo cumplen con los requerimientos de

norma en los parámetros evaluados.

Extracción de Grasa y determinación de proteína en muestras de harinas de soya desgrasadas

Para que las harinas de soya estuvieran libres de grasa fue necesario someterlas a una serie

de extracciones con hexano y determinar el número de cambios de solvente para lograr la

mayor extracción. Los resultados se muestran en el Cuadro 3.

Cuadro 3. Extracto etéreo en harina de soya germinada y sin germinar.

# EXTRACCIONES % GRASA RESIDUAL harina de soya integral

%GRASA RESIDUAL harina de soya germinada

1 17.1 ± 0.4 17.12 ± 0.3 2 15.4 ± 0.5 15.4 ± 0.4 3 13.3 ± 0.12 13.3 ± 0.08 4 1.4 ± 0.06 1.4 ± 0.03 5 1.0 ± 0.01 1.0 ± 0.01

Proporción harina/hexano 1:4 p/v en agitación por 2 horas a temperatura ambiente. Los resultados son el promedio de tres repeticiones + el error estándar

Los resultados muestran que para reducir el contenido de lípidos en las harinas de soya fue

necesario realizar 5 extracciones a cada tipo de harina, lográndose obtener un 1.0% de grasa

residual; con esta concentración de grasa se puede hablar de una harina desgrasada (Badui,

1993).

A estas harinas desgrasadas se le volvió a determinar contenido de proteína, encontrando

para la harina integral un 43.6% ± 0.3, mientras que para la germinada un 44.8% ± 0.4.

Estos datos fueron la base para la preparación de las mezclas.

Evaluación farinográfica en sistema mezclas de harinas-agua

La evaluación farinográfica se llevó a cabo en dos tipos de sistemas. El primero formado

por mezclas de harina de trigo adicionada con diferentes niveles de soya y el segundo con

todos los ingredientes para la elaboración de pan blanco, incluyendo la harina de trigo

adicionada con soya. Al primero se le denominó como sistema mezclas de harinas-agua,

mientras que al segundo se le llamó como formulación para panificación.

Sistema Mezclas de Harinas - Agua

En el Cuadro 4 se muestran los resultados del análisis farinográfico de las harinas

adicionadas.

Cuadro 4. Efecto de la adición de diferentes concentraciones de harinas de soya germinada y sin germinar a sobre las propiedades farinográficas en mezclas de harinas-agua.

%ABS TP (min.)

TMC (min.)

EST (min)

TCOL (min.)

TESTIGO 55.0 + 0.0 17.0 + 0.05 19.0 + 0.02 20.3+ 0.02 31.6 + 0.03 INTEGRAL 0,5% 55.0 + 0.0 17.8 + 0.2 20.6 + 0.2 22.7 + 0.5 32.8 + 0.2 INTEGRAL 1,0% 55.7 + 0.0 19.6 + 0.4 20.8 + 0.9 22.7 + 0.5 33.7 + 0.5 INTEGRAL 1,5% 56.3 + 0.0 20.0 + 0.0 21.8 + 0.2 23.2 + 0.7 39.5 + 1.5

GERMINADA 0,5% 55.7 + 0.00 17.3 + 0.2 19.0 + 0.4 21.7 + 0.5 28.2 + 0.6 GERMINADA 1,0% 56.2 + 0.00 18.0+ 0.0 19.8 + 0.0 21.8 + 0.2 29.9 + 0.7 GERMINADA 1,5% 56.7 + 0.00 18.8 + 0.2 20.3 + 0.2 22.6 + 0.5 29.9 + 0.3

Donde: Integral: harina de soya integral desgrasada. Germinada. Harina de soya germinada y desgrasada. Los niveles de sustitución (0.5, 1.0, y 1.5%) representan el aporte de proteína por parte de las harinas de soya. %ABS: Absorción de agua; TP: Tiempo pico; TMC: Tiempo de Máxima Consistencia; EST: Estabilidad; TCOL: Tiempo de colapsamiento. Los resultados son el promedio de tres repeticiones + el error estándar En los resultados se observa que el porcentaje de absorción va incrementándose conforme

aumenta el grado de sustitución de harina de soya, mostrando un valor mayor las mezclas

con harina de soya germinada; esto es debido al incremento en la cantidad de proteína de la

mezcla; a mayor concentración de proteína, mayor nivel de absorción de agua. Los

resultados anteriores concuerdan con lo reportado por Indrani y col (1997).

Los valores del tiempo pico indican el tiempo necesario para alcanzar el punto de máxima

consistencia, en donde se observa que a mayor adición de harina de soya, tanto para

integral como para germinada, se requiere un mayor tiempo para alcanzar este punto. Los

valores de tiempos de máxima consistencia (TMC) señalan el tiempo al cual la masa

empieza a decaer; en los resultados se observa que las masas adicionadas con las harinas de

soya tardan más tiempo en decaer que la masa testigo, esto también se observa en la

estabilidad.

Las proteínas de la soya tienen la propiedad de aportar al producto elasticidad (Stauffer

2002), lo que puede estar relacionado con un mayor requerimiento energético que debe

suministrase durante el mezclado, aumentando de esta forma los tiempos necesarios para

desarrollar la masa a su punto de óptima consistencia. Basman y col (2003), así como

también Indrani y col (1997) reportaron que al aumentar los niveles de adición de harina de

soya a harina de trigo, las propiedades farinográficas de estas mezclas cambian con

respecto al testigo, observando incrementos en el porcentaje de absorción, y en el tiempo de

desarrollo de la masa al aumentar el nivel de sustitución. Los resultados presentados en el

Cuadro 4 están acordes con la información de estos autores.

El tiempo de colapsamiento indica el tiempo en el que la masa pierde sus propiedades

viscoelásticas y deja de ser apta para la producción de pan; en los resultados obtenidos se

observa que conforme se incrementa la adicción de harina de soya, el tiempo de

colapsamiento se incrementa, siendo este fenómeno más notable en las muestras

adicionadas con harina integral.

Es importante resaltar que en este sistema todas las muestras presentaron un tiempo pico

falso (datos no mostrados), lo cual puede estar relacionado con una absorción rápida de

agua al inicio del proceso, generando mayor resistencia al mezclado sin que la masa

presente las propiedades viscoelásticas características de una masa desarrollada al punto

óptimo. No se encontró información que avale o refute estos resultados.

Ensayos extensográficos en sistema Mezclas de Harinas - Agua

En los cuadros 5-8 se muestran los resultados del comportamiento extensográfico a

diferentes tiempos de reposo con los diferentes niveles de adición.

La resistencia a la extensión evaluada a los 50 mm después del inicio de la curva (T50) y a

los 45 minutos de reposo (Cuadro 5) es afectada por la adición de harina de soya

independientemente de la concentración adicionada. La harina de soya germinada fue la

que aumentó en mayor proporción este parámetro en comparación con el testigo. Al

incrementarse el tiempo de reposo, de 45 a 90 minutos, este parámetro se incrementa, sin

que tenga influencia la concentración de harina de soya adicionada. Posteriormente T50 no

cambia con la concentración y el tiempo de reposo (P< 0.05).

Cuadro 5. Efecto de la adición de harinas de soya desgrasadas integral y germinada a diferentes concentraciones sobre la resistencia medida a 50 mm del inicio de la curva (T 50).

Tiempo 45 (min.)

Tiempo 90 (min.)

Tiempo 135 (min.)

TESTIGO 430a + 7 550d + 8 543e + 12 INTEGRAL 0.5 % 460b + 4 553d + 2 546e + 5 INTEGRAL 1.0 % 469b + 1 553d + 5 546e + 8 INTEGRAL 1.5 % 469b + 5 557d + 2 550e + 8

GERMINADA 0.5 % 503c + 5 557d + 5 547e + 5 GERMINADA 1.0 % 503c + 12 563d + 5 550e + 7 GERMINADA 1.5 % 510c + 8 563d + 6 557e + 5

Donde: Integral: harina de soya integral desgrasada. Germinada. Harina de soya germinada y desgrasada. Los niveles de sustitución (0.5, 1.0, y 1.5%) representan el aporte de proteína por parte de las harinas de soya. T50: Resistencia a la extensión evaluada a 50 mm. Los resultados son el promedio de tres repeticiones + el error estándar. Letras iguales significan que no existe diferencia significativa. El análisis estadístico se llevó a cabo de forma independiente para cada columna de resultados.

En el cuadro 6 se presentan los resultados obtenidos en la determinación de TMAX, donde se

puede observar que no existe un cambio considerable por los distintos niveles de adición de

harina de soya germinada o integral comparados con el testigo, excepto para las muestras

con 1.0 y 1.5% de harina de soya germinada a los 45 minutos de reposo. Al analizar el

efecto del tiempo de reposo se encontró que existe un incremento significativo (P< 0.05) en

este parámetro al pasar de 45 minutos a 90 minutos. Posteriormente se observó un ligero

decremento en esta variable.

Cuadro 6. Efecto de la adición de harinas de soya germinada y sin germinar a diferentes concentraciones en la resistencia máxima a la extensión (Tmax).

Tiempo 45 (min)

Tiempo 90 (min.)

Tiempo 135 (min.)

TESTIGO 503a + 5 617c + 1.5 603d + 5

INTEGRAL 0.5 % 510ª + 8 627c + 8 607d + 6

INTEGRAL 1.0 % 513ª + 8 627c + 8 607d + 5

INTEGRAL 1.5 % 518ª + 6 633c + 8 610d + 8

GERMINADA 0.5 % 503ª + 2 630c + 0 607d + 9

GERMINADA 1.0 % 443b + 9 630c + 0 610d + 8

GERMINADA 1.5 % 453b + 5 637c + 1 617d + 12

Donde: Integral: harina de soya integral desgrasada. Germinada. Harina de soya germinada y desgrasada. Los niveles de sustitución (0.5, 1.0, y 1.5%) representan el aporte de proteína por parte de las harinas de soya. Tmax. Resistencia a la máxima extensión. Los resultados son el promedio de tres repeticiones + el error estándar. Letras iguales significan que no existe diferencia significativa. El análisis estadístico se llevó a cabo de forma independiente para cada columna de resultados.

Al comparar los resultados de T50 y de Tmax se puede notar que la adición de las harinas

de soya tiende a incrementar la resistencia a la extensión, sin embargo este efecto se

observa con mayor facilidad en T50. Para ambos parámetros, el tiempo de reposo

incrementó los valores de resistencia a la extensión. Maforimbo y col (2006), así como

también Hegazy y col (1990) reportaron que la resistencia a la extensión se incrementa al

adicionar harina de soya, esta información es semejante a los resultados mostrados en este

trabajo para T50. Con respecto a Tmax, Indrani y col (1997) reportaron que al adicionar

harina de soya la resistencia a la extensión disminuye, lo cual es semejante a los valores

obtenidos con la adición de 1.0 y 1.5% en harina germinada.

Los resultados del cuadro 7 muestran el comportamiento de la extensibilidad que tienen las

6 diferentes masas a diferentes tiempos de reposo comparados con el testigo. Se observa

que no hay ningún efecto tanto con la adición de harina de soya y el tiempo de reposo

sobre este parámetro. La información publicada es contradictoria sobre este parámetro, ya

que algunos autores citan que la extensibilidad se incrementa (Maforimbo y col 2006,

Hegazy y col 1990), mientras que otros citan que disminuye (Indrani y col 1997). En

ninguno de los casos los resultados de este trabajo concuerdan con la información

publicada, lo cual podría deberse a las concentraciones de harina de soya adicionada en los

diferentes trabajos.

.

Cuadro 7. Efecto de la adición de harinas de soya germinada y sin germinar a diferentes concentraciones sobre la Extensibilidad (L).

Tiempo 45 (min.)

Tiempo 90 (min.)

Tiempo 135 (min.)

TESTIGO 140a + 16 141a + 8 142a + 3

INTEGRAL 0.5 % 147ª + 5 142ª + 2 147ª + 2 INTEGRAL 1.0 % 159ª + 1 146ª + 2 147ª + 2 INTEGRAL 1.5 % 162ª + 2 151ª + 1 148ª + 2

GERMINADA 0.5 % 147ª + 2 143ª + 3 140ª + 1 GERMINADA 1.0 % 151ª + 1 147ª + 2 145ª + 4 GERMINADA 1.5 % 155ª + 4 150ª + 4 148ª + 2

Donde: L. Extensibilidad.; Integral: Mezclas de harina de trigo con harina de soya integral desgrasada. Germinada. Mezclas de harina de trigo con harina de soya germinada y desgrasada. Los niveles de sustitución (0.5, 1.0, y 1.5%) representan el aporte de proteína por parte de las harinas de soya. Los resultados son el promedio de tres repeticiones + el error estándar. Letras iguales significan que no existe diferencia significativa. El análisis estadístico se llevó a cabo de forma independiente para cada columna de resultados.

Los resultados obtenidos en la evaluación el índice de fuerza (Tmax/L) se muestran en el

Cuadro 8 para la harina de trigo adicionada con diferentes niveles de harina de soya

germinada y sin germinar. En estos resultados se encuentra que el valor más alto para este

parámetro a los 45 minutos de reposo lo tiene el testigo y no tiene variación significativa

(P<0.05) con las muestras adicionadas con harina de soya tanto integral como germinada a

un nivel de adición de 0.5% ; posterior a este nivel este parámetro tiende a disminuir,

siendo este comportamiento más marcado con la adición de harina de soya germinada. Al

evaluar el efecto por tiempo de reposo se observa un incremento en este parámetro al pasar

de 45 a 90 minutos, permaneciendo constante posteriormente. Para estos tiempos de reposo

(90 y 135 min.) no se observó efecto por la adición de las harinas de soya.

Cuadro 8. Efecto de la adición de harinas de soya desgrasadas integral y germinada a diferentes concentraciones sobre la relación Tmax/L.

Tiempo 45 (min.)

Tiempo 90 (min.)

Tiempo 135 (min.)

TESTIGO 3.6ª + 0.01 4.4d + 0.29 4.2d + 0.12 INTEGRAL 0.5 % 3.5ª + 0.08 4.4d + 0.09 4.2d + 0.04 INTEGRAL 1.0 % 3.2b + 0.05 4.2d + 0.21 4.1d + 0.05 INTEGRAL 1.5 % 3.2b + 0.05 4.2d + 0.04 4.1d + 0.00

GERMINADA 0.5 % 3.4ª + 0.05 4.4d + 0.08 4.3d + 0.05 GERMINADA 1.0 % 2.9c + 0.09 4.3d + 0.08 4.2d + 0.16 GERMINADA 1.5 % 2.9c+ 0.12 4.2d + 0.12 4.2d + 0.12

Donde: Integral: harina de soya integral desgrasada. Germinada. Harina de soya germinada y desgrasada. Los niveles de sustitución (0.5, 1.0, y 1.5%) representan el aporte de proteína por parte de las harinas de soya. Tmax/L: relación T/L. Los resultados son el promedio de tres repeticiones + el error estándar. Letras iguales significan que no existe diferencia significativa. El análisis estadístico se llevó a cabo de forma independiente para cada columna de resultados.

Los resultados mostrados en el Cuadro 8 son los esperados, ya que al incrementarse el valor

de Tmax y permanecer constante el valor de L, la relación T/L se incrementa.

Ensayos farinográficos en formulación para panificación. En el cuadro 9 se muestran los resultados del análisis farinográfico de las formulaciones

para pan blanco adicionadas con diferentes niveles de harinas de soya.

Cuadro 9. Efecto de la adición de harinas de soya desgrasadas integral y germinada a diferentes

concentraciones sobre las propiedades farinográficas en mezclas para panificación.

TP (min)

TMC (min)

EST (min)

TCOL (min)

TESTIGO 9.8a+0.2 9.8a+0.2 17.3a+0.5 22.0a+1.6 INTEGRAL 0.5 % 10.2ª+0.2 10.2ª+0.2 17.5a+0.2 32.2b+1.4 INTEGRAL 1.0 % 11.3b+0.2 11.3b+0.2 18.7a+1.3 32.7b+2.5 INTEGRAL 1.5 % 11.7b+0.7 11.7b+0.7 19.2a+1.0 31.5b+0.4

GERMINADA 0.5 % 11.0a+0.0 11.0a+0.0 17.8a+1.3 29.7b+1.7 GERMINADA 1.0 % 11.7b+0.7 11.7b+0.7 18.9b+1.0 29.2b+1.2 GERMINADA 1.5 % 11.7b+2.2 11.7b+2.2 19.8b+0.8 28.7b+2.0

Donde: Integral: mezcla de ingredientes de pan y harina de soya integral desgrasada. Germinada.Mezcla de ingredientes de pan y harina de soya germinada y desgrasada. Los niveles de sustitución (0.5, 1.0, y 1.5%) representan el aporte de proteína por parte de las harinas de soya.TMC: Tiempo de Máxima Consistencia, EST: Tiempo de Estabilidad, TP: Tiempo pico, TCOL: Tiempo de colapsamiento. Los resultados son el promedio de tres repeticiones + el error estándar. Letras iguales significan que no existe diferencia significativa. El análisis estadístico se llevó a cabo de forma independiente para cada columna de resultados

Los resultados del cuadro 9 muestran que al utilizar la formulación completa para

panificación, el tiempo pico es menor en comparación a los valores obtenidos en los

sistemas harinas-agua (Cuadro 4). Además se observa que el tiempo pico y el tiempo de

máxima consistencia para este sistema tiene el mismo valor, no existiendo una variación

significativa en estos parámetros a un nivel de sustitución de harina de soya de 0.5% para

ambos tipos de harinas, comparando con el testigo, sin embargo, al aumentar este nivel a 1

y 1.5% si existe un incremento en dichos parámetros. Este fenómeno, como ya se había

explicado anteriormente, es debido al incremento en la resistencia a la extensión (T50 y

Tmax) que confieren las proteínas de la soya a la masa, lo que hace necesario un

incremento energético y por lo tanto un mayor tiempo de mezclado. En este sistema ya no

se encontró el tiempo pico falso observado en el sistema harinas-agua. En este cuadro

también se observa que el sistema formulación para panificación es menos estable que el

sistema harinas-agua (Cuadro 4) ya que hay un decremento en los valores de este

parámetro.

El valor de la estabilidad en el sistema para panificación no muestra un cambio

significativo entre el testigo y los niveles de adición de harina integral, sin embargo este

parámetro si aumenta considerablemente a partir de un nivel de adición del 1% de harina de

soya germinada. Con respecto al tiempo de colapsamiento se puede observar un

incremento en este parámetro al aumentar el nivel de adición de harina de soya con

respecto al testigo. Estos resultados están acorde con los publicados por Basman y col

(2003) e Indrani y col (1997).

Evaluación del efecto del nivel de sustitución de harina de soya sobre las propiedades

estructurales y sensoriales del producto terminado.

VOLUMEN ESPECIFICO En el cuadro 10 se muestran los resultados de la evaluación de los cambios en volumen

específico que sufre el pan al adicionarle harina de soya.

Cuadro 10. Volumen específico en pan de harina de trigo adicionado de harina de soya germinada y sin germinar a diferentes concentraciones.

NIVEL DE ADICIÓN Volumen específico (cm3/g)

Testigo 0% 3.8a+0.05 Integral 0.5% 4.3b+0.01

Integral 1.0% 4.5c+0.03 Integral 1.5% 4.6d+0.03

Germinada 0.5% 4.4c+0.05 Germinada 1.0% 4.7d+0.01 Germinada 1.5% 4.8d+0.01

Donde: Integral: Pan adicionado con harina de soya integral desgrasada. Germinada. Pan adicionado con harina de soya germinada y desgrasada. Los niveles de sustitución (0.5, 1.0, y 1.5%) representan el aporte de proteína por parte de las harinas de soya. Los resultados son el promedio de tres repeticiones + el error estándar Letras iguales significan que no existe diferencia significativa. El análisis estadístico se llevó a cabo de forma independiente para cada columna de resultados.

Los resultados del cuadro 10 muestran que el nivel de adición de Harina de soya tanto

germinada como sin germinar tiene un efecto positivo sobre el volumen del producto

(P<0.05). También se observa que el proceso de germinación ayuda a mejorar este

parámetro, ya que en las muestras trabajadas con harina de soya germinada se tienen

mayores volúmenes.

Estos resultados están acorde con los reportados por Stauffer (2002) quien menciona que la

harina de soya contiene enzimas que intervienen en la formación de hidroperóxidos de

ácidos grasos ricos y que reaccionan con el gluten, aumentando su viscoelasticidad, fuerza

y el volumen del pan horneado.

COLOR En el cuadro 11 se muestran los resultados de la evaluación de los cambios en el color en

la miga, debido al nivel de adición de Harina de Soya.

Cuadro 11. Efecto en el color de la miga del pan adicionado de harina de soya germinada y sin

germinar a diferentes concentraciones.

Miga L a b

Testigo 64.5a+1.4 0.7ª+0.05 12.9ª+0.3 Integral 0.5% 62.2a+1.9 0.5b+0.04 11.6b+0.06 Integral 1.0% 62.5ª+1.3 0.5b+0.04 11.3b+0.2 Integral 1.5% 61.0a+ 2.4 0.5b+0.04 10.7c+0.08

Germinada 0.5% 61.5ª+1.5 0.4c+0.06 12.7ª+0.08 Germinada 1.0% 62.7ª+0.8 0.4c+0.03 11.8b+1.0 Germinada 1.5% 62.4ª+0.7 0.2c+0.01 10.2c+0.3

Donde: Integral: Pan adicionado con harina de soya integral desgrasada. Germinada. Pan adicionado con harina de soya germinada y desgrasada. Los niveles de sustitución (0.5, 1.0, y 1.5%) representan el aporte de proteína por parte de las harinas de soya. a: coloración rojiza; b: coloración amarillenta; L: luminosidad. Los resultados son el promedio de tres repeticiones + el error estándar. Letras iguales significan que no existe diferencia significativa. El análisis estadístico se llevó a cabo de forma independiente para cada columna de resultados.

Los resultados del cuadro 11 muestran que la miga tiende a ser amarillenta (+b) y la

luminosidad tiende a ser constante en todas las muestras. La tonalidad rojiza (a) disminuye

con la adición de harina de soya en comparación con el testigo, sin que el porcentaje de

adición tenga influencia en este parámetro. A mayor nivel de adición de harina de soya

(integral o germinada) el valor de “b” (tono amarillento) va disminuyendo debido a la

acción oxidante de la lipoxigenasa que blanquea los carotenoides de migajón (pigmentos

amarillos naturales) dando un migajón más blanco. Estos resultados concuerdan con los

reportados por Liu 1997.

En el cuadro 12 se muestran los resultados de la evaluación de los cambios en color en la

corteza, debido al nivel de adición de Harina de Soya.

Cuadro 12. Efecto en el color de la corteza del pan adicionado de harina de soya germinada y sin germinar a diferentes concentraciones.

Corteza L a b Testigo 56.5ª+0.7 31.0a+1.0 16.3ª+0.2

Integral 0.5% 53.5ª+1.5 29.2ª+1.5 16.4ª+1.1 Integral 1.0% 54.4ª+0.9 28.2ª+3.2 16.1ª+0.3 Integral 1.5% 55.8ª+1.9 27.0a+1.0 15.7ª+0.3

Germinada 0.5% 52.9ª+1.2 29.9ª+2.0 16.8ª+0.8

Germinada 1.0% 53.2ª+1.5 27.9ª+3.2 16.5ª+0.2 Germinada 1.5% 54.6a+1.2 26.9ª+1.4 16.2ª+1.3

Donde: Integral: Pan adicionado con harina de soya integral desgrasada. Germinada. Pan adicionado con harina de soya germinada y desgrasada. Los niveles de sustitución (0.5, 1.0, y 1.5%) representan el aporte de proteína por parte de las harinas de soya. a: coloración rojiza; b: coloración amarillenta; L: luminosidad Los resultados son el promedio de tres repeticiones + el error estándar. Letras iguales significan que no existe diferencia significativa. El análisis estadístico se llevó a cabo de forma independiente para cada columna de resultados.

Los resultados del cuadro 12 muestran que la corteza tiende a ser rojiza (+a) manteniéndose

constante para los diferentes niveles de adición tanto de soya germinada e integral. Stauffer

(2002) reporta que a un nivel de adición del 3 al 12% en base de harina, el color rojizo de

la corteza tiende a mejorar, sin embargo probablemente debido a los bajos niveles de

adición manejados en este trabajo este parámetro no fue afectado

En cuanto a la luminosidad, no se encontró efecto significativo por la adición de las

harinas de soya ni por el nivel de adición al comparar con el testigo. La coloración

amarillenta (b) tendió a mantenerse constante en comparación con el testigo para los dos

tipos de harina (germinada e integral), siendo menor que los valores reportados para miga.

Estos resultados concuerdan con los reportados por Liu (1997).

TEXTURA

En el cuadro 13 se muestran los resultados del efecto del nivel de adición de harina de soya

sobre la firmeza, la fuerza y el trabajo de compresión que se requiere para deformar el

producto a un 50% de su altura original.

Cuadro 13. Cambios en la textura debido a la adición de Harina de Soya.

FIRMEZA Kgf

FUERZA DE COMPRESION AL 50%

Kgf

RESILENCIA

Testigo 0.93 2.1 0.178 Integral 0.5% 0.88 2.2 0.162 Integral 1.0% 0.85 2.2 0.169 Integral 1.5% 0.88 1.9 0.161

Germinada 0.5% 1.14 2.3 0.152

Germinada 1.0% 1.23 2.2 0.153 Germinada 1.5% 1.32 2.2 0.15

Donde: Integral: harina de soya integral desgrasada. Germinada. Harina de soya germinada y desgrasada. Los niveles de sustitución (0.5, 1.0, y 1.5%) representan el aporte de proteína por parte de las harinas de soya

Los resultados del cuadro 13 muestran que la adición de harina de soya integral no

modifica la firmeza del producto (P>0.05), en cambio la harina de soya germinada tienden

a incrementarse estos valores.

La fuerza de compresión es la fuerza necesaria para comprimir al producto al 50% de su

altura original; el cuadro muestra que la adición de harina de soya tanto germinada como

sin germinar no modifican este parámetro. En los resultados reportados por Stauffer (2002)

menciona que la harina de soya usada de 3 al 12% en base de harina tiende a necesitar una

mayor fuerza de compresión, sin embargo el nivel de adición manejado en este trabajo no

permite ver este fenómeno.

Con respecto a los valores obtenidos en las muestras adicionas con harina de soya sin

germinar se observa que tienen una resilencia, es decir una capacidad para recuperar su

forma original después de la segunda compresión, muy semejante comparada con el testigo,

sin embargo si se presenta cambio en las muestras adicionadas con harina de soya

germinada, sin que la concentración de harinas de soya (germinada y sin germinar) tenga

influencia en este parámetro.

RESULTADOS DEL PROCESO DE EXTRACCION DE PROTEINA 7S. ETAPA 1

Para la etapa 1 se varió el tiempo de extracción a temperatura ambiente. Se planteó probar

desde 2 hasta 18 horas. En esta etapa también se modificaron el número de extracciones,

es decir, las veces que se volvió a realizar la solubilización de los precipitados obtenidos de

la primera centrifugación.

Cuadro 14. “Etapa de extracción de proteína, tiempo de contacto. Nitrógeno total en el precipitado de la primera extracción. Factor: N x 6.25”.

Tiempo (h) Proteína total base seca (g)

Proteína total de la muestra base seca (%)

Coeficiente de variación

2 46.37 22.32 ± 3.62 16.20 5 38.01 22.79 ± 1.64 7.19

9.5 46.10 25.96 ± 9.21 35.49 18 48.76 34.64 ± 2.55 7.35

Cuadro 15. “Etapa de extracción de proteína, tiempo de contacto. Proteína soluble

cuantificada por el método de Bradford en el sobrenadante de la primera extracción”.

Tiempo (h) Proteína soluble total (g)

Proteína total de la muestra base seca (%)

Coeficiente de variación

2 0.90 19.56 ± 9.39 48.01 5 1.14 24.63 ± 7.39 30.01

9.5 0.63 13.69 ± 7.47 54.58 18 0.87 18.82 ± 4.48 23.80

El tiempo estimado para poder realizar una extracción protéica optimizada se dedujo a partir

de la cantidad de nitrógeno remanente en el precipitado (Cuadro 14) después de la primera

extracción, y a partir de la proteína solubilizada (Cuadro 15) en el disolvente. Puede observarse

que después de las 2h de contacto harina-disolvente la cantidad de nitrógeno total no varía

importantemente, al igual que la cantidad de proteína soluble. Así, un tiempo de dos horas es

suficiente para extraer la mayor proporción de extracto protéico de la harina de soya.

Electroforesis.

En los electroforegramas donde se corrió el sobrenadante de los distintos tiempos de

extracción se observaron bandas bien definidas y reproducibles en cada carril. En el caso de los

precipitados no se observan bandas bien definidas lo cual indica que aún hay mezcla de

sobrenadante en el precipitado. Por lo que se determinó evaluar el número de extracciones a

aplicar al residuo de la centrifugación.

Cuadro 16 “Etapa de extracción de proteína, número de extracciones. Proteína soluble por el método de Bradford en los sobrenadantes de las repeticiones de las extracciones” Número de extracciones

Proteína soluble muestra (g proteína soluble/g de muestra base seca)

1 49.60 ± 1.35 2 6.67 ± 1.21

Nota: condiciones de extracción: Tris-HCl 0.8M pH . Primera extracción 5 h de contacto. Cantidad de muestra empleada 5g. De cada evaluación se realizaron 2 repeticiones. Centrifugación a 35000 x g.

El número de ciclos de extracciones seleccionado fue de uno, ya que después de la primera

extracción, la proteína soluble extraída no es una cantidad relevante para incluir una repetición

de la extracción (Cuadro 16).

ETAPA 2

En la etapa 2 de estudio se realizaron experimentos donde los valores de pH se modificaron

para determinar en qué valor se precipitaba la mayor proporción de fracción protéica que se

está buscando. Se planteó experimentar en un intervalo de pH de 4.3 hasta 5.8. Se evaluó el

contenido de proteína soluble.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0 2 4 6 8 10pH

Conc

entra

ción d

e prot

eína s

oluble

(mg/m

L)

Figura 1 “Solublidad del extracto protéico de Glycine max a distintos pH (3.59, 4.3,

4.5, 4.8, 5.0). Método de cuantificación de proteína soluble de Lowry.”

La figura 1 muestra un barrido de cantidad de proteína soluble presente en el sobrenadante

después de ajustar el extracto protéico a distintos pH. Se denota que a pH 4.5 la solubilidad

de las proteínas es mínima, ya que queda menor cantidad de ellas en el sobrenadante

después de la centrifugación. Esto da pie a considerar este pH como el óptimo para extraer

la fracción 7S, y la forma para asegurar esto es por medio de un electroferograma. En la

figura 2 se presentan los resultados del análisis electroforético realizado a estas muestras Se

utilizó como patrón de comparación proteína de soya solubilizada con Tris-HCl 0.2M pH 8.0.

Figura 2. “Electroferograma del efecto de la variación del pH en las fracciones del extracto

protéico de Glycine max. Carriles 1 y 2: patrón de comparación; 3 y 4: pH 3.6; 5 y 6: pH

4.29; 7 y 8: pH 4.5; 9 y 10: pH 4.8; 11 y 1 pH 25 Muestras inyectadas por duplicado.

Comparando con el testigo, las muestras tratadas a pH 3.6 muestran la aparición de 2 bandas

(ver flechas en la figura 7). También se puede observar que estas bandas (3 y 4) tienen mejor

resolución en comparación al patrón (1 y 2). En el caso de las muestras tratadas a pH 4.29 (5

y 6), se observó que las bandas disminuyeron en intensidad de color lo que debe estar

relacionado con una menor proporción de proteína presente en este extracto. En la misma se

puede notar la menor definición de en las bandas de proteína de bajo peso molecular, las cuales

no se encuentran presentes en la muestra testigo. En las muestras de pH 4.5 se apreció

claramente que la intensidad de las bandas es la menor en comparación con las otras muestras

y a éste ocurrió la desaparición de 3 bandas (ver flechas en la figura 4); en el pH de 4.8, se pudo

observar que las bandas que desaparecieron en el pH 4.5 comenzaron a poder ser percibidas

nuevamente aunque su intensidad es muy baja y finalmente en pH de 5, las bandas que

desaparecieron a pH de 4.5 (ver flechas en la figura 7) aumentaron en intensidad, siendo mayor

que a pH de 4.8, apreciándose casi de igual forma e intensidad al pH de 4.29.

ETAPA 3

En esta etapa se volvió a probar con los diferentes pH evaluados en la etapa anterior, pero

además resolubilizando la muestra después de la segunda centrifugación en 4 diferentes

solventes (Tris-HCl 0.2M pH 8, Tris-Gly, Agua y NaCl 0.5M). La solubilización se llevó a

cabo mezclando el sobrenadante de la segunda centrifugación con el solvente en una

proporción muestra solvente 1:1.

Figura 3. “Efecto del pH y del tipo de solvente en la fracción 7s de Glycine max. Carriles 1’

y 2’: patrón de comparación 1) Tris-HCl 0.2M pH 8, 2) Buffer Tris-Glicina, 3) Agua y 4) NaCl 0.5M”

En la figura 3 se pueden apreciar los resultados electroforéticos correspondientes a la fase

proteína insoluble a los pH evaluados y resolubilizadas en 4 diferentes solventes (Tris-HCl

0.2M pH 8, Tris-Gly, Agua y NaCl 0.5M). La cantidad de bandas apreciadas fue

prácticamente constante para todos los pH trabajados, pero la intensidad de las bandas fue

diferente para todos estos. Así, a pH 4.5 la coloración fue mayor. En cuanto al disolvente

empleado, la coloración de las bandas es muy homogéneo, lo cual indica que la cantidad de

proteína en la muestra debió de ser muy similar a la inyectada en la electroforesis.

El proyecto se lleva avanzado hasta esta etapa en cuanto a la extracción.

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