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UNIVERSIDAD DE CHILE

Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas

Departamento de Química Farmacológica y Toxicológica

MIOFIBROBLASTOS CARDIACOS DE RATA

ADULTA SON RESISTENTES A AUTOFAGIA

INDUCIDA POR ESTIMULACIÓN β2-

ADRENÉRGICA

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico

JIMENA ANDREA CANALES URRIOLA

Patrocinante : Dr. Guillermo Díaz-Araya.

Directores de tesis : Dr. Guillermo Díaz-Araya.

Pablo Aránguiz Urroz

Santiago, Chile

2010

2

AGRADECIMIENTOS

Agradezco al profesor Dr. Guillermo Díaz Araya por darme la oportunidad de

trabajar en su laboratorio y darme a conocer el mundo de la ciencia. También agradezco

su constante apoyo y preocupación, tanto en el ámbito profesional y como en el ámbito

personal.

Al profesor Dr. Hernán Lara por facilitarnos en reiteradas ocasiones

dependencias de su laboratorio y materiales necesarios para realizar algunos

experimentos.

A mis padres, Jorge y Yihecika, por estar siempre presentes y ser responsables

de mucho de lo que he logrado hoy. Por entregar grandes valores y enseñarlos siempre

de la mejor manera: con el ejemplo. Del mismo modo, agradezco a mis hermanos Jorge,

Jessica y Claudia por hacer muchas veces oídos a mis quejas, por ser consejeros y por

ser confidentes. En definitiva, gracias a mi hermosa familia, pues ha sido un pilar

fundamental en mi formación y en el camino que he recorrido para llegar a estas

instancias.

A Mario por su compañía durante este último período. Agradezco la paciencia y

el cariño, como también la demostración que la vida siempre da otras oportunidades.

A mis amigas Sara, Javiera y Marcela por los años de amistad. Este concepto

implica muchos sentimientos y experiencias compartidas que no son simples de resumir

en estas líneas.

A Carlitos (Cartagena y Constenla), Cristina, Nancy y Carmen por su amistad en

el periodo universitario y que ha perdurado hasta hoy, por su apoyo en los momentos

difíciles y por estar siempre dispuestos a compartir.

A Pablo por su entrega de conocimientos durante el período de tesis. A él, a

Raúl, a Miguel, a Deisy y a Coni por hacer mucho más grato el trabajo en el laboratorio.

De la misma manera, agradezco el buen ánimo de Yenni, Gabriela, Diego, Marcelo y

Pedro, con quienes compartí en el último tiempo.

A todos ustedes, muchas gracias.

3

ÍNDICE GENERAL

Página

ÍNDICE GENERAL 3

ÍNDICE DE FIGURAS 8

ÍNDICE DE TABLAS 9

ÍNDICE DE ABREVIATURAS 10

RESUMEN 15

SUMMARY 16

INTRODUCCIÓN 1

Generalidades 1

Estructura del músculo cardiaco. 1

Fibroblastos cardiacos 1

4

Miofibroblastos cardiacos. 2

Comportamiento de fibroblastos y miofibroblastos cardiacos. 3

Sistema adrenérgico en el corazón 4

Sistema adrenérgico en fibroblastos cardiacos 5

Receptores adrenérgicos y sus vías transduccionales en

fibroblastos cardiacos 6

Autofagia 7

Mecanismos moleculares implicados en la autofagia 8

Rol de la autofagia 10

Autofagia en patologías cardiovasculares. 10

HIPÓTESIS 12

OBJETIVOS 13

Objetivo General 13

Objetivos Específicos 13

MATERIALES Y MÉTODOS 14

Reactivos 14

Modelo Animal 14

Aislamiento y cultivo de fibroblastos cardiacos de rata adulta 15

5

Diferenciación de fibroblastos a miofibroblastos 15

Cuantificación de proteínas 16

Preparación de extractos celulares totales 16

Electroforesis de geles de poliacrilamida 17

Electrotransferencia de proteínas 17

Inmunowestern blot 17

Inmunocitoquímica 18

Obtención de membranas celulares 19

Ensayo de desplazamiento y unión de competencia 19

Determinación de AMP cíclico 20

Análisis estadístico 20

RESULTADOS. 21

Caracterización de receptores adrenérgicos en fibroblastos y

miofibroblastos cardiacos de rata adulta 21

Determinación de Bmax y Kd de receptores β2-adrenérgicos en

fibroblastos y miofibroblastos cardiacos de rata adulta 22

Determinación de funcionalidad de receptores β2-adrenérgicos

en fibroblastos y miofibroblastos cardiacos de rata adulta 23

Activación de ERK 1/2 por estímulo con ISO 23

Producción de cAMP por estímulo con ISO 26

6

Determinación de autofagia en fibroblastos y miofibroblastos

cardiacos de rata adulta frente a concentraciones decrecientes

de suero 27

Determinación de autofagia en fibroblastos y miofibroblastos

cardiacos en condiciones basales 29

Determinación de autofagia en fibroblastos y miofibroblastos

cardiacos de rata adulta frente a estimulación β2-adrenérgica 30

Procesamiento de LC3 I a LC3 II inducido por ISO 30

Localización de LC3 endógeno en vesículas autofágicas inducida

por ISO 32

DISCUSIÓN 35

Caracterización de receptores adrenérgicos en fibroblastos y

miofibroblastos cardiacos de rata adulta 35

Determinación de Bmax y Kd de receptores

β2-adrenérgicos en fibroblastos y miofibroblastos cardiacos de rata adulta 35

Determinación de funcionalidad de receptor β2-adrenérgico 37

Autofagia en fibroblastos y miofibroblastos cardiacos de rata adulta 40

Alcances fisiopatológicos 44

CONCLUSIONES 45

7

REFERENCIAS 46

8

ÍNDICE DE FIGURAS

Página

Figura 1: Esquema de autofagia 9

Figura 2: Desplazamiento de [3H]-DHA 21

Figura 3: Ensayo de unión de [3H]-DHA 22

Figura 4: Activación de ERK 1/2 por estimulación β2-adrenérgica 25

Figura 5: Producción de cAMP por estimulación β2-adrenérgica 26

Figura 6: Procesamiento de LC3 I a LC3 II frente a concentraciones

decrecientes de suero 28

Figura 7: Procesamiento de LC3 I a LC3 II en condiciones basales 29

Figura 8: Procesamiento de LC3 I a LC3 II inducido por

estimulación β2-adrenérgica 31

Figura 9: Organización de LC3 endógeno bajo estimulación

β2-adrenérgica 33-34

9

ÍNDICE DE TABLAS

Página

Tabla 1: Kd y Bmax en fibroblastos y miofibroblastos

cardiacos de rata adulta 23

10

ABREVIATURAS

α-SMA : Alfa actina de músculo liso

[3H]-DHA : Dihidroalprenolol tritiado

µg : Microgramo

µl : Microlitro

µm : Micrómetro

µM : Micromolar

AC : Adenilato ciclasa

AMPK : Kinasa activada por Adenosina monofostato

Ang II : Angiotensina II

Atg : Proteína de genes asociados a la autofagia

Bmáx : Número total de receptores expresado en fmoles/mg de

proteína

BSA : Albúmina de suero de bovino

CaCl2 : Cloruro de calcio

Camp: : Adenosina monofosfato ciclico

cel : Célula

cm : Centímetro

cpm : Cuentas por minuto

csp : Cantidad suficiente para

11

DMEM F-12 : Dulbecco's Modified Eagle's Medium formula 12

DMSO : Di metil sulfoxido

EDTA : Acido etilendiaminotetraacético

EGF : Factor de crecimiento epidermal

EGTA : Ácido etilén glicol-bis( γ-aminoetil eter)-N,N,N’,N’-tetracético

EIA : Enzimoinmuno análisis

EMT : Transición epitelial-mesenquimal

ERK : Proteína kinasa activada por señal extracelular

ET-1 : Endotelina 1

FBS : Suero fetal de bovino

FITC : Fluoresceína isotiocianato

fmoles : Femtomoles

FSK : Forskolina

g : Gramos

h : Hora

HEPES : Acido N-2-hidroxietilpiperazina N-2-etanosulfónico

IGF-II : Factor de crecimiento análogo a insulina tipo II

IL 1 : Interleuquina 1

IL-4 : Interleuquina 4

IL-6 : Interleuquina 6

ISO : Isoproterenol

12

JNK : Kinasa N-terminal de c-Jun

KCl : Cloruro de potasio

Kd : Constante de disociación

kDa : Kilo Dalton

LC3 : Cadena liviana 3 de la proteína 1 asociada a microtúbulo

MAPK : Proteína quinasa activada por mitógenos

MEC : Matriz extracelular

mg : Miligramo

min : Minuto

mL : Mililitro

mm : Milímetro

mM : Milimolar

MMP : Metaloproteasa

mRNA : Ácido ribonucleico mensajero

mTOR : mammalian Target of Rapamicin

mTORC1 : Complejo 1 de mTOR

N : Normal

NA : Noradrenalina

Na3VO4 : Ortovanadato de sodio

NaCl : Cloruro de Sodio

NaOH : Hidróxido de sodio

13

NE : Norepinefrina.

ng : Nanogramos

nm : Nanómetros

nM : Nanomolar

nmoles : Nanomoles

PBS : Tampón fosfato salino

PDGF : Factor de crecimiento derivado de plaquetas

PDE : Fosfodiesterasa

PE : Fosfatidiletanolamina

p-ERK : Proteína kinasa activada por señal extracelular fosforilada.

PI3-K : Fosfatidilinositol 3 kinasa.

PKA : Proteína kinasa A

PKB : Proteína kinasa B

pM : Picomolar

PMSF : Fenilmetilsulfonifluoruro

PVDF : Poli fluoruro de vinilideno

rpm : Revoluciones por minuto

s : Segundos

SD : Desviación estándar

SDS : Dodecil sulfato de sodio

SDS-PAGE : Gel de poliacrilamida desnaturante

14

TBS : Tampón tris salino

TCA : Acido tricloro acético

TGF-β : Factor de crecimiento transformante beta

TNF-α : Factor de necrosis tumoral α

Tris : Tris-(hidroximetil)-aminoetano

v/v : Proporción volumen/volumen

15

RESUMEN

Los fibroblastos cardiacos son células que cumplen un rol fundamental en el

mantenimiento de la homeostasis de la matriz extracelular del corazón. Luego de un

daño al miocardio, además, participan activamente del remodelado cardiaco como tal o

diferenciándose a miofibroblasto, un fenotipo celular que presenta características que lo

hacen apto para funciones de cicatrización. Se ha observado que luego de un daño al

miocardio, el corazón está expuesto a un mayor tono adrenérgico con la finalidad de

compensar la disfunción adquirida por la injuria del tejido. Estudios de nuestro

laboratorio han demostrado que la estimulación β2-adrenérgica por Isoproterenol induce

autofagia en fibroblastos cardiacos de rata adulta, un proceso degradativo que se ha

reportado capaz de perder su equilibrio en diversas patologías cardiovasculares. Por

esto, se vuelve interesante determinar si estos mismos estímulos son capaces de inducir

autofagia en miofibroblastos cardiacos, células que aparecen sólo cuando hay daño al

miocardio. Los resultados muestran que tanto fibroblastos como miofibroblastos

cardiacos presentan receptores adrenérgicos sólo del subtipo β2. Miofibroblastos

cardiacos presentaron mayor número de receptores β2-adrenérgicos y con mayor

afinidad por sus ligandos que fibroblastos cardiacos. En ambos fenotipos celulares los

receptores mencionados se encuentran funcionales. En cuanto a la autofagia, los

estímulos clásicos inductores de autofagia (rapamicina y/o privación de nutrientes) y la

estimulación β2-adrenérgica por Isoproterenol inducen autofagia en fibroblastos. De

modo distinto, estos inductores no fueron capaces de inducir autofagia en

miofibroblastos cardiacos de rata adulta, aunque se encontró que en condiciones basales

presentaban mayor nivel de autofagia que los fibroblastos. Los resultados demuestran

que los miofibroblastos cardiacos son resistentes a la inducción de autofagia por

estimulación β2-adrenérgica, lo que puede abrir una puerta para el entendimiento del rol

de este proceso en estados patológicos del corazón.

16

SUMMARY

Cardiac fibroblasts are cells that play a fundamental role in the maintaining of

extracellular matrix homeostasis of the heart. After a myocardial damage, furthermore,

participate actively of cardiac remodelling as itself or differentiated to myofibroblast, a

phenotype that present characteristics which make it suitable for healing functions. It

has been observed that after damage to myocardium the heart is exposed to a higher

adrenergic tone, in order to compensate the acquired dysfunction of tissue injury.

Studies from our laboratory have shown that cardiac fibroblasts of adult rat exposed to

β2-adrenergic stimulation by Isoproterenol, undergo autophagy, a degradative process

have been reported capable of losing their balance in diverse cardiovascular pathologies.

Therefore, it becomes interesting determinate if cardiac myofibroblasts, cells that appear

only when there is myocardial damage, are capable of undergo autophagy by β2-

adrenergic stimulation. The results showed that cardiac fibroblast and myofibroblast

present adrenergic receptor only subtype β2. Cardiac myofibroblasts presented higher

number of β2-adrenergic receptor and with higher affinity that cardiac fibroblasts. In

both cellular phenotypes the receptors are functional. With regard to autophagy, we

showed that cardiac fibroblasts undergo this process by classics stimuli of autophagy

and by β2-adrenergic stimulation. Differently, cardiac myofibroblast of adult rat did not

undergo autophagy under any of de autophagic stimuli, but were found to have a higher

autophagy basal level that cardiac fibroblast. The results show that cardiac

myofibroblasts of adult rat are resistant of undergo autophagy by β2-adrenergic

stimulation, which can open a door for the understanding the role of autophagy in the

pathologic states of heart.

1

1. INTRODUCCIÓN

1.1 Generalidades

Las enfermedades cardiovasculares son, en la actualidad, uno de los principales

problemas de salud que afectan a la población. En los países desarrollados dan cuenta

de un 27% de mortalidad, cifra que se elevaría a 37% en el año 2020 (1). En nuestro

país, concordante con estos datos, las enfermedades cardiovasculares son hoy en día

responsables de un 27% de las muertes (2) . Es por esto que el estudio del sistema

cardiovascular, a nivel molecular, es esencial para entender la causalidad de sus

patologías y, así, vislumbrar nuevas estrategias terapéuticas.

1.2 Estructura del músculo cardiaco

El corazón, a nivel celular, está compuesto principalmente por cardiomiocitos y

fibroblastos. Los cardiomiocitos corresponden al un 30% de las células constituyentes

del corazón, ocupando un 70% del volumen cardiaco, mientras que los fibroblastos,

principales células no musculares del corazón, corresponden a un 70% del total de

células y ocupan un 30% del volumen total del miocardio (3). Menos del 5%

corresponde a otras células no musculares, tales como células endoteliales, células del

músculo liso vascular, mastocitos y células residentes del sistema inmune (4).

1.2.1 Fibroblastos cardiacos

Los fibroblastos son células que, en un principio, se pensaba tenían sólo una función de

soporte estructural en el corazón (4), sin embargo, se ha descubierto que tienen la

capacidad de proliferar, migrar, diferenciarse a miofibroblastos (5) y, además, realizan

2

funciones que anteriormente no se les asociaban. Una de estas es el mantenimiento de la

homeostasis de la matriz extracelular (MEC) (5), al ser responsables de la síntesis y

secreción de proteínas que la conforman (principalmente colágeno tipo I y III y

fibronectina) (6, 7), como también de la secreción de metaloproteasas (MMPs) que

degradan estas proteínas y permiten el recambio de la MEC (8). Por otro lado, los

fibroblastos pueden responder a estímulos mecánicos, eléctricos o químicos para

mantener el normal funcionamiento cardiaco y, además, son capaces de sintetizar y

liberar mediadores que actúan de manera autocrina y/o paracrina, tales como citoquinas

[Factor de Necrosis Tumoral tipo alfa (TNFα), Interleuquina 1 (IL-1) e Interleuquina 6

(IL-6)], factores de crecimiento [factor de crecimiento transformante (TGF-β)] y

también péptidos vasoactivos [Angiotensina II (Ang II) y endotelina 1 (ET-1)] (7, 8).

En condiciones patológicas, tales como hipertensión arterial, insuficiencia cardiaca o

infarto al miocardio, el fibroblasto cardiaco participa activamente en los procesos de

remodelado y, al haber daño tisular, también en los de cicatrización (4, 8). En estos

casos, su función la cumple al diferenciarse a miofibroblasto, un fenotipo especializado

de fibroblasto activado (7). Esta diferenciación ocurre por estímulos mecánicos y

químicos de manera simultánea (9). Los estímulos mecánicos en sí pueden llevar a la

liberación de estímulos químicos, como factores de crecimiento, especialmente TGF-β1,

o bien pueden participar otros mediadores químicos no derivados de la tensión, como

factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento análogo a la

insulina tipo II (IGF-II) e interleuquina-4 (IL-4) que, junto con la tensión, lograrán la

diferenciación (6, 9).

1.2.2 Miofibroblastos cardiacos

Los miofibroblastos tienen características especiales que los distinguen de los

fibroblastos y que dan cuenta de su rol en los procesos de reparación en que se ven

involucrados. Primero, no son células que residen normalmente en el tejido cardiaco,

3

sino que aparecen en el momento del daño y, funcionalmente, son capaces de secretar

mayores cantidades de proteínas de la MEC (8, 9), siendo los principales responsables

del depósito de éstas en el proceso de reparación del tejido (10). Estos antecedentes,

sumados a que aumentan el recambio de colágeno y la degradación de MMP, los

sindican como células críticas para el proceso de remodelado cardiaco (8). También se

ha demostrado in vivo que tienen mayor propiedad de migración y proliferación que los

fibroblastos, lo que los vuelve aptos para reclutarse en la zona del daño y reparar el

tejido (11). Ahora, en términos estructurales, se caracterizan por expresar proteínas

contráctiles, tales como α-actina del músculo liso (α-SMA), vimentina y desmina, las

cuales formarán un aparato microfilamentoso contráctil que se conectará al espacio

extracelular por adhesiones focales supermaduras, otorgándole a la célula mayor

capacidad de producir fuerza y así contraer el tejido de granulación y, por lo tanto, darle

integridad estructural a la cicatriz (7, 9). En resumen, dadas todas sus características, los

miofibroblastos son capaces de remodelar la MEC y, por anclaje y contracción, limitar

la cicatriz (8).

1.2.3 Comportamiento de fibroblastos y miofibroblastos cardiacos

Fuera de las diferencias estructurales claramente definidas entre fibroblastos y

miofibroblastos, se han observado otras relacionadas con el comportamiento de estos

fenotipos celulares frente a diversos estímulos. Estudios de nuestro laboratorio han

demostrado que estatinas son capaces de inducir muerte celular por apoptosis en

fibroblastos y miofibroblastos cardiacos de ratas neonatas, sin embargo, se observó que

esto ocurre en menor medida en miofibroblastos (12). Otro estudio de nuestro

laboratorio demostró que al sobreexpresar el receptor tipo 1 de Ang II (AT1) en

fibroblastos y miofibroblastos cardiacos de ratas neonatas, al estimular con Ang II éstos

mueren por apoptosis, sin embargo, volvemos a observar que miofibroblasto es más

resistente a este proceso que el fibroblasto (13). Finalmente, se ha observado también

que miofibroblastos resisten mayormente a la privación de suero, pudiendo sobrevivir

4

hasta 7 días bajo esta condición (14). De esta manera, se ha demostrado que en diversas

condiciones desfavorables para la viabilidad del fibroblasto, el miofibroblasto es capaz

de sobrevivir en mayor medida.

Ahora, comparando con otros tipos de miofibroblastos, se ha visto que en la piel, una

vez que la epitelización de una herida ha sido completada, es decir, cuando el tejido

granulomatoso ha evolucionado a una cicatriz madura, los miofibroblastos desaparecen

de la zona mediante una masiva apoptosis (7, 9). Sin embargo, se ha observado que en

la cicatriz madura del infarto, donde ya no deberían residir miofibroblastos, éstos

persisten (15). Esta deficiencia de apoptosis en los miofibroblastos cardiacos podría

asociarlos a procesos ya no de reparación, sino patológicos como la fibrosis cardiaca

(16).

1.3 Sistema adrenérgico en el corazón

Un infarto al miocardio es capaz de progresar y llegar a una disfunción cardiaca, debido

a que la exacerbación del depósito de MEC contribuye al engrosamiento del tejido,

disminuyendo su capacidad de relajación y contracción necesaria para bombear sangre

(17). En este caso, cuando ya se observa una pérdida de función del miocardio, se

encuentra aumentado el tono simpático con la finalidad de compensar esta deficiencia

(18). Así, el sistema adrenérgico se mantiene activado buscando adaptar al corazón a las

necesidades del organismo, pese a su disfunción. Sin embargo, la estimulación

simpática crónica del miocardio contribuye con los cambios morfológicos en el órgano

que finalmente serán deletéreos para su normal funcionamiento (18).

En el corazón, a nivel molecular, la acción del sistema adrenérgico se ejerce a

través de receptores α y β-adenérgicos, siendo estos últimos los más abundantes. En

cuanto a la distribución de estos receptores en las poblaciones celulares del corazón, se

ha descrito que los cardiomiocitos presentan receptores α1, β1 y β2-adrenérgicos, siendo

5

predominantes los receptores β1-adrenérgicos (19). Por otro lado, se ha demostrado que

los fibroblastos sólo presentan un subtipo de receptor adrenérgico: el receptor β2 (20,

21).

Para entender el mecanismo por el cual la estimulación simpática exacerbada

produce efectos nocivos sobre el corazón, es importante saber qué procesos gatilla sobre

sus poblaciones celulares. Estudios han demostrado que catecolaminas provocan

hipertrofia e, incluso, muerte de cardiomiocitos (22). Esto, en parte, podría explicar la

disfunción que adquiere el miocardio bajo estas condiciones, sin embargo, también es

importante saber qué ocurre con la población celular más numerosa del corazón:

fibroblastos.

1.3.1 Sistema adrenérgico en fibroblastos cardiacos

Actualmente existe abundante literatura acerca de los efectos de la estimulación

adrenérgica sobre funciones del fibroblasto cardiaco. En cuanto a la proliferación, es

bien entendido que la estimulación adrenérgica la promueve, sin embargo, la

controversia radica en el mecanismo mediante el cual logra este efecto (8). Fibroblastos

cardiacos humanos han demostrado aumentar su proliferación bajo estímulos con el

agonista β-adrenérgico inespecífico Isoproterenol (ISO), mediante un mecanismo

autocrino, es decir, probablemente este estímulo provoque secreción de factores de

crecimiento u otros mediadores que le otorguen la capacidad de proliferar (20). En

cambio, otro estudio en fibroblastos cardiacos de rata adulta ha demostrado que

Norepinefrina (NE), agonista α- y β- adrenérgico, resulta ser un agente co-mitogénico

en este tipo celular, es decir, este estímulo promueve directamente la proliferación (23).

Ahora, relacionado a la capacidad secretora del fibroblasto, la estimulación con

NE promueve la secreción de TGF-β (un factor de crecimiento sindicado como agente

profibrótico por varios autores (8)), en fibroblastos cardiacos neonatos (24).

Finalmente, en cuanto a la síntesis y secreción de proteínas de la MEC, no hay

6

consenso: mientras hay estudios que indican que Noradrenalina (NA) estimula la

expresión de colágeno tipo I y fibronectina en fibroblastos cardiacos de rata neonata

(25), otros indican que la estimulación con ISO en fibroblastos cardiaco de rata adulta

reduce la síntesis del colágeno (26). A pesar de este último antecedente, la información

global nos da a entender que la estimulación adrenérgica sostenida contribuye al

desarrollo de fibrosis en el corazón bajo condiciones patológicas.

1.3.2 Receptores adrenérgicos y sus vías transduccionales en

fibroblastos cardiacos

Como se mencionó anteriormente, se ha descrito que fibroblastos cardiacos presentan

sólo un subtipo de receptor adrenérgico: el receptor β2 (20, 21). Éste es un receptor de

siete dominios transmembrana acoplado dualmente a proteína Gs y proteína Gi (27).

Dado su acoplamiento a la proteína Gs, los efectos de la estimulación adrenérgica en

estos fibroblastos estarán mediados por la activación de la subunidad Gαs que activará a

adenilato ciclasa (AC), produciendo un aumento en los niveles de AMP cíclico (cAMP)

y, consecuentemente, la activación de la proteína kinasa A (PKA) que es capaz de

activar, mediante fosforilación, diversos intermediarios (28). Sin embargo, ésta no es la

única vía que se activa por estimulación adrenérgica en el fibroblasto, ya que se ha visto

que la subunidad Gβγ también tendría implicancias en los efectos de catecolaminas al

activar la Fosfatidilinositol-3 Kinasa (PI3-K) clase I que llevará a la activación de la vía

de la proteína kinasa B (PKB o Akt) y, consecuentemente, a la activación de mTOR y

p70S6K (29-31). Se han descrito a cAMP y la vía PKA como inhibidores de la

proliferación celular y de la síntesis de proteínas, en cambio la vía PKB/Akt como

activadora de estos fenómenos, por lo que los procesos proliferativos en fibroblastos

cardiacos frente a estimulación adrenérgica se podrían explicar por esta última (29).

Finalmente, la estimulación β-adrenérgica también sería capaz de activar AMPK

mediante el aumento de cAMP y consecuente activación de la vía cAMP-Adenosina

(30). Estas tres vías asociadas a la estimulación β-adrenérgica, PKA, PKB y AMPK,

7

además, convergen en diversos procesos celulares. Uno de ellos es la regulación de la

autofagia: mientras AMPK modula positivamente este proceso, PKB lo inhibe (31) y se

cree que PKA también lo inhibiría (32).

Estudios han demostrado que el estímulo de fibroblastos con TGF-β1, un factor de

crecimiento utilizado para diferenciar in vitro fibroblastos a miofibroblastos, disminuye

el número de receptores β-adrenérgicos, aún manteniendo su afinidad por ISO, en este

tipo celular (33, 34). Sin embargo, las concentraciones y el tiempo de estímulo que se

utilizaron en estos casos fue menor a la necesaria para lograr la diferenciación de

fibroblastos a miofibroblastos. Más allá de estos antecedentes, poco es lo que se conoce

acerca de las vías transduccionales activadas por las catecolaminas en miofibroblastos

cardiacos.

1.4 Autofagia

Autofagia se define como cualquier evento donde material citoplasmático se entregue al

lisosoma para su degradación (35). Se han identificado tres tipos de autofagia:

microautofagia, macroautofagia y autofagia mediada por chaperonas, que difieren entre

sí en su función fisiológica y la manera en que entregan material citoplasmático al

lisosoma (35). Macroautofagia es la forma más prevalente, por lo cual será la que

convoque este trabajo y nos referiremos a ella simplemente como autofagia.

Autofagia es un proceso dinámico, altamente conservado en eucariontes y la principal

vía catabólica mediante la cual las células son capaces de degradar y reciclar tanto

macromoléculas de vida media larga como organelos (35-37). Se caracteriza por el

secuestro de material citoplasmático en una vesícula de doble membrana llamada

autofagosoma. Esta estructura se fusiona con el lisosoma, entregándole su contenido

para que sea degradado y para que los componentes constitutivos puedan ser reciclados

(31).

8

1.4.1 Mecanismos moleculares implicados en la autofagia

El proceso de autofagia consta de varias etapas en las que se ha descrito la participación

de una maquinaria molecular compuesta por diversas proteínas que han sido

mayormente dilucidas en levadura y cuya presencia y función se conserva en

eucariontes. Luego de diversas denominaciones por distintos autores, se ha llegado a su

actual denominación: proteínas Atg (38).

La primera etapa de la autofagia es su inducción, cuya regulación está dada por la

proteína kinasa Target of Rapamicin (TOR, mTOR en mamíferos), sindicada como el

principal inhibidor de este proceso (39). Se han descrito dos formas como ésta puede

inhibir la autofagia: por un lado, mantiene fosforilada a Atg13, lo que disminuye la

afinidad de ésta por Atg1 y, por lo tanto, impide su unión, que es un paso trascendental

para comenzar la señalización del proceso autofágico (Figura 1A); por otro lado, es

capaz de controlar, por señalización río abajo, transcripción y traducción de efectores de

la autofagia (39).

El segundo paso de la autofagia es la nucleación de la vesícula, promovida por el

complejo de la PI3 Kinasa (PI3 Kinasa clase III en mamíferos) y Atg6 (Beclin-1 en

mamíferos) (Figura 1B). Se pensaba que el retículo endoplasmático rugoso y el aparato

de Golgi suplían de membrana durante esta etapa, sin embargo actualmente se indica

que una estructura poco conocida, llamada fagóforo, cumpliría este rol (31).

Un tercer paso es la elongación de la vesícula, donde participan dos sistemas de

conjugación “similares a ubiquitina” (31). El primero de ellos es el sistema de

conjugación de Atg12 a Atg5 mediante ayuda de Atg7 y Atg10. Este nuevo dímero es

capaz de unirse a Atg16 (Atg16 L1 en mamíferos) oligomerizado, formando un

complejo multimérico necesario para la elongación de membranas aisladas (31) (Figura

1C). El segundo sistema de conjugación es el de Atg8 (LC3 en mamíferos), donde esta

proteína es escindida y luego conjugada con Fosfatidiletanolamina (PE) por acción

secuencial de Atg4, Atg7 y Atg3, logrando el paso de LC3-I, que es una proteína

9

soluble, a LC3-II, que es insoluble y se asocia a la membrana del autofagosoma (31, 40)

(Figura 1C).

El cuarto paso es la fusión del autofagosoma al lisosoma, que ocurre por la fusión de la

membrana externa del primero con la membrana del segundo. El autofagosoma,

entonces, entrega su contenido delimitado por su membrana interna (cuerpo autofágico)

al lisosoma, formando así el autolisosoma (Figura 1D), una estructura de membrana

simple que requerirá un pH ácido para poder concretar la última etapa de degradación

del contenido autolisosomal y reciclaje de componentes de interés celular (Figura 1E)

(31, 39).

Figura 1. Esquema de autofagia

A. Regulación de la inducción de autofagia por TOR kinasa (37). B. Aislación de la membrana y participación del

Complejo PI3 Kinasa III y Beclin-1 en la nucleación de la vesícula. C. Elongación de la membrana y participación

de los sistemas de conjugación similares a ubiquitina en este proceso. D. Orientación de autogafosoma al lisosoma y

fusión. E. Degradación del contenido autolisosomal. (Adaptado de Maiuri, 2007 (41)).

10

1.4.2 Rol de la autofagia

Autofagia es un proceso que se encuentra activo en condiciones normales, pues es

necesario para mantener la homeostasis celular y para recambiar proteínas y organelos

(35, 40). Sin embargo, es capaz de aumentar en condiciones específicas: al aumentar el

requerimiento energético, en el remodelado estructural celular o al aumentar

componentes dañados en la célula (35). Por su función, se entiende que la autofagia

sirva como un mecanismo de adaptación de la célula a condiciones de estrés en pos de

su supervivencia, sin embargo, es capaz también de provocar un tipo de muerte celular

programada distinta a la apoptosis, llamada Muerte Celular Programada Tipo II (31). De

este modo, no hay consenso en cuanto al beneficio o perjuicio que la autofagia pueda

significar a la célula.

1.4.3 Autofagia en patologías cardiovasculares

Se ha observado que la autofagia se encuentra alterada en diversos estados patológicos

cardiovasculares: aumentada en cardiomiopatía e insuficiencia cardiaca (36) y

disminuida en hipertrofia cardiaca (40). Además, se ha encontrado aumentada en

condiciones de isquemia y reperfusión (36). Sin embargo, nuevamente nos encontramos

frente a la misma interrogante: ¿aumenta o disminuye para promover la sobrevida bajo

una condición patológica o para llevar a muerte celular?. Estudios de autofagia en

células cardiacas están orientados mayoritariamente al cardiomiocito, donde se ha

indicado que el proceso autofágico sirve como respuesta al estrés y esta respuesta

participa en la patogénesis de la enfermedad (42). Sin embargo, poco se sabe en cuanto

a autofagia en fibroblastos cardiacos.

Datos de nuestro laboratorio han determinado que la estimulación β-adrenérgica con

ISO en fibroblastos cardiacos de rata adulta induce autofagia (43). Este dato es

importante para comenzar a entender la función de autofagia en patologías

cardiovasculares, ya que asocia la estimulación adrenérgica, aumentada en diversas

11

patologías cardiacas, con el proceso autofágico en la población celular más numerosa

del corazón.

La interrogante que nace a partir de todos los antecedentes presentados es si existe

alguna relación entre la autofagia y la estimulación adrenérgica en miofibroblastos

cardiacos, fenotipo celular inducido por daño tisular al corazón y que presenta mayor

resistencia a condiciones desfavorables para la célula.

12

2. HIPÓTESIS

Los miofibroblastos cardiacos de rata adulta son más resistentes a la autofagia inducida

por estimulación β2-adrenérgica que los fibroblastos cardiacos.

13

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo general

Determinar in vitro si el proceso de autofagia promovido por estimulación

adrenérgica en los miofibroblastos cardiacos de rata adulta está disminuido respecto a

los fibroblastos cardiacos de rata adulta.

3.2 Objetivos específicos

3.2.1 Determinar presencia y caracterizar receptores β-adrenérgicos en fibroblastos y

miofibroblastos cardiacos de rata adulta.

3.2.2 Demostrar funcionalidad de receptores β-adrenérgicos en fibroblastos y

miofibroblastos cardiacos de rata adulta.

3.2.3 Determinar si estimulación con ISO induce autofagia en fibroblastos y

miofibroblastos cardiacos de rata adulta.

14

4. MATERIALES Y MÉTODOS

4.1 Reactivos

De Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EEUU): Tritón X-100, azul de tripán.

De Gibco BRL (Carlsbad, California EEUU): tripsina-EDTA, estándares para

masas moleculares de proteínas pre-teñidas, suero fetal de bovino (FBS).

De MERCK (Darmstadt, Alemania): compuestos inorgánicos y orgánicos, sales, ácidos

y solventes.

De PerKin Elmer Life Sciences, Inc. (Boston, MA, EEUU): reactivo

quimioluminiscente para Western Blot (Western Lightning), [3H]-DHA.

De Cell Signaling Technology (Beverly, MA): anticuerpo fosfo-p44/42 MAPK (p-

ERK1/2) y anticuerpo LC3B.

De Santa Cruz Biotechnology Inc. (Heidelberg, Germany): anticuerpo ERK 1.

De Falcon (USA): material de plástico estéril para la obtención y cultivo de fibroblastos

cardiacos.

De Chemicon (Tamecula, USA): TGF-β1. De Calbiochem (La jolla, CA, EEUU):

anticuerpos secundarios anti-IgG de conejo y ratón conjugado a peroxidasa.

4.2 Modelo animal

Ratas Sprague-Dawley macho adultas de 200 - 300 g de peso, provenientes del bioterio

de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Universidad de Chile, en

cumplimiento de todas las normas éticas referidas a la utilización de animales.

15

4.3 Aislamiento y cultivo de fibroblastos cardiacos de rata

adulta

Las ratas fueron anestesiadas con 300 μl de una solución de Ketamina:Xilacina

(2:1) para removerles el corazón desde la aorta. El corazón fue canulado por la aorta y

se perfundió una solución de CaCl2 2 mM para promover el latido y eliminar la sangre

desde el tejido. Luego se perfundió una solución de EGTA 2 mM para quelar el calcio

remanente. Finalmente se perfundió una solución de Colagenasa A 0,13% por 30 min.

Después de esto, se retiraron las aurículas y se homogenizó el ventrículo para llevar a

tres sucesivas digestiones con colagenasa A por 10 min cada una en baño

termorregulado a 37ºC con agitación. El producto de las digestiones fue centrifugado a

500 rpm por 2 min, se recuperó el sobrenadante y se centrifugó a 1000 rpm por 10 min

para obtener los fibroblastos en el pellet. Los fibroblastos fueron plaqueados con

DMEM-F12 + 10%FBS, luego de 2 h se lavaron 3 veces con PBS, se repuso DMEM-

F12 + 10% FBS y se dejaron proliferar hasta llegar a confluencia. Los cambios de

pasaje se realizaron mediante tripsinización (hasta pasaje 1 como máximo).

4.4 Diferenciación de fibroblastos a miofibroblastos

Se utilizaron fibroblastos cardiacos adultos en pasaje 1, los cuales se cultivaron por 84 h

en medio DMEM-F12 suplementado con TGF-β1 5 ng/mL. En estas condiciones cerca

del 100% de los fibroblastos se diferenciaron a miofibroblastos. Una vez cumplido el

tiempo se retiró el medio suplementado y los miofibroblastos se mantuvieron por 6 h

con DMEM-F12 suplementado con FBS 10%. Luego, los miofibroblastos obtenidos se

utilizaron para los ensayos posteriores.

16

4.5 Cuantificación de proteínas

Se cuantificó proteínas, tanto de extractos celulares como de membranas

celulares, por el método de Lowry: se preparó el reactivo A, que consiste en CTC

(sulfato de cobre 0,1%, ácido tartárico 0,2% y carbonato de sodio 10%), dodecilsulfato

de sodio 10%, hidróxido de sodio 0,8 N y agua nanopura en una proporción de 1:1:1:1.

400 μl del reactivo A se mezclaron con 395 μl de agua nanopura y con 5 μl de muestra,

se dejó reaccionar por 10 min y luego se le agregó 200 μl del reactivo B (Stock de Folin

& Ciocalteu en una dilución de 1:5 con agua nanopura) y se incubó a 40º C por 30 min.

Finalmente la lectura de absorbancia se midió en espectrofotómetro a una longitud de

onda de 750 nm.

Para la curva de calibración se siguió el mismo procedimiento, utilizando como

estándar de proteínas Albúmina de Suero Bovino y tampón de lisis RIPA como

disolvente.

4.6 Preparación de extractos celulares totales

Se prepararon extractos de proteínas totales para evaluar el procesamiento de LC3

(LC3-I/LC3-II) y la activación de ERK (fosfo-p44/42 MAPK o pERK 1/2) en

fibroblastos y miofibroblastos adultos. Se sembraron en placas de 60 mm a una

densidad de 1x104 cel/cm2 para fibroblastos y de 5x103 cel/cm2 para miofibroblastos. Al

finalizar los estímulos correspondientes, las células se lavaron tres veces con PBS frío y

luego se lisaron con 100 µL de tampón de lisis RIPA (Tris-HCl 10 mM pH 7,2; EDTA

5 mM; NaCl 150 mM; Tritón X-100 1% v/v; SDS 0.1% v/v; deoxicolato 1% v/v;

leupeptina 2 µg/mL; benzamidina 10mM; PMSF 1 mM y Na3VO4 100 µM). El

homogeneizado se centrifugó a 15.000 rpm durante 10 min a 4°C. El sobrenadante se

recuperó en un tubo nuevo, se determinó la concentración de proteínas por el método de

Lowry y se desnaturó en tampón SDS-PAGE 4X (glicerol 20 mL, 2-mercaptoetanol 10

17

mL, SDS 5 g, Tris base 1,51 g, Azul de bromofenol 0,01 g, Agua csp. 100 mL, pH 6.8),

para ser almacenado a –20°C.

4.7 Electroforesis en geles de poliacrilamida

La separación de las proteínas de acuerdo a su masa molecular se realizó mediante

electroforesis en geles de poliacrilamida según Laemmli, 1970. Para la detección se

cargaron 50 µg de extracto proteico para LC3 I/LC3 II y fosfo-p44/42 MAPK. Los geles

concentrador y separador fueron al 5 y 15%, respectivamente, para LC3I/LC3 II; y al 5

y 12%, respectivamente, para pERK 1/2. La electroforesis se realizó a un voltaje

constante de 90 Volt en tampón de electroforesis (Tris base 30,25 g, glicina 144 g, SDS

10 g, agua 1000 mL para tampón de electroforesis 10X).

4.8 Electrotransferencia de proteínas

Una vez realizada la electroforesis, las proteínas se electrotransfirieron a una membrana

de nitrocelulosa (BioRad) para pERK 1/2 y a una membrana de PVDF para LC3 I/LC3

II, a 350 mili-Amperes en tampón de transferencia durante 90 min para la primera y 45

min para la segunda.

4.9 Inmunowestern blot

Una vez transferidas, la membranas se bloquearon con tampón de bloqueo (TBS;

Tween-20 0,1% (TBS-T); leche sin grasa 5% p/v) durante 1 h a temperatura ambiente y

posteriormente se incubaron con los anticuerpos primarios correspondientes según

ensayo. LC3 B y pERK 1/2 se utilizaron en tampón de incubación (TBS-T 0,1%) a una

dilución 1:1000 toda la noche a 4°C con agitación suave. Posterior a la incubación, las

18

membranas se lavaron 3 veces por 10 min en TBS–T al 0,1%, e incubadas durante 2 h a

temperatura ambiente con el segundo anticuerpo anti-IgG de conejo o ratón conjugado

con peroxidasa, a un título de 1:5000 en tampón de bloqueo TBS-T al 0,1%.

Para detectar las proteínas, las membranas, previamente lavadas, se incubaron durante 1

min con el sustrato quimioluminiscente “Western Lightning” y se expusieron a la

película de fotografía Kodak-Biomax. Las películas se digitalizaron y las imágenes

fueron sometidas a densitometría con ayuda de los programas computacionales Corel ®

Paint Shop Pro Photo X2 y USI. Después de realizar los ensayos de inmunowestern

blot, las membranas se incubaron por 45 min en una solución de rojo Ponceau (rojo

Ponceau 2%, TCA 30%, ácido sulfosalicílico 30%) para desprender los anticuerpos,

posteriormente se lavaron en TBS–T al 0,1% por tres veces. Luego de este tratamiento,

las membranas pudieron ser reutilizadas para ensayos de Western blot con tubulina para

LC3I/LC3 II y con ERK-1 para pERK 1/2 como controles de carga.

4.10 Inmunocitoquímica

Se sembraron las células en placas de 35 mm con cubreobjeto a una densidad de

1x104 cel/cm2 para fibroblastos y de 5x103 cel /cm2 para miofibroblastos. Al finalizar

los estímulos correspondientes, las células fueron lavadas dos veces con PBS frío, luego

fueron fijadas al cubreobjeto con Formaldehído 4% por 15 min en frío. Se lavaron 2

veces con PBS frío y fueron permeabilizadas con Tritón X-100 en PBS al 0,2% por 5

min en frío. Se volvieron a lavar con PBS frío y fueron bloqueadas con una solución de

Albúmina de Suero Bovino (BSA) en PBS al 3% por 1 h a temperatura ambiente. Luego

fueron lavadas y se les expuso al anticuerpo LC3 B en una dilución 1:100 en BSA al 3%

durante toda la noche a 4º C. Luego se lavaron tres veces con PBS frío y se les expuso

al anticuerpo secundario Anti-IgG de conejo conjugado con el fluoróforo FITC, al

marcador de núcleos Hoescht y al marcador de esqueleto de actina

Rhodamina/Phalloidin en una dilución de 1:800, 1:1000 y 1:600 en BSA 3%,

19

respectivamente, durante 2 h a temperatura ambiente y oscuridad. Finalmente fueron

lavadas tres veces con PBS frío y los cubreobjetos que contenían las células fueron

montados a un portaobjeto con el reactivo Dako, que permitió fijar el vidrio y mantener

las células en perfecto estado. Se almacenaron en oscuridad y se observaron y

fotografiaron por microscopía confocal.

4.11 Obtención de membranas celulares

Las células se sembraron en placas de 100 mm a una densidad de 1x104 cel/cm2

para fibroblastos y de 5x103 cel /cm2 para miofibroblastos. Al finalizar los estímulos

correspondientes, fueron lavadas con PBS frío 3 veces y se lisaron con tampón de lisis

para binding. (Tris-HCl 1mM pH 7,5 y EGTA 2 mM). Obtenido el homogenizado, se

centrifugó a 15.000 rpm por 30 min a 4º C, se descartó el sobrenadante y el pellet se

resuspendió en tampón de resuspensión (glucosa 0,25 M, EDTA 1 mM, Tris-HCl 5mM)

y se almacenó a -80º C. Para la cuantificación de proteínas mediante el método de

Lowry y posterior ensayo de binding, el pellet fue descongelado, resuspendido en

tampón de binding (Tris-HCl 50 mM pH 7,4, NaCl 120 mM, KCl 4 mM, CaCl2 1mM,

bacitracina 0,1 mM y BSA 0,25%) y sonicado.

4.12 Ensayo de desplazamiento y Unión de competencia

Para el ensayo de desplazamiento se creó una batería experimental donde el

control llevó 20 μl de Dihidroalprenolol tritiado ([3H]-DHA) 150 nM y 200 μg de

proteína total del homogenizado de membranas. Además, a los otros tubos se les agregó

20 μl del desplazante correspondiente (propanolol 10 mM, atenolol 10 mM o ICI-

118551 10 mM). Todos los tubos se llevaron a un volumen final de 200 μl con tampón

Tris-Mg y se incubaron en baño termorregulado a 37º C con agitación por 30 min.

Luego de esto, la reacción se detuvo agregando 2 mL de tampón Tris-Mg a cada tubo y

20

el contenido de cada uno se depositó en su respectivo pocillo del sistema de filtración al

vacío donde previamente fueron colocados filtros Whitman GF/C. Cada uno de los

tubos se lavó 2 veces con 2 mL de tampón Tris HCl, contenido que también se vertió en

el correspondiente papel filtro de sistema. Los papeles filtros se recuperaron en viales de

centelleo, se agregó a cada uno 0,5 ml de agua destilada y 4 ml de mezcla de centelleo y

se agitaron vigorosamente en vórtex. Para obtener las cuentas totales (Ct) se agregó a un

vial de centelleo 20 μl de [3H]-DHA 150 nM, 0,5 ml de agua destilada y 4 ml de mezcla

de centelleo. Para el blanco se agregó a un vial de centelleo 0,5 ml de agua y 4 ml de

mezcla de centelleo. La radioactividad de cada tubo se midió en cuentas por minuto

(cpm) en el contador de centelleo.

Para el ensayo de unión de competencia se procedió de igual manera, con la

diferencia que se utilizó un único desplazante (propanolol) a distintas concentraciones

(concentraciones finales de 1nM, 10 nM, 100 nM, 1 μM, 10 μM, 100 μM y 1mM). Para

determinar la cantidad de receptores (Bmax) y la afinidad del receptor (Kd) por

propanolol se utilizó el método de Scatchard.

4.13 Determinación de AMP cíclico

Se determinó AMP cíclico (cAMP) mediante un enzimoinmuno análisis (EIA)

de competencia con Cyclic AMP EIA Kit de Cayman Chemical Company.

4.14 Análisis estadístico

Los resultados mostrados corresponden al promedio ± SD de, al menos, tres

ensayos independientes. Los datos se analizaron por ANOVA y la prueba Tuckey para

determinar la significancia estadística de los resultados. Para comparar dos grupos se

utilizó la prueba t Student.

21

5. RESULTADOS

5.1 Caracterización de receptores adrenérgicos en fibroblastos

y miofibroblastos cardiacos de rata adulta

Teniendo en antecedente que los fibroblastos cardiacos presentan receptores β2-

adrenérgicos, se procedió a comprobar la existencia de este subtipo de receptores β-

adrenérgicos en este fenotipo celular y en miofibroblastos cardiacos de rata adulta. Para

esto, se realizó un ensayo de desplazamiento utilizando para ello [3H]-DHA como

ligando caliente y como ligando frío propanolol 1 mM (antagonista β-inespecífico),

atenolol 1 mM (antagonista β1-específico) o ICI-118551 1 mM (antagonista β2-

específico). Los resultados muestran que tanto en fibroblastos como en miofibroblastos

se deplaza casi completamente [3H]-DHA en presencia de propanolol y en presencia de

ICI-118551, en cambio en presencia de atenolol no se observó desplazamiento del

ligando marcado. (Figura 2).

Figura 2. Desplazamiento de [3H]-DHA

Extractos de membranas celulares fueron expuestos a [3H]-DHA en una concentración de 15 nM. El control

corresponde a membranas expuestas sólo al ligando marcado y sus valores corresponden al 100% de la unión

específica de [3H]-DHA. Los desplazantes Propanolol (Propa), ICI-118551 (ICI) y Atenolol (Ate) se utilizaron en una

concentración de 1 mM. A. Desplazamiento de [3H]-DHA en membranas celulares de fibroblastos cardiacos de rata

22

adulta. B. Desplazamiento de [3H]-DHA en membranas celulares de miofibroblastos cardiacos de rata adulta. Los

resultados corresponden al promedio de tres experimentos independientes ± SD. (* p < 0,05 , ** p< 0,01)

5.2 Determinación de Bmax y Kd de receptores β-adrenérgicos

en fibroblastos y miofibroblastos cardiacos de rata adulta

Para determinar los valores de Bmax, correspondientes a la cantidad de

receptores, y de Kd, correspondientes a la afinidad del receptor por el desplazante

utilizado (en este caso, Propanolol), se realizó un ensayo de unión de [3H]-DHA (Figura

3). Para calcular estos valores, se utilizó la regresión de Scatchard. Para fibroblastos se

obtuvo un valor de Bmax de 35,9 ± 4,0 fmol/mg de proteína y un valor de Kd de 23,1 ±

9,0 nM. Para miofibroblastos se obtuvo un valor de Bmax de 83,5 ± 4,3 fmol/mg de

proteína y un valor de Kd de 4,8 ± 2,7 nM (Tabla 1). Se determinó que los valores de Kd

y Bmax fueron significativamente diferentes entre los dos fenotipos celulares.

Figura 3. Ensayo de unión de [3H]-DHA

23

Extractos de membranas celulares fueron expuestas a [3H]-DHA en una concentración de 15 nM y como desplazante

fue utilizado Propanolol en concentraciones de 1nM, 10 nM, 100 nM, 1 μM, 10 μM, 100 μM y 1mM. A. Unión de

[3H]-DHA frente a concentraciones crecientes de propanolol en membranas celulares de fibroblastos cardiacos de rata

adulta. B. Unión de [3H]-DHA frente a concentraciones crecientes de propanolol en membranas celulares de

miofibroblastos cardiacos de rata adulta. Datos del promedio ± SD de tres experimentos independientes.

Tabla 1. Kd y Bmax en fibroblastos y miofibroblastos cardiacos de rata adulta

Fibroblastos Miofibroblastos.

Kd (nM) 23,1 ± 9,0 4,8 ± 2,7 *

Bmax (fmol / mg proteína) 35,9 ± 4,0 83,5 ± 4,3 **

Los datos obtenidos del ensayo de unión de [3H]-DHA se analizaron por Scatchard y se obtuvo los valores de la

constante de disociación (Kd) y la cantidad de receptores (Bmax) para los receptores β2-adrenérgicos en fibroblastos y

miofibroblastos cardiacos de rata adulta. Los resultados corresponden al promedio de tres experimentos

independientes ± SD. (* p < 0,05 , ** p< 0,01)

5.3 Determinación de funcionalidad de receptor β2-

adrenérgico en fibroblastos y miofibroblastos de rata adulta

5.3.1 Activación de ERK 1/2 por ISO

Luego de determinar la presencia del receptores β2-adrenérgicos en fibroblastos

y miofibroblastos cardiacos de rata adulta, evaluamos la funcionalidad de éstos. Para

24

ello, primero evaluamos la activación de las proteínas Kinasas Reguladas por Señal

Extracelular 1 y 2 (ERK 1/2 o p44/42 MAPK), ya que es un reflejo de la activación de

receptores acoplado a proteína G por actividad de la subunidad Gβγ. Se determinó la

activación temprana (considerada menor a 20 min) de esta vía por el estímulo β2-

adrenérgico. De este modo, se evaluó la activación de ERK 1/2 a 5 y 15 min de estímulo

con ISO.

Se obtuvo que en fibroblastos hubo fosforilación significativa sólo de ERK 1 a

los 15 minutos de estímulo con ISO 10 μM, en cambio en miofibroblastos se fosforiló

significativamente ERK 1 y ERK 2 a igual tiempo de estímulo (Figura 4).

25

Figura 4. Activación de ERK 1/2 por estimulación β2-adrenérgica

A.

B.

Las células fueron mantenidas en un medio DMEM F-12 sumplementado con 10% de FBS por 6 h y luego fueron

estimuladas con ISO 10 μM por 5 y 15 min. Los resultados fueron relativizados a su control. A. Fosforilación de ERK

1 y ERK 2 en fibroblastos cardiacos de rata adulta. B. Fosforilación de ERK 1 y ERK 2 en miofibroblastos cardiacos

de rata adulta. Los resultados corresponden al promedio de cuatro experimentos independientes ± SD. (* p < 0,05).

26

5.3.2 Producción de cAMP por estímulo con ISO

Para determinar funcionalidad de los receptores β2-adrenérgicos también se

midió la producción de cAMP frente a un estímulo con ISO, ya que cAMP es un

segundo mensajero que refleja la activación de receptores acoplados a proteína Gs por

actividad de la subunidad Gα. Para obtener concordancia con los datos obtenidos en la

medición de ERK 1/2, medimos la cantidad de cAMP también en una fase temprana.

Las células fueron estimuladas con ISO 10 μM por 10 min. Se observó que en ambos

tipos celulares hubo producción significativa de cAMP comparado con sus respectivos

controles (Figura 5).

Figura 5. Producción de cAMP por estimulación β2-adrenérgica

Las células fueron mantenidas en un medio DMEM F-12 suplementado con 10% de FBS por 6 h y luego fueron

estimuladas con ISO (10 μM) por 10 min. A. Producción de cAMP en fibroblastos cardiacos de rata adulta. B.

Producción de cAMP en miofibroblastos cardiacos de rata adulta. Los resultados corresponden al promedio de tres

experimentos independientes ± SD. ( * p < 0,05 )

27

5.4 Determinación de autofagia en fibroblastos y

miofibroblastos cardiacos de rata adulta frente a

concentraciones decrecientes de suero

Como se sabe que el proceso autofágico es promovido, entre otras condiciones,

por estrés nutricional, se observó, por Inmunowestern blot, el procesamiento de la

proteína LC3 I a LC3 II en fibroblastos y miofibroblastos cardiacos expuestos a un

medio suplementado con concentraciones decrecientes de suero por 24 horas. Se

observó que fibroblastos comenzaron a procesar la proteína LC3 I a LC3 II de manera

significativa, comparada con su control, ya en un medio DMEM F-12 suplementado con

1% de FBS (Figura 6A). De manera diferente, miofibroblastos no presentan un

procesamiento significativo de la proteína LC3 I a LC3 II, respecto a su control, ni

siquiera en la privación total de suero (Figura 6B). Es destacable el hecho que,

aparentemente, en miofibroblastos la condición basal presenta mayor procesamiento de

la proteína LC3 I a LC3 II que fibroblastos (Figura 6, Western Blot).

28

Figura 6. Procesamiento de LC3 I a LC3 II frente a concentraciones decrecientes de

suero

A B

Las células fueron mantenidas en un medio DMEM F-12 suplementado con 10% de FBS, 5 % de FBS, 2,5% de FBS,

1% de FBS y DMEM F-12 no suplementado por 24 h. Las células mantenidas en medio DMEM F-12 suplementado

con 10% de FBS fueron consideradas como el control y los valores del resto de las condiciones fueron relativizados a

los de éstas. A. Procesamiento de LC3 I a LC3 II en fibroblastos cardiacos de rata adulta expuestos a concentraciones

decrecientes de suero. B. Procesamiento de LC3 I a LC3 II en miofibroblastos cardiacos de rata adulta expuestos a

concentraciones decrecientes de suero. Los resultados corresponden al promedio de tres experimentos

independientes ± SD. (* p < 0,05)

29

5.5 Comparación de autofagia entre fibroblastos y

miofibroblastos cardiacos de rata adulta en condiciones

basales

Dado que en el experimento anterior, donde se determinó autofagia en estos dos

fenotipos celulares, se observó un nivel mayor procesamiento de la proteína LC3 I a

LC3 II en miofibroblastos comparado con fibroblastos en estado basal, se procedió a

determinar si esta diferencia es efectivamente significativa. Para esto, se midió el

procesamiento de LC3 I a LC3 II mediante Western Blot en fibroblastos y

miofibroblastos cardiacos de rata adulta mantenidos en un medio suplementado con

10% de FBS (condición basal). Se obtuvo que, efectivamente, miofibroblastos cardiacos

de rata adulta procesan LC3 I a LC3 II en una condición basal de una manera

significativamente mayor que fibroblastos cardiacos de rata adulta

Figura 7. Procesamiento de LC3 I a LC3 II en condiciones basales

Fibroblastos y miofibroblastos

cardiacos de rata adulta fueron

mantenidos en un medio DMEM-

F12 suplementado con 10% de

FBS, lo que se ha definido como

condición basal. Los resultados

corresponden al promedio de

tres experimentos independientes

± SD. (* p < 0,05).

30

5.6 Determinación de autofagia en fibroblastos y

miofibroblastos cardiacos de rata adulta frente a estimulación

β2-adrenérgica

5.6.1 Procesamiento de LC3 I a LC3 II inducido por ISO

Se determinó el procesamiento de LC3 I a LC3 II por Inmunowestern blot en

fibroblastos y miofibroblastos cardiacos de rata adulta expuestos a ISO 10 μM para

observar si la activación β-adrenérgica es capaz de promover autofagia, y se utilizó

rapamicina 100 nM, inhibidor de mTOR y estímulo clásico de autofagia, como control

positivo. Los resultados muestran que en fibroblastos hay un significativo

procesamiento de la proteína LC3 I a LC3 II bajo estímulo con ISO y rapamicina

respecto a su control (Figura 8A). En miofibroblastos no hay una significancia de dicho

proceso bajo ninguno de los estímulos respecto a su control (Figura 8B). Es destacable

que en miofibroblastos, como ya se ha comprobado, la condición basal tiene un

procesamiento mayor de la proteína LC3 I a LC3 II respecto a la condición basal de

fibroblastos (Figura 8A y 8B, Western blot).

31

Figura 8. Procesamiento de LC3 I a LC3 II inducido por estimuIación β2-adrenérgica

A Control Rap ISO B Control Rap ISO

Las células fueron mantenidas en un medio DMEM F-12 suplementado con 10% de FBS por 6 h y luego fueron

estimuladas con Rapamicina (Rap) 100 nM como control positivo y con Isoproterenol (ISO) 10 μM por 24 h. Los

valores obtenidos fueron relativizados a su respectivo control. A. Procesamiento de LC3 I a LC3 II inducido por ISO

en fibroblastos. B. Procesamiento de LC3 I a LC3 II inducido por ISO en miofibroblastos. Los resultados

corresponden al promedio de tres experimentos independientes ± SD. (* p < 0,05, ** p< 0,01)

32

5.6.2 Localización de LC3 endógeno en vesículas autofágicas inducida

por ISO

Por otro lado, se determinó autofagia por Inmunocitoquímica. Mediante esta

técnica observamos la organización de LC3 endógeno bajo distintos estímulos. Cuando

el proceso autofágico es inducido, LC3 se localiza en las vesículas autofágicas y, por lo

tanto, se observa un patrón punteado con mayor intensidad de marca y claramente

definido que puede distinguirse del patrón observado en una célula en la que no se ha

inducido autofagia.

Fibroblastos y miofibroblastos cardiacos de rata adulta fueron expuestos a

privación de aminoácidos, estímulo clásico de la autofagia utilizado como control

positivo, y a ISO 10 μM como estímulo de interés para este trabajo.

En fibroblastos se observa que el control no presenta marca verde

correpondiente a LC3 endógeno en la forma e intensidad que ocurre frente al estímulo

con ISO o con privación de aminoácidos (Figura 9A). Estas dos últimas condiciones

muestran una marca verde claramente definida en un patrón punteado que indica la

localización de LC3 en las vesículas autofágicas, siendo mayor la marca en privación de

aminoácidos que en estímulo con ISO. Por otro lado, vemos que en miofibroblastos

control aparece un patrón punteado de la marca verde con mayor intensidad que en el

control de los fibroblastos, sin embargo, entre miofibroblastos control, estimulados con

ISO o en privación de aminoácidos, no hubo diferencias que denotaran mayor o menor

autofagia entre ellos (Figura 9B).

Finalmente, es importante destacar que todas las imágenes presentadas se

encuentran en la misma escala de aumento. En un campo visual se pueden observar más

de un fibroblasto, en cambio, en miofibroblastos, células diferenciadas de mayor

tamaño, no alcanza un campo para cubrir la visión total de al menos una célula. Esto

demuestra las diferencias morfológicas ampliamente descritas entre fibroblastos y

miofibroblastos.

33

Figura 9. Organización de LC3 endógeno bajo estimulación β2-adrenérgica

A

34

B

Las células fueron mantenidas en un medio DMEM F-12 suplementado con FBS 10% por 6 h y luego expuestas a

ISO 10 μM y a EBSS [medio sin aminoácidos (-AA)] por 24 h. LC3 endógeno se muestra en verde, citoesqueleto de

actina se muestra en rojo y núcleo celular se muestra en azul. Un patrón punteado claramente definido de la marca

verde muestra la organización de LC3 endógeno en vesículas autofágicas, denotando inducción de autofagia. A.

Organización de LC3 bajo estimulación con ISO en fibroblastos. B. Organización de LC3 bajo estimulación con ISO

en miofibroblastos. Las figuras corresponden a imágenes representativas de tres experimentos independientes.

35

6. DISCUSIÓN

6.1 Caracterización de receptores adrenérgicos en fibroblastos

y miofibroblastos cardiacos de rata adulta

El primer objetivo de la presente memoria fue caracterizar los receptores

adrenérgicos en miofibroblastos cardiacos de rata adulta teniendo en cuenta que en

fibroblastos cardiacos, células de las cuales se originan los miofibroblastos cardiacos,

sólo existen receptores del tipo β2-adrenérgicos. De este modo, realizamos un ensayo de

desplazamiento utilizando sólo ligandos del receptor β-adrenérgico: β-adrenérgico

inespecífico (propanolol), β1-específico (atenolol) y β2-específico (ICI-118551). Los

resultados mostraron, en ambos fenotipos, un desplazamiento de la marca radiactiva

sólo frente a propanolol e ICI-118551, lo que confirma que los fibroblastos y

miofibroblastos cardiacos de rata adulta presentan receptores adrenérgicos sólo del

subtipo β2. Esto ya había sido descrito por otros autores en fibroblastos cardiacos

humanos y de rata adulta (20, 21), sin embargo, en los miofibroblastos no ha sido

descrito previamente en la literatura la presencia única de este subtipo de receptores

adrenérgicos.

6.2 Determinación de Bmax y Kd de receptores β2-adrenérgicos

en fibroblastos y miofibroblastos cardiacos de rata adulta

En cuanto al número de receptores β2-adrenérgicos (representado por el valor

Bmax) y la afinidad de éstos por el desplazante utilizado (representado por el valor Kd),

se observó significativas diferencias entre fibroblastos y miofibroblastos cardiacos de

rata adulta. Los miofibroblastos presentaron mayor número de receptores β2-

adrenérgicos y mayor afinidad de estos receptores por propanolol que los fibroblastos.

36

En la literatura se ha encontrado que el TGF-β1, factor de crecimiento utilizado

para diferenciar fibroblastos a miofibroblastos in vitro, modula el número de receptores

β-adrenérgicos en distintos tipos celulares: fibroblastos cardiacos de rata adulta, en

fibroblastos pulmonares de embrión humano (células HEL 299) y en células del

músculo liso (33, 34, 44). En todos estos estudios se observó que TGF- β1 tiene la

capacidad de disminuir el número de receptores β-adrenérgicos aún manteniendo la

afinidad de éstos por el ligando utilizado en cada caso, lo que se contrapone a lo

determinado en el actual estudio. Sin embargo, existen diferencias experimentales que

darían cuenta de los disímiles resultados: las concentraciones y el tiempo de estímulo

con TGF-β1 en esos casos son considerablemente menores a las condiciones utilizadas

para lograr la diferenciación del fibroblasto a miofibroblasto (1ng/ml, 2 ng/ml ó 1,5 pM

de TGF-β1 por 24 h como tiempo máximo contra 5 ng/ml de TGF-β1 por 84 h utilizados

para la diferenciación in vitro). Hasta la fecha no hay antecedentes del efecto en función

del tiempo de TGF-β1 en fibroblastos cardiacos. De acuerdo a esos resultados, se haría

necesario determinar el efecto de TGF-β1 dependiente de la dosis y dependiente del

tiempo sobre el número de receptores β-adrenérgicos. De todas maneras, hay que

atender al hecho que nuestro objetivo es el miofibroblasto cardiaco y para ello el efecto

de TGF-β1 se debe evaluar al tiempo y concentración en los cuales la diferenciación

total de ellos ha ocurrido, esto es 84 h y 5 ng/ml.

Por otro lado, se ha visto que en el corazón de ratas transgénicas que

sobreexpresan TGF-β1 el número de receptores β-adrenérgicos aumenta, aunque se

mantiene la afinidad de éstos por el ligando utilizado (45). A pesar que aquel estudio de

unión de ligandos se realizó en membranas de un homogenizado de corazón y no sobre

membranas de fibroblastos purificados, por lo que se observa también el efecto sobre

cardiomiocitos, es destacable el hecho que, al sobreexpresar TGF-β1, el corazón esté

siendo expuesto a este estímulo de manera crónica y, por lo tanto, podría dar luz de lo

que ocurre con el número de receptores β-adrenérgicos frente a un estímulo sostenido en

el tiempo con este factor de crecimiento.

37

6.3 Determinación de funcionalidad de receptor β2-

adrenérgico

Para determinar la funcionalidad del receptor β2-adrenérgico, un receptor

asociado a proteína Gs, se evaluaron elementos que reflejan la actividad de la subunidad

Gαs y de la subunidad Gβγ: producción de cAMP y activación de ERK 1/2,

respectivamente. En fibroblastos y miofibroblastos cardiacos de rata adulta se observó

un aumento significativo de la producción de cAMP frente al estímulo β2-adrenérgico

(ISO) respecto a sus controles. De la misma manera, se observó que en ambos tipos

celulares se activó ERK a los 15 min de estímulo con ISO; la diferencia radicó en que

fibroblastos sólo presentó activación de ERK 1 y miofibroblastos presentó activación de

ERK 1/2. Dado los resultados, podemos decir que los receptores β2-adrenérgicos son

funcionales en fibroblastos y miofibroblastos cardiacos de rata adulta.

Es destacable el hecho que, a pesar que miofibroblastos presentaron mayor

número de receptores y mayor afinidad de éstos por su ligando, esto no se vio reflejado

en la producción de cAMP, que es una de las formas más directas de evaluar

funcionalidad de receptores acoplados a proteína Gs. De partida, al comparar los niveles

de cAMP en condiciones basales entre fibroblastos y miofibroblastos, se obtuvo que la

producción de cAMP fue significativamente menor en miofibroblastos respecto a

fibroblastos (dato no mostrado). Esto nos da a entender que TGF-β1, además de modular

el número de receptores y la Kd, podría modular las vías transduccionales implicadas en

la síntesis y degradación de cAMP.

En la literatura existe abundante información acerca de los efectos antagónicos

de cAMP y TGF-β, donde el primero inhibiría efectos del segundo en diversos tipos

celulares (46-48), incluyendo fibroblastos cardiacos de rata adulta (26, 49). Actualmente

existe poca información acerca de la situación inversa, donde TGF-β influya sobre los

niveles de cAMP, que es lo que podría explicar el fenómeno observado en este estudio.

En cardiomiocitos, se ha observado que TGF-β1 disminuye la acumulación de cAMP

38

estimulada por el factor de crecimiento epidermal (EGF) (50), y en células del músculo

liso de arteria pulmonar se observó el mismo efecto de TGF-β1 sobre el aumento de

cAMP inducido por activación del receptor de prostaciclina (51). Lo importante de estos

estudios es que en ambos se determinó que, al menos en parte, la disminución de la

producción de cAMP estaba asociada a una disfunción de la adenilato ciclasa (AC). Más

aún, en células del músculo liso de arteria pulmonar se determinó que una disminución

de la expresión del mRNA de las isoformas 1,2 y 4 de AC y un aumento en la proteína

Gi estaría asociada, entre otros efectos, a la disminución de producción de cAMP por

TGF-β1 (51). Consistente con todos estos datos, se ha documentado en células HEL 299

que TGF-β1 es capaz de disminuir el número de receptores β2-adrenérgicos y por esto se

ve disminuido la producción de cAMP frente a un estímulo con un agonista β2, sin

embargo, en el mismo trabajo se vio que luego del pretratamiento con TGF-β1, el

estímulo con forskolina (FSK), un activador directo de AC, no es capaz de aumentar la

acumulación de cAMP (34).

Por lo demás, también se debe considerar la participación de fosfodiesterasa

(PDE), una enzima que cumple la función de hidrolizar cAMP y/o cGMP, en el control

de los niveles de cAMP. Se ha reportado que TGF- β1, al inducir la transición epitelial-

mesenquimal (EMT) en una línea de células humanas de epitelio alveolar tipo II, es

capaz de regular la expresión y actividad de distintas isoformas de PDE (52). En este

trabajo se observó que TGF- β1 fue capaz de aumentar la expresión de PDE4A y

PDE4D a nivel proteico y de mRNA, así como también aumentó la actividad enzimática

específica sobre cAMP dos veces por sobre el control. Además, ellos demostraron que

la isoforma PDE4 fue el principal contribuyente a la actividad específica de degradación

de cAMP, lo que corroboró la relación entre un aumento específico de isoformas PDE4

y una disminución específica del cAMP frente al pretratamiento con TGF- β1.

De este modo, se observa que el efecto de TGF-β1 sobre la acumulación de

cAMP podría no estar relacionado exclusivamente a su efecto sobre la cantidad de

39

receptores que se presentan en la célula, sino también a un efecto directo de éste sobre

AC y/o PDE.

Finalmente, existen tres puntos a considerar en el modelo experimental utilizado

en nuestro trabajo: primero, la diferenciación de fibroblastos a miofibroblastos implica

la exposición prolongada a TGF-β1 por 84 h; segundo, el estímulo adrenérgico ISO se

hace en medio suplementado con suero FBS 10%, el cual en sí lleva TGF-β1; tercero, se

ha demostrado que los miofibroblastos secretan TGF-β1 y que expresan un mayor

número de receptores para este factor de crecimiento. Considerando estas condiciones,

es posible esperar un efecto mantenido de TGF-β1 sobre la actividad de la AC y la PDE.

Por lo tanto, aunque aquí no se evaluó la actividad de la AC y la PDE, el escaso

aumento de cAMP estimulado por ISO podría, en nuestro caso, ser explicado por esos

hallazgos.

En cuanto a la activación de ERK 1/2, es destacable notar que es similar en

ambos tipos celulares, aunque en fibroblastos no hubo una activación de ERK 2 a los 15

min de estímulo con ISO. Fuera de este resultado, podemos ver que no hay diferencias

significativas entre el nivel de activación de ERK 1 entre fibroblastos y miofibroblastos

(dato no mostrado), lo que nuevamente aparece como una contradicción frente a la

diferencia del número de receptores β2-adrenérgicos y su afinidad, entre ambos

fenotipos celulares. Se ha reportado en la literatura que agentes que aumentan los

niveles de cAMP son capaces de inhibir la activación de ERK promovida por distintos

estímulos en distintos modelos celulares (26, 53-55). Orientando hacia nuestro modelo,

se ha descrito en fibroblastos cardiacos de rata adulta que ISO, un agente que en sí

mismo es capaz de activar la vía de las ERKs, bloquea la activación de ésta cuando es

promovida por TGF-β en etapas tempranas (20 min de estímulo). Con estos

antecedentes, se podría inferir que, en el actual estudio, el estímulo con ISO causa un

efecto dual en que, a tiempos menores, cAMP esté inhibiendo la expresión de ERK y

luego este efecto se pueda revertir. De este modo, tendríamos que los miofibroblastos,

que expresan menor cantidad de cAMP basal y frente a un estímulo β2-adrenérgico, son

40

capaces de activar ERK 1/2 a los 15 min de estímulo con ISO, en cambio los

fibroblastos, que expresan mayor cantidad de cAMP basal y bajo un estímulo β2-

adrenérgico, son capaces de activar sólo ERK 1 a los 15 min de estímulo con ISO. De

todas formas, es importante determinar qué ocurre en cuanto a la activación de ERK 1/2

en fibroblastos a mayor tiempo de estímulo con ISO.

6.4 Autofagia en fibroblastos y miofibroblastos cardiacos de

rata adulta

Para determinar autofagia en estos fenotipos celulares, se evaluó mediante la

técnica de Western blot el procesamiento de la proteína LC3 I a LC3 II. Dado que

autofagia se ha asociado ampliamente a condiciones de privación de nutrientes (31, 39),

en un primer lugar, se observó este proceso en fibroblastos y miofibroblastos frente a

concentraciones decrecientes de suero por 24 h. Se obtuvo que los fibroblastos

comenzaron a sufrir autofagia significativamente por sobre su control en un medio

suplementado con 1% de FBS y, como se esperaba, también en un medio libre de suero.

Por otro lado, miofibroblastos, aunque mostraron una tendencia similar a la de los

fibroblastos, no fueron capaces de sufrir el mismo efecto bajo ninguna de las

condiciones.

En cuanto al procesamiento de LC3 I a LC3 II, al estimular con rapamicina

(inhibidor de mTOR, por lo tanto, inductor de la autofagia) y con ISO como estímulo de

receptores β2-adrenérgicos, se observó que en fibroblastos cardiacos de rata adulta hubo

una clara inducción de la autofagia. En este caso, se obtuvo que la estimulación β2-

adrenérgica logró inducir autofagia en menor grado que rapamicina. Por

inmunocitoquímica se confirmó lo mismo que por Western blot: LC3 endógeno

prácticamente no localiza en vesículas autofágicas en fibroblastos controles, pero sí lo

hace bajo estímulo con ISO y, en mayor medida, en un medio privado de aminoácidos.

41

En cuanto a miofibroblastos, nuevamente se obtuvo, por ambas técnicas, un nulo

incremento de la respuesta autofágica frente a los estímulos indicados.

Cabe destacar que los miofibroblastos no fueron capaces de sufrir mayor

autofagia que su propio control bajo ninguna de las condiciones a las cuales fueron

expuestos, sin embargo, los niveles basales de procesamiento de la proteína LC3 I a

LC3 II detectados por Western blot aparentaron ser considerablemente mayores que en

fibroblastos. Del mismo modo, se observó por inmunocitoquímica que en

miofibroblastos el nivel basal de localización de LC3 endógeno en vesículas autofágicas

fue mayor al del nivel basal en fibroblastos, sin embargo, no hubo diferencias en el

patrón autofágico entre miofibroblastos controles y los sujetos a estímulos para inducir

autofagia. Esta virtual mayor autofagia en los miofibroblastos cardiacos respecto a los

fibroblastos cardiacos fue confirmada comparando el procesamiento de LC3 I a LC3 II

en ambos fenotipos en una condición basal.

Todos estos antecedentes muestran la dualidad del comportamiento de

miofibroblastos frente al proceso de autofagia: por un lado, en una condición basal

sufren de dicho proceso, sin embargo, frente a estímulos clásicos y frente a nuestro

estímulo de interés, no existe un aumento por sobre su control.

La explicación de este fenómeno se puede entender a través de los efectos que

produce TGF-β1 y que son adicionales a aquél que promueve la diferenciación de

fibroblastos a miofibroblastos. Se ha determinado que TGF-β1 induce autofagia en

células epiteliales mamarias, en células epiteliales renales y en células de carcinoma

hepatocelular y mamario (56-58). Se dilucidó, en células de carcinoma hepatocelular,

que la vía se señalización por la cual TGF-β1 induce la autofagia involucraría a las vías

de Smad y de JNK (58). Esto antecedentes podrían servir, en parte, para explicar la

visualización de un mayor procesamiento de la proteína LC3 I a LC3 II en

miofibroblastos cardiacos en su estado basal, así como la mayor localización de LC3

endógeno en vesículas autofágicas. A pesar de esto, los miofibroblastos cardiacos de

42

rata adulta no fueron capaces de aumentar esta autofagia frente a estímulos clásicos del

proceso ni bajo estimulación β2-adrenérgica.

En diversos estudios se ha determinado que TGF-β1 realiza muchos de sus

efectos por una vía no canónica, es decir, una vía alternativa a aquella que tiene relación

con las proteínas Smad. Esta vía no canónica involucraría a la proteína PI3-K y, por lo

tanto, indirectamente a mTOR, una proteína clave en la regulación de la autofagia. En

fibroblastos de riñón se ha determinado que TGF-β1 activa la vía de PI3-K y que esto

lleva a una activación de mTOR a través de la fosforilación de Akt y tuberina (TSC2)

(59). En este estudio, además, se asoció la activación del Complejo 1 de mTOR

(mTORC1) con la proliferación de miofibroblastos en el intersticio renal y con la mayor

expresión de proteínas de la MEC, ambos efectos inducidos por TGF-β1. Además, los

autores explican que este efecto producido por TGF-β1 se ha observado en fibroblastos,

pero no en células epiteliales. Por otro lado, se ha visto que TGF-β1 regula una variedad

de procesos en el desarrollo del cáncer, entre éstos la EMT (60). Recientemente se ha

descrito en células epiteliales que la EMT inducida por TGF-β1 induce tanto el aumento

del tamaño celular como la capacidad invasiva de células que han sufrido esta transición

a través de la activación de mTOR, y que esta activación ocurre por la vía PI3-K y Akt

(61). Finalmente, en fibroblastos embriónicos humanos se ha observado TFG-β activa a

mTORC1 en este tipo de células y no en células epiteliales en un forma dependiente de

la vía PI3-K/Akt/TSC2, y que rapamicina, un inhibidor del complejo mTORC1, sólo

disminuyó levemente la diferenciación de fibroblasto a miofibroblasto por TGF-β (62).

Cabe destacar que en todos estos estudios citados, la participación de mTOR se evaluó

al inhibir a esta proteína (sola o en el complejo mTORC1) con rapamicina a distintas

concentraciones por distintos tiempos. Lo importante es recalcar que rapamicina inhibió

los efectos asociados a TGF-β en un pretratamiento con el este agente inhibidor de

mTOR, lo que difiere con nuestras condiciones experimentales (primero utilizamos

TGF-β1 para diferenciar y luego se estimuló con rapamicina). Por esto, seguramente, en

nuestro estudio no vemos que rapamicina pueda revertir el efecto de diferenciación

ejercido por TGF-β1.

43

Lo interesante de los últimos antecedentes expuestos, es que todos apuntan a una

asociación entre TGF-β1, el agente utilizado para diferenciar fibroblastos a

miofibroblastos, y mTOR, la proteína clave en el proceso de autofagia. Como se ha

indicado, la autofagia se induce al inhibir la proteína mTOR, por esto se eligió

rapamicina como control positivo de algunos experimentos. Si TGF-β1 es capaz de

activar mTOR por su vía no canónica, PI3-K/Akt, es razonable esperar que el proceso

de autofagia se vea disminuido en miofibroblastos que han logrado su diferenciación in

vitro. Ahora, como ya se ha mencionado previamente, nuestras condiciones

experimentales conservarían los efectos de TGF-β1 (la exposición a TGF-β1 por tiempo

prolongado, por el suero y el efecto autocrino), indicando que su vía de señalización se

mantiene activa durante este período. Considerando esto último, se podría explicar

porqué ni siquiera el estímulo con rapamicina por 24 h pueda revertir la situación y, por

lo tanto, los miofibroblastos no puedan sufrir autofagia en mayor medida que su propio

control.

En resumen, podemos decir que TGF-β1 podría estar ejerciendo un efecto dual

en cuanto al proceso de autofagia. Por un lado, estaría activando la vía Smad y JNK y,

por lo tanto, manteniendo un nivel aparentemente elevado de autofagia, seguramente

por modulación de la expresión de proteínas implicadas en el proceso de autofagia, ya

que ambas actúan a nivel de transcripción. Sin embargo, por otro lado estaría

estimulando la vía PI3-K/Akt/mTOR y, por lo tanto, volviendo a las células poco

susceptibles a estímulos autofágicos que se dirijan, directa o indirectamente, a la

inhibición de la proteína mTOR. Por todo lo anteriormente expuesto, se vuelve

interesante evaluar la asociación y efecto de las vías de señalización asociadas a TGF-β1

en el proceso de autofagia en fibroblastos y miofibroblastos cardiacos de rata adulta.

44

6.5 Alcances fisiopatológicos

Los alcances fisiopatológicos de los resultados obtenidos en este trabajo tiene

diversas aristas. Por un lado, en los miofibroblastos cardiacos, a pesar de haber un

mayor número de receptores β2-adrenérgicos, esto no se refleja en la producción de

cAMP y en la activación de ERK 1/2. Así, pareciera existir una autorregulación en la

señalización intracelular de modo de no verse mayormente afectados por el ya

aumentado tono adrenérgico en estados de daño al miocardio.

Por otro lado, se obtuvo que los miofibroblastos sufrieron autofagia basalmente.

Esto podría encontrar explicación en el hecho que el miofibroblasto es un fenotipo

celular asociado a procesos de reparación tisular y, por lo tanto, es extremadamente

secretor de proteína de la MEC, por lo que seguramente aumenta su autofagia en un

estado basal con la finalidad de obtener precursores y energía para la síntesis de

proteínas MEC, esencialmente colágeno. En este sentido, nuestro laboratorio ha

determinado que la autofagia en fibroblastos cardiacos de rata adulta estaría siendo

activada por estimulación β2-adrenérgica, en parte, con la finalidad de degradar

colágeno (43), probablemente, a fin de utilizar esos aminoácidos y energía en promover

la proliferación celular, un efecto que sí es mediado por estimulación adrenérgica en

fibroblastos, pero no en los miofibroblastos pues ellos no tienen la capacidad de

proliferar in vitro (63). Si entendemos que el miofibroblasto repara el tejido en gran

medida por depósito de proteínas de la MEC, el estímulo adrenérgico aumentado en

estados de daño al miocardio, sería contraproducente para su función. De este modo,

disminuiría su respuesta al estímulo β2-adrenérgico para evitar aumentar la degradación

de proteínas de la MEC por autofagia, sin embargo, recurriría a un nivel basal que le

permita obtener precursores y energía para procesos de síntesis proteica.

45

7. CONCLUSIONES

1. Fibroblastos y miofibroblastos cardiacos de rata adulta presenta sólo un subtipo de

receptor adrenérgico: el receptor β2-adrenérgico.

2. Miofibroblastos cardiacos de rata adulta presentan mayor número de receptores β2-

adrenérgicos que fibroblastos cardiacos de rata adulta. Del mismo modo, los receptores

β2-adrenérgicos de miofibroblastos cardiacos de rata adulta son más afines por sus

ligandos que los de fibroblastos cardiacos de rata adulta.

3. Los receptores β2-adrenérgicos de fibroblastos y miofibroblastos cardiacos de rata

adulta son funcionales, ya que son capaces de activar a proteínas ERK y aumentar la

producción de cAMP frente a un estímulo β2-adrenérgico.

4. Fibroblastos cardiacos de rata adulta sufren autofagia en un medio con baja o nula

suplementación de suero, mientras que los miofibroblastos no son capaces de sufrir

mayor autofagia en un medio con baja o nula suplementación con suero.

5. Fibroblastos cardiacos de rata adulta sufren autofagia por estímulos clásicos de dicho

proceso, como lo son rapamicina o privación de aminoácidos, y de manera menos

potente por estímulo β2-adrenérgico. Por otro lado, los miofibroblastos cardiacos de rata

adulta no son capaces de sufrir autofagia por estímulos clásicos del proceso, como

tampoco por estímulo β2-adrenérgico, sin embargo, sus niveles basales de autofagia son

mayores a los niveles basales de fibroblastos.

46

8. REFERENCIAS

1. Organización Mundial de la Salud. 55ª Asamblea Mundial de la Salud , A55/16,

punto 13.11. In: 2002.

2. Szot MJ. Demographic-epidemiologic transition in Chile, 1960-2001. Rev Esp

Salud Publica 2003;77:605-13.

3. Camelliti P, Borg TK, Kohl P. Structural and functional characterisation of

cardiac fibroblasts. Cardiovasc Res 2005;65:40-51.

4. Weber KT. Fibrosis in hypertensive heart disease: focus on cardiac fibroblasts. J

Hypertens 2004;22:47-50.

5. Booz GW, Baker KM. Molecular signalling mechanisms controlling growth and

function of cardiac fibroblasts. Cardiovasc Res 1995;30:537-43.

6. MacKenna D, Summerour SR, Villarreal FJ. Role of mechanical factors in

modulating cardiac fibroblast function and extracellular matrix synthesis. Cardiovasc

Res 2000;46:257-63.

7. Brown RD, Ambler SK, Mitchell MD, Long CS. The cardiac fibroblast:

therapeutic target in myocardial remodeling and failure. Annu Rev Pharmacol Toxicol

2005;45:657-87.

8. Porter KE, Turner NA. Cardiac fibroblasts: at the heart of myocardial

remodeling. Pharmacol Ther 2009;123:255-78.

9. Gabbiani G. The myofibroblast in wound healing and fibrocontractive diseases.

J Pathol 2003;200:500-3.

10. Chai Q, Krag S, Chai S, Ledet T, Wogensen L. Localisation and phenotypical

characterisation of collagen-producing cells in TGF-beta 1-induced renal interstitial

fibrosis. Histochem Cell Biol 2003;119:267-80.

11. Sun Y, Weber KT. RAS and connective tissue in the heart. Int J Biochem Cell

Biol 2003;35:919-31.

47

12. Copaja M. Participación de Rho en la muerte inducida por estatinas de

fibroblastos y miofibroblastos cardiacos de rata. Tesis Doctoral. Universidad de Chile.

2010.

13. Vivar R. Apoptosis dependiente de Angiotensina II en fibroblastos cardiacos que

sobreexpresan el receptor AT1: Participación de Fosfolipasa C y Proteinakinasa C.

Memoria de Título. 2007.

14. Soto C. Muerte celular de fibroblastos y miofibroblastos cardiacos neonatos por

sobre-expresión de los receptores tipo 1 y 2 de Angiotensina II. Memoria de Título.

Universidad de Chile. 2006.

15. Sun Y, Weber KT. Infarct scar: a dynamic tissue. Cardiovasc Res 2000;46:250-

6.

16. Zhang HY, Phan SH. Inhibition of myofibroblast apoptosis by transforming

growth factor beta(1). Am J Respir Cell Mol Biol 1999;21:658-65.

17. Swaney JS, Patel HH, Yokoyama U, Lai NC, Spellman M, Insel PA, Roth DM.

Adenylyl cyclase activity and function are decreased in rat cardiac fibroblasts after

myocardial infarction. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2007;293:H3216-H3220.

18. Hasking GJ, Esler MD, Jennings GL, Burton D, Johns JA, Korner PI.

Norepinephrine spillover to plasma in patients with congestive heart failure: evidence of

increased overall and cardiorenal sympathetic nervous activity. Circulation

1986;73:615-21.

19. Woodcock EA. Cardiac alpha 1-adrenergic drive in pathological remodelling.

Cardiovasc Res 2008;77:452-62.

20. Turner NA, Porter KE, Smith WH, White HL, Ball SG, Balmforth AJ. Chronic

beta2-adrenergic receptor stimulation increases proliferation of human cardiac

fibroblasts via an autocrine mechanism. Cardiovasc Res 2003;57:784-92.

21. Meszaros JG, Gonzalez AM, Endo-Mochizuki Y, Villegas S, Villarreal F,

Brunton LL. Identification of G protein-coupled signaling pathways in cardiac

fibroblasts: cross talk between G(q) and G(s). Am J Physiol Cell Physiol

2000;278:C154-C162.

48

22. Scheuer J. Catecholamines in cardiac hypertrophy. Am J Cardiol 1999;83:70H-

4H.

23. Leicht M, Greipel N, Zimmer H. Comitogenic effect of catecholamines on rat

cardiac fibroblasts in culture. Cardiovasc Res 2000;48:274-84.

24. Fisher SA, Absher M. Norepinephrine and ANG II stimulate secretion of TGF-

beta by neonatal rat cardiac fibroblasts in vitro. Am J Physiol 1995;268:C910-C917.

25. Akiyama-Uchida Y, Ashizawa N, Ohtsuru A, Seto S, Tsukazaki T, Kikuchi H,

Yamashita S, Yano K. Norepinephrine enhances fibrosis mediated by TGF-beta in

cardiac fibroblasts. Hypertension 2002;40:148-54.

26. Liu X, Sun SQ, Hassid A, Ostrom RS. cAMP inhibits transforming growth

factor-beta-stimulated collagen synthesis via inhibition of extracellular signal-regulated

kinase 1/2 and Smad signaling in cardiac fibroblasts. Mol Pharmacol 2006;70:1992-

2003.

27. Rosenbaum DM, Rasmussen SG, Kobilka BK. The structure and function of G-

protein-coupled receptors. Nature 2009;459:356-63.

28. Xiao RP, Cheng H, Zhou YY, Kuschel M, Lakatta EG. Recent advances in

cardiac beta(2)-adrenergic signal transduction. Circ Res 1999;85:1092-100.

29. Colombo F, Gosselin H, El-Helou V, Calderone A. Beta-adrenergic receptor-

mediated DNA synthesis in neonatal rat cardiac fibroblasts proceeds via a

phosphatidylinositol 3-kinase dependent pathway refractory to the antiproliferative

action of cyclic AMP. J Cell Physiol 2003;195:322-30.

30. Dubey RK, Gillespie DG, Mi Z, Jackson EK. Endogenous cyclic AMP-

adenosine pathway regulates cardiac fibroblast growth. Hypertension 2001;37:1095-

100.

31. Yang YP, Liang ZQ, Gu ZL, Qin ZH. Molecular mechanism and regulation of

autophagy. Acta Pharmacol Sin 2005;26:1421-34.

32. Budovskaya YV, Stephan JS, Deminoff SJ, Herman PK. An evolutionary

proteomics approach identifies substrates of the cAMP-dependent protein kinase. Proc

Natl Acad Sci U S A 2005;102:13933-8.

49

33. Iizuka K, Sano H, Kawaguchi H, Kitabatake A. Transforming growth factor

beta-1 modulates the number of beta-adrenergic receptors in cardiac fibroblasts. J Mol

Cell Cardiol 1994;26:435-40.

34. Mak JC. Transforming growth factor beta-1 inhibits beta-2-adrenoceptor gene

transcription. Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol 2010;362:520-5.

35. Levine B, Kroemer G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell

2008;132:27-42.

36. Gustafsson AB, Gottlieb RA. Autophagy in ischemic heart disease. Circ Res

2009;104:150-8.

37. Klionsky DJ, Emr SD. Autophagy as a regulated pathway of cellular

degradation. Science 2000;290:1717-21.

38. Klionsky DJ, Cregg JM, Dunn WA, Jr., Emr SD, Sakai Y, Sandoval IV, Sibirny

A, Subramani S, Thumm M, Veenhuis M, Ohsumi Y. A unified nomenclature for yeast

autophagy-related genes. Dev Cell 2003;5:539-45.

39. Levine B, Klionsky DJ. Development by self-digestion: molecular mechanisms

and biological functions of autophagy. Dev Cell 2004;6:463-77.

40. Nishida K, Kyoi S, Yamaguchi O, Sadoshima J, Otsu K. The role of autophagy

in the heart. Cell Death Differ 2009;16:31-8.

41. Maiuri MC, Zalckvar E, Kimchi A, Kroemer G. Self-eating and self-killing:

crosstalk between autophagy and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol 2007;8:741-52.

42. Zhu H, Rothermel BA, Hill JA. Autophagy in load-induced heart disease.

Methods Enzymol 2009;453:343-63.

43. Aranguiz-Urroz P, Canales J, Copaja M, Troncoso R, Vicencio JM, Carrillo C,

et al. Beta(2)-adrenergic receptor regulates cardiac fibroblast autophagy and collagen

degradation. Biochim Biophys Acta 2010.

44. Nogami M. TGF- beta 1 modulates beta-adrenergic receptor number and

function in cultured human tracheal smooth muscle cells. Am J Physiol Lung Cell Mol

Physiol 1994;266:L187-L191.

50

45. Rosenkranz S, Flesch M, Amann K, Haeuseler C, Kilter H, Seeland U, Schlüter

KD, Böhm M. Alterations of beta-adrenergic signaling and cardiac hypertrophy in

transgenic mice overexpressing TGF-beta(1). Am J Physiol Heart Circ Physiol

2002;283:H1253-H1262.

46. Greenberg RS, Bernstein AM, Benezra M, Gelman IH, Taliana L, Masur SK.

FAK-dependent regulation of myofibroblast differentiation. FASEB J 2006;20:1006-8.

47. Liu X, Ostrom RS, Insel PA. cAMP-elevating agents and adenylyl cyclase

overexpression promote an antifibrotic phenotype in pulmonary fibroblasts. Am J

Physiol Cell Physiol 2004;286:C1089-C1099.

48. Xing D, Bonanno JA. Effect of cAMP on TGFbeta1-induced corneal keratocyte-

myofibroblast transformation. Invest Ophthalmol Vis Sci 2009;50:626-33.

49. Swaney JS, Roth DM, Olson ER, Naugle JE, Meszaros JG, Insel PA. Inhibition

of cardiac myofibroblast formation and collagen synthesis by activation and

overexpression of adenylyl cyclase. Proc Natl Acad Sci U S A 2005;102:437-42.

50. Nair BG, Yu Y, Rashed HM, Sun H, Patel TB. Transforming growth factor-beta

1 modulates adenylyl cyclase signaling elements and epidermal growth factor signaling

in cardiomyocytes. J Cell Physiol 1995;164:232-9.

51. El-Haroun H, Clarke DL, Deacon K, Bradbury D, Clayton A, Sutcliffe A, Knox

AJ. IL-1beta, BK, and TGF-beta1 attenuate PGI2-mediated cAMP formation in human

pulmonary artery smooth muscle cells by multiple mechanisms involving p38 MAP

kinase and PKA. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2008;294:L553-L562.

52. Kolosionek E, Savai R, Ghofrani HA, Weissmann N, Guenther A, Grimminger

F, Seeger W, Banat GA, Schermuly RT, Pullamsetti SS. Expression and activity of

phosphodiesterase isoforms during epithelial mesenchymal transition: the role of

phosphodiesterase 4. Mol Biol Cell 2009;20:4751-65.

53. Cospedal R, Lobo M, Zachary I. Differential regulation of extracellular signal-

regulated protein kinases (ERKs) 1 and 2 by cAMP and dissociation of ERK inhibition

from anti-mitogenic effects in rabbit vascular smooth muscle cells. Biochem J 1999;342

( Pt 2):407-14.

51

54. Graves LM, Bornfeldt KE, Raines EW, Potts BC, Macdonald SG, Ross R, Krebs

EG. Protein kinase A antagonizes platelet-derived growth factor-induced signaling by

mitogen-activated protein kinase in human arterial smooth muscle cells. Proc Natl Acad

Sci U S A 1993;90:10300-4.

55. Wu J, Dent P, Jelinek T, Wolfman A, Weber MJ, Sturgill TW. Inhibition of the

EGF-activated MAP kinase signaling pathway by adenosine 3',5'-monophosphate.

Science 1993;262:1065-9.

56. Gajewska M, Gajkowska B, Motyl T. Apoptosis and autophagy induced by

TGF-B1 in bovine mammary epithelial BME-UV1 cells. J Physiol Pharmacol 2005;56

Suppl 3:143-57.

57. Koesters R, Kaissling B, Lehir M, Picard N, Theilig F, Gebhardt R, et al.

Tubular Overexpression of Transforming Growth Factor-beta1 Induces Autophagy and

Fibrosis but not Mesenchymal Transition of Renal Epithelial Cells. Am J Pathol 2010.

58. Suzuki HI, Kiyono K, Miyazono K. Regulation of autophagy by transforming

growth factor-beta (TGFbeta) signaling. Autophagy 2010;6.

59. Wang S, Wilkes MC, Leof EB, Hirschberg R. Noncanonical TGF-beta

pathways, mTORC1 and Abl, in renal interstitial fibrogenesis. Am J Physiol Renal

Physiol 2010;298:F142-F149.

60. Zavadil J, Bottinger EP. TGF-beta and epithelial-to-mesenchymal transitions.

Oncogene 2005;24:5764-74.

61. Lamouille S, Derynck R. Cell size and invasion in TGF-beta-induced epithelial

to mesenchymal transition is regulated by activation of the mTOR pathway. J Cell Biol

2007;178:437-51.

62. Rahimi RA, Andrianifahanana M, Wilkes MC, Edens M, Kottom TJ, Blenis J,

Leof EB. Distinct roles for mammalian target of rapamycin complexes in the fibroblast

response to transforming growth factor-beta. Cancer Res 2009;69:84-93.

63. Petrov VV, van Pelt JF, Vermeesch JR, Van Duppen VJ, Vekemans K, Fagard

RH, Lijnen PJ. TGF-beta1-induced cardiac myofibroblasts are nonproliferating

functional cells carrying DNA damages. Exp Cell Res 2008;314:1480-94.