““Metodología Metodología clásica y clásica y

molecular en molecular en la la

identificación identificación de especies de de especies de Enterococcus Enterococcus

spp” spp”

AUTORES•M.Sepúlveda,

•H.Bello, •M. Ruiz,

•J. Hormazábal, •M. Domínguez, •G. González,

•S. Mella, •R. Zemelman

Revista médica de Chile v.130 n.1 Santiago ene. 2002

REVIEW hecho por Tessy Caspine

OBJETIVOSOBJETIVOS

• Identificar las cepas de Enterococcus utilizando técnicas clásicas de bioquímica y de amplificación genómica con la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).

• Comparar las dos técnicas: convencionales y PCR para la identificación de especies de importancia Clínica.

DATOS INTERESANTESDATOS INTERESANTES

• En las bacterias de género Enterococcus, las especies más conocidas son E. fæcalis y E. fæcium.

• Las cepas de Enterococcus spp. poseen propiedades fisiológicas que facilitan su caracterización fenotípica por métodos bioquímicos convencionales Muy complejo.

• Ahora se utilizan métodos moleculares: estudios de ac. Nucleicos para identificación de especies PCR, hibridación ADN-ADN, hibridación ADN-ARN y análisis de proteínas.

¿QUÉ MÉTODOS SE ¿QUÉ MÉTODOS SE UTILIZARON?UTILIZARON?

• Cepas bacterianas– Muestreo

• Identificación. – La identificación fenotípica de género se

realizó según lo establecido por Facklam.

– A nivel de especie de acuerdo al esquema propuesto por Carvalho.

– PCR Multiplex: La identificación genotípica por Dutka-Malen.

Cepas BacterianasCepas Bacterianas•Se estudiaron 305 cepas de Enterococcus spp

244 de pacientes hospitalizados 61 de pacientes ambulatorios•Controles

E fæcalis ATCC 29212 E fæcium cepa Cernelle 68 (C-68)

Identificación fenotípicaIdentificación fenotípica

• Clasificación de FacklamEsta clasificación separa las especies en tres grupos basándose en la formación de ácidos en presencia de algunos sustratos como:– manitol– sorbitol

– sorbosa– la hidrólisis de la arginina.

Identificación fenotípica: Identificación fenotípica: especieespecie

• Clasificación de Carvalho• Se utilizan carbohidratos y un test de

suceptibilidad (EFRO) que los divide en 5 grupos.– Manitol

• Sorbosa– Arginina

» Arabinosa– Sorbitol

• Raffinosa– Telurito

• Movilidad– Pigmento

» Sacarosa– Piruvato

Identificación genotípica

• Protocolo de Dutka-Malen• Por medio de un ensayo de PCR

permite la identificación de los genotipos de 4 glucopéptidos resistentes para Enterococcus.– Van A: resistencia a Vancomicina y

Teicoplanina.– Van B: resistencia a Vancomicina y no a

Teicoplanina.– VanC1 y Van C2: Bajos niveles de

resistencia a Vancomicina.

PCR MultiplexPCR Multiplex

• Tipo especial de PCR

– Se amplifica más de una secuencia blanco.– Se logra agregando en la reacción más de un

par de primers.

– Ahorra tiempo y esfuerzo sin comprometer efectividad.

• Requisitos– Los primers deben ser compatibles.

– Los primers utilizados deben tener un Tm parecidos y no deben exhibir interacción entre ellos o en la cadena de ADN.

Utilización de PCR Utilización de PCR MultiplexMultiplex

Aplicaciones en:

• Pruebas de ADN• Análisis de delecciones

• Mutaciones

• Polimorfismos• Ensayos cuantitativos• Transcripción reversa (RT-PCR)

Desventajas:

• Falta de amplificación o amplificación desigual.• Dificultades en reproducir algunos resultados.

EjemploEjemplo

ProtocoloProtocoloGeneralGeneral

PCRPCRMultiplexMultiplex

PCR de bacterias en PCR de bacterias en identificaciónidentificación

2 colonias200uL de agua

Centrifugar 10s2uL sobrenadante

1uL de MgCl2 (50mM)

2.5uL dNTP’s(1.25mM)

2uL de c/uDe los primers (20p/mol)

2.5uL buffer 10X 0.15uL (5U/uL)

• Programa de PCR

PrimersPrimers utilizadosutilizados

RESULTADOSRESULTADOS

E.Faecalis 89.2%

E.faecium 10.2%

E. hirae 1.2%

E.gallinarum0.4%, E.raffinosus 0.4%, E.avium0.4% , E. durans0.4%No identificada0.4%

272

25

3

RESULTADOS: PCR

• Amplificación de 8 cepas E fæcalis por métodos bioquímicos.

• El fragmento de ADN amplificado (941 pb) fue comparable con aquel obtenido a partir de la cepa control de E fæcalis ATCC 29212.

RESULTADOS: PCRRESULTADOS: PCR

• Amplificación de 6 cepas de E fæcium. • Producto de amplificación (550 pb),

comparable con el producto de amplificación de la cepa control E fæcium C-68.

RESULTADOS:PCRRESULTADOS:PCR

• Amplificación positiva (822 pb) de 1 cepa para E gallinarum.

• En una cepa que fenotípicamente había sido identificada como el complejo E casseliflavus/E gallinarum.

• 7 cepas de especies poco frecuentes no dieron amplificación positiva.

DISCUSIÓN FINALDISCUSIÓN FINAL• E.faecalis y E. faecium son las bacterias

mayormente aisladas en centros hospitalarios.

• En este trabajo se estandarizó un protocolo de identificación por medio de amplificación por PCR de algunas especies de Enterococcus.

• Los resultados permitieron confirmar en 100% el estudio fenotípico, además de identificar especies en casos donde la identificación a través de las propiedades fisiológicas no fue concluyente.

CONCLUSIÓN y CONCLUSIÓN y RECOMENDACIÓNRECOMENDACIÓN

• Con la amplificación por PCR (molecular) hecha a las distintas cepas bacterianas fue posible comprobar la identificación fenotípica (bioquímica)

• La técnica de PCR puede ser de utilidad en la identificación de especies de Enterococcus, particularmente de aquellas cuya identificación fenotípica es más compleja.