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- 8 - 8 EVALUACION DE LA IMPLICACION DE Enterococcus sp Vancomicina Resistentes EN MASTITIS BOVINA Y SU DETECCION EN QUESO PERA MARIA FERNANDA RANGEL ARENAS PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS MICROBIOLOGÍA AGRICOLA Y VETERINARIA BOGOTA 2010

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EVALUACION DE LA IMPLICACION DE Enterococcus sp Vancomicina Resistentes EN MASTITIS BOVINA Y SU DETECCION EN QUESO PERA

MARIA FERNANDA RANGEL ARENAS

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

MICROBIOLOGÍA AGRICOLA Y VETERINARIA BOGOTA 2010

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IIMPLICACION DE Enterococcus sp EN MASTITIS BOVINA Y SU DETECCIÓN EN QUESO

PERA

MARIA FERNANDA RANGEL ARENAS

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcial

Para optar el titulo de

Microbiólogo Agrícola y Veterinario

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

PROGRAMA PROFESIONAL MICROBIOLOGÍA AGRICOLA Y VETERINARIA BOGOTA 2010

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Nota de advertencia.

Artículo 23 de la Resolución No 13 de Julio de 1946 “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma y la moral católica y porque la tesis no contenga ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo por buscar la verdad y justicia”.

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EVALUACION DE LA IMPLICACION DE Enterococcus sp Vancomicina Resistentes EN MASTITIS BOVINA Y SU DETECCION EN QUESO PERA

MARIA FERNANDA RANGEL ARENAS

APROBADO

________________________________

Adriana del Pilar Pulido Villamarín Bact. MSc. Director

Pontificia Universidad Javeriana

________________________________ Rubiela Castañeda Salazar MV. MSc.

Jurado Pontificia Universidad Javeriana

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EVALUACION DE LA IMPLICACION DE Enterococcus sp Vancomicina Resistentes EN MASTITIS BOVINA Y SU DETECCION EN QUESO PERA

MARIA FERNANDA RANGEL ARENAS

APROBADO

________________________ __________________________ Ingrid Schuler. Ph.D Janeth Arias P. Bact. MSc., M Ed Decana Académica Directora Facultad de Ciencias Carrera de Microbiología

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A Dios por llenarme de fortaleza y bendiciones cada día.

A mis padres por brindarme su apoyo, amor y comprensión y por hacer de mí la persona que soy

ahora

A mis hermanos por su amor, preocupación y confianza que me ayudaron a alcanzar esta meta

A mis amigos por su tiempo y colaboración

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AGRADECIMIENTOS

A la Dra Adriana del Pilar Pulido Villamarín, por su esfuerzo, entrega, dedicación y compresión durante todo este tiempo; por su ayuda incondicional y por compartir conmigo sus conocimientos; además de hacer cada vez de mi una mejor persona llena de grandes metas y responsabilidades A la Dra Rubiela Castañeda, por su colaboración, conocimientos y tiempo para culminar con exito este proyecto

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CONTENIDO 1. INTRODUCCION ...................................................................................................... 19 2. PLANTEAMIETO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION ................................... 20

3. OBJETIVOS ............................................................................................................... 21 3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS ................................................................................... 21 4. MARCO TEORICO ................................................................................................... 21 4.1 GÉNERO ENTEROCOCCUS ................................................................................. 21

4.1.1 Antecedentes y Taxonomìa ................................................................................... 21 4.1.2 Características Generales ....................................................................................... 22 4.1.4. Mecanismos de resistencia a antimicrobianos ...................................................... 24

4.2 IMPORTANCIA CLÍNICA ..................................................................................... 25 4.2.1 Implicación clínica en mastitis bovina ................................................................. 25 4.2.2 Importancia clínica en humanos .......................................................................... 27 4.2.3 Implicaciones zoonóticas ....................................................................................... 27 4.3 DIAGNÓSTICO ...................................................................................................... 28 4.3.1 Aislamiento y Medios de cultivo ........................................................................... 28 4.3.2 Identificación ......................................................................................................... 30 4.4 TRATAMIENTO PARA EL HUMANO Y LA MASTITIS BOVINA ................. 31 4.5 CONTROL Y PREVENCIÓN DE LAS INFECCIONES POR Enterococcus sp ... 31 5.1 Ubicación Geográfica ............................................................................................... 32 5.2 Población .................................................................................................................. 32 5.3 Obtención de Muestras ............................................................................................. 33 5.3.1 Muestras de leche .................................................................................................. 33 5.3.2 Derivados lácteos ................................................................................................... 33 5.4 Procesamiento de muestras ....................................................................................... 34 5.4.1 Muestras de leche .................................................................................................. 34 5.4.1.1 Prueba de Hotis: ................................................................................................. 34 5.4.1.2 Aislamiento e identificación: .............................................................................. 34 5.4.1.3 Pruebas de Sensibilidad Antimicrobiana: ........................................................... 34 5.4.2 Procesamiento de leche de Cantinas:..................................................................... 34 5.4.3 Derivados lácteos .................................................................................................. 34 5.5 Análisis Estadístico .................................................................................................. 35 6. RESULTADOS Y DISCUSION ................................................................................ 35 6.1 Aislamiento e Identificación de microorganismos en muestras de leche ................. 35

6.2 Pruebas de susceptibilidad a Antibióticos ................................................................ 38 6.3 Hallazgos en muestras de cantinas ........................................................................... 41 6.4 Evaluación de calidad del producto lácteo ............................................................... 43 7. CONCLUSIONES ...................................................................................................... 47 8. BIBLIOGRAFIA ........................................................................................................ 48

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TABLAS Tabla1. Pruebas diagnósticas utilizadas para la detección de mastitis…………………………....17 Tabla 2. Fundamento de los medios de cultivo utilizados para detección de Enterococcus ssp…………………………………………................................................................19 Tabla 3. Fundamento de las bioquímicas utilizadas para la detección de Enterococcus spp.....21 Tabla 4. Porcentaje de Sensibilidad a los Antibióticos utilizados en los diferentes microorganismos…...……………………………………………………………………………….…….30 Tabla 5. Características organolépticas del primer y segundo procesamiento de quesos en la planta 1 y 2 ………………………………………………………………………..………………..35

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FIGURAS Figura 1. Prueba de California Mastitis test…………………………………………………………24 Figura 2. Toma de muestras por ordeño manual ………………………………………………….25 Figura 3. Muestras de leche directamente del animal de todas las fincas N: 62………….…..28 Figura 4. Resultados de muestras de leche tomadas directamente del animal………..……….29 Figura 5. Aislamientos microbianos en agar sangre, enterocococsell y MacConkey…...30 Figura 7. Muestras de cantinas………………………………………………………………………..33 Figura 8. Porcentajes de positividad de microorganismos en muestras de leche de cantinas de los tres hatos………………………………………..……………………………………..34 Figura 9. Aislamientos de diferentes microorganismos en 3 hatos muestreados a partir de muestras de leche provenientes de cantinas…………………………………………………………35 Figura 10. Queso pera antes y después de su fecha de vencimiento…………………………....36 Figura 11. Porcentaje de positividad a Enterococcus vancomicina R en el primer y segundo muestreo de muestras de queso en la planta 1 y 2………………………………………………….37 Figura 12. Enterococcus sp VanR en agar enterocococsell con vancomicina a partir de queso pera posvencimiento…….…………………………………………………………38

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RESUMEN

El objetivo principal de este estudio, fue determinar la presencia/ausencia de microorganismos del género Enterococcus Vancomicina Resistentes (VanR) en leche cruda proveniente de hembras con mastitis clínica y/o subclínica en 3 hatos lecheros de la Sabana de Bogotá y en queso pera procesado con la leche de dichas vacas. Se recolectaron 62 muestras de leche de los cuartos afectados con mastitis subclínica grado III de hembras productoras no tratadas con terapia antibiótica, 22 muestras de leche cantina y 100 muestras de queso pera. A las muestras de leche se les realizo la prueba de hotis y posteriores aislamientos en agar BHI + sangre, MacConkey y Enterocococsell con vancomicina, se incubaron a 37 °C por 48 horas; además se realizó identificación bioquímica de los microorganismos aislados. Las colonias presuntivas para Enterococcus sp VanR fueron evaluadas mediante tinción de Gram y pruebas de identificación como catalasa, tolerancia a NaCl 6.5 % e hidrólisis de la esculina. Se realizaron pruebas de sensibilidad antibiótica a 33 microorganismos clínicamente importantes en el proceso de mastitis bovina. A las muestras de queso pera se les evaluó características organolépticas y microbiológicas en agar enterocococsell para determinar ausencia/presencia del microorganismo. Los resultados mostraron que Enterococcus sp VanR no fue un agente etiológico en el proceso de mastitis subclinica grado III como si lo fueron Streptococcus γ y α hemolítico y Escherichia coli. Los antibióticos de elección para tratar la mastitis subclínica en las fincas son la Cefoperazona y Ciprofloxacina. Un alto porcentaje de Enterococcus sp VanR en las muestras de cantina pudo estar influenciado por inadecuadas condiciones de higiene y manejo de los equipos de ordeño. La presencia de Enterococcus sp VanR en queso pera no favorece la preservación y la calidad del producto.

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EVALUACION DE LA IMPLICACION DE Enterococcus sp Vancomicina Resistentes EN MASTITIS BOVINA Y SU DETECCION EN QUESO PERA

1. INTRODUCCION

El consumo regular de leche por parte del ser humano, se remonta al momento en que los antepasados dejaron de ser nómadas y comenzaron a domesticar animales y a cultivar la tierra para alimentar los animales que mantenían junto al hogar. En esos tiempos la leche se guardaba en pieles o vejigas de animales o la dejaban expuestas al sol por lo que el producto se coagulaba, allí surgió la idea del primer derivado lácteo. El uso de la leche como alimento se remonta a más de 3500 años A.C y a lo largo del tiempo las diferentes culturas la han aprovechado de distintas maneras. (Pinzón, 2006; Cruz, 2007) A mediados de siglo XIX, los descubrimientos de Louis Pasteur representaron la primera victoria de la ciencia contra toxinas y microorganismos patógenos, y de esta forma se logro conservar por más tiempo las propiedades nutritivas de los alimentos. El tratamiento térmico conocido como pasteurización, el descremado mecánico y las técnicas de enfriamiento, sumados a otros avances, permitieron hacia fines de siglo XIX la modificación de la producción industrial de leche y sus derivados. (Pinzón, 2006) Si bien son incuestionables las cualidades nutritivas de la leche y los subproductos lácteos, desde su síntesis en la glándula mamaria hasta su llegada al consumidor, esta está sometida a un gran número de riesgos como: la contaminación y multiplicación de microorganismos patógenos, formación de toxinas, alteración físico-química de sus componentes, absorción de olores extraños, generación de malos sabores y contaminación con sustancias químicas tales como pesticidas, antibióticos, desinfectantes, metales, detergentes, entre otros, todos estos atentan contra la calidad higiénica y nutricional del producto, afectando la salud pública y económica del país. ( Revelli y Tercero, 2005; Cruz, 2007)

• Los productos lácteos y la leche pueden contaminarse con microorganismos patógenos o sus toxinas y provocar enfermedad en el consumidor

• Los microorganismos pueden causar alteraciones de la leche y productos lácteos haciéndolos inadecuados para el consumo

• Los microorganismos producen cambios deseables en las características físico químicas de la leche durante la elaboración de diversos productos lácteos

La leche es una de las sustancias producidas por la naturaleza que funciona como fuente de alimento. Por esto, un factor fundamental que influye sobre el valor de aceptación universal de esta es la imagen que representa, ya que constituye una fuente nutritiva elemental para el ser humano. ( Revelli y Tercero, 2005) Las características nutricionales que hacen de ella un alimento completo para la dieta de los seres humanos, también la hacen un medio de cultivo ideal para el crecimiento de una gran variedad de microorganismos, como los Enterococcus sp; entre otros, este es un diverso e importante grupo de bacterias en términos de su interacción con los seres humanos al ser habitante normal del tracto gastrointestinal del hombre, animales e insectos, además en ocasiones son utilizados con fines industriales. (Pinzón, 2006; Cruz, 2007)

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2. PLANTEAMIETO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION

La leche, representa una alta proporción de ingresos totales en la ganadería y anualmente se calculan grandes pérdidas ocasionadas por mastitis; la mastitis bovina es una de las patologías que ocasiona una gran cantidad de pérdidas económicas a nivel mundial y en especial en las regiones con una producción lechera intensiva; adicionalmente es una de las causas más comunes para el sacrificio temprano de las vacas lecheras, seguida de problemas de fertilidad; el 26.5% de las vacas lecheras sacrificadas en el continente americano es debido a trastornos ocasionados por esta patología.( Castañeda et al., 2000; Cruz, 2007) Los daños ocasionados por la mastitis subclínica son mucho mayores, ya que esta forma es por lo menos unas 20 a 50 veces más frecuente que la clínica; además de los altos costos financieros para el ganadero la mastitis tiene una gran importancia en el valor higiénico de la leche y de los subproductos (Corbellini, 1998; Castañeda et al., 2000) Se reconocen diversos agentes etiológicos; sin embargo, microorganismos como los pertenecientes al género Enterococcus sp aún no han sido reconocidos como causantes de esta patología, pero sí son reconocidos como agentes importantes en salud publica y especialmente los resistentes a antibióticos. Una de las posibles fuentes alimenticias de infección en humanos puede ser la leche cruda y los productos lácteos. Consumir estos alimentos, implica riesgos para la salud humana; en Colombia, a pesar de la normativa establecida por el ICONTEC NTC 399 y el decreto número 2838 de 2006 del Ministerio de Protección Social, donde se reglamenta la prohibición de comercializar estos productos y los requisitos que debe cumplir la leche cruda como materia prima para su comercialización y consumo, sigue siendo consumida en algunos sectores rurales y urbanos. El consumo de este producto implica riesgos para la salud, debido a que puede estar contaminado por varios microorganismos debido a la alta manipulación, el medio ambiente o por provenir de animales enfermos.(Pinzón, 2006 ; MPS Colombia, 2010) Frente a este problema se hace necesario un estudio que permita determinar la presencia o ausencia de Enterococcus sp VanR presentes en la leche cruda proveniente de bovinos, de cantinas y derivados lácteos; debido a la limitada información reportada actualmente con respecto a la relación entre este microorganismo en el área clínica veterinaria e industrial. Por ello la finalidad de este estudio, es investigar mediante trabajo de campo y de laboratorio, las implicaciones de Enterococcus sp VanR y reconocer su poder patógeno en la glándula mamaria y la importancia de la contaminación en leche y queso pera, para así realizar sugerencias a quien corresponda y garantizar un adecuado control y prevención sobre ellos. (Pinzón, 2006; Marguet et al., 2008)

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3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GENERAL Determinar la presencia/ausencia de microorganismos del género Enterococcus Vancomicina Resistentes en leche cruda proveniente de hembras con mastitis clínica y/o subclinica y en queso pera procesado con la leche muestreada. 3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS

• Demostrar la implicación de Enterococcus Vancomicina Resistentes como agente

etiológico asociado en el proceso de mastitis clínica o subclínica. • Reportar el perfil de sensibilidad y/o resistencia de los microorganismos implicados en el

proceso de mastitis clínica o subclínica. • Determinar la presencia/ausencia de Enterococcus Vancomicina Resistentes en queso

pera.

4. MARCO TEORICO

4.1 GÉNERO ENTEROCOCCUS 4.1.1 Antecedentes y Taxonomìa

Los enterococos son microorganismos considerados dentro del grupo de Bacterias Ácido Lácticas (BAL), ya que son fermentadoras y productoras de acido láctico, función por la cual son usadas en la industria para darle ciertas características a los alimentos. Los primeros intentos para clasificar taxonómicarnente las bacterias acido lácticas se deben a Orleáns en 1919, quien, basándose en la morfología, en la disposición celular y en criterios fisiológicos tales como el tipo de metabolismo fermentativo de la glucosa, el tipo de isómero del ácido láctico producido y la capacidad de desarrollarse a 10 y a 45 °C, las clasificó en los géneros Etabacterium sp, Sfrepiobacrerium sp y Microbacterium sp, de morfología bacilar, y Streprococcus sp, Beracoccus sp y Tetracoccus sp, de morfología cocoide (Rodríguez, 2001; Machota et al., 2002; Reuter y Klein, 2003). Desde el reconocimiento de los estreptococos, su clasificación se basa en las características antigénicas según Lancefield, respecto a esto y según las pruebas serológicas se tiene constancia que los Enterococos pertenecen al grupo D de la clasificación de Lancefield, junto con los no enterococos que pertenecen al grupo de los Streptococcus (Rodríguez, 2001; Reuter y Klein, 2003). No existe un sistema de clasificación sencillo para diferenciar este heterogéneo grupo de microorganismos y la misma está sometida a revisión constante una forma de clasificación depende de una combinación de características, incluyendo: patrón de hemólisis en placas de agar sangre, composición antigénica, características de crecimiento, reacciones bioquímicas y más recientemente, análisis genético. La tecnología de hibridación del ADN ha revolucionado la taxonomía, poniendo de manifiesto que los enterococos son tan diferentes del resto de los

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estreptococos, que constituyen un nuevo género, ubicado dentro de la familia Enterococcaceae. (Rodríguez, 2001). 4.1.2 Características Generales

Enterococcus sp, son bacterias Gram-positivas, de morfología cocoide no esporulada que aparecen al microscopio formando pares y/o cadenas cortas. Son microorganismos quimiótrofos y su desarrollo depende fundamentalmente de la presencia de carbohidratos, igualmente, poseen un metabolismo fermentativo, por lo que no tienen la capacidad de sintetizar ATP por respiración; sin embargo, son microorganismos anaerobios facultativos, catalasa negativos, ureasa negativos e incapaces de sintetizar citocromos; no obstante, se ha observado que E. faecalis es capaz de sintetizarlos en presencia de una fuente de hemina (Márquez, 1995; Lara, 1998; Machota et al., 2002) Los enterococos presentan ciertos requerimientos nutricionales, siendo necesarios para su crecimiento al menos 10 aminoácidos, bases púricas y pirimídicas y ciertas vitaminas como: biotina, nicotinato, pantotenato, riboflavina y piridoxina, además, E. faecalis requiere ácido fólico en el caso de utilizar el piruvato como fuente de energía. La mayoría de los enterococos se desarrollan en un intervalo de 10 y a 45 °C y a valores de pH 4,4 y 9,6 y en presencia de un 6,5% de NaCl. La separación de los enterococos del grupo de los estreptococos surgió del conocimiento de su mayor resistencia a diferentes condiciones ambientales y a que sobreviven a 60 °C durante 30 minutos, además de ser capaces de hidrolizar la esculina; estas características siguen hoy vigentes para la diferenciación de este grupo de cocos gram positivos. La confirmación de diferentes pruebas genéticas (pruebas de hibridación de ácidos nucleicos) ha permitido establecer esta separación. (Márquez, 1995; Machota et al., 2002). Respecto a su hábitat, los enterococos son esencialmente bacterias que habitan en el intestino tanto del hombre como de diversas especies animales e incluso de insectos, influyendo favorablemente en su equilibrio microbiano. (Lara, 1998). 4.1.3 Factores de virulencia Una de las causas que determina la infección enterocóccica, consiste en la colonización de las mucosas humanas o de animales por parte del microorganismo, el cuenta con moléculas superficiales que actúan como adhesinas, esto implica la necesidad de que existan receptores en las células del huésped y son generalmente de naturaleza proteica, glicoprotéica, lipoprotéica o glicosídica, sobre los tejidos. (Velasco et al., 2001) Además de su reconocida capacidad para adquirir resistencia a antibióticos, los enterococos desarrollan intercambio de información genética por conjugación, características que aumentan su virulencia. Dentro de estas características están: la adherencia a tejidos del huésped, la invasión y formación de abscesos, la respuesta inflamatoria, la secreción de productos tóxicos y la síntesis de enzimas hidrolíticas. (Marguet et al., 2008) Las infecciones enterocóccicas también pueden ocurrir debido a que el microorganismo resiste la acción de diversos mecanismos de defensa del humano o animal, mediante la participación de algunas cápsulas de polisacáridos y de proteínas superficiales con actividad antifagocitaria. Enterococo puede producir cambios directos en los tejidos del animal por producción de toxinas, o indirectos por mecanismos inflamatorios. (Departamento de sanidad y seguridad social, 2002) Algunos de los factores de virulencia importantes en Enterococcus vancomicina R, son la citolisina o hemilisina, Sustancia de agregación (AS), Gelatinasa, Proteína de superficie de enterococos, Carbohidratos de la pared celular y polisacáridos capsulares. (Velasco, 2001; Ingolf et al 2007¸ Herráez, 2008; Valenzuela et al., 2008; Platero et al., 2009)

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4.1.3.1 Citolisina o Hemolisina La citolisina es una enzima de E. faecalis capaz de destruir células de eucariotes y procariotes, así como a los eritrocitos de humano y de animales como el caballo, la vaca y el conejo. Se considera que dicha sustancia desempeña un papel importante durante la primera fase de la infección por enterococos la cual, aún cuando es asintomático, implica la penetración bacteriana en los tejidos intestinales humanos, así como una toxemia y cierto daño tisular que antecede a la segunda fase, en la que ocurre la manifestación de los principales síntomas. (Herráez, 2008; Ingolf et al., 2007) La citolisina desempeña relevantes funciones patogénicas: actúa como toxina, provocando la ruptura del sistema membranoso de los glóbulos rojos y de diversas células humanas. Los mecanismos implicados en el daño tisular son desconocidos, pero es probable que esta proteína induzca la liberación de mediadores inflamatorios a partir del tejido dañado o de las células fagocitarias y de esta manera contribuya a la severidad del proceso inflamatorio. (Velasco et al., 2001; Valenzuela et al., 2008) 4.1.3.2 Sustancia de agregación (AS) Esta sustancia tiene un papel decisivo en la patogenia; esta es una proteína superficial, cuya presencia incrementa la adherencia e internalización enterocóccica en los macrófagos, interaccionan con las integrinas CD11b, CD18 y CR3, presentes también en otras células de defensa del humano. (Herráez, 2008; Valenzuela et al., 2008; Platero et al., 2009) En general, las principales funciones que desempeña la sustancia de agregación AS, son las siguientes:

- Potenciación de la conjugación de plásmidos. - Adhesión a los tejidos del hospedero. - Internalización y la supervivencia en los fagocitos.

Potenciación de la conjugación de plásmidos. Una de las características más importantes del género Enterococcus sp radica en la eficacia con la que lleva a cabo la conjugación plasmídica; el proceso inicia cuando un clon que actúa como potencial receptor libera al medio ciertos péptidos, denominados feromonas, que promueven la aproximación de enterococos hacia ella y la secuencial transferencia de diversos plásmidos provenientes de las células bacterianas capaces de actuar como donadoras. (Rodríguez, 2001; Sanidad y Seguridad Social, 2002; Valenzuela et al., 2008) Adhesión a los tejidos del hospedero. Este es un factor de gran importancia por su capacidad de adhesión, para que se produzca la colonización de la bacteria. Esta requiere de la presencia de estructuras de la pared bacteriana denominadas adhesinas que son el primer paso en la producción de la infección, le permite unirse a receptores específicos de las células epiteliales, es de naturaleza peptídica, ya que se encuentran en unas estructuras llamadas pilis o fimbrias que realizan la adhesión a unos receptores de membrana y la infección resultará si los microorganismos son llevados a sitios donde los mecanismos defensivos del huésped no los eliminen. (Rodríguez, 2001; Valenzuela et al., 2008)

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Promoción de la internalización y la supervivencia en los fagocitos En las numerosas infecciones endógenas debidas a enterococos, es determinante el papel de los macrófagos, los cuales suelen actuar como vehículos responsables de la translocación del microorganismo, desde el intestino hasta el sistema linfático o el torrente circulatorio del individuo involucrado. (Velasco et al., 2001) 4.1.3.3 Gelatinasa Es una enzima capaz de degradar a la gelatina, caseína, hemoglobina y a ciertos péptidos bioactivos, incluidas las feromonas quimiotácticas de E. faecalis, las cuales promueven la llegada de neutrófilos a los tejidos colonizados por el microorganismo; una de las posibles funciones de esta proteasa podría consistir en modificar, junto con las feromonas quimiotácticas, la defensa del hospedero, induciendo alternativamente la ausencia o la acumulación de leucocitos en los tejidos colonizados. (Platero et al., 2009) 4.1.3.4 Proteína de superficie de enterococos La proteína de superficie extracelular de Enterococos, es una adhesina que se describió inicialmente en E. faecalis MMH594, una cepa muy virulenta y resistente a la gentamicina. (Herráez, 2008) 4.1.3.5 Carbohidratos de la pared celular y polisacáridos capsulares Son componentes de las cápsulas bacterianas que juegan un papel importante en la patogenia de las enfermedades infecciosas, ya que debido a su complejidad y a su capacidad para conferir resistencia a la fagocitosis pueden intervenir en los procesos de evasión del sistema inmunitario del hospedador. (Herráez, 2008) Por último, diversos estudios in vitro han demostrado que las adhesinas enterocóccicas más destacadas corresponden a proteínas, ácidos lipoteicoicos de la pared celular y uno o más carbohidratos superficiales. Cuando el microorganismo ya ha realizado el proceso de adherencia, puede invadir otras regiones e ingresar al sistema linfático o a la circulación sanguínea, lo que provoca diversas alteraciones patológicas, muchas de estas inician con severas respuestas inflamatorias, e inclusive, con la participación de enzimas y toxinas enterocóccicas.(Velasco et al., 2001; Platero et al., 2009). 4.1.4. Mecanismos de resistencia a antimicrobianos Microorganismos del género Enterococcus, son intrínsecamente resistentes a varios antibióticos empleados para tratar infecciones humanas como cefalosporinas, vancomicina, penicilinas, quinolonas, clindamicina, trimetoprim y sulfametoxazol. Además de esta resistencia intrínseca, los enterococos han adquirido resistencia a muchos otros antibióticos, tanto por mutaciones como por su elevada capacidad de adquirir material genético externo mediante la transferencia de plàsmidos o trasposones. (Johnston y Jaykus, 2004; Albornoz et al., 2005) Los enterococos intercambian genes de resistencia entre miembros de su mismo género y con cepas de otros géneros, incluyendo bacterias Gram positivas y Gram negativas. (Mundy, 2000; Herráez, 2008)

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Los enterococos desarrollan resistencia glicopéptidos como la vancomicina alterando los precursores peptidoglucanos de la pared celular bacteriana, de manera que la vancomicina no se puede unir a ellos y por lo tanto no puede inhibir la síntesis de la pared bacteriana. Existen varios fenotipos de resistencia a la vancomicina como los son VanA, VanB, Van B2 y VanC (Devriese et al., 1996; Manson et al., 2003; Albornoz et al., 2005; Platero et al., 2009) Al menos los cuatro fenotipos de resistencia a glicopèptidos en este género bacteriano son definidos por el nivel de resistencia a vancomicina, la expresión de la resistencia constitutiva o inducible, la capacidad de ser transferida por conjugación, codificación plasmídica o cromosòmica y producción o no de proteínas de membrana. (Márquez, 1995; Herráez, 2008; Fisher y Phillips, 2009) Van A es el fenotipo que presenta mayor relevancia clínica al ser codificado por un transposón, que habitualmente está integrado en plásmidos, puede diseminarse entre los Enterococcus sensibles; el Van B, los Enterococcus de este fenotipo son resistentes a Vancomicina, entre las cepas con mayor grado de resistencia es posible que pertenezcan a este fenotipo o bien a un grupo heterogéneo de genes VanB. La resistencia es transferida por conjugación y su presencia no está asociada a plásmidos y el fenotipo VanC presenta moderada resistencia a vancomicina. (Mac et al., 2003; Platero et al., 2009) 4.2 IMPORTANCIA CLÍNICA A pesar de ser Enterococcus reconocido como habitante normal de tracto gastrointestinal, es también reconocido su papel patógeno tanto en animales como en humanos en algunas patologías específicas. 4.2.1 Implicación clínica en mastitis bovina La mastitis bovina es una patología donde se refleja una reacción inflamatoria de la glándula mamaria, que produce alteraciones físicas y químicas en la leche, aumento del número de células somáticas por la presencia de microorganismos patógenos y pérdida de la funcionalidad. La inflamación sucede como consecuencia de la respuesta de los tejidos a lesiones traumáticas, a sustancias irritantes, a la presencia de agentes infecciosos y/o a las toxinas que ellos secretan en el tejido. (Corbellini, 1998; Scaramelli y González, 2005; Cruz, 2007; Calderón y Rodríguez, 2008) Desde el punto de vista de su signología, la mastitis se divide en clínica y subclínica. En la mastitis clínica, el cuarto afectado se inflama, hay dolor, edema, la leche presenta coágulos y grumos, se vuelve amarilla o rojiza por la presencia de pus o de sangre; en casos severos hay aumento de la temperatura y del pulso, decaimiento, pérdida del apetito y baja de la producción. Los casos clínicos de mastitis se pueden definir según su gravedad en mastitis clínica ligera, mastitis clínica moderada y mastitis severa. (Scaramelli y González, 2005; Calderón y Rodríguez, 2008) La forma subclínica es la forma más frecuente e importante de esta enfermedad y se caracteriza por la ausencia de signos clínicos en la ubre y por la apariencia normal de la leche. Se debe siempre recurrir a pruebas diagnósticas especiales; además, la presencia sobre el rebaño es de orden multifactorial, donde se unen factores que tienen que ver con el animal, relacionados con el agente causal y factores ambientales y de manejo donde se incluye el ordeño que es determinante en la aparición de la enfermedad. El mayor efecto económico se da en las formas subclínicas, donde los diferentes microorganismos aumentan el número de las células somáticas, trayendo como consecuencia una disminución de la producción láctea. (Velasco et al., 2001; Lukasova y Sustackova, 2003) La inflamación se caracteriza por un aumento de los leucocitos y NaCl en la leche, este aumento de los leucocitos puede ser detectado por le método de California Mastitis Test. (Cuesta et al, 1997) Su diagnóstico se realiza a partir de la manifestación

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de una relación sodio-potasio aumentada en la leche y un aumento de la concentración de interleuquina-8 (IL-8), cuando no hay mastitis clínica, el aumento de los niveles de sodio e IL-8 indican que está ocurriendo una respuesta inflamatoria, a pesar de la ausencia de signos clínicos. (Lasarte, 2000; Castillo et al., 2007) Con base en su etiología infecciosa, los patógenos causantes de la mastitis bovina se han clasificado en contagiosos, ambientales y oportunistas, de acuerdo con su origen y forma de transmisión. Patógenos contagiosos como Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Corynebacterium bovis y Mycoplasma bovis; tienen su reservorio en la glándula mamaria y la leche de vacas infectadas, su transmisión puede ocurrir en el momento del ordeño por prácticas como el uso compartido de toallas para lavar y secar las ubres o por medio de las manos contaminadas de los ordeñadores o por el uso de pezoneras no desinfectadas entre vacas en los ordeños mecánicos; los patógenos ambientales son microorganismos Gram negativos, habitantes normales del ambiente como, Escherichia coli, Klebsiella sp, Enterobacter sp, Serratia sp, Pseudomonas sp y Proteus sp, algunas bacterias Gram positivas como: Streptococcus uberis, Streptococcus dygalactiae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium y patógenos oportunistas, Staphylococcus hycus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hominis, Staphylococcus intermedius y muchas otras especies de estafilococos, que forman parte de la flora normal de la piel. (Machota et al, 2002) Los estreptococos y enterococos que habitan en las vacas y en el ambiente como Streptococcus uberis, Streptococcus dygalactiae, Streptococcus bovis, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, entre otros, pueden causar cuadros subclínicos y también clínicos de diferente intensidad, desde leves hasta agudos. ( Scaramelli y González, 2005; Calderón y Rodríguez, 2008) La mastitis, particularmente subclínica, es la más persistente y más común del grupo de enfermedades de importancia económica en ganado de leche. Ocurre frecuentemente y puede conducir a grandes pérdidas económicas debido al reducido rendimiento de leche y multas a causa de los elevados recuentos de células somáticas presentes en los tanques de leche. Algunas pruebas utilizadas para el diagnóstico de mastitis bovina se encuentran registradas en la tabla a continuación.

Tabla1. Pruebas diagnósticas utilizadas para la detección de mastitis

Prueba diagnóstica Fundamento

Prueba California Mastitis Test (CMT)

Es una prueba realizada en campo, que detecta el estado de salud de la ubre mediante la estimación gruesa del contenido de las células somáticas. Se basa en la gelificación que tiene lugar cuando el ADN es liberado de las células somáticas presentes en la leche por la acción de un detergente aniónico como el alkyl-aril-sulfonato de sodio en la paleta que contiene 4 compartimentos; por tanto, a mayor contenido celular de la leche mayor gelificación. (Scaranelli y González, 2005 y Mellenberger y Roth , 2000)

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Prueba de Hotis

Esta prueba se realiza en el laboratorio, se utiliza como un examen visual que consiste en revelar la presencia de microorganismos que fermentan la lactosa al agregar a 9 ml de leche 0.3 ml de púrpura de bromocresol 9%, si están presentes el color de esta mezcla vira a amarillo esto se debe a una disminución de pH en la solución y la reacción es negativa cuando no hay cambios o adquiere una coloración grisácea con o sin sedimentos. (Figueroa et al., 2000)

4.2.2 Importancia clínica en humanos

Por formar parte de la flora intestinal los enterococos son capaces de producir infecciones en pacientes ambulatorios y hospitalarios, anteriormente se pensaba que la mayoría de las infecciones causadas por este tipo de microorganismo eran endógenas; sin embargo, la mayoría de las infecciones ocurren en pacientes hospitalizados o bajo tratamiento de diálisis en los cuales el agente es exógeno, encontrándose el microorganismo en el medio ambiente o en las manos del personal hospitalario. En algunos países ocupa el segundo o tercer lugar en frecuencia como causa de infección nosocomial. (Rodríguez, 2001) Los enterococos han sido aislados de infecciones del tracto urinario, bacteremia y endocarditis, infecciones pélvicas, abdominales y de heridas sobreinfectadas como lo ha reportado una investigación hecha por la dirección general de salud pública de Catalunya.( Departamento de Sanidad y Seguridad Social, 2002) Se han encontrado en heridas quirúrgicas de tejidos blandos y bacteremias; ocasionalmente se aisla del liquido pleural y del líquido cefalorraquídeo, la infección puede ser mucho más severa en pacientes inmunosuprimidos (Ospina et al., 2000; Machota et al., 2002). El atributo más sorprendente de los enterococos es su resistencia relativa y absoluta a los antimicrobianos de uso más común en las infecciones por Gram positivos. 4.2.3 Implicaciones zoonóticas

La presencia de Enterococcus faecalis y Enterococcus faecium en leche es indicativa de contaminación fecal y reflejo de condiciones higiénico sanitarias de producción deficientes. Situación que no ha limitado el empleo de la leche cruda en la elaboración de más del 50% de queso blanco que se consume en el país. (Reyes et al., 2002) Todos estos problemas son derivados de mal manejo sanitario, de la deficiencia en las prácticas ganaderas y de manejo e higiene de la unidad de explotación o empresa pecuaria. Investigaciones han atribuido a alimentos muy contaminados con enterococos, casos y brotes de intoxicaciones alimentarías presentándose nauseas intensas, cólicos abdominales, diarrea, entre otros; sin embargo, ha sido complicado demostrar su implicación, indicándose una asociación sinérgica con otro microorganismo. (Facklam, 2002; Giraffa, 2002) Enterococcus sp, es un agentes que puede transmitirse a los humanos a través del contacto directo o mediante el consumo de productos y subproductos lácteos entre otros alimentos, afectando directamente la salud del consumidor; otros problemas en la salud humana que han adquirido importancia son las intoxicaciones alimentarias y la transfencia de genes o plásmidos de resistencia a antibióticos de estos a otros microorganismos complicando así un futuro tratamiento antibiótico frente a otro tipo de infecciones. Adicionalmente, son productoras de

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aminas biógenas, que están implicadas en las intoxicaciones alimentarias por el consumo de alimentos fermentados como el queso; los síntomas son aumento del ritmo cardiaco, de la respiración y de la presión sanguínea, además son responsables de la migraña que se produce después del consumo de este alimento. (Muñoz et al., 2008; Platero et al., 2009) Por dichas implicaciones en salud pública, este grupo de microorganismos deben ser tenido en cuenta dentro del control de calidad de productos de consumo como alimentos y bebidas fermentadas tales como el queso, la leche, cerveza, vinos entre otros. (Giraffa, 2002) 4.3 DIAGNÓSTICO 4.3.1 Aislamiento y Medios de cultivo Estas, son bacterias cuyas necesidades nutricionales son fácilmente suministradas en medios de cultivo con peptona y extracto de levadura como el agar BHI y Columbia con sangre para el aislamiento primario, la mayoría de las especies producen colonias visibles luego de una incubación de 24 horas a 37 °C en aerobiosis. Dado que su metabolismo es exclusivamente de tipo fermentativo, crecen también en condiciones de microaerofilia o anaerobiosis, aunque algunas especies crecen mejor en atmósfera enriquecida con CO2. (Machota et al., 2002) Su aislamiento es sencillo, si se parte de muestras clínicas como orina y exudados, cuando se trabaja con muestras intestinales es necesario utilizar medios de cultivo selectivos, para lo cual se aprovecha la capacidad que tienen de crecer en condiciones adversas utilizando agentes como sales biliares, colorantes y antibióticos; existen más de 60 medios selectivos diferentes basados en estas características, como el medio de Slanetz y Barley o el caldo con kanamicina y esculina (Machota et al., 2002). Por otra parte, los enterococos se han aislado de numerosos alimentos, entre los que se incluyen la leche y sus subproductos, embutidos crudos, vegetales, aceitunas negras y pescado. (Lara, 1998) Algunos de los medios de cultivo utilizados para el aislamiento e identificación del género Enterococcus se observan en la tabla a continuación

Tabla 2. Fundamento de los medios de cultivo utilizados para detección de Enterococos spp.

Medio de cultivo Fundamento

Agar Kanamicina Esculina Azida (KAA), y caldo

canamicina esculina azida

El medio líquido se utiliza para la detección presuntiva de Enterococos y el medio sólido permite la detección confirmativa, hidrolizan la esculina con la producción de glucosa y esculetina, la cual reacciona con el amonio hierro (III) citrato para dar un complejo de color variable entre el verde y el negro. (Panreac química S,A. 2003)

Agar selectivo para Enterococos ( para filtración por

membrana) SLANETZ Y BARTLEY ( base) o Enterocococsell Agar con Vancomicina

La Azida de sodio inhibe el crecimiento de los microorganismos Gram-negativos, los Enterococos reducen el 2, 3, 5 Trifenil- 2H-Tetrazolio Cloruro (TTC) produciendo un precipitado rojo insoluble ya que se reduce en el interior de la célula bacteriana, lo que resulta en la producción colonias de color rojo ladrillo, la peptona proporciona nitrógeno, minerales y aminoácidos, el extracto de levadura es la fuente de vitaminas, la dextrosa es la fuente de carbono, el fosfato dipotásico actúa como un amortiguador para el medio, la Vancomicina es un antibiótico de espectro restringido fundamentalmente a bacterias gram positivas actúa a nivel de la biosíntesis de la pared

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celular inhibiendo la síntesis del peptidoglicano, la resistencia intrínseca de bajo nivel en los enterococos usualmente se debe a la presencia de genes vanC ya que estos inhiben la unión de la vancomicina al microorganismo. (Merck,1994; Becton, Dickinson and Company, 2003)

Caldo Hewitt Broth

Updyke y Nickle, basándose en trabajos, modificaron el medio para obtener crecimientos de Estreptococos ß-hemolíticos contiene una alta concentración de sustancias proteicas,. ( Panreac química S.A. 2003)

EVA (azida y violeta de etilo)

Medio específico para los Enterococos ya que no se producen crecimientos de bacilos Gram-positivos ni cocos Gram-negativos, la presencia del Sodio Azida y el Violeta de Etilo hacen de este un medio selectivo, la mezcla de peptonas constituye el elemento nutritivo y la Glucosa la fuente energética. los fosfatos hacen las funciones de regulación del pH y el Sodio Cloruro le da la salinidad necesaria para mantener el equilibrio osmótico, el ajuste de la concentración de Violeta de Etilo es crítico para el buen crecimiento de los Enterococos y la inhibición del resto de los microorganismos, la Glicerina según algunos autores facilita la fermentación de la glucosa por los Enterococos (Merck,1994)

Agar métodos estándar (APHA)

Medio para el recuento en placa en leches y sus derivados, la composición del medio basada en la peptona de caseína como aportación nutritiva, el extracto de levadura como sustrato vitamínico y la glucosa como fuente energética, favorece el crecimiento de la mayor parte de los microorganismos, sin precisar de otros aditivos. (Panreac química S.A. 2003)

Agar MRS Y caldo MRS

La presencia de la peptona, glucosa, manganeso y magnesio se aportan los componentes nutritivos y energéticos para el crecimiento de los Lactobacilos., el di-Amonio Hidrógeno Citrato inhibe el crecimiento de la mayor parte de gérmenes contaminantes, el di-Potasio Hidrógeno Fosfato se emplea para estabilizar el pH del medio, mientras que el Tween constituye su fuente de ácidos grasos. (Merck,1994)

Agar sal y manitol

El efecto inhibidor se debe a la alta concentración de Sodio Cloruro del medio. Con la fermentación de la D(-)-Manita se genera ácido que ocasiona el viraje del rojo de fenol al amarillo, permitiendo así una mayor claridad en el momento de establecer el diagnóstico, ya que la mayoría de los Estafilococos patógenos fermentan este azúcar. ( Panreac química S.A. 2003)

Vancomycin screen agar

La infusión de corazón permite el cultivo de una amplia variedad de microorganismos. La infusión de carne y peptonas son las fuentes de nitrógeno orgánico, carbón, azufre y vitaminas. La dextrosa es la fuente de carbohidratos. El medio tiene como solución buffer el fosfato disódico y la vancomicina esta en una concentración de 6 µ/mL que es usado para determinar la resistencia a este antibiótico. (Becton, Dickinson and Company, 2003)

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4.3.2 Identificación La identificación de este tipo de bacteria de origen clínico, presenta pocas dificultades ya que Enterococcus spp son cocos gram positivos, catalasa negativos, oxidasa negativos debido a que carecen de citocromo oxidasa y con un metabolismo homofermentativo por lo que producen acido láctico como producto final de la fermentación de la glucosa, sin formación de gas. El fundamento de algunas de las pruebas bioquímicas utilizadas para la confirmación de Enterococcus sp se encuentran registradas en la tabla a continuación:

Tabla 3. Fundamento de las bioquímicas utilizadas para la detección de Enterococcus spp

Pruebas reportadas Fundamento

Prueba de catalasa

El peroxido de hidrogeno se utiliza como reactivo para la prueba de la Catalasa. La catalasa es una enzima propia de la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que poseen citocromos, con la excepción de Estreptococos. Su función es descomponer el Peróxido de Hidrógeno (H2O2) desprendiendo oxígeno libre. La catalasa también se determina en organismos anaerobios. ( Panreac química S,A. 2003)

Prueba Bilis esculina

Se basa en la capacidad de los Estreptococos del grupo D y de los Enterococcus para crecer en un medio de cultivo que contiene 40% de bilis y de hidrolizar la esculina a esculetina; esta se combina con el citrato ferroso que posee el medio, dando un complejo de color negro. Esta se prueba se realizara sembrando en superficie tubos de agar bilis esculina inclinado y su interpretación positiva se muestra con ennegrecimiento del medio. (Rodríguez, 2001)

Prueba de tolerancia al NaCl

Se basa en la capacidad de los enterococos de crecer en una concentración de 6.5% de NaCl. Se trata de un medio de cultivo líquido que contiene además de NaCl, glucosa y un indicador de pH: púrpura de bromocresol. Esta prueba se realizará inoculando en el cado salado la cepa a estudiar y se incubara 18-24 horas a 35 °C. En la interpretación de los resultados, se considera una prueba positiva cuando aparece turbidez con o sin solidificación del medio, que se observara como un viraje de color del púrpura al amarillo. La no aparición de la turbidez indica una prueba negativa. (Rodríguez, 2001)

Se pueden presentar algunas dificultades en cuanto a la identificación de los enterococos en su diferenciación con el genero Streptococcus, los estreptococos son bacterias con necesidades

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nutricionales más complejas, por ello, producen colonias de tamaño más pequeño que los enterococos cuando las condiciones en cuanto a los medios de cultivo, temperatura, atmósfera y tiempo son iguales y además requieren periodos de incubación de 48 horas. El crecimiento en caldo 6.5 % de cloruro sódico en un intervalo de a 10 y 45 °C y a un pH de 9.6 a una temperatura de 60 °C durante 30 minutos, permiten tener una diferenciación respecto a estos dos géneros bacterianos, muchos medios de cultivo selectivos incorporan sales biliares y esculina, ya que los enterococos tienen la capacidad de hidrolizar la esculina en presencia de sales biliares, esta propiedad solo la comparten los estreptococos del grupo D de Lancefield. (Machota et al., 2002) 4.4 TRATAMIENTO PARA EL HUMANO Y LA MASTITIS BOVINA Los enterococos presentan resistencia intrínseca y/o adquirida a muchos antibióticos como clindamicina, cefalosporinas y aminoglucósidos entre otros; por ello aún se encuentran en estudio fármacos que puedan tratar la infección de este microorganismo. Las especies de Enterococcus sp son generalmente sensibles a vancomicina, antibiótico que se utiliza en procesos clínicos, aunque en la última década se ha comprobado un importante cambio en los patrones de sensibilidad de estas bacterias, ya que se ha empezado a detectar resistencias a la vancomicina, producción de ß-lactamasas y resistencias de alto nivel a los aminoglucósidos. (Devriese et al., 1996; Vanderlinder, 2008; Houben, 2003) A fines de la década de 1980 fue descrita en Europa la resistencia a la vancomicina único antimicrobiano útil frente a las cepas resistentes a otros fármacos” causando desde entonces impacto en otras partes del mundo. El tratamiento de las infecciones enterocócicas es complicado, tanto por los patrones especiales de sensibilidad o resistencia que ellos exhiben, como por la necesidad de pruebas de estudio de la sensibilidad especiales para demostrar su verdadera susceptibilidad “in vitro”. (Rodríguez, 2001; Palavecino, 2001) Por otra parte, una terapia antibacterial para tratar la mastitis bovina consiste en la terapia de “la vaca seca”, esta hace parte de un sistema de dirección recomendado para reducir el nivel de infecciones intramamarias y prevenir nuevas infecciones durante el periodo seco. También se estima la importancia para prevenir esta enfermedad en hembras bovinas, mediante prácticas de desinfección, secado y sellantes; medidas higiénicas de manejo en los equipos de ordeño y en el ambiente en que se encuentran los animales, antes de llegar a un tratamiento antibiótico, ya que la mayor consecuencia del abuso de los antibióticos incluye el desarrollo de resistencia antibiótica en la flora bacteriana de los animales y las poblaciones humanas con un aumento del riesgo de residuos antibióticos en los alimentos entre ellos la leche. Por consiguiente, algunos países han adoptado el uso selectivo de la terapia de la vaca seca, en ciertas vacas o algunos cuartos. 4.5 CONTROL Y PREVENCIÓN DE LAS INFECCIONES POR Enterococcus sp Aunque hasta el momento no se han reportado importantes infecciones de mastitis bovina producida por Enterococcus Vancomicina Resistentes (Enterococcus sp VanR), dentro de los principios para el control de este microorganismo en esta enfermedad, es importante tener en cuenta: Eliminar las infecciones existentes, prevenir las infecciones nuevas y controlar el estado de salud de las ubres. Entre los factores importantes para el control de la mastitis se incluyen: Utilizar métodos de ordeño e higiene apropiados, utilizar instalaciones, función y mantenimiento adecuado del equipo de ordeño, tener un manejo adecuado de las vacas en periodo seco, terapia apropiada de la mastitis durante la lactancia, desechar las vacas infectadas crónicamente, desinfección de los pezones antes o después del ordeño, mantener un ambiente limpio y apropiado, tener un buen registro de datos, controlar el estado de salud de las ubres y

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mantener una revisión periódica del programa de manejo de la salud de la ubre. (Meglia y Mata, 2001; Wellenber et al., 2002; Vanderlinder, 2008) Los antisépticos y desinfectantes compuestos por amonio cuaternario tienen una gama amplia de aplicaciones veterinarias y juegan un papel importante en control de enfermedades infecciosas en los animales. En la industria lechera se usan normalmente para la desinfección del equipo de ordeño y en la desinfección del pezón para prevenir la mastitis infecciosa. Se ha demostrado que la desinfección de los pezones después de ordeñar, reduce la incidencia de la mastitis, causada por los microorganismos. La desinfección de las ubres es un componente importante en el control de la mastitis. (Aarestrup y Hasman, 2004; Vanderlinder, 2008)

5. MATERIALES Y METODOS

5.1 Ubicación Geográfica Se recolectaron muestras de leche directamente de bovinos y de cantina en 3 fincas lecheras ubicadas en la Sabana de Bogotá (Hato 1: Mosquera, Hato 2: Soacha y Hato 3: Tocancipá);. Adicionalmente, en dos plantas procesadoras de productos lácteos ubicadas en Bogotá, se obtuvieron muestras de queso tipo pera elaborado con la leche de los bovinos muestreados en campo. Las muestras de leche y los quesos tipo pera, fueron transportados en condiciones de refrigeración, posteriormente fueron procesados y analizados en los laboratorios de la Pontificia Universidad Javeriana (Sede Bogotá).

5.2 Población Al total de la población de hembras para ordeño, se les realizó la prueba CMT con el fin de identificar los animales que presentaban algún grado de mastitis; la selección se estableció de acuerdo con la interpretación por espesamiento de la mezcla cuando y subsecuente formación de gel, debido a la presencia promedio de 200 000 cel somáticas /ml de leche, lo determina que existe algún grado de mastitis en el cuarto del animal. ( Mellenberger y Roth, 2000; Ramírez et al., 2001).

Figura 1. Prueba de California Mastitis test. A.Reactivo de CMT; B. Paleta que contiene la leche y el reactivo, C. Mastitis subclinica grado III

Se recolectaron 62 muestras de leche de los cuartos afectados de hembras productoras no tratadas con terapia antibiótica, las cuales habían sido previamente diagnosticadas por California mastitis test (CMT) como positivas para mastitis subclínica grado III.

A B C

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Se obtuvieron al azar 100 muestras de queso tipo pera procesados con la leche obtenida de las hembras muestreadas. 5.3 Obtención de Muestras 5.3.1 Muestras de leche A partir de los animales que presentaron algún grado de mastitis se obtuvieron 62 muestras de leche provenientes directamente del animal por ordeño manual (Hato 1: 11, Hato 2: 29 y Hato 3: 22) con las respectivas medidas de asepsia durante el procedimiento. Para la obtención de las muestras se descartaron los primeros chorros y luego se recolectó en tubos de ensayo. Se tuvo en cuenta que la realización del procedimiento cumpliera con las medidas de asepsia y bioseguridad apropiadas.

Figura 2. Toma de muestras por ordeño manual

Adicionalmente se tomaron 22 muestras de cantina (Hato 1: 8, Hato 2: 2 y Hato 3: 12). Los tubos fueron rotulados, identificados y transportados en condiciones de refrigeración, se procesaron en un periodo no mayor a 5 horas. (Castañeda et al., 2000) 5.3.2 Derivados lácteos Se eligieron al azar 100 muestras de queso tipo pera, procesados con la leche obtenida de las hembras muestreadas en las fincas analizadas. Las muestras de queso obtenidas de la planta 1 fueron procesadas con leche del hato 1 y 2 y las de la planta 2 con la leche del hato 3. Estas muestras fueron suministradas por el productor y se obtuvieron en su empaque original por ser producto final para consumo y comercialización. Cada muestra fue debidamente identificada y transportada en condiciones de refrigeración, se procesaron en un periodo no mayor a 5 horas. (Castañeda et al, 2000)

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5.4 Procesamiento de muestras 5.4.1 Muestras de leche 5.4.1.1 Prueba de Hotis: Esta prueba fue realizada a 62 muestras de leche provenientes directamente del animal diagnosticados con mastitis subclínica grado III y a 22 muestras de cantina. A 9.5 ml de leche se le adicionaron 0.5 ml de solución de púrpura de bromocresol al 9%, se incubó a 37°C por 24H, posteriormente se evaluaron cambios como proteólisis y/o acidificación. (Castañeda et al., 2000). 5.4.1.2 Aislamiento e identificación: Los tubos de la prueba de hotis fueron sembrados en agar BHI con sangre 5%, MacConkey y Enterocococsell con vancomicina, se incubaron a 37 °C por 48 horas; se realizaron aislamientos e identificación bioquímica a los diferentes microorganismos encontrados.( Wegene et al., 1997; Armenteros et al., 2006) Las colonias presuntivas para Enterococcus vancomicina Resistente (vanR) fueron evaluadas mediante tinción de Gram y pruebas de identificación bioquímica como catalasa, tolerancia a NaCl 6.5 % e hidrólisis de la esculina. 5.4.1.3 Pruebas de Sensibilidad Antimicrobiana: Se realizaron pruebas de sensibilidad antibiótica por el método de difusión Kirby Bauer a 33 microorganismos clínicamente importantes en el proceso de mastitis bovina (Streptococcus γ hemolítico, Streptococcus α hemolítico, Pseudomonas sp, Staphylococcus aureus, Klebsiella sp, E. coli hemolítica, E.coli y Enterococcus sp) , para esto se realizó una suspensión en solución salina fisiológica a la concentración del patrón 0.5 de MacFarland; los antibióticos utilizados fueron cefoperazona, tetraciclina, ciprofloxacina, streptomicina, timetropim sulfa, metronidazol y amoxacilina + ac clavulánico. La incubación se realizó a 37º por 24h. (Reyes et al., 2002; Scaranelli y González, 2005) y la lectura se determinó midiendo el diámetro de inhibición para cada microorganismo y antibiótico. (Chockalingam et al., 2007) 5.4.2 Procesamiento de leche de Cantinas: La leche de cantinas fue inoculada en medios agar BHI con sangre 5%, MacConkey y Enterocococsell con vancomicina, se incubaron a 37 °C por 48 horas. Posteriormente, se realizó aislamiento e identificación bioquímica a las diferentes colonias y las presuntivas para Enterococcus sp VanR fueron evaluadas mediante tinción de Gram y pruebas para identificación bioquímica como catalasa, tolerancia a NaCl 6.5 % e hidrólisis de la esculina. 5.4.3 Derivados lácteos A partir de las muestras de queso tipo pera se evaluaron características organolépticas como: color, olor y textura una semana después de procesado el producto y una semana posterior a la fecha de vencimiento incluida en el empaque. Se realizaron diluciones 1/10 en agua bufferada, posteriormente se adicionó a la superficie de las cajas de agar enterocococsell con vancomicina 100 µl de la dilución, se incubó a una temperatura de 37 °C durante 24 a 48 horas, para determinar ausencia/presencia del microorganismo. (Reyes et al, 2002)

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5.5 Análisis Estadístico Los resultados fueron analizados mediante estadística descriptiva, organizados y representados a través de tablas e histogramas.

6. RESULTADOS Y DISCUSION

Para evaluar el estado de salud de la ubre, se realizó la prueba de California Mastitis Test, esta se basa en la gelificación del ADN cuando es liberado de las células somáticas presentes en leche a consecuencia de la respuesta inmune y/o inflamación. (Scaranelli y Gonzales, 2005 y Rojas, 2009) En este estudio se evaluaron un total de 62 muestras de animales con mastitis subclínica grado III, en ninguno de los hatos se presentaron animales con mastitis clínica. 6.1 Aislamiento e Identificación de microorganismos en muestras de leche Aunque la identificación de microorganismos diferentes a Enterococcus sp VanR no fue objetivo propuesto para el trabajo, los medios de cultivo utilizados permitieron la identificación de otros microorganismos importantes asociados con mastitis bovina. A partir de las 62 muestras analizadas, se presentó un 1.6 % (n=1) de muestras positivas para Enterococcus sp VanR, que corresponde a la presencia de menor positividad en comparación con los demás aislamientos obtenidos en el estudio, confirmando con esto que no es un agente etiológico en el proceso de mastitis en las fincas evaluadas. La mayoría de aislamientos correspondieron a Streptococcus γ hemolítico 33.8% (n=21) y Streptococcus α hemolítico (Esculina negativa y NaCl 6.5% negativo) 29% (n=18), Escherichia coli 9.7% (n=6), Staphylococcus sp 8.1% (n=5) y con en menor porcentaje Pseudomonas sp 6.5% (n=4), Streptococcus β hemolítico 4.8% (n=3) Staphylococcus aureus 3.2% (n=2) y unas pocas para Escherichia coli hemolítica 1.6% (n=1) y Bacillus sp 1.6% (n=1) como lo muestra la figura 3. Estos resultados coinciden con lo reportado por Contreras y Ordoñez, 1995 en un estudio bacteriológico de muestras de leche realizado en el Valle de Ubaté, ya que no muestran ninguna implicación del Enterococcus sp en la mastitis bovina, en aquel estudio se encontraron microorganismos correspondientes en mayor porcentaje a S. agalactiae, S. aureus y cepas de Staphylococcus sp diferentes a S. aureus como agente etiológico de la mastitis bovina (Armenteros et al.,2006; Chockalingam et al. 2007) La presencia de Enterococcus sp, es poco frecuente en animales; pero se corrobora que existen diferentes tipos de aislamientos de interés clínico implicados en la enfermedad. (Castañeda et al., 2000 y Chockalingam et al., 2007) En reportes por Araya et al., 2005, Hariharan et al., 2004 y Lukosova et al., 2003, se reconocen a Staphylococcus sp y Streptococcus sp como microorganismos importantes en procesos de mastitis bovina, también considerados mayoritarios y altamente contagiosos causantes de mastitis subclínica. (Castañeda et al., 2000)

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Figura 3. Muestras de leche directamente del animal de todas las fincas N: 62

Streptococcus γ y α hemolítico fueron los microorganismos que se aislaron con mayor frecuencia en los hatos estudiados, especialmente Streptococcus γ hemolítico en los hatos 2 y 3 con 48.3 % (n=14) y 31.8 % (n=7) respectivamente y Streptococcus α hemolítico en el hato 1 con 63.6% (n=7) y en el 2 con 34.5% (n=10), por presentar la mayor positividad en comparación con los demás aislamientos, es posible considerarlo como el agente etiológico más frecuentemente aislado en casos de mastitis bovina y responsable de la mastitis subclínica en las fincas analizadas, resultados que concuerdan con una investigación reportada por Contreras, 2008 y Rojas, 2009. Es considerado como un patógeno contagioso de la glándula mamaria que penetra luego se adhiere y por último invade los tejidos, según los reportes, la forma de trasmisión se da principalmente durante la práctica de ordeño, permitiendo la diseminación de las bacterias de glándulas infectadas a glándulas sanas, estas una vez alcanzan el interior de la glándula mamaria pueden ocasionar taponamientos con obstrucción al desplazamiento de la leche. (Barrón et al., 2003; Odierno et al., 2005, Armenteros, 2006; Takeshima et al., 2008) Otro microorganismo de importancia fue Escherichia coli presentado en mayor proporción en el hato 3 con un 27.3% (n=6), ha sido reportado por Jurado, 2003 y Armenteros et al., 2006, como el agente más frecuentemente aislado en mastitis subclínica, es un patógeno hallado entre el 20 y 40% de los casos de mastitis y que además causa la muerte del animal en dosis muy altas; este microorganismo infecta el pezón del animal penetrando y multiplicándose en la cisterna de la ubre, por su toxicidad y capacidad inductora de citoquinas inflamatorias genera en el animal diferentes síntomas inflamación del cuarto afectado, decaimiento, pérdida del apetito, toxemia, anorexia, depresión, temblores, fiebre (40 –42ºC),taquicardia, taquipnea, fluidos cerosos con pequeños grumos amarillentos entre otros, lo que conlleva a una pérdida casi total en la producción láctea. (Herrera, 2009; Blum et al., 2008; Takeshima et al., 2008)

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Figura 4. Resultados de muestras de leche tomadas directamente del animal

En el hato 3 se presentó mayor presencia 18.2 % (n=4) en comparación con los otros 2 hatos analizados. De acuerdo con, Taponen y Pyoralla en el 2009, se reportó Staphylococcus sp como un microorganismo frecuentemente aislado de mastitis subclínica, que puede persistir en la glándula mamaria y aumentar el recuento de células somáticas causando así la sintomatología: esta infección se origina patógeno por un ordeño manual o mecánico en malas condiciones sanitarias que puede ser diseminado por el ordeñador o por el equipo de ordeño mecánico, entre la población animal ordeñada. (Rojas, 2009). Otros géneros bacterianos encontrados en este estudio en baja proporción corresponden a Pseudomonas sp, Klebsiella sp y Bacillus sp, con presencia esporádica y origen ambiental; adicionalmente Bacillus sp encontrado en cuadros clínicos de mastitis hemorrágicas y ocasionalmente gangrenosa (Kikuchi, 1995; Herrero et al., 2005; Rojas, 2009). En cuanto a la distribución geográfica de los aislamientos para los hatos estudiados, se estima que las 3 fincas lecheras, presentaron mayores porcentajes para diferentes microorganismos causantes de la enfermedad; esto puede ocurrir posiblemente debido a factores multifactoriales, a las practicas sanitarias empleadas en el momento del ordeño como lo describen previas investigaciones y a posibles condiciones medioambientales como la época de lluvia para la diseminación de estos patógenos como. Algunas imágenes de los aislamientos obtenidos de las diferentes cepas de microorganismos se muestran en la figura 5.

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Figura 5. Aislamientos microbianos en agar sangre, enterocococsell y MacConkey A. Enterococcus sp en agar sangre. B. Enterococcus sp VanR. C.E. coli en agar MacConkey

En resumen, los factores que pudieron incidir directamente en este estudio y que posiblemente se presentaron son: una incorrecta rutina de ordeño, presencia de ambientes contaminados y deficiencias en las principales medidas de control de la mastitis como la higiene del ordeño y tratamiento de los casos clínicos. (Armenteros et al., 2006) 6.2 Pruebas de susceptibilidad a Antibióticos Los resultados obtenidos en las pruebas de sensibilidad a antibióticos a partir de los diferentes microorganismos clínicamente importantes en el proceso de mastitis bovina se encuentran registrados en la tabla 4, donde se puede analizar el comportamiento de los aislamientos frente a los 7 antibióticos evaluados. Existen diferencias considerables para cada microorganismo estudiado; así, el género que presentó mayor sensibilidad fue Streptococcus α hemolítico y quien presentó resistencia a todos los antibióticos con excepción de Amoxacilina + Ac clavulánico fue Escherichia coli. Asimismo, se puede asegurar que según este estudio y a lo reportado por Armenteros et al, 2006, los antibióticos de elección a emplear en los animales de los 3 diferentes hatos lecheros podría ser la cefoperazona y la ciprofloxacina, debido a que la mayoría de los aislamientos bacterianos enfrentados a estos antimicrobianos presentaron alto grado de sensibilidad.

Figura 6. Prueba de sensibilidad antibiótica en muller hinton con y sin sangre. A. Streptococcus alfa hemolítico B. Pseudomonas sp.

Fue importante el perfil de sensibilidad que evidenciaron más del 50% de las bacterias frente a Ciprofloxacina (Streptococcus α hemolítico, Pseudomonas sp, Klebsiella sp y Escherichia coli hemolítica); ya que este antibiótico ha demostrado que en Colombia puede llegar ser una

A B

C A B

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alternativa en el tratamiento contra la infección en bovinos. (Maza et al., 2001; Armenteros et al., 2006). Básicamente para la terapia antibacterial de mastitis bovina se recomiendan ß lactámicos, aminoglucósidos, lincosamidas, macrólidos, tetraciclina, polipéptidos, trimetoprim-sulfonamidas combinadas , quinolonas; la cefoperazona y la ciprofloxacina que corresponden a β lactámicos y quinolonas respectivamente son el tratamiento de elección por los hallazgos del presente estudio y lo reportados por Castañeda et al., 2000.

Tabla 4. Porcentaje de Sensibilidad a los Antibióticos utilizados en los diferentes microorganismos

Antibiótico TetraciclinaStreptomicina Trimetropim

SulfaMetronidazol Amoxacilina

Ac Cla

n % n % n % n % n % n % n %

Streptococcusα hemolítico

N:10

10 100 8 80 8 80 0 0 5 50 0 0 9 90

PseudomonasspN: 7

1 14.2 0 0 7 100 3 42.2 1 14.2 0 0 0 0

Staphylococcusaureus

N: 4

4 100 3 75 2 50 0 0 2 50 0 0 2 50

Klebsiella spN: 4

0 0 0 0 4 100 0 0 1 25 0 0 0 0

StreptococcusŸ hemolítico

N:5

5 100 5 100 1 20 0 0 0 0 0 0 1 20

Escherichiacoli hemolítica

N:1

1 100 0 0 1 100 0 0 1 100 0 0 1 100

Escherichia coliN: 1

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 100

Enterococcus sp VanR

N=1

1 100 1 100 0 0 0 0 1 100 0 0 1 100

Cefoperazona Ciprofloxacina

Bacterias como Escherichia coli y Pseudomonas sp, presentaron un alto grado de resistencia a la Tetraciclina y al Trimetropim Sulfa, lo que coincide con lo reportado por Armenteros et al, 2006; este grado de resistencia puede ser por el uso indiscriminado de algunos antibióticos en el tratamiento de los diversos procesos infecciosos en bovinos, entre ellos mastitis. Adicionalmente, se puede observar en la tabla 4 que el 100% (N=33) de los microorganismos presentaron resistencia al Metronidazol, esto se debe a que los medicamentos a los que se genera mayor resistencia es a los Nitroinidazoles (Metronidazol), presentando una taza de resistencia alta en países industrializados; en países como Colombia, donde el uso indiscriminado de antibióticos es muy frecuente, tanto en patologías humanas como veterinarias, la tasa de resistencia es mucho mayor razón por la cual no se recomienda este medicamento para una terapia antibacterial. (Rey et al., 2008). Por otra parte se encontró, que los aislamientos bacterianos presentaron más del 50% de resistencia a la mayoría de los antibióticos evaluados (Streptomicina, Metronidazol, Tetraciclina, Cefoperazona, Trimetoprimsulfa y Ciprofloxacina) lo que se denomina multiresistencia (Araya et al., 2005). Aunque el porcentaje de aislamientos evaluados fue mínimo con respecto a otros estudios, se puede sugerir que en nuestro país es importante la alta presencia de bacterias resistentes en la leche no pasteurizada, ya que esto podría ser un

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problema para la salud pública, por la transmisión a través de los alimentos y traer graves repercusiones económicas en el productor. (Araya et al., 2005; Vanegas et al., 2009) Las pruebas de susceptibilidad demostradas indican que los microorganismos Staphylococcus sp (n=4) y Enterococcus sp VanR (n=1) evidencian sensibilidad al antibiótico Trimetoprimsulfa y una resistencia del 100% a la Streptomicina y al Metronidazol, ya que probablemente en las regiones evaluadas se han utilizado con frecuencia este tipo de fármacos para el control de las infecciones, lo cual conduce a las bacterias al desarrollo de la resistencia. Investigaciones previas han demostrado que la Streptomicina es un antibiótico que induce la resistencia de alto nivel con mayor frecuencia. (Johnston y Jaykus, 2004; Araya et al, 2005 y López et al., 2006; Valenzuela et al., 2009). Lo que se confirma en este estudio, ya que es el segundo fármaco al que se presenta mayor porcentaje de resistencia en los microorganismos, comparado con el resto de antibióticos.

Es importante tener en cuenta que aunque Enterococcus sp VanR no tuvo en este estudio gran importancia como agente etiológico, aun así se evaluó la sensibilidad que puede presentar a diferentes antimicrobianos, este estudio muestra que el microorganismo presento un 100% (n=1) de resistencia a la streptomicina, según Palavecino, 2001 son intrínsecamente resistentes a varios grupos de agentes antimicrobianos entre ellos los aminoglucósidos (Streptomicina). Por la falta de alternativas para tratar infecciones producidas por este microorganismo se recomienda la evaluación de la susceptibilidad que puede presentar a fármacos como la tetraciclina. Se debe saber, que se encuentran en estudio nuevos agentes antimicrobianos para tratar infecciones causadas por Enterococcus sp VanR, el tratamiento aun no está establecido debido a la falta de información sobre su correlación clínica; ya que la tasa de curación espontánea de casos de mastitis subclínica a microorganismos ambientales se encuentra alrededor del 65% y la cura espontánea de casos clínicos de mastitis es baja <20%. (Ruegg, 2005) Finalmente es importante tener presente que antes de pasar a un tratamiento antibiótico para combatir la enfermedad se recomienda controlarla con desinfectantes diseñados y aplicados en el postordeño y en la forma recomendada; los cuales reducen hasta el 50% los casos de contaminación de la glándula mamaria y las buenas prácticas de higiene a los propietarios del hato lechero o al personal que labora en los mismos, ya que el antibiótico puede ser incapaz de eliminar las bacterias de la glándula mamaria y por el contrario promover la presencia de cepas resistentes a diferentes antibióticos. Adicionalmente no se debe olvidar el uso de antibióticos de amplio espectro como las Quinolonas (ciprofloxacina) tienen efectiva actividad contra los microorganismos Gram negativos y Gram positivos y los β lactámicos (cefoperazona), ya que son antibióticos que interfieren con la formación de la pared celular bacteriana y a que presentaron una efectividad mayor al 50% en general para los microorganismos encontrados en el estudio. Por la importancia que tienen dichas bacterias en este y otros estudios se recomienda realizar pruebas de susceptibilidad bacteriana frente a antibióticos antes formular una terapia. (Rodríguez et al., 2001 y Restrepo et al., 2002) Por otra parte a partir de este y otro estudio, se recomienda a la salud pública, el uso prudente de antibióticos, ya que el uso indiscriminado puede promover la resistencia bacteriana en la cadena alimenticia. (Palavecino, 2001)

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6.3 Hallazgos en muestras de cantinas Los resultados del presente trabajo demuestran que existe una alta presencia del microorganismo de interés Enterococcus sp VanR 95.5% (n=21), seguido de Escherichia coli 77.3% (n=17) y Pseudomonas sp 50% (n=11) en muestras de cantina en los hatos estudiados como lo muestra la figura 8.

Figura 7. Muestras de cantinas

Una posible razón por el cual se presentó un alto porcentaje para Enterococcus sp VanR y Escherichia coli en muestras de cantina en los 3 hatos muestreados, puede deberse a que estos microorganismos son considerados indicadores fecales, por encontrarse en concentraciones de 106 UFC/g y 10 5 -107 UFC/g respectivamente. (Vergaray et al., 2007; Casellas, 2008). Es posible que Enterococcus sp VanR se encuentren en muestras de cantina por un ambiente contaminado, presencia de heces, aguas encharcadas y lodazales, deficiencias en las principales medidas de control, incorrecta rutina de ordeño y tratamiento de los casos clínicos, mal manejo del equipo de ordeño y diseminación de bacterias de glándulas infectadas a glándulas sanas y por el contacto directo o indirecto con el hombre o por la relación que existe entre en equipo de ordeño y la pureza del agua que se utiliza para dicho proceso; también por la relación que mantiene el ganado vacuno con otros animales de granja así estos rumiantes adquieren distintas especies de Enterococcus sp. Esto se debe tener presente como una posible recomendación a las personas encargadas de la rutina de ordeño en las fincas lecheras, para evitar la presencia de animales enfermos a causa de estas fallas, ya que el elevado porcentaje de circulación de microorganismos unido a otras causas indica que es importante la aplicación de medidas de control en la enfermedad. (Rodríguez, 2001; Jurado, 2003; Araya, 2005; Citak et al., 2005; Armenteros et al., 2006; Akeshima et al., 2008; Rojas, 2009)

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Figura 8. Porcentajes de positividad de microorganismos en muestras de leche de cantinas de los tres

hatos

En cuanto a la distribución geográfica las muestras positivas para Enterococcus sp VanR, presentaron similitud en los 3 hatos muestreados. En los hatos 2 y 3 la positividad llegó a su totalidad 100% (n= 2 y 12) respectivamente como se muestra en la figura 9, esto puede deberse a que existe un mayor nivel de contaminación fecal en la leche, equipo de ordeño y cantinas al cual llega este producto. (Araya et al., 2005)

Figura 9. Microorganismos aislados a partir de muestras de leche provenientes de cantinas en los

tres hatos

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Por otra parte de acuerdo con la literatura, el alto grado de resistencia que han adquirido los Enterococcus sp a los Glicopéptidos en muestras de leche, es por el uso indiscriminado de los antibióticos como avoparcina que es una sustancia promotora de crecimiento en ganadería a nivel terapéutico para promover el crecimiento de los animales incrementando el aumento de peso y mejorando la utilización del alimento perteneciente a este grupo de antibióticos, por esta razón el uso de este tipo de fármacos en la dieta animal, está siendo prohibido como una medida de seguridad en la salud pública (Giménez, 2005, Torres y Zarazaga, 2002; Valenzuela et al., 2009). Este mecanismo de resistencia a los fármacos puede ser de manera intrínseca o adquirida; esta última se basa en la adquisición de plásmidos y transposones; los cuales pueden estar presentes en los alimentos actuando como reservorio de genes para la resistencia de antibióticos (Citak et al., 2005 ; Sánchez et al., 2009) Adicionalmente, se detectó la presencia de microorganismos ambientales como Escherichia coli, Streptococcus sp, Pseudomonas sp, Staphylococcus aureus y Bacillus sp, estas son bacterias formadoras de biopelìculas en alimentos, compuestos que causan deterioro en los productos de consumo como la leche y el queso y en la maquinaria en la cual son procesados; aunque este análisis no hizo parte de la metodología llevada a cabo en el presente estudio, esta puede ser una de las posibles fuentes por el cual se encontraron este tipo de microorganismos en la leche, especialmente la proveniente de los cantinas a donde fue llevada después del ordeño. (Calderón y Rodríguez, 2008) Es muy importante tener en cuenta que la leche es un producto indispensable en la dieta del hombre, por esta razón, es necesario consumirla en adecuadas condiciones, ya que de lo contrario se pondría en peligro la salud de quienes la consumen, por la diseminación de bacterias causantes de enfermedades tales como: tuberculosis, brucelosis, faringitis estreptocócica, entre otras. (Rojas, 2009) Finalmente se debe tener en cuenta el control en la toma de muestras de leche a partir de cantina, ya que es una herramienta importante para establecer un diagnóstico sobre el estado sanitario de las fincas, si por el contrario no se practicaran este tipo de procedimientos podría traer como consecuencia patologías al hombre. (Juste, 2009) 6.4 Evaluación de calidad del producto lácteo A partir de 100 muestras de queso pera provenientes de dos plantas de productos lácteos (Planta 1 y 2), en nuestro estudio se realizó un seguimiento en cuanto a sus características organolépticas tales como color, olor y textura; al estudiar la relación existente entre la presencia del microorganismo y la fecha de vencimiento se encontró una correlación, lo que indica que la fecha de vencimiento incide con la presencia de Enterococcus sp VanR, ya que el queso pera cambió sus características originales cuando se hizo un segundo análisis posterior a la fecha de vencimiento, como se observa en la tabla 5 y en la figura 10.

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Tabla 5. Características organolépticas del primer y segundo procesamiento de quesos en la planta 1 y 2

Características Muestreo 1 Muestreo 2 Planta 1 Color Blanco Amarillo

Olor Normal Rancio Textura Normal suave Mucoide

Planta 2 Color Blanco Amarillo y verdoso Olor Normal Rancio Textura Normal suave Mucoide y Seco

Figura 10. Queso pera antes y después de su fecha de vencimiento

El análisis microbiológico en busca de Enterococcus sp VanR en agar enterocococsell con vancomicina, de 100 muestras de queso pera, la planta 1 presentó un 12% (n=3) de positividad inmediata su empaque y un 68% (n=17) posterior a la fecha de vencimiento y para la planta 2 un 4% (n=1) en el primer procesamiento y 8% (n=2) de muestras positivas con la presencia de este microorganismo en el segundo procesamiento, como se observa en la figura 11. Es importante resaltar que en el primer procesamiento de las muestras de queso pera en las dos plantas de productos lácteos se presentaron Enterococcus sp VanR aunque en baja proporción, esto puede estar asociado a una inadecuada calidad bacteriológica de la materia prima por las condiciones higiénico sanitarias de producción y de manejo utilizadas en el momento de la producción y empaque. Es importante tener presente las medidas higiénicas utilizadas en el momento de elaboración, empaque y distribución del producto, ya que estas, son bacterias resistentes a la desecación, al calor y a los agentes de limpieza. (Departamento de sanidad y seguridad social, 2002, Gelsomino et al., 2002 y Reyes et al., 2002; Lukosova y Sustackova, 2003). Herráez, 2008 reporta que los niveles de Enterococos en queso varían en función de la contaminación de la leche, la supervivencia en el ambiente de la quesería y las condiciones particulares de elaboración y maduración de cada variedad; la presencia y multiplicación de estos en el queso resulta favorecida por su elevada adaptabilidad a diversos sustratos y a condiciones ambientales adversas, incluida la pasteurización, que les permite soportar las condiciones habituales de la fabricación y convertirse en parte importante de la microbiota fermentadora del producto. Se ha descrito la presencia de enterococos en numerosas variedades de queso de leche cruda o pasterizada en niveles de 104-106 ufc/g en la cuajada hasta 105-107 ufc/g en queso maduro, donde pueden convertirse en el grupo microbiano predominante causante de problemas en la salud pública, es probable que lleguen al ser humano y transfieran su resistencia a otras cepas patógenas, complicando el tratamiento en caso de presentar enfermedad. (Herrera, 2006; Herráez, 2008; Platero et al., 2009)

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Figura 11. Porcentaje de positividad a Enterococcus vancomicina R en el primer y segundo muestreo de

muestras de queso en la planta 1 y 2.

Algunos autores como Valero et al., 2002 y Araya 2005 citan las especies bacterianas E. faecalis y E.faecium como especies de mayor frecuencia que causan patología en humanos, la alta tasa de resistencia a vancomicina como la descrita en este estudio, representa un delicado problema para la salud pública, ya que los Enterococcus sp VanR son capaces de servir como reservorios de genes de resistencia; la presencia de estas bacterias resistentes a antibióticos en la leche y en los subproductos es de suma importancia, ya que posibilita la diseminación de estos microorganismos a las personas a través de la cadena alimenticia como lo reportó la investigación de Gelsomino, 2002. Los enterococcus forman parte de la flora intestinal de humanos y animales, por ello su presencia en alimentos es indicativa de contaminación fecal y reflejo de condiciones higiénico sanitarias de producción y manejo deficientes; esta situación ha limitado el empleo de la leche cruda de más del 50% de queso que se consume en otros países latinoamericanos. (Collignon, 1999; Reyes et al., 2002; Giraffa, 2002; Araya et al., 2005; Citak et al., 2005)

Figura 12. Enterococcus sp VanR en agar enterocococsell con vancomicina a partir de queso pera

posvencimiento Por otra parte, Sánchez 2009 encontró que los quesos producen aminas biógenas en los alimentos ricos en proteínas como lo son los quesos. Aunque no fue un objetivo a estudiar, esto se debe tener en cuenta por lo observado según el cambio de sus características organolépticas (color, olor y textura) en las muestras de queso pera después de su fecha de vencimiento. Estos son compuestos causantes de diferentes problemas toxicológicos como jaquecas, nauseas y vómitos; por la concentración en que pueden encontrarse en determinados

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alimentos y bebidas, como son los derivados lácteos. (Tham et al., 2002; Barrón et al., 2003; Platero et al., 2009; Platero et al., 2009). Es importante saber que en Colombia se reportó la resistencia a Vancomicina por primera vez en el año 1998 donde inicialmente aparecieron casos aislados y luego aparecieron brotes afectando de esta forma la salud en el humano. (Bazet et al., 2005). Adicionalmente los datos arrojados por el programa de optimización de antibióticos realizado por la Fundación Cardioinfantil de Bogotá, citan que la prevalencia de Enterococcus sp no es muy alta, en Colombia se ha descrito el (25.1%) de casos, pero si en otros países de Latinoamérica, como Argentina, Chile y Brasil con un 62.5%, 59.1% y 32.4% respectivamente. (Ali, 2009)

Finalmente es fundamental tener en cuenta que los rechazos crecientes de los productos que se ofertan en el mercado local e internacional resultan para el productor sobreoferta sin salida comercial, pérdidas económicas muchas veces mayores que las que provocan las enfermedades sobre los animales en forma directa. Con el agravante de que el problema puede afectar a los demás, por afectarse la imagen de una región completa o del país en general ante potenciales compradores en el exterior. (Vanderlinder, 2008 Wellenber et al., 2002)

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7. CONCLUSIONES

• En las fincas analizadas, gracias al examen clínico y la prueba de California Mastitis test se encontró una mayor prevalencia de mastitis suclínica grado III

• No hay implicación de Enterococcus sp VanR como agente etiológico en mastitis subclínica bovina en las fincas analizadas.

• Los antibióticos de elección para tratar el problema de mastitis subclínica grado III en las fincas estudiadas son la Cefoperazona y la Ciprofloxacina

• El alto porcentaje de Enterococcus sp VanR en leche de cantina puede estar influenciado por las inadecuadas condiciones de higiene y manejo de los equipos de ordeño de las fincas.

• La presencia de Enterococcus sp VanR en muestras de queso tipo pera, no favorece la

preservación y la buena calidad del producto.

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ANEXOS

NORMATIVA COLOMBIANA A continuación se presentan algunas normas establecidas según el Instituto Colombiano de normas técnicas y certificación ICONTEC para indicar los limites de microorganismos permitidos en los productos lácteos, si la muestra ensayada no llegara a cumplir con el requisito establecido en la presente norma se rechaza el lote, en caso de discrepancia se repite el ensayo sobre la muestra reservada para tales efectos. Normas según el Icontec para indicar los limites de Enterococcus permitidos en los productos lácteos

• NTC 3856 productos lácteos leche UAT (UHT) ultra alta temperatura, larga vida y leche ultra pasteurizada Esta norma establece los requisitos que deben cumplir las leches UAT (UHT) ultra alta temperatura, larga vida y ultra pasteurizada, que se clasifican según su contenido de grasa. La leche UAT (UHT) ultra alta temperatura después del tratamiento térmico debe cumplir con lo establecido en la tabla 1 basado en la prueba de esterilidad para lácteos. (Icontec, 2004)

Tabla 1. Requisito de microorganismos para leche UAT (UHT) ultra alta temperatura larga

vida Microorganismo N N M C Recuento de microorganismos mesofilicos UFC//ML

5 1000 10000 1

Recuento de coliformes UFC//ml 5 <1 - 0 Recuento de psicrotrofos UFC/ml 5 100 1000 1 Donde:

� n: número de muestras a examinar � C: número de muestras permitidas � m: índice máximo permisible para identificar el nivel de buena calidad � M: índice máximo permisible para identificar el nivel de calidad aceptable

• NTC 399 productos lácteos. Leche cruda

Esta norma establece los requisitos que debe cumplir la leche cruda como materia prima para su industrialización.

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La calidad microbiológica de la leche cruda tomada de un hato debe cumplir con los requisitos establecidos en la tabla 2. (Icontec, 2002)

Tabla 2. Requisito de la leche cruda tomada de un hato

Requisito Limite Recuento de microorganismos mesofilicos UFC//ml máximo

700000

• NTC 4225 Productos lácteos. Queso fundido Esta norma establece las definiciones, clasificación y los requisitos que debe cumplir el queso fundido para consumo directo o para elaboración posterior. Entre los requisitos específicos, los requisitos microbiológicos, el queso en sus diferentes clases deberá cumplir con los requisitos microbiológicos señalados en la tabla 3. (Icontec, 1997)

Tabla 3. Requisito microbiológico para queso fundido

Requisito N m M C Recuento aerobias mesófilas UFC/ g 3 3x16 4 5x16 4 1 NMP de coliformes/ g 3 20 93 1 Recuento de coliformes fecales/ g 3 <3 - 0 � De acuerdo al articulo 2 el Ministerio de Protección Social y el decreto 2838 de 2006, el

presidente de la república de Colombia en ejercicio con las atribuciones constitucionales y legales, decreta:

Los comercializadores de leche cruda o leche cruda enfriada para consumo humano directo que no se ajusten a lo establecido en la presente información, no podrán comercializar el producto en el territorio nacional. Leche cruda: leche que no ha sido sometida a ningún tipo de termización ni de higienización Leche cruda enfriada: leche que no ha sido sometida a ningún tipo de termizaciòn y de higienización y se conserva una temperatura de 4 °C +/- 2 °C Para la autorización de las zonas especiales de comercialización de leche cruda y leche cruda enfriada para consumo humano directo, se tendrán en cuenta los siguientes requisitos, tendientes a reducir el riesgo para la salud del consumidor:

• Estar ubicadas en zonas aisladas o de difícil acceso • Población a abastecer • Disponibilidad alimentaria • Desarrollar los programas sanitarios y de inocuidad que determine el instituto

colombiano ICA para la vigilancia de brucelosis y tuberculosis

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� Artículo 5: comercialización de leche cruda para consumo humano directo: La leche crecida para consumo humano directo deberá comercializarse en un tiempo no superior a ocho horas transcurridas a partir del momento de su ordeño. � Artículo 6: Comercialización de leche cruda enfriada para consumo humano directo: La leche cruda enfriada para consumo humano directo deberá comercializarse en un tiempo no superior a las 24 horas transcurridas a partir del momento de su ordeño � Articulo 7: Requisitos par la comercialización de leche cruda y leche cruda enfriada. Todo

comercializador de leche cruda y le che cruda enfriada para consumo humano directo deberá cumplir con los siguientes requisitos:

• Estar registrados y autorizados por las autoridades sanitarias de los departamentos, distritos o municipios

• Cumplir en lo pertinente con las condiciones higiénico-sanitarias establecidas en le decreto 3075 de 2007

� Articulo 8: equipos y utensilios. Los equipos y utensilios que en el proceso de

comercialización entran en contacto directo con la leche cruda y la leche cruda enfriada para consumo humano directo, deberán cumplir con los siguientes requisitos:

• Estar fabricados con materiales resistentes al uso, así como a la utilización frecuente

de los agentes de limpieza y desinfección. • Los utensilios y superficies deben poseer un acabado liso, no poroso, no

absorbente, estar libres de defectos, grietas, • Todas las superficies de contacto con la leche cruda o leche cruda enfriada deben

ser inertes, de manera que no exista interacción entre estas • En los espacios interiores de contacto directo con la leche cruda y leche cruda

enfriada, los equipos no deben poseer piezas o accesorios que requieran lubricación o roscas de acoplamiento u otras conexiones peligrosas

• Las tuberías empleadas para la conducción de la leche cruda deben ser de materiales resistentes, inertes, no porosos, impermeables y fácilmente desmontable para su limpieza

Los comercializadores de leche cruda enfriada deberán tener equipos para enfriamiento de leche cruda, con capacidad apropiada que garantice que la temperatura de la leche se encuentre a 4 °C+/- 2°C. Los tanques de almacenamiento de leche cruda enfriada deberán ser utilizados únicamente para este fin, estar provistos de equipos de gradación y evitar posible contaminación con el ambiente No se permite el uso de recipientes plásticos.

� Articulo 9. Salud del manipulador. Todo manipulador o comercializador de leche cruda y leche cruda enfriada deberá:

• Poseer un certificado medico que reconozca su aptitud para manipular la

leche, el cual tendrá vigencia por un año

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• Mantener la higiene personal y los buenos hábitos higiénicos • Estar libres de lesiones en la piel y síntomas de afecciones respiratorias

� Articulo 10. procedencia de la leche. La leche cruda y leche cruda enfriada que se comercialice para consumo humano directo, deberá proceder de ganaderías inscritas en programas de saneamiento establecidas por el instituto Colombiano Agropecuario ICA, las cuales han cumplido con procesos de vigilancia epidemiológica de brucelosis y tuberculosis bovina.

� Articulo 11. características fisicoquímicas de la leche cruda y la leche cruda enfriada. La

che cruda y la leche cruda enfriada deberán cumplir con:

• La leche liquida proveniente de los animales bovinos debe tener mínimo 2.9% de proteína

• Debe estar ausente de adulterantes, neutralizantes y conservantes

� Articulo 12. características microbiológicas de la leche cruda y de leche cruda enfriada. La leche cruda y leche cruda enfriada deberá cumplir con los siguientes requisitos:

Requisitos microbiológicos

Índice permisible Unidades Recuento de mesófilos aerobios UFC/ml 700.000

RECOMENDACIONES PARA LAS PLANTAS DE PRODUCTOS LACTEOS

Para el control de la Mastitis por diferentes microorganismos se requiere:

• La prevención, no el tratamiento, es la clave para un control efectivo y rentable de la mastitis.( Castañeda et al,2000)

• Baño de pezones después del ordeño y tratamiento de secado • Higiene durante el ordeño: • Baño de pezones antes del ordeño • Eliminación de vacas infectadas • Tratamiento de mastitis clínicas durante la lactación • Vacunas • La desinfección de la glándula mamaria postordeño es un factor importante para

disminuir el RCS en leche por cuarto, al igual que el lavado y secado de la ubre, es claro tener en cuenta que ambas prácticas de manejo hacen parte de una cadena de elementos tendientes a mantener el buen estado de salud de la glándula mamaria, que de ninguna manera, de forma independiente, podrían lograr tal fin.(Ramirez et al,2001)

Los siguientes son algunos factores importantes para la prevención y control de agentes alterantes como lo son los enterococos, implicados en procesos de calidad de productos lácteos. La presencia de este tipo de bacterias es un indicador de problemas en cuanto la

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higiene y calidad del producto. Por tanto la presencia de estas causa en sus derivados: corta duración del producto, aumento de la acidez (rancidez), mal olor y sabor del producto y además es un indicador para las empresas de productos lácteos para obtener premios o sanciones. (Corbellini, 2000; Alamilla, 2007) Por todo lo anterior es de gran importancia tener en cuenta las siguientes recomendaciones:

- Mantener el producto en condiciones de enfriado a 4°C después de ser empacado debido a que las temperaturas extremas, la acidez o la contaminación por microorganismos pueden deteriorar su calidad rápidamente. (Alamilla, 2007).

- Conservar en producto a 4°C permite mantener estable la carga bacteriana, sin embargo, a bajas temperaturas por largos períodos de tiempo se establece el desarrollo de la flora psicrofila, lo cual origina serios problemas en la industria Láctea. ( Revelli et al, 2004)

- Mantener condiciones de higiene en el momento del procesamiento del producto y empacado ya que de esta manera se evita la presencia y diseminación de agentes patógenos.

- Los recipientes deben ser lavados con solución desinfectante y con agua limpia - Empacado/ procesado en atmósferas modificadas. El dióxido de carbono (CO2) es una

agente antimicrobiano natural y se ha demostrado que inhibe o reduce el crecimiento bacteriano, a cambio se alarga la vida de anaquel (Tiempo durante el cual un producto, generalmente empacado o no permanecerá en buenas condiciones para ser comercializado)

- Otra condición que incrementa el recuento bacteriano, no solo en la finca si no en la cadena de comercialización, es el deficiente lavado de los cauchos de los recipientes usados para el procesamiento del producto lácteo, por ello el uso de recipientes de boca ancha con cortes y orillos internos garantizan un lavado, desinfección y remoción de sedimentos contaminados .

- Otro factor que se debe tener en cuenta referente a los recipientes plásticos, es la porosidad que algunos materiales poseen, favoreciendo el deposito de micropelículas de material en descomposición con suficiente carga bacteriana para entrar en descomposición. Por ello el olor rancio que algunos recipientes libran.

- La leche y los productos lácteos pueden estar contaminados con un gran número de substancias indeseables, por ello es importante tener en cuenta la contaminación de la leche después del ordeño, ya que esta es dependiente del proceso tecnológico utilizado del material para empaques y otros.( Castañeda et al,2000)

Finalmente, la calidad integral de la leche y por ende de los productos lácteos, adquiere gran importancia en función de dos aspectos fundamentales como son: la salud pública y su aptitud industrial, necesitando obviamente de todos los sectores involucrados en la producción primaria, conservación, transporte, almacenamiento y transformación. Es imprescindible partir de animales sanos, genéticamente aptos, apropiadas condiciones de alimentación y manejo, buenas prácticas de higiene, control y tratamiento de mastitis y otras patologías, con el objetivo de asegurar al consumidor productos inocuos, íntegros y legítimos. (Alamilla, 2007).

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BENEFICIOS PARA LA PLANTA PROCESADORA DE PRODUCTOS

LACTEOS

Una vez finalizado el proyecto se entregara un informe a la Industria Láctea de las muestras procesadas para que beneficie a esta en cuanto a:

• Reforzar medidas de asepsia y control en el momento de la recogida de la leche y procesamiento de esta para obtener los derivados lácteos

• Evitar riesgos en la salud del consumidor • Análisis microbiológicos a la leche y productos lácteos • Análisis a las características organolépticas en los productos lácteos • Incremento de Productos convenientes y seguros que promuevan en la salud • En caso tal, reforzar medidas en cuanto a : contaminación bacteriológica, empaque de

productos, controles de temperatura, entre otros.; ya que estos pueden ser motivos de descomposición y/o mala calidad del producto

• Compromiso y seguridad de la Industria Láctea para comercializar cada vez más y más productos de excelente calidad