Análisis conformacional de glicopéptidos en estado ... · molecular clásica que nos permite...

Fernando García Alesanco

Francisco Corzana López y Gonzalo Jiménez Osés

Facultad de Ciencias, Estudios Agroalimentarios e Informática

Grado en Química

2014-2015

Título

Director/es

Facultad

Titulación

Departamento

TRABAJO FIN DE GRADO

Curso Académico

Análisis conformacional de glicopéptidos en estadoasociado mediante dinámica molecular

Autor/es

© El autor© Universidad de La Rioja, Servicio de Publicaciones, 2015

publicaciones.unirioja.esE-mail: [email protected]

Análisis conformacional de glicopéptidos en estado asociado mediante dinámica molecular, trabajo fin de grado

de Fernando García Alesanco, dirigido por Francisco Corzana López y Gonzalo Jiménez Osés (publicado por la Universidad de La Rioja), se difunde bajo una Licencia

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UNIVERSIDAD DE LA RIOJA

FACULTAD DE CIENCIAS, ESTUDIOS AGROALIMENTARIOS E INFORMÁTICA Grado en Química Curso 2014/15

Trabajo de fin de grado

FERNANDO GARCÍA ALESANCO

Tutores: Francisco Corzana López Gonzalo Jiménez Osés

ANÁLISIS CONFORMACIONAL DE GLICOPÉPTIDOS EN ESTADO ASOCIADO MEDIANTE DINÁMICA MOLECULAR 1

ÍNDICE

1. Resumen 3

2. Objetivo 7

3. Introducción 11

3.1. Dinámica Molecular 13

3.2. Mucinas y anticuerpos anti-MUC1 15

4. Metodología 19 4.1. Preparación de datos 21

4.2. Minimizaciones y dinámica molecular 26

5. Resultados y Discusión 31

6. Conclusiones 39

7. Referencias 43

RESUMEN


RESUMEN

En este Trabajo de Fin de Grado se ha llevado a cabo el análisis conformacional en disolución acuosa de un complejo formado por un anticuerpo antitumoral (denominado SM3) y el glicopéptido Ala-Pro-Asp-Thr*-Arg-Pro, el cual presenta la treonina unida a un residuo de N-acetilgalactosamina a través de un enlace D-O-glicosídico. Este pequeño glicopéptido constituye el fragmento peptídico más pequeño necesario para el reconocimiento de la mayor parte de este tipo de anticuerpos. El estudio conformacional está basado en cálculos de dinámica molecular de 100 ns realizados con disolvente explícito. Como resultado, la conformación observada para el glicopéptido en el estado asociado con el anticuerpo es muy similar a la ya descrita por difracción de rayos X. Este estudio puede ayudar a entender, a nivel atómico, los elementos clave en el reconocimiento molecular de pequeños glicopéptidos por anticuerpos antitumorales, lo cual puede ser útil para el desarrollo tanto de vacunas como de marcadores antitumorales.

ABSTRACT

Herein the conformational analysis of a glycopeptide Ala-Pro-Asp-Thr*-Arg-Pro (where threonine is glycosylated with N-acetylgalactosamine via an D-O-glycosidic linkage) in complex with an antitumoral antibody has been performed. This glycopeptide is the epitope recognized by most of this type of antibodies. The study involves the use of 100 ns molecular dynamics (MD) simulations in explicit water molecules. The conformation obtained from these calculations is similar to that reported by X-ray diffraction. This study may help to understand, at atomic level, the key factors responsible for the molecular recognition of small glycopeptides by antitumoral antibodies, allowing the development of both more efficient vaccines and novel biomarkers.

OBJETIVO


El objetivo principal de este trabajo de fin de Grado consiste en el estudio conformacional en disolución acuosa del complejo formado por el anticuerpo antitumoral SM3 y el glicopéptido Ala-Pro-Asp-Thr*-Arg-Pro, en el que la treonina se encuentra glicosilada con GalNAc a través de un enlace D-O-glicosídico. Para ello se han utilizado cálculos de dinámica molecular (DM) en disolución acuosa, empleando moléculas explicitas de disolvente. Dichos cálculos se han realizado con el programa informático AMBER. A continuación, se enumeran los objetivos secundarios del trabajo:

1) Preparación de los archivos de entrada para llevar a cabo los cálculos de DM, utilizando como estructura de partida la descrita previamente por difracción de rayos X.

2) Realización de los cálculos de DM. 3) Análisis de los resultados y comparación de la conformación/es obtenidas con

la descrita en la estructura de rayos X.

INTRODUCCIÓN


DINÁMICA MOLECULAR

La Dinámica Molecular1 es una técnica computacional basada en la mecánica molecular clásica que nos permite “visualizar” el movimiento de una molécula o conjunto de moléculas. Así, podemos conocer cuál o cuáles son las conformaciones mayoritarias para una molécula (por ejemplo, en disolución acuosa) y la población de cada una de ellas, a unas determinadas condiciones de presión y temperatura.

Esta técnica computacional considera que los átomos de una molécula son esferas rígidas, con una carga puntual fija. Las distintas esferas se unen a otras mediante muelles (que hacen las veces de enlaces químicos) que tienen una determinada constante elástica (Figura 1).

Figura 1: Átomos representados como esferas y enlace representado como un muelle.

En este tipo de cálculos, la energía potencial de una molécula va a depender de la posición de estas esferas. A la ecuación matemática que describe esta energía potencial en función de las coordenadas xyz de los átomos, junto con una serie de parámetros, constituyen lo que se conoce como campo de fueras (o force field en inglés). Los parámetros se obtienen de datos experimentales (rayos X, IR...) o bien de cálculos ab initio. Como puede verse en la Figura 2, el campo de fuerzas tiene una serie de parámetros enlazantes (energía de enlace, de ángulo y de torsión) y términos no enlazantes, que definen las interacciones electrostáticas o las de van der Waals.

Figura 2: Términos enlazantes (arriba) y no enlazantes (abajo) de un campo de fuerzas.

Enlace

¦ nm mnmn

nmCoulomb rr

qqV, )(H

¦ ¸¸¹

·¨¨©

§�

ji ij

ij

ij

ijvdW r

BrA

V,

612

Ángulo Ángulo diedro


Actualmente existen muchos campos de fuerzas, la mayor parte de ellos diseñados para reproducir el comportamiento conformacional de un determinado tipo de moléculas, como por ejemplo, péptidos y proteínas, ácidos nucleicos, lípidos o carbohidratos. Así, por ejemplo, mientras que los campos de fuerzas AMBER y CHARMM se utilizan para simular correctamente proteínas y ácidos nucleicos, el GLYCAM ha sido parametrizado para el estudio de carbohidratos. El campo de fuerzas que se ha utilizado en este trabajo es AMBER, y en concreto, la versión ff03.r1,2 ya que posee los parámetros adecuados para simular correctamente proteínas, como el anticuerpo SM3, y péptidos. Este campo de fuerzas se ha implementado con GLYCAM_06h3 para simular correctamente el enlace glicosídico entre el GalNAc y el residuo de treonina.

El método de DM consiste en resolver la ecuación de movimiento de Newton para un sistema de partículas. En este caso, la fuerza viene dada por el gradiente de la energía potencial del sistema con respecto a las coordenadas atómicas (Fi=δEpotencial/δri). Los cálculos de DM suelen hacerse a temperatura constante y presión constante. En cuanto al tratamiento del disolvente, en los métodos de DM existen diversas aproximaciones. Estas van desde considerarlo simplemente como una constante dieléctrica, usar un modelo de disolvente continuo o incluir explícitamente las moléculas de disolvente.


MUCINAS Y ANTICUERPOS ANTI-MUC1

Los glicopéptidos y las glicoproteínas están constituidos por una parte proteica o peptídica y por uno o varios carbohidratos que se unen entre sí a través de un enlace denominado glicosídico. La presencia de estos carbohidratos en la estructura estabiliza determinadas conformaciones de la cadena peptídica e incluso la hacen más resistente a la degradación enzimática.

Las mucinas son un tipo de glicoproteínas involucradas en procesos biológicos muy importantes, como la inflamación, la respuesta inmunológica, la comunicación intercelular y el crecimiento celular. Además, tienen un gran interés desde el punto de vista terapéutico para el desarrollo de nuevas vacunas contra el cáncer como se verá más adelante.

Una de las mucinas más estudiadas es la MUC1, 4-6 una glicoproteína asociada a la membrana celular. Como se puede observar en la Figura 3, la MUC1 está compuesta por la repetición de una secuencia de 20 aminoácidos. Las tres treoninas y las dos serinas que la componen son puntos de glicosilación, es decir, a estos aminoácidos se les unen diferentes carbohidratos. En el caso de las mucinas, el primer residuo es siempre la N-acetilgalactosamina (GalNAc), la cual se une a través de un enlace D-O-glicosídico a los grupos hidroxilo de la serina y/o treonina. Es importante señalar que la MUC1 se encuentra deficientemente glicosilada en las células cancerosas o tumorales debido al mal funcionamiento de algunas enzimas como las glicosiltransferasas (Figura 3). Como consecuencia de esto, muchos de los antígenos que antes estaban enmascarados quedan ahora expuestos al sistema inmune y pueden ser reconocidos por anticuerpos anti-MUC1.7 De ahí el uso de derivados de MUC1 como vacunas terapéuticas. 8-11 Este hecho convierte también a los anticuerpos anti-MUC1 como prometedores candidatos para la terapia contra el cáncer, ya que, si se le coloca al anticuerpo una sonda, cuando éste se una al antígeno, presente en las células tumorales, va permitir su localización. No solo eso, también se puede conseguir unir al anticuerpo una droga, que al interaccionar con el antígeno APDT*RP se libere, permitiendo la destrucción o eliminación de la célula cancerosa.


Figura 3: Diferencias estructurales entre la mucina MUC1 presente en una célula sana y en una tumoral.

En general, los anticuerpos anti-MUC1 reconocen la secuencia peptídica compuesta por seis aminoácidos: Ala-Pro-Asp-Thr-Arg-Pro.7 Además, se sabe que la presencia de una unidad de GalNAc en la treonina favorece la unión con los anticuerpos.12 En la Figura 4 se muestra la estructura del antígeno APDT*RP, junto con la nomenclatura empleada para los distintos aminoácidos (Tabla 1).

Figura 4: Estructura del antígeno APDT*RP.


Tabla 1: Nomenclatura de aminoácidos.

En general, las vacunas diseñadas con los glicopéptidos generan una mayor respuesta inmune en ratones que aquellas que sólo presentan cadenas peptídicas en las que está el fragmento Ala-Pro-Asp-Thr-Arg-Pro.13 Por tanto, parece claro que existe una relación entre afinidad antígeno-anticuerpo y respuesta inmune. Lógicamente, el estudio del reconocimiento molecular de estos antígenos por anticuerpos antitumorales es fundamental y permitirá el desarrollo de vacunas más eficaces.

En este sentido, recientemente se ha publicado la estructura de rayos X de un anticuerpo anti-MUC1, denominado SM3, y el glicopéptido Ala-Pro-Asp-Thr*-Arg-Pro, siendo Thr*= D-O-GalNAc-Thr (Figura 5).12 El estudio de esta estructura revela que la cadena peptídica interacciona con el anticuerpo a través de enlaces de hidrógeno e interacciones CH-S. En esta figura, los enlaces de hidrógeno entre la cadena peptídica y el anticuerpo se muestran en color rosa. Por otro lado, el GalNAc presenta una interacción hidrofóbica entre el metilo del GalNAc y el Thrp33H y un enlace de hidrógeno entre el su hidroximetilo y la Tyr32L. Además, el metilo del carbono-E de la treonina está involucrado en una interacción hidrofóbica con una tirosina (Tyr32L), tal como se muestra en la Figura 5.

A = Alanina Ala1

P = Prolina Pro2

D = Ácido aspártico Asp3

T = Treonina Thr4

R = Arginina Arg5

P = Prolina Pro6


Figura 5: Estructura de rayos X del anticuerpo SM3 y del glicopéptido Ala-Pro-Asp-Thr*-Arg-Pro. La cadena peptídica del antígeno está representada en verde, mientras que el GalNAc aparece en azul. Los

residuos del anticuerpo que interaccionan con el antígeno están en amarillo. El resto del anticuerpo aparece en gris.

Lógicamente, es importante saber si esta estructura observada en el estado sólido el cristal está también presente (o es la más poblada) en disolución acuosa. Es por ello por lo que en este Trabajo de Fin de Grado se ha realizado el estudio conformacional de este complejo utilizando cálculos de DM.

Trp91L Trp96L

Trp33H

Tyr32H

Asn31H

Tyr32L

Pro6

Ala1

Pro2

Asp3

Ser4

Arg5GalNAcPro6

Ala1

Pro2Asp3

Thr4

Arg5

Tyr32L

Trp91LTrp96L

Trp33H

Gln97H

Tyr32H

Asn31H

GalNAc

b)a) -GalNAc-Thr -GalNAc-Ser

METODOLOGÍA


Para llevar a cabo los cálculos de dinámica molecular (DM), se ha seguido la metodología que se describe a continuación. Todos los cálculos se han corrido en una máquina Linux con una tarjeta NVIDA GTX 770 con AMBER 12.14

Todos los pasos y los programas que se utilizan para realizar este trabajo se muestran de una forma ordenada en la Figura 6 y se describen a continuación.

Figura 6: Esquema de los distintos programas integrados en AMBER y pasos a seguir para la preparación de archivos y posterior realización y análisis de la dinámica molecular.

En primer lugar, a partir de la estructura de rayos X y utilizando el módulo de AMBER llamado xLEaP se han preparado los archivos de topología, que contienen información del campo de fuerzas, y de coordenadas, que como su nombre indica contienen las coordenadas xyz de todos los átomos que componen el sistema. La estructura de rayos X se ha conseguido de la base datos PDB (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do). El código PDB para dicha estructura es: 5A2K.12 En la Figura 7 se muestra la estructura del complejo antígeno-anticuerpo:

http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do


Figura 7: Estructura por rayos X del complejo SM3:APDT*RP. Código PDB: 5A2K. El anticuerpo se muestra en color verde y el antígeno con los carbonos en violeta. Los puntos rojos corresponden a moléculas de

agua.

Los campos de fuerza que se van a utilizar para realizar la dinámica molecular son, como ya se ha comentado anteriormente el AMBER (versión ff03.r1)2 y el GLYCAM06.3 En En primer lugar, cargamos el módulo xLEaP mediante los siguientes comandos:

> export AMBERHOME=/home/paco/amber12

> /home/paco/amber12/bin/xleap&

En la Figura 8 se muestra la pantalla de inicio de xLEaP:

Figura 8: Interfaz de xLEaP.


Una vez entrado en xLEaP, se cargan los campos de fuerza con estas instrucciones (Figura 9):

> source /home/usuario/amber6/dat/leap/cmd/leaprc.ff03.r1

> source /home/usuario/amber6/dat/leap/cmd/leaprc.GLYCAM_06h

Figura 9: Interfaz de XLEaP, mostrando los dos campos de fuerzas cargados.

El siguiente paso es cargar la molécula que se quiere estudiar

> molecula=loadpdb SM3_APDTgRP (En este caso g=*)

En este paso, el xLEaP pone los átomos de hidrógeno de forma automática, ya que estos no aparecen en la estructura cristalina. La carga que atribuye a la cadena lateral de los distintos aminoácidos es aquella que posee cada residuo a pH neutro. A continuación, con el siguiente comando, se alinea la molécula en las coordenadas x,y,z para, posteriormente, añadir una “caja de agua”.

> alignaxes molecula

Una vez alineada la molécula, se crea la caja de agua.

> solvatebox molecula TIP3PBOX 10


Existen varios modelos de agua. La utilización de un modelo u otro se hace en función de la exactitud del estudio a realizar.

La complejidad de estos modelos se diferencia por el número de “puntos” que se utilizan en su definición. Hay modelos de 3, de 4, de 5 y de 6 puntos.

Figura 10: Distintos modelos de agua según el número de puntos.

La M considera la carga negativa del oxígeno y las L representan los pares solitarios del oxígeno. El modelo elegido en este trabajo es el TIP3P,15 un modelo de 3 puntos, rígido y sencillo, no muy costoso computacionalmente y que es ampliamente utilizado en los cálculos de DM.

TIP3P r(OH)/Å 0,9572 HOH/deg 104,52 carga (O) -0,834 carga(H) +0,417

Tabla 2: Características del modelo de agua TIP3P.

A la hora de correr la dinámica, la caja de agua creada difundiría al vacío. Por ello, en la simulación, se extienden periódicamente imágenes de la caja en las tres direcciones del espacio del sistema (Figura 11). Esto es conocido como PBC (del inglés Periodic Boundary Conditions). Cada interacción no enlazante sólo se considera una vez, bien dentro de la caja real o con átomos de las cajas imaginarias.


Figura 11: Condiciones periódicas (Periodic Boundary Conditions) utilizadas en los cálculos de DM con disolvente. La “caja real” es la que se encuentra en el centro del sistema, coloreada con un color más

intenso.

En la siguiente figura, se muestra el complejo SM3:APDT*RP solvatado por la caja de agua descrita anteriormente.

Figura 12: Complejo SM3:APDTgRP solvatado con una caja de agua TIP3P. La caja se extiende 10 Å, a partir de los extremos del soluto centrado en el origen.

La densidad de la caja es 0.8183 g/mL. Este valor ligeramente pequeño de la densidad se debe a que el programa xLEaP, cuando añade las moléculas de agua, borra aquellas


que se superponen o entran en contacto con las moléculas de soluto, quedando por lo tanto huecos.

Este efecto se aprecia bastante bien en la Figura 12. De hecho, la parte cercana a la molécula está más despoblada de aguas.

Una vez que se tiene la molécula con las moléculas de agua explicitas, el siguiente paso consiste en crear los dos archivos; el de coordenadas (con extensión xyz) y el de topología (con extensión tpp). Para ello, se utiliza el siguiente comando.

> saveAmberParm molecula APDTgRP_wat.tpp APDTgRP_wat.xyz

A continuación, se llevan a cabo los cálculos de DM. Para estos cálculos se ha utilizado el módulo PMEMD.CUDA,16 implementado en AMBER y que permite utilizar los 1536 microprocesadores presentes en la tarjeta NVIDA GTX 770, disminuyendo considerablemente el tiempo de cálculo.

Antes de llevar a cabo la DM, es preciso minimizar el sistema. Dicha minimización se realiza en dos pasos. Primero, una minimización únicamente de las moléculas agua, dejando fijo el soluto y, a continuación, una minimización de todo el sistema.

Para iniciar el programa PMEMD.CUDA se escribe el siguiente comando:

/home/usuario/amber12/bin/ -O –i min.in –o min1.out –p APDTgRP_wat.tpp –c APDTgRP_wat.xyz –r APDTRgP_wat_min.rst

El significado de cada una de las etiquetas que precede a los archivos se muestra en la siguiente tabla:

Tabla 3: Significado de palabras clave de AMBER.

O = sobrescribir archivos viejos

i = archivo con los parámetros para minimizar

o = archivo de salida

p = archivo de topología

c = archivo de coordenadas

r = archivo con las coordenadas minimizadas


Minimización únicamente del disolvente (min1.in)

&cntrl

imin = 1, (minimizar)

maxcyc = 1000, (número máximo de ciclos para minimizar)

ncyc = 500, (a partir de los 500 ciclos se pasa de steepest descent a conjugate gradient)

Steepest-descent es un método de minimización muy rápido,17 utilizado inicialmente y muy eficaz cuando el sistema se encuentra alejado del mínimo. Tras aplicar este método, se emplea el conjugated-gradient, que es computacionalmente menos costoso y muy eficaz cuando el sistema está ya próximo al mínimo de energía.18

ntb = 1, (condiciones periódicas, volumen constante)

ntr = 1, (utilizamos restricciones)

cut = 10, (cut-off para interacciones de Van der Waals. Es decir, distancia a partir de la cual se considera que estas interacciones son igual a 0. Se utiliza para disminuir el tiempo de cálculo)

/

En la siguiente sección se mantiene “fijado” el complejo SM3:APDT*RP, dejando sólo a las moléculas de agua que se muevan en la minimización.

500.0 (constante de fuerza para fijar el soluto en Kcalmol-1·Å-2)

RES 1 (residuos que forman parte del soluto)

END

Minimización de todo el sistema (min2.in):

&cntrl

imin = 1, (minimizar), maxcyc = 2500, (número máximo de ciclos para minimizar)

ncyc = 1000, (a partir de los 500 ciclos se pasa de steepest descent a conjugate gradient)

ntb = 1, (condiciones periódicas, volumen constante), ntr = 0, (sin restricciones)

cut = 10, (cut-off para interacciones de Van der Waals)

/


Dinámica Molecular (DM)

Una vez finalizada la minimización del sistema, se llevan a cabo tres DM encadenadas, siguiendo un protocolo19 establecido en el grupo de investigación de Química Biológica de la UR (ver Figura 13). La primera, de 20 ps de duración, tiene como objetivo subir la temperatura del sistema, a volumen constante, de 0 a 298 K, que es la temperatura a la que se desea realizar la simulación. En este paso, se mantiene fijo el soluto, utilizando una constante de fuerza de 10 Kcal·mol-1·Å-2. A continuación, se realiza una segunda DM de 100 ps de duración y a presión y temperatura constantes (1 atm, y 298 K, respectivamente). Esta simulación tiene como objetivo hacer que la densidad se estabilice y tienda a 1 g/mL. Finalmente, se realiza la MD3, de 100 ns, a presión y temperatura constante. En esta simulación, las coordenadas de cada átomo del sistema se guardan cada 2 ps, de forma que el archivo final contiene 50.000 frames (o pasos).

Figura 13: Esquema de las tres dinámicas moleculares que se realizan en el trabajo.


A modo de ejemplo, se muestra a continuación el archivo de entrada de DM1:

&cntrl

imin = 0, (dinámica molecular), ntb = 1, (condiciones periódicas, volumen constante) cut = 10 , ntr = 1, (con restricciones)

tempi = 0.0, temp0 = 298.0, (temperatura inicial y temperatura a la que queremos correr la dinámica molecular)

ntt = 1, (control de temperatura), nstlim = 10000, (número de ciclos), dt = 0.002, (timestep = 2 fentosegundos, utilizado para realizar las integrales con respecto al tiempo)

Si se multiplica el número de ciclos por el timestep se obtiene la duración de la dinámica molecular: = 10000 · 0.002 = 20 ps)

ntwx = 100, (graba la trayectoria cada 100 ciclos)

/

10.0 (constante de fuerza para fijar el soluto en Kcalmol-1·Å-2)

RES 1

END

Como puede verse en la Figura 14, la temperatura sube rápidamente de 0 a 298 K. De hecho, la temperatura deseada se alcanza en los primeros 2.5 ps.

Figura 14: Variación de la temperatura a lo largo de la DM1.

Tal como se ha comentado anteriormente, la segunda DM tiene como objetivo hacer que el sistema se equilibre y que la densidad tenga un valor próximo a 1 g/mL.

0

50

100

150

200

250

300

0 25 50 75 100 125 150 175 200

Tem

pera

tura

(K)

tiempo (ps)

0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0


Figura 15: Variación de la densidad a lo largo de la DM2.

Por último, la tercera dinámica (DM3) contiene las coordenadas del sistema en equilibrio (presión, temperatura y densidad constante) frente al tiempo. Esta es la DM que se analiza y de la cual se obtienen los datos que se muestran en la siguiente sección.

0.8

0.85

0.9

0.95

1

1.05

0 100 200 300 400 500

Dens

idad

(g/m

L)

tiempo (ps) 0 10.0 25.0 50.0 75.0 100

RESULTADOS Y DISCUSIÓN


Una vez realizada la DM3, se analiza la trayectoria y todos los datos obtenidos empleando principalmente dos programas, el VMD,20 que se puede descargar gratuitamente de la web (http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/) y un programa integrado en AMBER llamado CPPTRAJ.21

Para trabajar con estos dos programas son necesarios dos archivos. Por un lado, el archivo de topología (tpp) y por otro, el archivo “coord”, que contiene las coordenadas xyz de cada uno de los átomos del sistema (complejo antígeno-anticuerpo y disolvente) en función del tiempo. En ocasiones, este archivo recibe el nombre no muy acertado de “trayectoria”. En concreto, y como se ha comentado, este archivo presenta 50.000 frames, que equivalen a 100.000 ps (100 ns).

La cantidad de información que se puede obtener con estos dos programas es muy variada. Así, permite medir distancias entre átomos, monitorizar determinados ángulos o ángulos diedros durante la trayectoria, etc. El programa VMD además presenta la posibilidad de editar todas las imágenes o gráficos obtenidos, ya sea color, tamaño, tipo de representación, fondo y una infinidad de opciones de editar.

En la Figura 16 se muestra la superposición de 10 frames obtenidos durante la simulación DM3 (un frame por cada 10 ns). En esta figura se ha eliminado la “caja” de agua para simplificar la imagen. En color verde se muestra el anticuerpo SM3. En color añil la cadena peptídica del antígeno APDT*RP y en color fucsia el residuo GalNAc.

Figura 16: Superposición de 10 frames obtenidos de la DM3 en la que se muestra el complejo SM3:APDT*RP.

http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/


Esta superposición indica que la flexibilidad del anticuerpo es limitada, presentando una conformación mayoritaria. A simple vista también se observa que, sin embargo, el antígeno tiene cierto grado de flexibilidad.

En la Figura 17 se muestra la población obtenida de la DM3 para los distintos enlaces de hidrógeno observados en el rayos X entre el antígeno APDT*RP y el anticuerpo SM3 (ver Figura 5). Estos valores de población de los enlaces de hidrógeno pueden obtenerse fácilmente utilizando el programa CPPTRAJ, indicando simplemente el ID de los átomos entre los que queremos determinar la presencia de estas interacciones y la palabra clave hbond. Puede decirse que todos los enlaces de hidrógeno observados en el estado sólido12 (excepto el que implica a la Ala 1) están presentes en disolución, si bien muchos de ellos tienen una baja población. El metilo de la Ala1 tiene una orientación distinta a la estructura obtenida por rayos X y parece estar implicado en una interacción hidrofóbica con el anillo aromático de la Tyr32L.

Con respecto al GalNAc, el enlace de hidrógeno entre el hidroximetilo de este residuo y el OH de la Tyr32L está poblado en torno al 9% del tiempo total de la simulación.

Figura 17: Superposición de 10 frames del glicopéptido APDT*RP obtenidos de la DM3 de 100 ns realizada sobre el complejo antígeno-anticuerpo. La cadena peptídica del glicopéptido se muestra en

verde y el GalNAc en fucsia. Los residuos del anticuerpo que interaccionan directamente con el antígeno aparecen en amarillo, el resto aparecen en gris. La población de los enlaces de hidrógeno entre el

antígeno y el anticuerpo se muestra en gris y rosa.


En la Figura 18 se muestra una superposición de varios frames de la DM3 del antígeno. Estos frames se han superpuesto con la estructura observada en el rayos X (mostrada en color gris).

Figura 18: Superposición de 10 frames del antígeno APDT*RP en el complejo con el anticuerpo SM3 obtenida de la DM3. En gris se muestra la conformación obtenida por rayos X para este antígeno.

En general, la conformación de la cadena peptídica y del carbohidrato es muy similar a la del estado sólido, si bien hay diferencias interesantes, una de ellas, como ya se ha comentado es la orientación del metilo de la Ala1. La mayor diferencia está en la cadena lateral de la arginina 5. Como puede verse, en disolución parece existir una interacción electrostática entre la carga positiva del grupo guanidinio de la arginina 5 y la carga negativa del grupo CO2

- del ácido aspártico. Esta interacción, no observada en el rayos X, se denomina puente salino22 (ver Figura 19).

Figura 19: Puente salino entre ácido aspártico y arginina. La distancia entre los átomos mostrados en verde se ha utilizado en la figura 30 para monitorizar esta interacción electrostática.


En la Figura 20 se muestra la variación a lo largo de la DM3 de la distancia entre los átomos que aparecen en verde en la Figura 19. Como puede verse, inicialmente esta distancia es mayor a 7 Å. Sin embargo, a partir del frame 5000 la distancia se mantiene constante y en torno a 4 Å, lo que podría indicar la formación de una interacción electrostática fuerte, tipo puente salino.

Figura 20: Distancia en Å entre el ácido aspártico y la arginina (ver figura 28).

En la siguiente figura se muestran los ángulos diedros I y \ que se utilizan para caracterizar la conformación de un péptido o proteína. En general, estos diedros se agrupan en dos conformaciones de mínima energía en el diagrama de Ramachandran23 (Figura 21, panel derecho): la lámina E, con I/\ en torno a �90o/180o y la hélice D, con I/\ próximos a �60o /�30o.

Figura 21: Definición de ángulos I/\ para un aminoácido y diagrama de Ramachandran con las principales conformaciones de mínima energía.


Utilizando el programa VMD se puede obtener la distribución I/\ para cada uno de los aminoácidos que forman el glicopéptido APDT*RP. Esta distribución se muestra en la Figura 22. Como puede observarse, todos los residuos muestran una conformación similar a la observada en el rayos X, señalada con un punto rojo en los diagramas I/\. Cabe señalar, que la Thr4 muestra una conformación de tipo hélice D en el estado asociado, la cual varía considerablemente de la observada para este residuo en el estado libre. 24-27 Para el resto de los aminoácidos no hay diferencias significativas con respecto al estado libre.

Figura 22: Distribución de los ángulos I/\ de los distintos aminoácidos del glicopéptido APDT*RP en el estado asociado con SM3. Con un círculo rojo aparecen las conformaciones observadas en el rayos X

para cada residuo.

Adicionalmente, se ha estudiado la conformación del enlace glicosídico. Los ángulos diedros que definen dicho enlace se muestran en la Figura 23.

Figura 23: Definición de los ángulos diedros necesarios para estudiar el enlace glicosídico. Distribución I/\ para el enlace glicosídico y para el diedro F1 del residuo de treonina del glicopéptido APDT*RP en el

estado asociado con SM3.


El enlace glicosídico adopta mayoritariamente la típica conformación eclipsada observada en los derivados de GalNAc con treonina.28 Por otro lado, la cadena lateral de de este aminoácido (determinada por el diedro F1) es también bastante rígida, mostrando valores próximos a 60o.

Finalmente, es importante señalar que en la estructura de rayos X (Figura 5), el metilo del GalNAc está involucrado en una interacción tipo CH-S con el triptófano 33H (Trp33H).29 En la siguiente figura, se muestra la distribución de distancia entre el carbono del metilo y el centro del anillo aromático de este aminoácido. Como puede verse, en el estado asociado en disolución acuosa prevalece también dicha interacción, lo cual explica la mayor afinidad del derivado APDT*RP con respecto al péptido sin glicosilar.12

Figura 24: Distribución de la distancia entre el metilo del GalNAc y el centro del anillo aromático del Trp33H, donde puede observarse la presencia de una interacción CH-S entre ambos residuos.

0 2 4 6 8 100.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0Interacción�CH···π

Pop.

distance�/ÅDistancia/Å

CONCLUSIONES


En este trabajo se ha llevado a cabo el análisis conformacional en disolución acuosa de un complejo formado por un anticuerpo antitumoral (denominado SM3) y el glicopéptido Ala-Pro-Asp-Thr*-Arg-Pro, el cual presenta la treonina unida a un residuo de N-acetilgalactosamina a través de un enlace D-O-glicosídico, y se ha comparado con la estructura descrita por difracción de rayos X de dicho complejo.

Para ello se han realizado cálculos de dinámica molecular de 100 ns con moléculas de agua explícitas, a temperatura y presión constante (298 K y 1 atm), utilizando el programa AMBER 12, con los campos de fuerza ff03.r1 y GLYCAM06.

Con los datos obtenidos de la dinámica molecular se puede deducir que la conformación del glicopéptido en el estado asociado con el anticuerpo SM3 es similar a la observada en el estado sólido. Con respecto al fragmento peptídico, la diferencia más notable reside en la formación de un puente salino entre las cadenas laterales del ácido aspártico y de la arginina. Dicha interacción no existe en el estado sólido. Por otro lado, el enlace glicosídico presenta una conformación típica eclipsada. En cuanto a interacciones en las que está implicado el carbohidrato, existe un enlace de hidrógeno entre el hidroximetilo del GalNAc y la Tyr32L que es relativamente débil, con una población entorno al 10%; también existe una interacción CH-S entre el metilo del carbohidrato y uno de los triptófanos del anticuerpo. Estas interacciones pueden ser responsables de la mayor afinidad de los anticuerpos antitumorales por los derivados de mucina MUC1 parcialmente glicosilados con GalNAc.

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