MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA DE LOS · PDF fileprocedimientos in vitro que...

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE HIDALGO

INSTITUTO DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

ÁREA ACADÉMICA DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL E

INGENIERÍA EN ALIMENTOS

PROGRAMA EDUCATIVO DE

INGENIERÍA EN ALIMENTOS

MANUAL DE PRÁCTICAS DE

BIOQUÍMICA DE LOS PROCESOS METABÓLICOS

4º SEMESTRE

PROGRAMA EDUCATIVO DE INGENIERÍA EN ALIMENTOS

MANUAL DE PRÁCTICAS DE LA ASIGNATURA DE


DIRECTORIO:

HUMBERTO A. VERAS GODOY

RECTOR

ADOLFO PONTIGO LOYOLA

SECRETARIO GENERAL

OTILIO A. ACEVEDO SANDOVAL

DIRECTOR DEL INSTITUTO DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

ARTURO FLORES ÁLVAREZ

DIRECTOR GENERAL DE SERVICIOS ACADÉMICOS

CLARA ZÚÑIGA PÉREZ

DIRECTORA DE LABORATORIOS Y TALLERES

MIGUEL Á. MÍGUEZ ESCORCIA

SECRETARIO DEL INSTITUTO DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

RAFAEL GERMAN CAMPOS MONTIEL

JEFE DEL ÁREA ACADÉMICA DE ING. AGROINDUSTRIAL E ING. EN ALIMENTOS

BLANCA ROSA RODRÍGUEZ PASTRANA

COORDINADORA DEL PROGRAMA EDUCATIVO DE INGENIERÍA EN ALIMENTOS




FECHA DE APROBACIÓN DEL MANUAL DE PRÁCTICAS:

NOMBRE DE QUIENES PARTICIPARON EN LA ELABORACIÓN:

NOMBRE FIRMA

M. EN C. RODOLFO GÓMEZ RAMÍREZ

VO. BO. DEL PRESIDENTE Y SECRETARIO DE LA ACADEMIA:

NOMBRE FIRMA

M. EN C. RODOLFO GÓMEZ RAMÍREZ

M. EN A. JOSÉ JESÚS ESPINO GARCÍA

VO. BO. DEL COORDINADOR DEL PROGRAMA EDUCATIVO:

NOMBRE FIRMA

DRA. BLANCA ROSA RODRÍGUEZ PASTRANA

FECHA DE LA ÚLTIMA REVISIÓN Y/O ACTUALIZACIÓN:

REVISADO POR:

DIRECCIÓN DE LABORATORIOS Y TALLERES

JUNIO DE 2016

JUNIO DE 2016




ÍNDICE

A.- ENCUADRE DEL MANUAL DE PRÁCTICAS .............................................................. 5

1.- Introducción ................................................................................................................ 5

2.- Competencias ............................................................................................................. 5

3.- Programa del Sistema de Prácticas y Actividades Extramuros ................................... 5

B.- REGLAMENTO, NORMAS DE SEGURIDAD Y LINEAMIENTOS ............................... 5

1.- Reglamento de Laboratorios ....................................................................................... 5

2.- Medidas de Seguridad en los Laboratorios, Talleres, Clínicas y Actividades

Extramuros ..................................................................................................................... 10

3.- Lineamientos de seguridad para trabajar en laboratorios, clínicas, talleres y

actividades extramuros .................................................................................................. 11

C.- NORMAS DE SEGURIDAD ESPECÍFICAS DE LA PRÁCTICAS DE ESTE MANUAL

.......................................................................................................................................... 15

1.- Cuadro de normas y referencias de seguridad de la práctica ................................... 15

2.- Política Ambiental ..................................................................................................... 16

2a.- Cuadro de Disposición de Residuos .................................................................... 16

D.- CONTENIDO DE CADA PRÁCTICA EN PARTICULAR ............................................ 17

Práctica No. 1: Reacciones Bioquímicas de Oxido-Reducción ...................................... 18

Práctica No. 2: Efecto de la Temperatura sobre las Reacciones Bioquímicas............... 23

Práctica No. 3: Fase Fotoquímica de la Fotosíntesis ..................................................... 27

Práctica No. 4: Síntesis de Almidón en Plantas ............................................................. 33

Práctica No. 5: Hidrólisis Enzimática de la Sacarosa ..................................................... 39

Práctica No. 6: Respiración Aeróbica ............................................................................ 43

Práctica No. 7: Hidrólisis Enzimática de Triacilglicéridos ............................................... 47

Práctica No. 8: Hidrólisis Enzimática de Proteínas ........................................................ 50




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A.- ENCUADRE DEL MANUAL DE PRÁCTICAS

1.- Introducción

En la asignatura de Bioquímica de los Procesos Metabólicos se aborda el estudio de los

diferentes ciclos y rutas bioquímicas de síntesis y degradación de las principales

biomoléculas de importancia alimentaria. El estudio in vivo de dichas reacciones implica

procedimientos complicados que solamente se pueden llevar a cabo en laboratorios

altamente especializados. No obstante, en la actualidad se han desarrollado

procedimientos in vitro que involucran el uso de enzimas y reactivos purificados, mediante

estos procedimientos se simula lo que ocurre dentro del organismo animal o vegetal. En

este manual se describen procedimientos sencillos pero que ilustran de manera eficaz

algunas de las reacciones bioquímicas más importantes.

2.- Competencias

COMPETENCIA

GENÉRICA NIVEL INDICADORES

Comunicación 2

1. Seleccionan técnicas de pensamiento, lecto-escritura y expresión oral en español y/o en un segundo idioma.

2. Expresan y argumentan de forma oral y escrita ideas y pensamientos de manera coherente y lógica en español y/o en un segundo idioma.

3. Comunican ideas de forma oral y escrita estableciendo relaciones entre lo que leen y lo que entienden.

4. Elaboran fichas analíticas de contenidos especializados y realizan exposiciones temáticas.

Formación 2

1. Analizan la situación desde una única perspectiva. 2. Comprenden y expresan las diferentes partes del problema ubicando los

aspectos más significativos del mismo. 3. Expresan ideas de manera concreta. 4. Categorizan la información siguiendo un orden lógico. 5. Realizan acciones siguiendo instrucciones e introduce algunos cambios.

Pensamiento Crítico

1 1. Se familiarizan con los problemas sociales y de su profesión. 2. Identifica las partes, cualidades, las múltiples relaciones, propiedades y

componentes de un problema.

Creatividad 1 2. Generan ideas con facilidad. 7. Se interrogan, interesan e inquietan por los contenidos y objetos de

aprendizaje.

Liderazgo Colaborativo

1

1. Planifican y desarrollan el plan de trabajo. 4. Cuentan con responsabilidad y autonomía media. 5. Necesitan orientación y supervisión. 7. Afrontan situaciones cotidianas en contextos estructurados.

Ciudadanía 1

1. Se basan en normas y criterios de comportamiento identifica la diversidad de principios éticos, resultado del contexto en que se desenvuelven los sujetos y los colectivos con los que interactúa.

2. Presentan baja responsabilidad y autonomía. 3. Necesitan orientación y supervisión del académico. 4. Afrontan situaciones sencillas y resuelve problemas cotidianos donde se

presentan conflictos de intereses en contextos estructurados.

Uso de la Tecnología

1 1. Identifican las diversas tecnologías de la información y comunicación (TIC’s)

con aplicación en el campo profesional y social.




6

3.- Programa del Sistema de Prácticas y Actividades Extramuros

NÚM.

DE

PRÁCTIC

A

UNIDAD

PROGRAMÁTI

CA

SESIONE

S

NOMBRE

DE LA

PRÁCTICA

ÁMBIT

O

DE

DESARROLL

O

PROGRAMACIÓ

N

DE LA

PRÁCTICA

(SEMANA)

1 1 1 Reacciones Bioquímicas

de Oxido-Reducción. Laboratorio 8

2 1 1

Efecto de la Temperatura

sobre las Reacciones

Bioquímicas.

Laboratorio 9

3 2 1 Fase Fotoquímica de la

Fotosíntesis. Laboratorio 10

4 2 1 Síntesis de Almidón en

Plantas. Laboratorio 11

5 3 1 Hidrólisis Enzimática de

la Sacarosa. Laboratorio 12

6 3 1 Respiración aeróbica Laboratorio 13


Triacilglicéridos. Laboratorio 14


Proteínas. Laboratorio 15

2. Se utilizan las TIC's como herramientas de apoyo en el desarrollo de los contenidos básicos. (Sistemas operativos básicos, software de aplicación, entre otros).

COMPETENCIA ESPECÍFICA

NIVEL INDICADORES

Supervisión y Control de Procesos Alimentarios

1

2. Interpretan y resuelven problemas de química, fisicoquímica y bioquímica que les servirán como base para el entendimiento de los fenómenos que ocurren en los productos alimentarios en el proceso de transformación y durante el almacenamiento.

3. Manejan equipo y material de laboratorio de química, biología y física, así como equipo de cómputo.

Diseño y Mejoramiento de Productos, Procesos y Plantas Alimentaria

1


Aseguramiento de la Calidad de Productos Alimentarios

1





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B.- REGLAMENTO, NORMAS DE SEGURIDAD Y LINEAMIENTOS

1.- Reglamento de Laboratorios

CAPÍTULO III

De los usuarios

Artículo 18. Se consideran como usuarios de los laboratorios:

I. Los alumnos de la Universidad que, conforme a los planes y programas de

estudio de los diferentes niveles educativos, requieran de este apoyo.

II. El personal académico de la Universidad que requiera apoyo de los

laboratorios.

III. Los estudiantes o pasantes que se encuentren realizando tesis o prácticas

profesionales, prestatarios de servicio social o colaborando en actividades

académicas.

IV. Los profesores visitantes que requieran de la utilización o Servicios de los

laboratorios de acuerdo a convenios establecidos.

V. Las personas que, por causa académica justificada, autorice el Director de la

Unidad Académica.

Artículo 19. Los usuarios alumnos de la Universidad deberán acreditar esta calidad así

como el derecho a cursar la asignatura con la que se relaciona la práctica y/ó proyecto a

realizar, de acuerdo a los programas educativos vigentes.

Artículo 20. Tratándose de prácticas de asignatura de los planes y programas de estudio

vigentes en que deba asistir el grupo, éste quedará a cargo del profesor titular del mismo,

quien lo controlará y asesorará. En caso de que el profesor no asista, la práctica no podrá

realizarse.

Artículo 21. Los usuarios académicos de la Universidad deberán acreditar esta calidad

ante el Responsable de Laboratorios, así como tener aprobados los proyectos de

investigación.

Artículo 22. Los usuarios estudiantes a que se refiere la fracción III del artículo 18 de este

reglamento podrán hacer uso del laboratorio, clínica o taller de que se trate, con la

acreditación respectiva y cuando cuenten con la asesoría del director de tesis o del

investigador responsable del proyecto en el que participan, previo registro ante el Jefe de

Laboratorios, del protocolo de investigación aprobado y con el visto bueno del Director de

la Unidad Académica.




8

Artículo 23. Los profesores visitantes nacionales o extranjeros deberán acreditar su

pertenencia a la institución que representan, así como los programas y convenios con los

que se relaciona la actividad por realizar y tener aprobados los proyectos de investigación.

CAPÍTULO IV

De la operación y uso

Artículo 24. Los laboratorios permanecerán abiertos en el horario definido por cada

Unidad Académica. Cualquier uso fuera del horario de operación, deberá ser autorizado

por el director de la Unidad Académica.

Artículo 25. Durante el tiempo de operación de los laboratorios, solamente tendrán acceso

para su uso, en los horarios previamente establecidos:

I. El personal adscrito a los mismos.

II. Los usuarios a quienes se refiere el artículo 18 de este reglamento.

Artículo 27. Tras la adquisición o pérdida de algún equipo o mobiliario de laboratorio, el

Jefe de Laboratorio tiene la obligación de notificar inmediatamente su alta o baja dentro

del inventario. En caso de pérdida, se procederá a levantar un acta informativa y se

seguirá el procedimiento legal que corresponda.

Artículo 28. Cada laboratorio deberá contar con un archivo general, manuales de prácticas

y de operación, una bitácora actualizada de servicios prestados, prácticas o proyectos

realizados, otra bitácora por cada equipo que así lo requiera, y una copia del inventario

interno actualizado, que serán resguardados por el Responsable del Laboratorio.

Artículo 29. Las llaves de las puertas de acceso al laboratorio y de las demás áreas físicas

del mismo, estarán en poder del Responsable, y se contará con un duplicado en la

dirección de la Unidad Académica.

Artículo 30. Las mesas de trabajo de cualquier laboratorio, clínica y taller, serán usadas

mientras dure la práctica, por lo que no se podrá dejar material en ellas por mayor tiempo

del autorizado. En el caso de tratarse de procesos continuos que no se puedan

interrumpir, se comunicará al Responsable.

Artículo 31. Los espacios físicos destinados a cubículos u oficinas dentro de los

laboratorios, así como el mobiliario, equipo y materiales para el mismo fin, sólo podrán ser

utilizados por el personal adscrito al laboratorio.

Artículo 32. Durante su estancia en los laboratorios, toda persona se abstendrá de fumar,

de consumir alimentos, del uso de teléfono celular y radiolocalizador. La no observancia a

esta disposición causará la suspensión del derecho al uso de los laboratorios.




9

Artículo 33. Los equipos, herramientas, reactivos y materiales del laboratorio, que se

empleen durante una práctica o prestación de servicios, quedarán bajo la responsabilidad

directa del usuario que los solicitó. El solo hecho de hacer el vale correspondiente no da

derecho al usuario a sustraerlo de la Unidad, ni a conservarlo en uso exclusivo más del

tiempo autorizado; salvo autorización especial y por escrito del director de la Unidad

Académica.

Artículo 34. Todo material y equipo solicitados deberán ser devueltos al Responsable del

Laboratorio, quien tiene la obligación de revisar que estén completos y en buen estado.

En caso contrario, registrará este hecho en la bitácora del laboratorio, o del equipo

específico, notificando inmediatamente al Jefe de Laboratorios, quien hará un convenio

con el o los alumnos para fincar la responsabilidad y acordar la modalidad de la

reparación de la pérdida o daño, lo cual será informado a la dirección de la Unidad

Académica.

Artículo 35. Toda pérdida o daño al equipo o del material causados por el usuario serán

repuestos o reparados por él mismo, en especie o pagos, a través de depósito bancario o

directo en la Coordinación de Administración y Finanzas, en un lapso no mayor de quince

días hábiles, contados a partir de la fecha del incidente. De no cumplir lo anterior, se le

suspenderá el permiso para utilizar los laboratorios, clínicas o talleres y se sujetará a lo

dispuesto por la legislación universitaria.

Artículo 36. La persona que haga mal uso del equipo, materiales o instalaciones, o que

presente un comportamiento indisciplinado, será amonestada o se le suspenderá

temporal o definitivamente el permiso de uso de los laboratorios, clínica o taller, según la

gravedad o frecuencia con que dicha acción se realice, y de acuerdo a lo establecido en el

reglamento interno de la Unidad Académica correspondiente.

Artículo 37. Es obligación del Responsable del Laboratorio, supervisar el cumplimiento de

las reglas de seguridad, contar con carteles, cuadros u otros señalamientos. Será su

responsabilidad revisar y actualizarlos periódicamente.

Artículo 38. Todo usuario alumno que no utilice o que haga mal uso de los materiales de

protección diseñados para trabajar en el área o que ponga en peligro a otros usuarios a

través de su comportamiento inadecuado, se hará acreedor a las siguientes sanciones:

I. Será amonestado verbalmente. De no corregir de inmediato su actitud, le

será suspendida la autorización para seguir trabajando ese día.

II. En caso de reincidir, será suspendido por el resto del semestre.




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Artículo 39. El director de la Unidad Académica aplicará las sanciones referidas en el

artículo 38, según la gravedad de la falta.

Artículo 40. Respecto a los usuarios académicos de la Universidad y a los profesores

visitantes que infrinjan las normas de seguridad y disposiciones de este reglamento, la

Dirección de la Unidad Académica comunicará a la Secretaría General las faltas

cometidas para que, en su caso, se apliquen las sanciones que procedan.

Artículo 41. Ningún equipo, accesorio, material, reactivo o mobiliario podrá ser sustraído

de los laboratorios, sin la autorización de la dirección de la Unidad Académica, debiendo

el Jefe de laboratorios, vigilar y registrar, de acuerdo a los procedimientos establecidos

por la Dirección de Recursos Materiales cualquier mudanza autorizada, fuera o dentro de

la unidad académica.

Artículo 43. El manejo de reactivos y materiales dentro de los laboratorios deberá

sujetarse a las normas nacionales e internacionales que en materia de seguridad e

higiene estén establecidas.

Artículo 44. Toda información técnica perteneciente a los equipos y accesorios de un

Laboratorio es parte integral del mismo, y deberá estar disponible para su consulta en el

lugar al que pertenecen.

Artículo 45. Cada equipo mayor deberá contar con una bitácora de operación propia, la

cual será un libro de pasta dura, con hojas foliadas y resistentes, y se ubicará

permanentemente junto al equipo correspondiente; cada vez que sea utilizado un equipo,

el usuario deberá registrar en ella:

I. Nombre y firma;

II. Fecha;

III. Proyecto, práctica o servicio al que corresponde el uso;

IV. Hora de inicio del uso del equipo;

V. Hora de terminación del uso del equipo;

VI. Número de muestras y material usados;

VII. Unidad académica o dependencia externa de adscripción; y

VIII. Observaciones generales.

CAPÍTULO V

De los servicios

Artículo 47. Se consideran servicios prestados por los laboratorios: a toda actividad en

apoyo a la docencia e investigación, así como asesoría, capacitación, análisis, fabricación

y preparación de muestras, evaluación técnica de procedimientos experimentales, de




11

control, medición o calibración que se prestan a la comunidad universitaria o a los

sectores externos a la misma.

Artículo 48. Los servicios de los laboratorios serán de dos tipos: internos y externos.

Articulo 49. Los servicios internos serán gratuitos, y son aquellos servicios prestados a

usuarios internos que tengan por objeto cumplir con alguna de las funciones sustantivas

de la Universidad, siempre y cuando no represente un gasto no autorizado previamente.

Artículo 50. Tratándose de los servicios a los usuarios a que se refiere la fracción III del

artículo 18 del presente reglamento, los laboratorios, clínicas y talleres, les proporcionarán

aquellos que son de carácter general; en tanto que el costo de reactivos o materiales

específicos relacionados con las tesis de titulación, los cubrirá la Universidad, siempre y

cuando se tenga la autorización previa del presupuesto respectivo.

2.- Medidas de Seguridad en los Laboratorios, Talleres, Clínicas y Actividades

Extramuros

1. Las sustancias que se manejan comúnmente en el laboratorio y/ó taller son altamente

contaminantes. Como UNIVERSITARIOS tenemos gran compromiso con el cuidado del

medio ambiente y en consecuencia debemos desecharlas adecuadamente conforme a las

indicaciones que te indique tu catedrático. “NO DESECHES TUS SOLUCIONES,

RESIDUOS O PRODUCTOS DIRECTAMENTE EN LA TARJA”, utiliza los contenedores

correspondientes al tipo de sustancia en particular.

2. El usuario tendrá cuidado de no contaminar los reactivos o sustancias que utilice, o

tomar alguna directamente con la mano. Existen reactivos y/ó sustancias de los cuales se

preparan soluciones diluidas, que son altamente corrosivos. En este sentido, el contacto

con ellos deber ser reducido al mínimo con las manos, la nariz o la boca. Usar en todos

los casos una perilla o propipeta o bien el material apropiado para auxiliarte al tomar la

cantidad deseada de reactivo.

3. El usuario, por ningún motivo pipeteará las soluciones con la boca, así como tampoco

“PIPETEARA” directamente del frasco que contiene al reactivo o sustancia a utilizar. Para

ello, toma sólo la cantidad necesaria en un vaso de precipitados y NO DEVUELVAS EL

RESTANTE al frasco de origen, consulta con el Catedrático qué hacer con este restante y

sigue sus instrucciones. Así evitarás accidentes que van desde ligeros hasta muy graves,

y a la vez, que los reactivos se contaminen y que los resultados de tu práctica (y la de los

demás) se vean afectados.

4. Si el usuario necesita preparar una solución con reactivo(s) que desprende gases

(como los ácidos o el amoniaco) deberá HACERLO EN LA CAMPANA, PREVIA

ACTIVACIÓN DE LOS EXTRACTORES, y NO en las mesas de laboratorio.




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5. En caso de que alguna sustancia corrosiva te llegue a caer en la piel o en los ojos,

LAVA INMEDIATAMENTE la parte afectada al chorro del agua al menos durante 5

minutos y AVISA AL CATEDRÁTICO, para lo conducente. Si el derrame fue en una area

considerable de la piel o si el derrame fue en la ropa, usa las regaderas que están ubicadas en el

laboratorio y/ó taller.

6. Cuando peses en la balanza cualquier producto químico deberás utilizar un pesafiltro o

un recipiente adecuado, NUNCA en un trozo de papel. Además, procura no tirar el

producto alrededor de la balanza ya que puedes dañarla. Si esto sucede límpialo

inmediatamente con una brocha y/o con un trozo de tela limpio.

3.- Lineamientos de seguridad para trabajar en laboratorios, clínicas, talleres

y actividades extramuros

I. Todos los usuarios deberán respetar la Normatividad Universitaria vigente.

II. Los usuarios sólo podrán trabajar y permanecer en el laboratorio y/ó taller, bajo la

supervisión directa del catedrático. En ningún caso el auxiliar o responsable de

laboratorio, podrá suplir al catedrático ó investigador en su función.

III. Para asistir a sesiones de laboratorio y/ó taller, es requisito indispensable que los

usuarios se presenten con manual de prácticas,guía de trabajo y/ó de

investigación, con los materiales específicos por adquisición personal, necesarios

para el trabajo a realizar en los laboratorios y/ó talleres y portar adecuadamente su

equipo de seguridad según aplique, a indicación del catedrático:

Laboratorios y/ó talleres: bata reglamentaria blanca o de color y de manga

larga, y en caso de talleres de ingeniería pelo recogido, sin adornos, uñas cortas y

sin portar alhajas. Asimismo deberá portar, zapato y/ó bota antiderrapantes, portar

en cada visita a obra y en la realización de trabajo en campo el casco de seguridad

tipo jockey y el chaleco de seguridad de malla con franja reflejante. Si el catedrático

considera alguna otra, favor de indicarla previamente a los alumnos para que estén

en posibilidad de cumplirla estrictamente.

IV. En todo momento deberás conducirte en el laboratorio y/ó taller, con respeto y

responsabilidad hacia el catedrático y a los demás, tomando en cuenta que la

seguridad de tus compañeros y que la preservación de este espacio depende de

todos y cada uno de los usuarios.

V. El laboratorio y/o taller NO proporcionará manuales de prácticas a los usuarios, ya

que éstos serán suministrados por el catedrático de la asignatura correspondiente.

VI. La entrada al laboratorio y/ó taller será a la hora exacta de acuerdo a lo




13

Programado.

VII. El usuario solicitará el equipo, utensilios, herramienta, material y reactivos descritos correctamente, de acuerdo a las especificaciones del manual de prácticas, mediante el vale de préstamo debidamente requisitado. Formato DLA-009 y su identificación oficial de la U.A.E.H.

VIII. El usuario deberá revisar el mobiliario, equipo, herramienta y material que se les

proporcione, verificando que esté limpio, ordenado, completo y funcionando, éste

quedará a responsabilidad del usuario(s), durante el tiempo que dure la práctica y

después de su uso, deberá ser entregado en las mismas condiciones en las que le

fue proporcionado.

IX. El usuario que solicite y reciba el material, herramienta y/ó equipo deberá ser quien

a la vez, haga la entrega del mismo, al final de la práctica.

X. Si el usuario no conoce el funcionamiento del equipo o máquina alguna, puede

provocar que ésta sea averiada o bien provocar algún accidente al tratar de

utilizarla, para evitar lo anterior, por favor ¡solicite asesoría a su catedrático!.

XI. Al devolver el mobiliario, equipo y material, el usuario deberá solicitar el vale de

laboratorio Formato DLA-009 y su identificación oficial de la U.A.E.H.

XII. Cuando el material quede bajo la responsabilidad del usuario, el vale de laboratorio

Formato DLA-009 y su identificación oficial de la U.A.E.H., será retenido por el

auxiliar o responsable hasta la devolución del material.

XIII. El usuario de laboratorio o taller, debe conocer la ubicación y el uso de los

extintores, las puertas de emergencia y la circulación correcta del lugar así como

las rutas de evacuación, para que en emergencia, proceda correctamente.

XIV. Todo frasco, bolsa, caja o contenedor, deberán ser etiquetados. Por lo tanto

cualquier sustancia con recipiente no etiquetado será desechada, conforme a lo

que indica el “Manual de Procedimientos. Departamento Control del Medio

Ambiente” DLA-MO-7.2-01.6.

XV. En caso de pérdida, ruptura o desperfecto del equipo o material de laboratorio, el

usuario solicitará al auxiliar el vale de adeudo Formato DLA-010 y anotará en éste

el nombre y número de cuenta de todos los integrantes del equipo y será

respaldado con la identificación oficial de la U.A.E.H., debidamente requisitada en

este vale. El adeudo se repondrá en un plazo no mayor a 15 días hábiles. En este

procedimiento se retendrá únicamente el vale de adeudo.




14

XVI. Si el material adeudado no es repuesto en el plazo fijado, el o los usuarios

responsables, no podrán continuar con la realización de las prácticas

correspondientes. Control de adeudo Formato DLA-011.

XVII. En caso de no cumplir con la reposición del material en el plazo establecido, el

usuario(s), será(n) dado(s) de alta, en la aplicación del Sistema Institucional de

Control de Adeudos en Laboratorios, Clínicas y Talleres, implementado en la

Dirección de Laboratorios y Talleres de la U.A.E.H.

XVIII. La acreditación de cada una de las prácticas que se realicen, estará sujeta a la

evaluación que aplique el catedrático y a lo estipulado por la Dirección de

Administración Escolar.

XIX. El usuario que realice práctica de recuperación deberá cumplir con todo lo

estipulado en el presente.

XX. Los usuarios que por indisciplina o negligencia pongan en peligro su integridad, la

de sus compañeros, la del mobiliario, material, utensilios o la de las instalaciones,

serán sujetos a la sanción correspondiente prevista en el Reglamento de

Laboratorios Artículo 36 y 38.

XXI. Por la naturaleza de las cosas que existen en el laboratorio debes mantenerte

alerta y sin distracciones y además NO corras, NO ingieras alimentos, NO se

permite el uso de equipos de sonido personales y NO SE PERMITEN VISITAS

DURANTE TU ESTANCIA EN NINGÙN LABORATORIO, CLÍNICA O TALLER.

XXII. El usuario que incurra en alguna falta académica será sancionado de acuerdo a la

Normatividad Universitaria vigente.

XXIII. Queda estrictamente prohibido realizar cualquier tipo de actividad ajena al

desarrollo de las tareas propias del laboratorio, clínica y/o taller.

XXIV. Todo usuario deberá entrar y salir por los accesos autorizados, en orden y

cuidando su integridad y la de sus compañeros. (Manual de Higiene, Seguridad y

Ecología, Capitulo 1).

XXV. Los usuarios deben reportar cualquier anomalía o maltrato por parte del catedrático

y del personal de laboratorio, al jefe de los mismos o en su caso a la Dirección de

la Escuela o Instituto.




15

XXVI. Al concluir la práctica, deben dejar limpia el área de trabajo, así como el mobiliario,

material y equipos utilizados. NO TIRES PAPELES Y/O BASURA A LAS TARJAS,

MESAS Y/O EQUIPOS.

XXVII. Al concluir la licenciatura, maestría o doctorado y realices el trámite de titulación

solicitarás la constancia de “no adeudo de material, herramienta y/o equipo de

laboratorios, clínicas y talleres”, para obtenerla harás una donación en especie

(material que se usa en los, clínicas, laboratorios y talleres) de acuerdo al Formato

DLA-043, la cantidad de la donación será entre tres y cuatro salarios mínimos

vigente en el estado de Hidalgo para ello es necesario entregar la nota y escribir en

el formato el material donado, posteriormente el documento que se extienda se

entregará a la Dirección de Laboratorios y Talleres donde se elabora y entrega la

constancia de no adeudo.

XXVIII. Las situaciones no previstas en este lineamiento serán resueltos por la Dirección

correspondiente y la Dirección de Laboratorios de acuerdo a la legislación

universitaria aplicable.

XXIX. En los laboratorios se toma en cuenta la regla de cortesía la cual marca que por

ningún motivo o circunstancia las personas que se encuentren dentro de las

instalaciones del laboratorio, clínica y/o taller deberán de nombrarse con apodos,

malas palabras o faltarse al respeto de cualquier connotación sexual, racial o

social. En caso contrario la Dirección correspondiente y la Dirección de

Laboratorios aplicarán lo conducente de acuerdo a la legislación universitaria

aplicable.




16

C.- NORMAS DE SEGURIDAD ESPECÍFICAS DE LA PRÁCTICAS DE ESTE MANUAL

1.- Cuadro de normas y referencias de seguridad de la práctica

Para el llenado, consulte el “Manual de Higiene, Seguridad y Ecología”

TIPO DE RIESGO

COMO EVITARLO

COMO PROCEDER EN CASO DE

UN ACCIDENTE…




17

2.- Política Ambiental

2a.- Cuadro de Disposición de Residuos

“Manual de Procedimientos del Departamento de Control del Medio Ambiente. Plan de Manejo de los Residuos C R E T I(Corrosivos, Reactivos, Explosivos, Tóxicos e Inflamables) y el “Manual de Procedimientos del Departamento de Control del Medio Ambiente. Plan de Manejo de los Residuos R P B I” (Residuos Peligrosos Biológicos e Infecciosos).

TIPO DE RESIDUOS CLASIFICACIÓN TIPO DE CONTENEDOR

Es compromiso de todos los integrantes de la comunidad universitaria cumplir la

normatividad vigente aplicable en materia ambiental, así como con los requisitos e

iniciativas que la Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo emita, para mitigar el

impacto ambiental generado por las actividades universitarias y para direccionar a la

institución hacia el desarrollo sostenible mediante el fomento del equilibrio entre el

respeto al medio ambiente y el desarrollo universitario.

Política ambiental




17

D.- CONTENIDO DE CADA PRÁCTICA EN PARTICULAR

1. Identificación

2. Introducción

Las enzimas que catalizan oxidaciones celulares canalizan los electrones desde

centenares de sustratos diferentes hacia unos cuantos tipos de transportadores

universales de electrones. La reducción de estos transportadores en los procesos

catabólicos permite la conservación de la energía libre que se produce en la oxidación

de los sustratos. Las moléculas de NAD+, NADP+, FMN y FAD son coenzimas

hidrosolubles que experimentan oxidación y reducción reversibles en muchas

reacciones de transferencia de electrones del metabolismo. Los nucleótidos NAD+,

NADP+ se trasladan fácilmente de una enzima a otra, mientras que los nucleótidos de

flavina, FMN y FAD suelen estar muy fuertemente unidos a las enzimas llamadas

flavoproteínas, en las que actúan como grupo prostético. Las quinonas liposolubles

como la ubiquinona y la plastoquinona actúan como transportadores de electrones y

donadores de protones en el medio no acuoso de las membranas. Las

oxidorreductasas pueden transferir directamente el hidrógeno separado de diferentes

sustratos al oxígeno molecular, obteniéndose como resultado peróxido de hidrógeno.

Este compuesto constituye un tóxico poderoso para las células, razón por la cual tienen

necesidad de eliminarlo, disponiendo para ello de otras oxidorreductasas entre las

cuales se encuentran las peroxidasas.

Estas enzimas catalizan la oxidación de fenoles y otra gran cantidad de sustancias

mediante la reducción del peróxido a agua, como ocurre con la hidroquinona, uno de

sus posibles sustratos:

Hidroquinona + Peróxido Quinona + Agua

La quinona obtenida es un compuesto de color pardo cuya concentración es

directamente proporcional a la absorbancia medida a 400 nm, la cual puede utilizarse

como medida de su concentración. Además, la variación de la absorbancia con el

NOMBRE DE LA PRÁCTICA:

NO. DE PRÁCTICA: NO. DE SESIONES:

NO. DE INTEGRANTES MÁXIMO POR EQUIPO:

Reacciones Bioquímicas de Oxido-Reducción

1 2

5




18

3. Objetivo General

4. Objetivos Específicos

5. Reactivos/Insumos, Materiales/Utensilios y Equipos/Instrumentos

a) Reactivos/Insumos

CANTIDAD UNIDAD DESCRIPCIÓN ESPECIFICACIONES OBS.

1 pieza Papa Fresca, sin daño

aparente.

1 pieza Rábano Fresco, sin daño

aparente.

mL H2O2 0.05 M

mL Buffer de fosfatos 200 mM pH 7,0

mL Mezcla de guayacol/ H2O2

(40mM/20mM)

en buffer de fosfatos

de pH 5.5

una vez

preparada,

realizar

una

dilución

1:10

mL Soln de KMnO4 10 mM una vez

preparado,

realizar

una

dilución

1:50

100 mL Buffer de fosfatos 0.2 M, pH 5.5

25 mL Buffer de calibración pH 4.0

tiempo se puede tomar como medida de la velocidad de la reacción.

En los vegetales la peroxidasa, con sus diferentes formas isoenzimáticas, parece estar

relacionada con la oxidación de numerosos compuestos, proceso que tiene lugar con

mayor intensidad durante la maduración de los frutos. Estas isoenzimas se encuentran

en el interior de vacuolas celulares

Evaluar las reacciones de óxido-reducción catalizadas por enzimas.

Aplicar técnicas específicas de extracción de enzimas catalizadoras de reacciones de

óxido reducción.

Evaluar la actividad de enzimas catalizadoras de reacciones de óxido reducción




19

25 mL Buffer de calibración pH 7.0

b) Materiales/Utensilios


1 pieza Matraz Kitazato 250 o 500 ml

1 pieza Embudo Buchner

2 pieza Matraz Erlenmeyer 250 ml

2 pieza Papel filtro

2 pieza Tubos de centrífuga Hermle

refrigerada

De fondo redondo, con

tapón de rosca, de 50

ml.

1 pieza Probeta Graduada, de 50 ml.

1 pieza Embudo Chico, de cristal o de

plástico, de cuello

corto

2 pieza Vaso de precipitados Capacidad de 250 ml

1 pieza Matraz aforado Capacidad de 25 ml





1 pieza Micropipeta Capacidad de 50 μl



1 pieza Gradilla Para tubos de 13 x

100mm

2 pieza Trozos manta de cielo 25 x 25 cm aprox.

1 pieza Piceta Capacidad de 100 ml

5 pieza Celdas para

espectrofotómetro

De plástico o de vidrio,

de 3 ml

1 pieza Bureta De 25 ml

1 pieza Soporte universal

1 pieza Pinza para bureta

c) Equipos/Instrumentos


1 equipo pH metro

1 equipo Centrífuga refrigerada

1 equipo Balanza analítica Sensibilidad de

0.0001g




20

6. Desarrollo de la Actividad Práctica

Extracción de la catalasa

Moler una papa en la licuadora con 80 ml de agua destilada.

Filtrar el extracto primero a través de una gasa y posteriormente a través de papel

filtro. Se ajusta el volumen del filtrado a 100 ml con agua destilada.

Realizar estas operaciones lo más rápido posible y una vez que ya se hayan

preparado el resto de las soluciones.

Vaciar el filtrado en un EM y colocarlo en agua con hielo hasta su utilización.

Actividad de la catalasa

Colocar en un tubo de ensayo 100 µl de extracto enzimático y 900 µl de H2O2 500 mM

preparado en buffer de fosfatos 200 mM pH 7,0, manteniendo esta mezcla 40 °C.

Luego de 5 min de reacción se adicionan 250 µl de H2SO4 (1:3) para desnaturalizar la

enzima y detener la descomposición del H2O2.

Se titula el H2O2 no descompuesto con la solución de KMnO4.

Puesto que dentro del extracto enzimático pueden existir otros componentes

diferentes a la catalasa que descompongan el H2O2 se prepara un blanco, preparado

de la misma manera que las mezclas de reacción aunque con la incorporación del

H2SO4 (1:3) previo a la adición del extracto enzimático.

Una unidad de actividad de la catalasa (UCAT) se define como los µmol de H2O2

descompuesto/min.

Extracción de la peroxidasa:

Para extraer peroxidasas se pela y se corta un rábano en trozos pequeños, se muele

en la licuadora con 80 ml de agua destilada, se filtra recibiendo el filtrado en un EM y

se ajusta el volumen a 100 ml. Se mantiene en agua con hielo hasta su utilización.

Actividad de la Peroxidasa

La actividad la peroxidasa se evalúa por la medida del incremento de la absorbancia a

470 nm cada 5 s durante 120 s.

En un tubo de ensayo se colocan 100 µL de extracto enzimático y 1.9 ml de la mezcla

de guayacol/ H2O2, mezclar rápidamente y colocar en la celda del espectrofotómetro.

Tomar inmediatamente la lectura contra un blanco de agua destilada y repetir la

lectura a los 60 y a los 120 segundos.

Se trabaja un blanco de reactivos, el cual se prepara igual que la mezcla de reacción,

con la diferencia de que el extracto enzimático se hierve previamente en un baño

maría a 92




21

7. Cuestionario

8. Bibliografía

9. Formato y Especificación del Reporte de Práctica

°C durante 20 min asegurando la desnaturalización de la enzima.

Una unidad de actividad de peroxidasa (UPOD) se define como el cambio en una unidad

de absorbancia por min.

1. Investigar sobre las características de las enzimas evaluadas: PM, estructura, pH

óptimo, temperatura óptima.

2. Investigar cual es la importancia de las enzimas catalasa y peroxidasa.

- Baquero, L. E. D., J. A. R. Castro y C. E. C. Narváez. 2005. Catalasa, peroxidasa y

polifenoloxidasa en pitaya amarilla (Acanthocereus pitajaya): Maduración y

senescencia. Acta Biológica Colombiana, Vol. 10 No. 2, 2005 59

- Nelson, L. D. y M. M. Cox. 2000. Lehninger Principios de Bioquímica. Ediciones

Omega, S. A., Barcelona, Esp.

- Stryer, L., J. M. Berg y J. L. Tymoczko. 2003. Bioquímica, 5a edición. Editorial

Reverté, S. A. Barcelona, Esp.

a) Introducción

b) Objetivo

c) Desarrollo de la actividad práctica

d) Resultados

e) Discusión

f) Cuestionario

g) Bibliografía

Discutir la diferencia entre la función de las enzimas peroxidasa y catalasa.

Discutir cómo expresaría la actividad específica de las enzimas evaluadas y cuál es la diferencia con la actividad enzimática reportada en la práctica.




22

1. Identificación

2. Introducción




Efecto de la temperatura sobre la velocidad de

las reacciones bioquímicas

2 1

5

La temperatura afecta a todas las reacciones químicas. Cuanto mayor es la temperatura, mayor es la velocidad de reacción (McKee y McKee, 2003), lo anterior se debe a que un gran número de moléculas alcanzan un nivel energético suficiente para experimentar un cambio químico. A este nivel energético se le conoce como energía de activación. Para alcanzar la energía de activación en la mayoría de las reacciones inorgánicas es necesario utilizar temperaturas altas, cercanas o mayores a los 100°C. Dado que estas temperaturas no las resiste un ser vivo, la mayoría de las reacciones bioquímicas son catalizadas por las enzimas, las cuales disminuyen la energía de activación, favoreciendo el desarrollo de dichas reacciones sin necesidad de incrementar la temperatura. No obstante, la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas también aumenta al incrementar la temperatura del medio de reacción. Como las enzimas se desnaturalizan a temperaturas elevadas, dentro de un rango de temperatura (particular para cada enzima) el incremento de temperatura producirá un incremento en la velocidad de la reacción, pero al llegar a la temperatura de inicio de desnaturalización de la enzima, el incremento en temperatura producirá una disminución en la velocidad de la reacción. Cada enzima tiene una temperatura óptima a la que actúa con su máxima eficacia. La temperatura óptima depende otras condiciones del medio de reacción como el pH y la fuerza iónica y, comúnmente, esta temperatura será cercana a la temperatura normal del organismo del que procede. Por ejemplo, la temperatura óptima de la mayoría de las enzimas del ser humano está próxima a los 37°C (McKee y McKee, 2003). Las hidrolasas que rompen la unión alfa (1 4) del almidón reciben el nombre de amilasas. Se encuentran en la saliva y en el jugo pancreático de los animales, también se encuentran en vegetales y en microorganismos. La alfa amilasa es una endoamilasa que ataca las uniones glucosídicas a lo largo de la cadena, por tanto, los primeros productos de la acción de la amilasa son cadenas de amilosa más pequeñas que las originales. La acción prolongada de la alfa amilasa produce maltosa y pequeñas cantidades de glucosa y residuos de cadena corta de amilosa. La alfa amilasa actúa sobre la amilopectina a partir de las cadenas exteriores, pero también rompe enlaces ubicados entre los puntos de ramificación, sin embargo, su acción se detiene poco antes de llegar a los puntos de ramificación (Espín et al., 2004).




23

3. Objetivo General



a) REACTIVOS/INSUMOS

CANTIDAD DESCRIPCIÓN ESPECIFICACIONES OBS.

60 ml

Soln. patrón de almidón (0.1g/litro). Para 100 ml de solución:

Se pesa 0.01 g de almidón y se coloca en un EM de 250 ml. Se agrega aprox. 70 ml de água

destilada y se hierve por 5 minutos. Se lleva a temperatura ambiente, se

pasa a un matraz volumétrico de 100 ml y se afora.

4,000 U Alfa amilasa fúngica

40 ml Ácido acético 2N

12 ml Yoduro de potasio al 10%

80 ml Yodato de potasio 0.002M

b) MATERIALES/UTENSILIOS


1 Piceta de 250 ml

1 Matraz erlenmeyer de 250 ml

1 Matraz aforado de 100 ml

1 Probeta graduada de 50 ml


22 Tubos de ensayo de 15 x 150 mm

1 Gradilla para tubos de 15 x 150 mm

1 Micropipeta de 100 a 1000 microlitros


2 Vaso de precipitados de 100 ml


Evaluar el efecto de la temperatura sobre las reacciones bioquímicas.

Medir la actividad hidrolítica de la alfa amilasa sobre el almidón.

Medir el cambio en la actividad hidrolítica de la alfa amilasa con respecto a la temperatura de reacción.




24




1 Termómetro de 0 a 100°C

3 Vidrios de reloj

1 Espátula

2 Barras magnéticas para agitación

1 Gendarme de teflón

1 Cristalizador

c) EQUIPOS/INSTRUMENTOS


1 Balanza analítica Sensibilidad de 0.0001

g

1 Baño de incubación con termostato

1 Espectrofotómetro

Hidrólisis enzimática del almidón

a. Colocar 30 ml de solución de almidón (0.1g/litro) en cada uno de tres matraces

Erlenmeyer de 125, etiquetados como ‘T10’, ‘Tamb.’ y ‘T55’.

b. Incubar cada matraz a su respectiva temperatura (10°C, temperatura ambiente o 55°C). En recipientes separados incubar a su respectiva temperatura la solución enzimática, la cual deberá permanecer al menos 10 minutos en incubación.

c. A los tres matraces se les agrega 2000 U de alfa amilasa. A partir de este momento iniciar el cronómetro para registrar el tiempo de reacción.

Cuantificación del almidón remanente

d. Cada 2 minutos colocar 1 ml de la mezcla de reacción en un tubo de ensayo y agregarle las soluciones indicadas en los siguientes cuadros:

T10

Volumen en ml

Tubo Mezcla de reacción

Agua destilada

Ácido acético 2N

Yoduro de potasio al 10%

Yodato de potasio 0.002M

1 1 0 1.2 0.3 2.5

2 1 0 1.2 0.3 2.5

.

.

. 1

0 1.2 0.3 2.5

10 1 0 1.2 0.3 2.5

(blanco) 0 1 1.2 0.3 2.5




25

Tamb.

Volumen en ml


Agua destilada

Ácido acético 2N



1 1 0 1.2 0.3 2.5

2 1 0 1.2 0.3 2.5 . . .

1 0 1.2 0.3 2.5

10 1 0 1.2 0.3 2.5

(blanco) 0 1 1.2 0.3 2.5

T55

Volumen en ml


Agua destilada

Ácido acético 2N



1 1 0 1.2 0.3 2.5

2 1 0 1.2 0.3 2.5 . . .

1 0 1.2 0.3 2.5

10 1 0 1.2 0.3 2.5

(blanco) 0 1 1.2 0.3 2.5

e. Mezclar bien el contenido de cada tubo y leer inmediatamente la absorbancia a 570

nm, ajustando el espectrofotómetro a cero con el blanco de reactivos. Trabajar con dos celdillas que den la misma lectura con agua destilada, utilizando una para el blanco y otra para las muestras.

f. Elaborar una curva patrón de almidón como se indica en el siguiente cuadro:

Volumen en ml

Tubo Conc. final de almidón

(µg/ml)

Soln. patrón de almidón (0.1g/litro)

Agua destilada

Ácido acético

2N

Yoduro de

potasio al 10%

Yodato de

potasio 0.002M

A1 10 0.1 0.9 1.2 0.3 2.5

A2 20 0.2 0.8 1.2 0.3 2.5

A3 30 0.3 0.7 1.2 0.3 2.5

A4 40 0.4 0.6 1.2 0.3 2.5

A5 50 0.5 0.5 1.2 0.3 2.5

f.1. Medir inmediatamente la absorbancia de las muestras a 570 nm, ajustando el espectrofotómetro a cero con el blanco de reactivos.

f.2. Con los datos de curva patrón de almidón calcular la ecuación de regresión y utilizarla para calcular las concentraciones de almidón de las muestras.

(Rodes y Collazo, 2006)




26

7. Cuestionario

8. Bibliografía


Espín, S., Villacrés, E. y Brito, B. 2004. Caracterización físico-química, nutricional y funcional de raíces y tubérculos andinos. En: Conservación y uso de la biodiversidad de raíces y tubérculos andinos: Una década de investigación para el desarrollo (1993-2003), editado por Barrera, V., Tapia, C. y Monteros, A. Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias, Quito, Ecuador.

McKee, T y J. McKee. 2003. Bioquímica. La Base Molecular de la Vida, tercera edición. McGraw-Hill-Interamericana, Madrid, Esp.

Rodes, R. y Collazo, M. 2006. Manual de prácticas de fotosíntesis, 1ª Ed. Las prensas de ciencias, Universidad Nacional Autónoma de México, Facultad de Ciencias, México, D.F.

1. Investiga el número E.C. de la enzima utilizada y explica qué significado tiene dicho número.

2. El color desarrollado en la mezcla de reacción se debe a la interacción de las cadenas de amilosa con el I2. Si en la mezcla de reacción no se adicionó una solución de I2, explique de dónde proviene dicha substancia.

a) Introducción

b) Objetivo


d) Resultados

e) Discusión

f) Cuestionario

g) Bibliografía Elabore una gráfica de ‘Tiempo de reacción contra [almidón] con los datos de las tres

temperaturas de reacción utilizadas. Se deberá obtener algo parecido a la gráfica mostrada

enseguida:

[almidón]

10°C

Tamb

55°C

Tiempo de reacción

citlali

Texto tecleado

Concentración inicial de almidón: 0.1 g x 1x106 µg x 1 litro x 30 = 75 µg/ml litro1 g 1000 ml40




27

1. Identificación

2. Introducción

3.

4.

5.

6.

7. 8.

9.




Fase fotoquímica de la fotosíntesis

3 1

5

Experimentar con la fase fotoquímica de la fotosíntesis.

Las dos etapas de la fotosíntesis son conocidas tradicionalmente como reacciones lumínicas y

reacciones independientes de la luz (reacciones oscuras). En las reacciones lumínicas las

moléculas de pigmentos especializadas del fotosistema I capturan la energía lumínica y, a la

postre, pierden un electrón. Una serie de reacciones de transferencia de esos electrones

culmina con la reducción del NADP+ produciendo NADPH, lo anterior va de la mano con la

generación de un gradiente de protones transmembrana cuya energía se utiliza para sintetizar

ATP a partir de ADP + Fosfato inorgánico (Voet et al., 2009). Los pigmentos oxidados del

Fotosistema I son reducidos por electrones provenientes de los pigmentos del Fotosistema II,

los cuales son enseguida reducidos por electrones provenientes de la fotólisis del agua,

proceso que también produce protones, que son liberados en el lumen tilacoidal (Taiz y Zeiger,

2006).

Varios herbicidas interfieren con la fotosíntesis de manera específica. El amitrol inhibe

la biosíntesis de clorofila y de carotenoides. Otro herbicida, la atrazina, inhibe la

fotólisis del agua. Otros herbicidas interfieren con la transferencia de electrones; en el

fotosistema II, el diurón inhibe la transferencia de electrones a la plastoquinona,

mientras que los herbicidas del tipo de bigiridilio aceptan electrones compitiendo con

los aceptores de electrones del fotosistema I. Los inhibidores activos del fotosistema I

incluyen al diquat y al paraquat (Campbel y Farrel, 2004).




28

3. Objetivo General



d) REACTIVOS/INSUMOS


10 ml 2,6-Dicloro fenolindolfenol (DCPIP) 2.0 x 10-4 M

20 ml Buffer fosfato pH 6.5 (frio)

30 ml Sacarosa 0.5 M (frio) 5 g Hojas de espinaca Fresca

10 ml Solución de Paraquat Al 0.5% en agua destilada.

50 cm Papel aluminio

e) MATERIALES/UTENSILIOS

CANTIDAD DESCRIPCIÓN ESPECIFICACIONES OBS. 2 Matraz Erlenmeyer 250 ml

2 Papel filtro

4 Tubos de centrífuga Hermle refrigerada De fondo redondo, con tapón de rosca, de 50 ml.

6 Tubos de ensayo 15 x 150 mm con tapón de rosca

1 Probeta Graduada, de 50 ml. 1 Embudo Chico, de cristal o de

plástico, de cuello corto

2 Vaso de precipitados Capacidad de 250 ml 3 Vaso de precipitados Capacidad de 50 ml 1 Vaso de precipitados Capacidad de 100 ml 4 pipetas de 5 ml Graduadas 2 pipetas de 2ml Graduadas 1 Gradilla Para tubos de 15 x

Evaluar el efecto de sustancias inhibidoras sobre el flujo de electrones en el proceso de la fotosíntesis. Evaluar el efecto de la ausencia de luz sobre el flujo de electrones en el proceso de la fotosíntesis.

Experimentar con la fase fotoquímica de la fotosíntesis.




29


150mm

2 Gasas Limpias y secas 1 Piceta Capacidad de 250 ml 1 Mortero con pistilo Capacidad de 100 ml

f) EQUIPOS/INSTRUMENTOS


1 Potenciómetro

1 Centrífuga refrigerada Hermle, con rotor para

tubos de 50 ml.

1 Balanza analítica Sensibilidad de 0.0001 g

1 Espectrofotómetro Para lectura de absorbancia en el rango visible

Aislamiento de los cloroplastos

a) Lavar las hojas de espinaca, enjuagarlas con agua destilada y secarlas.

b) Cortar con las tijeras fragmentos de hojas con pocas nervaduras, pesar 10 g y

molerlas en un mortero con 30 ml de sacarosa 0.5 M.

c) Filtrar a través de una gasa para quitar los residuos.

d) Centrifugar la solución a 2500 rpm durante 5 minutos a 4°C y desechar el

sobrenadante (los cloroplastos están en el fondo).

e) Resuspender el precipitado (que contiene los cloroplastos) con 10 ml de buffer

frío y centrifugar a 2500 rpm durante 5 minutos a 4°C.

f) Repetir el paso 5.

g) Resuspender el precipitado con 10 ml de buffer frío y colocar los tubos en hielo.

(Melgarejo et al., 2010).




30

Reducción del DCPIP por el NADPH y efectos del herbicida y de la ausencia de luz a. Marcar cuatro tubos de ensayo de 15x150 ml (del 1 a 4) y adicionar las soluciones conforme se muestra en el siguiente cuadro:

SOLUCION Vol. de solución (ml)

Tubo No. 1 Tubo No. 2 Tubo No. 3 Tubo No. 4

Cloroplastos aislados

DCPIP

Paraquat

Buffer de fosfatos frío

Agua destilada

2

0

0

5

3

2

3

0

5

0

2

3

0

5

0

2

3

3

2

0

TOTAL 10 10 10 10

b. El tubo 2 se cubre con papel aluminio

c. Los tubos 1, 3 y 4 se exponen a la luz

d. Colocar los tubos en un vaso de precipitado con agua suficiente para cubrirlos (sin que penetre el agua o floten) y exponerlos a la lámpara encendida o a la luz del sol. Esperar 15 minutos y comparar visualmente las coloraciones de los tubos. e. Filtrar el contenido de los tubos y leer su absorbancia a 590 nm frente a un blanco de agua destilada. f. Restar a los tubos 2, 3 y 4 la absorbancia del tubo # 1. g. Calcular los moles de NADPH producidos por minuto de reacción. Curva de calibración del DCPIP a. Preparar las diluciones de la solución de DCPIP que se indican en el siguiente cuadro:

0.080 mM 0.040 mM 0.024 mM 0.008 mM

Soln. de DCPIP 0.2 mM (ml) 10 5 3 1

H2O destilada Aforar a 25 ml

b. Leer la absorbancia a 590 nm frente a un blanco de agua destilada.




31

7. Cuestionario

8. Bibliografía


1. Indique de dónde provienen los electrones que reducen los pigmentos oxidados del

fotosistema I.

2. Mencione cuál es la molécula donadora de electrones para reducir los pigmentos

oxidados del fotosistema II.

3. Mencione cuál es la molécula portadora de ‘poder reductor’ obtenida en la

fotosíntesis.

4. Mencione cual es la molécula portadora de energía obtenida en la fotosíntesis.

Campbell, M. y Farrel, S. 2004. Bioquímica, 4ª Ed. International Thompson Editores, S.A. de C. V., México, D.F. Melgarejo, L., Hernández, S., Barrera, J., Solarte, M., Suárez, D., Pérez, L. Rojas, Y., Cruz, M., Moreno, L., Crespo, S. y Pérez, W. 2010. Experimentos en fisiología vegetal. Universidad Nacional de Colombia, Bogotá. Taiz, L. y Zeiger, E. 2006. Fisiología vegetal, vol. 1. Publicacions de la Universitat Jaume I., Castelló de la Plana, Esp. Voet, D., Voet, J. y Pratt, C. 2009. Fundamentos de Bioquímica, La vida a nivel molecular, 2ª Ed., 2ª reimpresión. Editorial Médica Panamericana, Buenos Aires, Argentina.

a) Introducción b) Objetivo c) Desarrollo de la actividad práctica d) Resultados e) Discusión f) Cuestionario g) Bibliografía

Elabora un diagrama del flujo de electrones de los foto-sistemas I y II y señala los sitios donde

actúan los inhibidores

http://www.bdigital.unal.edu.co/8545/




32

1. Identificación.

NOMBRE DE LA PRÁCTICA: Síntesis de almidón en plantas

No. DE PRÁCTICA: 4 NO. DE SESIONES: 1

NO. DE INTEGRANTES MÁXIMO POR EQUIPO: 4

2. Introducción.

Las plantas almacenan almidón dentro de estructuras celulares denominadas plástidos, que

incluyen los cloroplastos. La síntesis de almidón le permite a la planta acumular un superávit de

glucosa. Debido a que la glucosa es un importante combustible celular, el almidón representa

energía almacenada (Campbell y Reece, 2007).

La luz es un factor determinante en la activación y regulación del metabolismo del almidón. Por

tanto, las modificaciones drásticas en el ritmo circadiano, la intensidad o la calidad de la luz,

afectan la tasa de acumulación y degradación del almidón, la removilización desde los vertederos

de los productos de la hidrólisis del almidón, y la concentración de carbohidratos solubles (Tofiño

et al., 2007).

El almidón está compuesto por dos tipos de polisacáridos, la amilosa, una estructura

lineal formada por moléculas de glucosa unidas mediante enlaces glucosídicos alfa (1

4), y la amilopectina, una molécula ramificada formada por moléculas de glucosa

unidas mediante enlaces glucosídicos alfa (1 4) con la diferencia de que a intervalos

de 20 a 25 residuos de glucosa se presentan ramificaciones con otras cadenas lineales,

debidas a enlaces glucosídicos alfa (1 6). Las cadenas de amilosa están formadas

por 200 a 300 residuos de glucosa, formando una estructura helicoidal con 6 a 8 residuos

de glucosa por cada vuelta de la hélice. Por su parte, la amilopectina está compuesta por

cientos de miles de residuos de glucosa y su peso molecular puede ser superior a los 108

Da (Koolman y Röhm, 2004).

3. Objetivo General. Experimentar con la síntesis de almidón en plantas.




33

4. objetivos específicos.

Evaluar el efecto de la luz sobre la producción de almidón en plantas.

Medir el almidón producido por las plantas expuestas a diferentes condiciones de iluminación.

5. Reactivos/insumos, materiales/utensilios y equipos.

g) REACTIVOS/INSUMOS


2 Plantas de geranio, en buen estado,

con hojas extensas.

Lo consigue el alumno.

40 ml Ácido acético 2N

15 ml Yoduro de potasio al 10%

200 ml Alcohol etílico absoluto o al 96%

70 ml Yodato de potasio 0.002M

10 ml

Soln. patrón de almidón (0.1g/litro) Soln. patrón de almidón (0.1g/litro).

Para 100 ml de solución: Se pesa 0.01 g de almidón y se coloca em um EM de 250 ml. Se

agrega aprox. 70 ml de água destilada y se hierve por 5 minutos. Se lleva a temperatura ambiente, se pasa a un matraz volumétrico de 100

ml y se afora.

h) MATERIALES/UTENSILIOS


1 Piceta de 250 ml


1 Mortero con pistilo

1 Embudo de vidrio de tallo corto

2 Tubo para centrífuga. De plástico, de fondo redondo, de 50 ml de capacidad.

1 Matraz aforado de 100 ml

1 Probeta graduada de 50 ml


20 Tubos de ensayo de 15 x 150 mm

1 Gradilla para tubos de 15 x 150 mm

1 Micropipeta de 100 a 1000




34

microlitros






1 Termómetro de 0 a 100°C

3 Vidrios de reloj

1 Espátula

2 Barras magnéticas para agitación

1 Gendarme de teflón

2 Cristalizadores

Papel de aluminio o cartulina

Clips

2 Gasas

i) EQUIPOS/INSTRUMENTOS


1 Balanza analítica Sensibilidad de 0.0001

g

1 Baño de incubación Con termostato





35

6. Desarrollo de la Actividad Práctica.

Efecto de la luz sobre la producción de almidón

a. Seleccionar plantas de geranio sin daños aparentes y con gran superficie foliar.

b. Las hojas de una de las plantas se cubren con trozos de cartulina o de papel aluminio sujetados a la hoja con clips, de manera que se cubra aproximadamente la mitad de la hoja. Deberá cubrirse tanto la cara superior (haz) como la cara inferior (envés).

c. Colocar ambas plantas a la luz del sol a temperatura ambiente durante 5 días, regándolas diariamente.

Extracción de almidón de las hojas

a. Colocar 20 g de hojas limpias y secas en un matraz EM de 250 ml, agregar 100 ml de etanol y calentar en baño maría hasta extraer los pigmentos de las hojas.

b. Eliminar la fracción etanólica y enjuagar las hojas con etanol caliente limpio.

c. Secar las hojas y triturarlas en un mortero, con agua destilada hirviente.

d. Vaciar el contenido del mortero a un EM de 250 ml. Enjuagar el mortero con agua destilada y vaciar el agua de lavado en el mismo matraz.

e. Incubar el contenido del matraz en un baño de agua a 90°C y con agitación constante durante una hora.

f. Filtrar a través de una gasa y enjuagar dos o tres veces el matraz con agua hirviente, pasando el líquido de lavado a través de la gasa.

g. Enfriar el contenido del matraz mediante inmersión en un baño de agua con hielo hasta que alcance la temperatura ambiente.

h. Vaciar la muestra en tubos de centrífuga y centrifugar a 10,000 rpm durante cinco minutos.

i. Vaciar el sobrenadante en un matraz volumétrico de 100 ml y aforar con agua destilada.





36

Cuantificación de almidón de las hojas

a. Colocar en tubos de ensayo las cantidades de extracto y soluciones indicadas en el siguiente cuadro:

Volumen en ml

Tubo Extracto Agua

destilada Ácido

acético 2N Yoduro de

potasio al 10% Yodato de

potasio 0.002M

1 1 0 1.2 0.3 2.5

2 1 0 1.2 0.3 2.5

3 1 0 1.2 0.3 2.5

4 1 0 1.2 0.3 2.5

5 1 0 1.2 0.3 2.5

6 1 0 1.2 0.3 2.5

7 (blanco) 0 1 1.2 0.3 2.5

Tubos 1-3: Muestras de plantas expuestas completamente al sol. Tubos 4-6: Muestras de plantas expuestas parcialmente al sol.

e. Medir inmediatamente la absorbancia de las muestras a 570 nm, ajustando el espectrofotómetro a cero con el blanco de reactivos.

f. Elaborar una curva patrón de almidón como se indica en el siguiente cuadro:

Volumen en ml

Tubo Conc. final de almidón

(µg/ml)

Soln. patrón de almidón (0.1g/litro)

Agua destilada

Ácido acético

2N

Yoduro de

potasio al 10%

Yodato de

potasio 0.002M

A1 10 0.1 0.9 1.2 0.3 2.5

A2 20 0.2 0.8 1.2 0.3 2.5

A3 30 0.3 0.7 1.2 0.3 2.5

A4 40 0.4 0.6 1.2 0.3 2.5

A5 50 0.5 0.5 1.2 0.3 2.5

g. Medir inmediatamente la absorbancia de las muestras a 570 nm, ajustando el espectrofotómetro a cero con el blanco de reactivos.

h. Con los datos de curva patrón de almidón calcular la ecuación de regresión y utilizarla para calcular las concentraciones de almidón de las muestras.





37

7. Cuestionario.

8. Bibliografía.


1. Realice un diagrama de las reacciones implicadas en la síntesis de almidón en plantas.

2. ¿Cuáles son las substancias producidas en la fase fotoquímica de la fotosíntesis y que se utilizadas posteriormente en la fase oscura?

3. ¿Cuál es la función del yodo en el método de cuantificación del almidón?

Campbell, N. y Reece, J. 2007. Biología, 7ª Ed., Editorial Médica Panamericana, Madrid, España.

Koolman, J. y Röhm, K. 2004. Bioquímica, Texto y Atlas, 3ª Ed. Revisada y ampliada. Editorial Médica Panamericana, Buenos Aires, Argentina. Rodes, R. y Collazo, M. 2006. Manual de prácticas de fotosíntesis, 1ª Ed. Las prensas de ciencias, Universidad Nacional Autónoma de México, Facultad de Ciencias, México, D.F. Tofiño, A., Romero, H. y Ceballos, H. 2007. Efecto del estrés abiótico sobre la síntesis y degradación de almidón. Una revisión. Agronomía Colombiana, 25(2): 245-254.


A partir de los datos de absorbancia y de la curva de calibración calcula las concentraciones de almidón en las muestras y discute si coinciden con los resultados esperados.




38




39




Hidrólisis Enzimática de la Sacarosa

5 1

5

1. Identificación

2. Introducción

3. Objetivo General


Estudiar la reacción de hidrólisis de la sacarosa.

Extraer la invertasa de levadura.

Evaluar la actividad hidrolítica de la invertasa sobre la sacarosa.

El disacárido más abundante en la naturaleza es la sacarosa, formada por la unión

entre la glucosa y la fructosa mediante enlace (α1 β2); es decir, ambos azúcares

aportan al enlace los carbonos anoméricos, formando un enlace dicarbonílico, y

quedando en consecuencia el disacárido sin poder reductor. La sacarosa es la forma

en que los hidratos de carbono son transportados por las plantas y es el azúcar de

mesa común (Feduchi et al., 2014).

La β-D-fructofuranosidasa (EC 3.2.1.26) cataliza la hidrólisis de restos terminales no

reductores β -D- fructofuranosídicos. El sustrato más importante de esta enzima es la

sacarosa, por lo que también recibe el nombre de sacarasa. El nombre común de

invertasa se debe a que los productos de la reacción presentan un cambio de signo (de

positivo a negativo) del valor de rotación óptica, ya que mientras la sacarosa es

dextrorrotatoria, la mezcla equimolecular de glucosa y fructosa que resulta de su

hidrólisis es levorrotatoria, por tal motivo, al producto de la hidrólisis suele llamársele

‘azúcar invertido’ (Blanco, 2006)




40




10 g Acetato sódico

20 ml Ácido acético

10 g D-Glucosa

Invertasa de levadura

La consigue al alumno

1 g Ácido 2,3-dinitrosalicílico

30 g Tartrato sódico potásico

10 Hidróxido sódico

5 Sacarosa



5 Celdas para el espectrofotómetro

1 Piceta

1 Gradilla para tubos de 15x150

1 Micropipeta de 10 a 15 μl

1 Micropipeta de 100 a 1000 μl

13 Tubos de ensayo de 15x150

20 Tubos de ensayo de 13x100 con

tapón de rosca.

1 Pipeta graduada de 0.1 ml

1 Pipeta graduada de 0.5 ml

1 Pipeta graduada de 1 ml

1 Pipeta graduada de 5 ml

1 Papel filtro

1 Pipeta Pasteur de plástico

1 Probeta de 10 ml

1 Probeta de 100 ml

1 Probeta de 250 ml

1 Matraz volumétrico de 25 ml

3 Pesafiltros de 25 ml

1 Matraz EM de 500 ml

2 Barra magnética para agitación


1 Varilla de vidrio

2 Espátula acanalada

1 Embudo de plástico de tallo corto

4 Tubos de fondo redondo para

centrífuga


1 Frasco de 250 ml con tapón de

rosca




41

2 Matraz volumétrico de 50 ml

1 Termómetro de -10 a 150°C

c. Equipos/instrumentos


1 Agitador magnético

1 Balanza (sensibilidad de 1 mg)

1 Baño termostático

1 Bloque seco o baño de agua hirviendo

1 Centrífuga


1 Homogenizador

1 Potenciómetro


6.1. Curva de calibración de glucosa

a) Preparar una solución de glucosa 40 mM y a partir de ésta preparar las siguientes diluciones:

Tubo Soln. de glucosa 40 mM (ml)

Agua destilada (ml)

Concentración de glucosa obtenida (mM)

0 0 5 0

1 0.25 4.75 2

2 0.5 4.5 4

3 0.75 4.25 6

4 1.0 4.0 8

5 1.25 3.75 10

6 2.5 2.5 20

7 5.0 0 40

b) Homogenizar las diluciones. c) Pipetear 0.1 ml de disolución de glucosa a un tubo de 13x100 con tapa de rosca. d) Añadir 1 ml del reactivo DNS, mezclar bien e incubar en un el bloque seco a 100

ºC durante 10 minutos. e) Enfriar y medir la absorbancia a 570 nm, utilizando como blanco la mezcla del tubo

0. Nota. Procesar cada disolución de glucosa por duplicado.




42

7. Cuestionario

8. Bibliografía

6.2. Extracción de la invertasa de levadura de panadería

a) Suspender 1 g de levadura liofilizada en 200 ml de búfer de acetato 0.1 M (pH 5.0 en NaCl 0.5 M).

b) Agitar la mezcla durante 15 min. También puede realizarse la extracción con ultrasonido o con un homogenizador.

c) Centrifugar la mezcla y tomar el sobrenadante como extracto enzimático. Guardar en refrigeración.

6.3. Ensayo de la actividad invertasa del extracto enzimático

a) Preparar en tubos de ensayo las mezclas de reacción como se indican en la siguiente tabla:

Blanco de sustrato Blanco de enzima Problema

Sacarosa 0.2M (ml) 0 1.0 1.0

Búfer de acetato 0.1M pH 5.0 (ml) 2.0 2.0 2.0

Agua destilada (ml) 2.0 1.1 1.0

Extracto enzimático (μl) 100 0 100

b) Incubar los tubos a 55 ºC durante 15 min. c) Transcurrido el periodo de incubación, detener la reacción sumergiendo los tubos en un baño de hielo picado. d) Pipetear 0.1 ml de la mezcla de reacción a un tubo de ensayo con tapón de rosca para medir el contenido de azúcares reductores por el método DNS. e) A partir de los valores de absorbancia de los ensayos problema, restando la absorbancia de de los blancos, determinar la actividad invertasa del extracto.

1. Investiga qué es la actividad óptica, cómo se mide y qué tipo de sustancias presentan esta propiedad.

2. Investiga el valor de actividad óptica de la sacarosa y de los productos de su hidrólisis. 3. Investiga cuáles son las condiciones óptimas de reacción de la enzima utilizada.

Blanco, A. 2006. Química Biológica, Ed. El Ateneo, Buenos Aires, Arg.

Feduchi, E., Blasco I., Romero C. y Yañez E. 2014. Bioquímica. Conceptos Esenciales, Editorial Médica Panamericana, Buenos Aires, Arg.

Murray, R., Bender A., Botham K., Kennelly P., Rodwell V. y Weil A. 2010. Harper.

Bioquímica Ilustrada, 28ª Ed. Mc Graw Hill Interamericana Editores, S.A. de C.V.,

México, D.F.




43


a) Introducción

b) Objetivo


d) Resultados

e) Discusión

f) Cuestionario

g) Bibliografía

Reportar la actividad de la invertasa en micromoles de sacarosa transformada por minuto.




30




Respiración aeróbica

6 1

5

1. Identificación

2. Introducción

3. Objetivo General


La vida de animales superiores depende por completo de un aporte de oxígeno para la respiración, el proceso por medio del cual las células obtienen energía en forma de ATP a partir de la reacción controlada de hidrógeno con oxígeno para formar agua (Murray et al., 2010). La respiración aerobia, el proceso que genera la mayoría de la energía que requieren los eucariotas, tiene lugar en las mitocondrias. Integradas en la membrana interna de la mitocondria están los ensamblajes respiratorios, donde se sintetiza el ATP (McKee y McKee, 2003). Utilizando oxígeno como aceptor electrónico terminal, los organismos aerobios, como los animales y los vegetales, oxidan totalmente el piruvato para formar CO2 y H2O mediante el mecanismo complejo de la respiración aerobia (McKee y McKee, 2003).

Estudiar el proceso de respiración aeróbica.

Cuantificar la producción de CO2 en el proceso de respiración aeróbica.

Evaluar el efecto de la actividad física sobre el proceso de respiración aeróbica.




31



CANTIDAD UNIDAD DESCRIPCIÓN ESPECIFICACIONE

S

OBS.

5 g Hidróxido de sodio

5 ml Fenolftaleína

Al 0.1% en etanol


CANTIDAD UNIDAD DESCRIPCIÓN ESPECIFICACIONE

S

OBS.

1 Piceta

1 Gotero o Pipeta Pasteur de

plástico

1 Probeta de 50 ml

1 Probeta de 100 ml

1 Bureta de 25 ml

1 Barra magnética

1 Soporte universal

1 Pinza para bureta

4 Matraz EM de 250 ml

3 Popotes de plástico Los trae el estudiante

c. Equipos/instrumentos


1 Agitador magnético

1 Balanza analítica


a) Preparación de soluciones para titulación del CO2. Mezclar 25 ml de una solución de NaOH 0.25 M con 75 ml de agua. Esta se utilizará para la titulación.

b) Preparar dos vasos con 100 ml de agua c/u. Poner c/u sobre un papel blanco. Marcar uno como control y el otro como ensayo. Añadir a cada vaso 6 gotas de fenolftaleína.

c) Añadir gota a gota la solución de NaOH al vaso marcado como control hasta que el agua cambie al más leve tono de rosa.

d) Soplar por 10 segundos a través de un popote dentro del agua del vaso marcado como ensayo. NO INHALAR durante este tiempo. Enseguida titular el contenido del vaso con la solución de NaOH.

e) Repetir el paso (d) pero ahora después de haber realizado actividad física: e1) Trotar en el mismo sitio durante 3 minutos, e2) Realizar ‘saltos de tijera’ durante 3 minutos. Las pruebas debe realizarlas la misma persona y deberá haber descansado al menos 10 minutos entre cada serie de ejercicios.




32

7. Cuestionario

8. Bibliografía

9. Formato y Especificaciones del Reporte de Práctica

1. Investiga la reacción que ocurre en la titulación del CO2. 2. Investiga en cuáles etapas bioquímicas se producen el CO2 y el H2O. 3. Además del oxígeno ¿Qué otras sustancias pueden participar como aceptores de electrones

en la respiración celular?

McKee, T y J. McKee. 2003. Bioquímica. La Base Molecular de la Vida, tercera edición. McGraw-Hill-Interamericana, Madrid, Esp.

Murray, R., Bender A., Botham K., Kennelly P., Rodwell V. y Weil A. 2010. Harper.

Bioquímica Ilustrada, 28ª Ed. Mc Graw Hill Interamericana Editores, S.A. de C.V.,

México, D.F.


Reportar la cantidad de CO2 presente en el aire expirado con y sin previa actividad física.




33




Hidrólisis Enzimática de Triacilglicéridos

7 1

5

1. Identificación

2. Introducción

3. Objetivo General

Estudiar las reacciones bioquímicas de hidrólisis de lípidos.

Los triacilgliceroles constituyen el 90% de los lípidos de la dieta y son la forma principal

de almacenamiento de energía metabólica en los seres humanos. Los triacilgliceroles

son triésteres del glicerol con ácidos grasos como el palmítico y el oleico. Puesto que

los triacilgliceroles no son solubles en agua, mientras que las lipasas sí los son, la

digestión se lleva a cabo en la interfase lípido-agua. Por tanto, la velocidad de la

digestión de los triacilgliceroles depende de la magnitud de la interfase lípido-agua, la

cual se ve incrementada por los movimientos peristálticos y por la acción emulsionante

de las sales biliares (Voet et al., 2009).

La lipasa pancreática cataliza la hidrólisis de los triacilgliceroles en las posiciones 1 y

3, produciendo una mezcla de ácidos grasos y 2-monoacilgliceroles (Voet et al., 2009;

Quesada, 2007). Además de las sales biliares, la lipasa necesita de una proteína

conocida como colipasa pancreática (Voet et al., 2009).

La hidrólisis de los triacilgliceroles también se lleva a cabo en el tejido adiposo, como

un proceso para obtener energía a partir de los ácidos grasos. Este proceso es

catalizado por lipasas sujetas a control hormonal, produciendo una mezcla de ácidos

grasos y glicerol. Los ácidos grasos se unen a la albúmina sérica para ser

transportados a los tejidos, mientras que el glicerol es transportado al hígado, en donde

se transforma en dihidroxiacetona y entra en las vías glucolítica o gluconeogénica

(Teijón et al., 2006).




34





5 g Lipasa pancreática o fúngica

50 mL Solución valorada de NaOH 0.04 M

60 mL Aceite comestible

5 mL Sol. Azul de bromotimol 0.01 %



6 pieza Matraz Erlenmeyer 250 ml

1 pieza Bureta 25 ml

1 pieza Soporte universal

1 pieza Pinza para bureta

1 pieza Termómetro De 0 a 100°C





4 pieza Pipetas de 5 ml Graduadas

2 pieza Pipetas de 2ml Graduadas

pieza Vaso de precipitado de 250 ml





0.0001g

1 equipo Baño de incubación Con termostato


Evaluar el efecto de la lipasa sobre los triacilglicéridos.

Colocar en tres EM de 125 ml, numerados del 1 al 3, 20 ml de agua y 10 ml de aceite;

colocarlos en el baño a 50 ºC.

A los EM 2 y 3 agregarles 0.08 g de lipasa. Procesar al mismo tiempo un duplicado de cada uno de

los tubos.




35

7. Cuestionario

8. Bibliografía


Incubar los tres tubos durante 30 minutos a 50 °C. Filtrar el contenido de los tubos 2 y 3 a

través de una manta de cielo para quitar la enzima remanente. Agregar a cada uno 2 gotas

de fenolftaleína. Titular agregando con una bureta una solución valorada de NaOH 0.005 M

hasta que el color vire a rosa pálido.

La cantidad de miliequivalentes empleadas para neutralizar la solución es igual a la

producción de ácidos grasos a partir de triglicéridos degradados por la lipasa pancreática.

Investigar las propiedades de las lipasas de diferentes fuentes (pancreática, fúngica,

bacteriana), incluyendo PM estructura, pH óptimo, temperatura óptima, sustratos que

utiliza y cofactores enzimáticos.

Quesada, S. 2007. Manual de experimentos de laboratorio para bioquímica, 1ª Ed., Editorial Universidad Estatal a Distancia, San José, Costa Rica.

Teijón, J., Garrido, A., Blanco, D., Villaverde, C. Mendoza, C. y Ramírez, J. 2006. Fundamentos de Bioquímica Metabólica, 2ª Ed., Edit. Tébar, S. L., Madrid, España.

Voet, D., Voet, J. y Pratt, C. 2009. Fundamentos de Bioquímica, La vida a nivel molecular, 2ª Ed., 2ª reimpresión. Editorial Médica Panamericana, Buenos Aires, Argentina

a) Introducción

b) Objetivo


d) Resultados

e) Discusión

f) Cuestionario

g) Bibliografía

Reportar la cantidad de ácidos grasos libres producidos por acción de la lipasa.




36




Hidrólisis Enzimática de Proteínas

8 1

5

1. Identificación

2. Introducción

3. Objetivo General


Estudiar las reacciones bioquímicas de hidrólisis de proteínas.

Cuantificar la actividad de enzimas proteolíticas.

Las proteasas actúan sobre el enlace peptídico, rompiéndolo y regenerando los

grupos amino y carboxilo. Un ensayo muy utilizado para evaluar la actividad hidrolítica

de enzimas consiste en hidrolizar una muestra de hemoglobinadesnaturalizada con

una cierta cantidad de la proteasa problema a pH de 7.5, 25°C y durante un tiempo de

reacción de 10 min. La hemoglobina no hidrolizada se precipita con ácido tricloroacético

y al sobrenadante, después de filtrar, se le añade reactivo fenólico, que produce un

color azul debido a la tirosina liberada (Guadix et a., 2000; Benitez et al., 2008).

La composición final y, por tanto, el uso de los hidrolizados proteínicos depende

principalmente de la fuente proteica, del tipo de proteasa usada, de las condiciones de

hidrólisis y del grado de hidrólisis alcanzado en la reacción. Los hidrolizados se utilizan

ampliamente en la tecnología alimentaria por sus propiedades nutricionales o

funcionales (Benitez et al., 2008)




37




2.5 g Hemoglobina

5 ml Ácido clorhídrico

5 g Ácido tricloroacético

0.5 g Tripsina

5 g Hidróxido de sodio

15 ml Reactivo de Folin-Ciocalteau

0.2 g Tirosina

1 pieza Papel Whatman No. 3



10 pieza Tubo de ensayo de 20x175

1 pieza Termómetro De 0 a 100°C







pieza Vaso de precipitado de 250 ml





0.0001g

1 equipo Baño de incubación Con termostato

1 Equipo Espectrofotómetro


Actividad proteolítica

a) Preparar una solución de hemoglobina al 2.5% en agua destilada y mantenerla a 5°C.

b) En un tubo de ensayo de 20x175 colocar 4 ml de la solución de hemoglobina y agregar

1 ml de HCl 0.3M.




38

c)Incubar la solución anterior a 25°C al menos 15 minutos.

d) Preparar una solución enzimática que contenga 0.1 g de enzima/ml.

e) Incubar la solución enzimática a 25°C al menos durante 15 minutos.

f) Agregar 1 ml de la solución enzimática a la solución de hemoglobina del paso c)

g) Mezclar bien e incubar 25°C durante 10 min.

h) Transcurrida la incubación agregar 10 ml de ácido tricloroacético 0.3N

i) Agitar vigorosamente para precipitar la proteína

j) Separar la proteína por filtración a través de papel Whatman No 3 o por centrifugación a

10,000 rpm.

k) A la fracción líquida del paso anterior agregarle 10 ml de hidróxido de sodio 0.5 M.

l) Mantener en agitación mientras se agrega 3 ml de reactivo de Folin-Ciocaltaeu.

m) Leer la absorbancia a 700 nm dentro de los 2 a los 10 minutos del paso anterior.

Estándar de tirosina

Procesar un estándar de tirosina para calcular la actividad de la enzima utilizada.

a) Preparar una solución que contenga 0.00016 miliequivalentes de tirosina/ml en ácido

clorhídrico 0.2M.

b) Pipetear 5 ml de la solución de tirosina en un tubo de 20x175 y agregarle 10 ml de

NaOH 0.5M

c) Mantener en agitación mientras se agrega 10 ml de reactivo de Folin-Ciocalteau.

d) Leer la absorbancia a 700 nm.

Blanco de reactivos

a) En un tubo de 13x175 pipetear 1 ml de solución enzimática y agregar 10 ml de

ácido tricloroacético 0.3M.

b) Agregar 5 ml de solución de hemoglobina, agitar hasta formación de un

precipitado.

c) Filtrar o centrifugar a 10,000 rpm.

d) Pipetear 5 ml del líquido en un tubo de 20x175 y agregar 1 ml de la solución de

tirosina.

e) Agregar 10 ml de NaOH 0.5M

f) Mantener en agitación mientras se agrega 3 ml del reactivo de Folin-Ciocaltaeu.

g) Leer la absorbancia a 700 nm.




39

7. Cuestionario

8. Bibliografía


Investiga cómo se calcula la actividad proteolítica con base en la cantidad de tirosina

liberada de la hemoglobina.

Investiga las condiciones óptimas de reacción de la enzima utilizada.

- Guadix, A., Guadix E.M., Páez-Dueñas M., González-Tello P. y Camacho F. 2000. Procesos

tecnológicos y métodos de control en la hidrólisis de proteínas. Ars Pharmaceutica, 41:1;

79-89.

- Benitez, R., Ibarz A. y Pagan J. 2008. Hidrolizados de proteína: procesos y

aplicaciones. Acta Bioquím Clín Latinoam; 42 (2): 227-36.


Reportar la actividad de la enzima utilizada, con base en la cantidad de tirosina producida por la hidrólisis de la hemoglobina.

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