Manual de Inmunologia

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Manual de Laboratorio de Inmunología

Básica y Clínica

Aurora Martínez Romero

José Luis Ortega Sánchez

Libro electrónico Manual de Laboratorio de Inmunología Básica y Clínica. ® 2011

A esta obra le ha sido emitida los Derechos de Autor por la Secretaría de Educación Pública del Instituto Nacional del Derecho de Autor con el Nº de Registro 03-2009-111713215700-14

Se publica en Abril de 2011 como un suplemento de REDVET Revista electrónica de Veterinaria (http://www.veterinaria.org/revistas/redvet) con nº ISSN 1695-7504 por la editorial Veterinaria Organización S.L.® http://www.veterinaria.org,

Inscrita en el BORME de España con el número 2001/0175466 en el Grupo Servicios, sector Veterinarios. Copyright veterinaria.org 1996-2011.


Manual de Laboratorio de Inmunología Básica y Clínica ® 2011 está protegido por los Derechos de Autor por la Secretaría de Educación Pública del Instituto Nacional del Derecho de Autor con el Nº de Registro 03-2009-111713215700-14. Se publica en Abril de 2011 como un suplemento de REDVET Revista electrónica de Veterinaria (http://www.veterinaria.org/revistas/redvet) con nº ISSN 1695-7504 por la editorial Veterinaria Organización S.L.® http://www.veterinaria.org, Inscrita en el BORME de España con el número 2001/0175466 en el Grupo Servicios, sector Veterinarios. Copyright veterinaria.org 1996-2011.

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Autores Dra. en C. Aurora Martínez Romero. División de Estudios de Postgrado e Investigación de la Facultad de Ciencias Químicas. Universidad Juárez del Estado de Durango. Gómez Palacio, Durango. México. [email protected]

C. Dr. en C., M.S.P. José Luis Ortega Sánchez. Unidad Regional Universitaria de Zonas Áridas. Universidad Autónoma Chapingo. Bermejillo, Durango. México. [email protected]



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INDICE

Presentación.................................................................................................................................................. 7

Introducción ................................................................................................................................................. 8

Manejo, transporte y almacenamiento de materiales en el laboratorio de Inmunología ........ 9

Prácticas generales de seguridad y bioseguridad en el laboratorio..................... 100

Reglamentos ........................................................................................................ 100

Normas de Seguridad específicas de las prácticas ................................................ 10

Manejo de residuos peligrosos biológico infecciosos (RPBI).................................. 13

Los residuos peligrosos biológico infecciosos (RPBI) … ........................................................................13

Cuadro de Competencias........................................................................................... 14 Mapa del sistema de prácticas de Inmunología. Estructura y programa del sistema de rácticas....................................................................................................................... 14 Contenido de cada práctica en particular ............................................................... 1616

PRACTICA NO. 1...................................................................................................................................... 17

ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN........................................................................ 17 Posición de las inyecciones: a) intravenosa b) intraperitoneal ................................... 19

PRACTICA NO. 2...................................................................................................................................... 25

DILUCIONES ............................................................................................................. 25

PRÁCTICA NO. 3.................................................................................................................................... 300

MÉTODO DE OUCHTERLONY ................................................................................. 30 REACCIONES DE INMUNODIFUSIÓN..................................................................... 30

PRÁCTICA NO. 4...................................................................................................................................... 34

DETERMINACIÓN DE INMUNOGLOBULINAS SÉRICAS ........................................ 34 1° PRUEBA DE PRECIPITACIÓN DEL SULFITO DE SODIO .............................. 34

2° PRUEBA DE TURBIDEZ DEL SULFATO DE ZINC........................................... 36

3° PRUEBA DEL GLUTARALDEHÍDO.................................................................. 39

PRACTICA NO. 5...................................................................................................................................... 40

BRUCELOSIS: Aspectos generales y Serodiagnóstico ............................................. 40 PRUEBA RAPIDA DE AGLUTINACIÓN EN PLACA.................................................. 45 (ROSA DE BENGALA (Card Test))............................................................................ 45



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PRACTICA NO. 6...................................................................................................................................... 48

FUNDAMENTO.......................................................................................................... 48

PRACTICA NO. 7...................................................................................................................................... 53

PRIMERA PARTE...................................................................................................... 53 AGLUTINACION ESTÁNDAR EN TUBO................................................................... 53 SEGUNDA PARTE..................................................................................................... 57 AGLUTINACIÓN EN TUBO EN PRESENCIA DE...................................................... 57 2-MERCAPTOETANOL ............................................................................................. 57

PRACTICA NO. 8...................................................................................................................................... 61

PRIMERA PARTE...................................................................................................... 61 AGLUTINACIÓN ESTANDAR EN MICROPLACA ..................................................... 61 AGLUTINACIÓN EN PRESENCIA DE 2- Me EN MICROPLACA .............................. 61 SEGUNDA PARTE..................................................................................................... 64

PRACTICA NO. 9...................................................................................................................................... 67

ANTÍGENOS DE SUPERFICIE DE GRUPOS SANGUÍNEOS .................................. 67 SISTEMA ABO........................................................................................................... 67 METODOLOGÍA ........................................................................................................ 68

PRACTICA NO. 10.................................................................................................................................... 71

REACCIONES FEBRILES ......................................................................................... 71

PRÁCTICA NO. 11.................................................................................................................................... 75

ANTIESTREPTOLISINAS.......................................................................................... 75

PRACTICA NO. 12.................................................................................................................................... 81

DIAGNOSTICO PRECOZ DEL EMBARAZO ............................................................. 81

PRACTICA NO. 13.................................................................................................................................... 85

DIAGNOSTICO SEROLÓGICO DE SÍFILIS .............................................................. 85

PRACTICA NO. 14.................................................................................................................................... 89

DETERMINACION DEL FACTOR REUMATOIDE..................................................... 89



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PRACTICA NO. 15.................................................................................................................................... 97

PROCEDIMIENTO PARA LA OBTENCIÓN DE CÉLULAS MONONUCLEARES A PARTIR DE SANGRE TOTAL POR EL MÉTODO FICOLL-HYPAQUE................................... 97

Viabilidad Celular.................................................................................................... 97

CONGELACIÓN Y DESCONGELACIÓN DE CÉLULAS MONONUCLEARES...... 98

PRACTICA NO. 16.................................................................................................................................. 101

PRUEBAS CRUZADAS ........................................................................................... 101

PRACTICA NO. 17.................................................................................................................................. 104

PRUEBA DE COOMBS............................................................................................ 104 PRUEBA DE COOMBS DIRECTA........................................................................... 104 PRUEBA DE COOMBS INDIRECTA ....................................................................... 106

PRACTICA No. 18................................................................................................................................... 108

PODER BACTERICIDA DEL SUERO NORMAL ..................................................... 108 Glosario de términos ................................................................................................ 111



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Presentación Este manual de prácticas de Inmunología se propone iniciar al estudiante en el estudio de la inmunología. Su contenido es teórico y esquematizado, redactado de tal manera que facilite su comprensión. Su planeación intenta seguir el trayecto que realiza una sustancia extraña a través del organismo, con los diversos mecanismos de defensa que opone a su penetración y en algunos casos limitar su replicación a través de la respuesta inmune. Se plantea la realización de 17 prácticas correspondientes a la aplicación de la inmunología clínica, implementadas de tal manera que el estudiante las pueda realizar sin la necesidad de material ni equipo sofisticado, únicamente con el material necesario para realizar las pruebas convencionales, de rutina en cualquier laboratorio de análisis clínicos, con fines didácticos se proporcionan a los estudiantes muestras de fluidos corporales “positivas”, trabajando siempre con ética profesional, en el manejo de este tipo de muestras. La base para la realización del presente Manual fue la visualización de la importancia que tiene que el estudiante de inmunología, tenga una formación sólida sobre su conocimiento práctico y que ingrese al ámbito laboral con las habilidades para resolver problemas en el área de la inmunología, además los estudiantes adquieren el conocimiento sobre la importancia de desarrollar su trabajo con ética y responsabilidad, con el compromiso de otorgar a los individuos que requieran de su servicio, la confianza de saber que cuentan con un laboratorio comprometido con la calidad y de esta manera puedan ser partícipes del mejoramiento de la calidad de vida de los pacientes. Esta obra enfrenta la aplicación de otorgar un servicio de calidad, proporcionando diagnósticos oportunos y confiables, es de fundamental importancia para quienes trabajamos sobre los problemas que aquejan la salud, tengamos conciencia de ser profesionales de calidad. Este Manual de prácticas de Laboratorio de la Cátedra de Inmunología, representa una revisión exhaustiva destinada a la enseñanza de la inmunología. La elaboración de este proyecto inicia con la construcción de las técnicas de laboratorio implementadas en el trabajo diario de un laboratorio clínico. Como criterios de selección de las prácticas, se consideró la necesidad sobre el conocimiento de las mismas frente al desempeño en el campo laboral. Además, las prácticas desarrolladas en su metodología se manejan el uso de material accesible en nuestro laboratorio, implementado de tal manera que se puedan aplicar en un laboratorio clínico, sin necesidad de equipo sofisticado, en donde el principio en su aplicación es el conocimiento del fundamento de cada uno de los exámenes de diagnóstico realizados.



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La problemática que se presenta es la necesidad de que los estudiantes procesen muestras positivas, para esto se les adiestra a trabajar con responsabilidad, puesto que al procesarlas están bajo el factor de riesgo inminente de infectarse. Es necesario trabajar con este tipo de fluidos corporales para que conozcan la interpretación real de los resultados que serán de suma importancia en la orientación al médico tratante sobre el estado de salud de los pacientes, el plasmar un diagnóstico presuntivo certero en la hoja de reporte dará credibilidad a nuestro desempeño como profesionales de la salud. Todo el personal involucrado en el sector salud tiene que manejar todo el material biológico teniendo en mente que es potencialmente infectante. Al egresar de la carrera tenga una sólida formación con base en sus estudios de inmunología, para aplicar sus conocimientos en el mundo del desempeño laboral, resolviendo problemas en el área de serología o inmunología, otorgando a los pacientes que requieran de su servicio, otorgar un elevado nivel de competitividad en cuanto al trabajo de calidad en su desempeño, colaborando con el equipo del personal de salud pública en el uso racional y oportuno de las sustancias, solamente para otorgar el mejor servicio a los usuarios. Desarrollando con ética y responsabilidad profesional su trabajo con el propósito de mejorar la calidad de vida del paciente. Incluso, este manual genera el interés del alumno a incursionar en el área de la investigación básica y aplicada relacionada a las áreas de la salud. Para comprender la terminología utilizada en inmunología, se anexa un glosario de términos. Además se recomienda al estudiante que busque la relación entre sus actividades diarias y conocimientos adquiridos anteriormente, para que lo logre en ellos un aprendizaje significativo y en vez de memorizar que analicen la terminología utilizada en inmunología buscando su significado etimológico, de esta manera lo que se estudie durante el curso jamás se olvide.



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Introducción Por definición, la Inmunología tiene como objetivo el estudio de los fenómenos relacionados con la inmunidad, por inmunidad se entiende el conjunto de mecanismos de defensa que protegen contra los microagresores que se encuentran en el medio ambiente. Inmunología, palabra de origen latino, etimológicamente significa, privilegio, exención. Actualmente, la Inmunología ya no puede limitarse al estudio de los medios de lucha contra los agentes infecciosos: su dominio, mucho más amplio, reagrupa las diversas reacciones que utiliza el organismo para mantener su integridad. La Inmunología es el estudio del mecanismo y de las consecuencias de las modificaciones específicas producidas en un organismo por introducción de una sustancia llamada antígeno; se llama reacción inmunitaria a la reactividad nueva y específica que el organismo adquiere después de la introducción de este antígeno, tanto si se trata de un agente infeccioso como de una molécula de peso molecular elevado o de una célula. Es importante generar la conciencia de trabajar con calidad, para que el médico siempre tenga confianza en el químico para apoyarse en él, con la certeza que se le apoyará para poder otorgar al paciente un diagnóstico definitivo. En cada práctica se realizó un análisis en la metodología de trabajo e interpretación de los resultados obtenidos. Se deben promover y coordinar esfuerzos de los diferentes constituyentes del sector salud para preservar la salud, combatir las enfermedades, prolongar la vida y estimular el desarrollo físico, mental y social de sus habitantes. Otorgar un servicio de calidad a la comunidad, “nuestro trabajo nos respaldará y será nuestra carta de presentación”. Los objetivos del presente manual de prácticas son exponer de manara clara las prácticas elementales implementadas en la medicina cotidiana en un laboratorio de diagnóstico del área de serología de un laboratorio de análisis clínicos, desarrollar habilidades y aptitudes necesarias para el manejo adecuado de muestras biológicas, realizar técnicas y métodos inmunológicos que apoyarán en el diagnostico certero y oportuno de padecimientos inmunes.



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Manejo, transporte y almacenamiento de materiales en el laboratorio de Inmunología Se implementa un programa de eco-eficiencia, que se logra a través de la generación de productos y servicios que satisfacen las necesidades humanas y generan calidad de vida, al mismo tiempo que se reducen en forma progresiva los impactos ambientales y el uso de recursos no renovables, reducción de la energía y de las emisiones tóxicas, aumento de la cultura del reciclaje y durabilidad del producto/servicio, entre otros. Se llevan a cabo estrategias de gestión ambiental, por lo que, se cuenta con servicio de recolección, transporte y disposición final de residuos biológico-infecciosos procedentes de las actividades relacionadas con la prevención y cuidado de la salud implementada en la Facultad de Ciencias Químicas. En las áreas de laboratorio hay rótulos de información y los contenedores necesarios para eliminar los residuos biológico-infecciosos:

1. Patológicos (Clave CRETIB (B) RPNE 1-2/03) 2. Punzocortantes (Clave CRETIB (B) RPNE 1-2/05) 3. Misceláneos (Clave CRETIB (B) RPNE 1-2/06)

Las actividades implementadas para monitorear el desempeño en el cuidado y mantenimiento del medio ambiente son:

- Capacitar al personal en el manejo adecuado de residuos biológico-infecciosos.

- Inspeccionar el sitio donde se generan los residuos y los programas de recolección, tipos de equipo, material y procedimientos adecuados.

- Mantener los suministros de material necesario para la selección, clasificación y empaque de residuos (contenedores plásticos, bolsas, cajas de cartón, etc.).

- Monitorear que se respete la programación de las fechas de recolección de residuos, en función de sus volúmenes de generación de los mismos y realizar los ajustes y seguimientos necesarios.

- Vigilar que el transporte de los residuos biológico-infecciosos generados sea el adecuado y bajo las normas de confinamiento para éste objeto.

- Garantizar que el destino final de los residuos biológicos generados sea el adecuado según las disposiciones de la Secretaría de Medio Ambiente, Recursos Naturales y Pesca (SEMARNAP).



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Prácticas generales de seguridad y bioseguridad en el laboratorio.

Reglamentos El presente manual está sustentado bajo normas oficiales mexicanas y reglamentos de los

Laboratorios de la Facultad de Ciencias Químicas de la UJED, así como,

Normas de Seguridad específicas de las prácticas a) Cuadro de Detección de Riesgos Particulares.

Tipo de peligro Como evitarlo Como proceder en caso de un accidente

Cortaduras Utiliza guantes de asbesto y/o acerados en caso de manejar equipo cortante, así como solicitar al laboratorista y/o a tu docente las recomendaciones en el manejo del mismo.

Si el sangrado es intenso, aplica presión o una compresa directamente sobre la herida y consiga atención médica. Si la cortadura es pequeña deja que sangre un poco y lávala con agua y jabón.

Descarga eléctrica Utiliza como tapete de piso un material aislante (madera) al encender o conectar electricidad; no tomes cables expuestos o dañados visiblemente.

Procura que la persona respire aire fresco. acomódala de modo que su cabeza quede debajo del cuerpo

Desmayo Cerciorarte de la ventilación en el área de trabajo (extractores) y evita llevar a cabo la práctica en caso de sentirte débil y/o mareado.

Procura que la persona respire aire fresco. Acomódala de modo que su cabeza quede debajo del cuerpo.

Incendio Apaga el equipo en caso de sobrecalentamiento y así mismo, desconéctalo en forma inmediata. No uses material no equipo visiblemente dañado.

Cierra todas las tomas de gas, desconecta todos los circuitos eléctricos. Usa una manta contra el fuego o un extinguidor para apagarlos.

Lesión de los ojos Utiliza lentes protectores y toma una distancia de medio metro o más de ser posible en la actividad a desarrollar.

Lava de inmediato el ojo con agua corriente. No permitas que la víctima se frote el ojo.

Quemaduras Utiliza guantes, camisa de manga larga y tu bata de trabajo, tomando el material y el equipo calientes con pinzas, contenedores, etc.

Lava con agua fría hasta que la sensación de ardor se calme.



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b) Cuadro de Disposición de desechos.

Tipo de desechos Como clasificarlos Tipo de contenedor

Orgánicos e inorgánicos Orgánica: cáscaras de frutas, sobras de comida, cabello y uñas, pasto y hojas, y esto es lo que usas para hacer la composta. Inorgánica: latas de aluminio y acero, pero deben de estar limpias. Al acabarse su contenido, se lavan como trastes normales y se dejan secar. Papel, cartón, envases de vidrio, de plástico.

El indicado para cada caso

c) Normas oficiales mexicanas. NOM-025-STPS-1999:5.1, 5.2, 5.3: NOM-001-STPS-1999:5.5. Condiciones de iluminación en los centros de trabajo http://info4.juridicas.unam.mx/ NOM-017.STPS-2001:NOM-114-STPS-1994:NOM-022-STPS-1999

Sistema para la identificación y comunicación de riesgos para proporcionar seguridad a los trabajadores de los centros de trabajo, como una solución a los problemas de riesgos de trabajo por esas sustancias. Se considera que existe una responsabilidad general para proporcionar seguridad a los trabajadores en los centros de trabajo. La comunicación sobre riesgos es una parte importante de esta responsabilidad, ya que las empresas pueden llegar a utilizar sustancias químicas y los trabajadores deben estar capacitados para reconocer el riesgo potencial de los diversos productos químicos, en los procedimientos de operación y saber usar el equipo de protección personal. Este sistema ha sido diseñado para llenar la necesidad de una comunicación efectiva y proporcionar información del uso seguro de sustancias químicas por los trabajadores, a través de la capacitación de los elementos que componen el sistema. La parte central de este sistema es la identificación de los riesgos inherentes de una sustancia:



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NOM-002-STPS-1993 Relativa a las condiciones de seguridad para la prevención y protección contra incendios en los centros de trabajo. http://www.dif.gob.mx/edif/sad/SGC_CHN/EXTERNOS/NOM-002-STPS-1993.pdf NOM-005-STPS-1993 Relativa a las condiciones de seguridad en los centros de trabajo para el almacenamiento transporte y manejo de sustancias inflamables y combustibles. http://www-economia.gob.mx/work/normas/noms/kpronoman/p005stps.pdf NOM-008-STPS-1993 Relativa a las condiciones de seguridad e higiene para la producción, almacenamiento y manejo de explosivos en los centros de trabajo. http://www-economia.gob.mx/work/normas/noms/kpronoman/p005stps.pdf NOM-009-STPS-1993 Relativa a las condiciones de seguridad e higiene para la producción, almacenamiento y manejo de sustancias corrosivas, irritantes y tóxicas en los centros de trabajo. http://www-economia.gob.mx/work/normas/noms/kpronoman/p005stps.pdf NOM-010-STPS-1993 Relativa a las condiciones de seguridad e higiene en los centros de trabajo donde se produzcan, almacenen y manejen sustancias químicas capaces de generar contaminación en el ambiente laboral. http://www.fabregat.com/catalogo/NOMs/NOM-010-STPS-1993.doc NOM-028-STPS-1993 Seguridad-código de colores para la identificación de fluidos conducidos por tuberías. http://www.celorio.com/vapor/norma.htm NOM-026-STPS-1993 Seguridad colores y su aplicación. http://www.dif.gob.mx/edif/sad/SGC_CHN/EXTERNOS/NOM-026-STPS-1993.pdf CONVENIO 170 (OIT) Convenio sobre la seguridad en la utilización de los productos químicos en el trabajo. NOM-008-SCFI-1993 Sistema General de Unidades de Medida. http://www.ine.gob.mx/ueajei/publicaciones/nom-008a.html NOM-022-STPS-1999 Relativa a las condiciones de seguridad en los centros de trabajo en donde la electricidad estática representa un riesgo. Electricidad estática en los centros de trabajo. Condiciones de seguridad e higiene. http://www.steps.gob.mx/DGSST/normatividad/noms/Nom-022.pdf NOM-114-STPS-1994 Sistema para la identificación y comunicación de riesgos por sustancias químicas en los centros de trabajo. http://www.facmed.unam.mx/deptos/salud/strabajo/pdf/nom-114.pdf



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Manejo de residuos peligrosos biológico infecciosos (RPBI)

Los residuos peligrosos biológico infecciosos (RPBI), son los que contienen bacterias, hongos, virus, parásitos, microorganismos capaces de causar infecciones, efectos nocivos para la salud y el medio ambiente. NOM-087-ECOL-1995 Establece los requisitos para la separación, envasado, almacenamiento, recolección, transporte, tratamiento y disposición final de los RPBI que se generan en establecimientos que prestan atención médica (Diario Oficial de la Federación 07/11/1995). Dicha Norma es de observancia obligatoria para los establecimientos que presten atención médica, tales como: hospitales, clínicas, laboratorios clínicos, laboratorios de producción de agentes biológicos, de enseñanza e investigación, tanto humanos como veterinarios en pequeñas especies y centros antirrábicos, cuando estos generen más de 25 kg/ mes o 1 kg/día de RPBI. http://bvs.insp.mx/artículos/2/11/06032001.pdf

Los RPBI se clasifican en: 1. Residuos de sangre y sus derivados: plasma, suero, etc. 2. Cultivos y cepas almacenadas de agentes infecciosos: vacunas, placas

de cultivo, etc. 3. Residuos patológicos: residuos de tejidos, órganos, partes y fluidos

corporales, etc. 4. Residuos no anatómicos derivados de la atención a pacientes y de los

laboratorios: torundas, guantes, cubrebocas, tubos, etc. 5. Residuos de objetos punzocortantes usados o sin usar: navajas,

jeringas, pipetas Pasteur, porta y cubreobjetos, etc. El siguiente cuadro muestra el color y tipo de envase requerido para cada uno de los tipos de RPBI:

Tipo de residuos Estado físico Envasado Color Sangre Sólidos Bolsas de plástico Rojo Cultivos y cepas de agentes infecciosos Residuos no anatómicos

Líquidos Recipientes herméticos

Rojo

Patológicos Sólidos Bolsas de plástico Amarillo Patológicos Líquidos Recipientes

herméticos Amarillo

Objetos punzocortantes usados y sin usar

Sólidos Recipientes rígidos Rojo



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Cuadro de Competencias Ubicar dentro del siguiente cuadro las competencias profesionales donde se ubica la cátedra de inmunología, identificando los diferentes ámbitos del desempeño profesional y laboral, el contenido requerido, así como también, las habilidades y actitudes que serán adquiridas durante el desarrollo de las prácticas de inmunología. Competencia a adquirir

Objetivo Intención o finalidad

Contexto o restricciones

Rangos (s) o situaciones

Aplicar Aplicar en el laboratorio clínico las prácticas realizadas en el laboratorio de Inmunología

Para realizar exámenes de diagnóstico certeros y confiables

Utilización de los laboratorios, material y equipo correspondiente, en cada práctica

En los procesos académicos, relativos a la inmunología básica

Mapa del sistema de prácticas de Inmunología. Estructura y programa del sistema de prácticas. El presente manual forma parte esencial de la cátedra de Inmunología, la cual se imparte en la Facultad de Ciencias Químicas dentro del plan de estudios del octavo semestre de la carrera de Químico Farmacéutico Biólogo. Se desarrolla de manera secuencial, acorde al programa temático de la parte teórica de inmunología, y es parte del sistema formativo básico de los estudiantes de la carrera de Q.F.B.

LABORATORIO

Duración: 6 sesiones (2

horas en cada una) que corresponden al 33.34% del curso.



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Competencia o unidad de competencia

Semana Prácticas Tipo Pre-requisitos

Encuadre 1ª. Introducción a la parte práctica de la cátedra de Inmunología

Laboratorio (2 horas)

Lectura de reglamento de Laboratorio

1ª. Unidad Generalidades sobre inmunidad y medios de defensa

2ª. Práctica No. 1 Animales de experimentación


Elaboración de cuestionario previo con diagrama de flujo

2ª. Unidad Células involucradas en el fenómeno de fagocitosis

3ª. Práctica No. 2 Diluciones



3ª. Unidad Inmunidad celular y humoral

4ª. Práctica No. 3 Método de Ouchterlony



4ª. Unidad Complemento

5ª. Práctica No. 4 Determinación de Inmunoglobulinas séricas



5ª. Unidad Anormalidades del sistema inmune e inmunidad frente a diferentes microorganismos

6ª. Práctica No. 5 Brucelosis: Aspectos generales y serodiagnóstico



6ª. Unidad Autoinmunidad

7ª. Práctica No. 6 Prueba de Rivanol



7ª. Unidad Reacciones de hipersensibilidad

8ª. Práctica No. 7 Primera parte. Aglutinación estándar en tubo Segunda parte. Aglutinación en tubo en presencia de 2-Mercaptoetanol (2-Me) Primera parte. Aglutinación estándar en microplaca Segunda parte. Aglutinación en microplaca en presencia de 2-Mercaptoetanol (2-Me)



8ª. Unidad Complejo Principal de histocompatibilidad (MHC)

9ª. Práctica No. 8 Antígenos de superficie de grupos sanguíneos



9ª. Unidad Reacciones inmunológicas

10ª. Práctica No. 9 Reacciones febriles



10ª. Unidad Inmunidad y terapia génica: beneficios y riesgos

11ª. Práctica No. 10 Antiestreptolisinas



11ª. Unidad Bioética en Inmunología

12ª. Práctica No. 11 Diagnóstico precoz del embarazo



12ª. Unidad 13ª. Práctica No. 12 Diagnóstico serológico de sífilis



13ª. Unidad 14ª. Práctica No. 13 Determinación del factor reumatoide





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14ª. Unidad 15ª. Práctica No. 14

Procedimiento para la obtención de células mononucleares a partir de sangre total por el método de Ficoll-Hypaque



15ª. Unidad 16ª. Práctica No. 15 Pruebas cruzadas



17ª. Práctica No. 16 Prueba de Coombs directa



Poder bactericida del suero normal



Contenido de cada práctica en particular

Se recomienda que la cantidad de alumnos por equipo para poder trabajar óptimamente en el laboratorio en la cátedra de Inmunología, sea de 4 a 5 alumnos por mesa de trabajo, para un mejor desempeño personal y participativo de cada integrante. En el desarrollo de las prácticas se pretende que se conceptualicen y apliquen los términos de respuesta inmune celular y humoral, fagocitosis, aglutinación, precipitación, inmunoglobulinas, diluciones, reacciones febriles, etc., asociándolos con la solución de problemas enfocados a resolver problemas relacionados con la salud. Se pretende que con el presente manual el estudiante adquiera las habilidades y conocimientos necesarios para el buen desempeño en un laboratorio clínico y que con el conocimiento del fundamento de cada procedimiento den un razonamiento lógico al diagnóstico presuntivo otorgado al médico solicitante del estudio con un espíritu crítico y resolutivo frente a los problemas que se puedan enfrentar en el ejercicio de su profesión.



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PRACTICA NO. 1

ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN Introducción La bioética tiene como objetivo conectar la reflexión ética con la investigación científica con la finalidad de construir una ciencia con conciencia al servicio integral del hombre, la experimentación clínica, constituye un valor en sí misma que debe ser buscado lícitamente por los científicos y que no se contrapone con la instancia ética en cuanto al objetivo común de ambas que es la búsqueda de la verdad para el hombre y para su salud. La Ley Federal de sanidad animal, publicada el 18 de Junio de 1993 (vigente) trata la prevención y control de las enfermedades de los animales, la cual fija las bases para el diagnóstico, prevención, control y erradicación de enfermedades y plagas de los animales terrestres, establece atribuciones de la Secretaría en cuestiones de medidas zoosanitarias. Normas oficiales para productos, subproductos animales, productos químicos, farmacéuticos, biológicos y alimenticios para uso en animales o consumo por éstos, así como envases y rótulos. Normas que deben reunir los siguientes establecimientos: ferias, frigoríficos, fábricas de productos o subproductos animales para consumo humano, los que fabriquen o expendan alimentos procesados para consumo animal y productos químicos y farmacológicos para uso en animales, hospitales y clínicas vegetarianas. Desde el punto de vista bioético, la experimentación clínica es objetada en base al uso de los pacientes y el investigador y puede aplicarse en varias etapas de la investigación: la selección de pacientes y su reclutamiento. La Ley Federal de Sanidad Animal contempla los laboratorios de prueba o diagnóstico en cuanto al trato humanitario, cuidado zoosanitario y técnicas de sacrificio. La elección de especies animales se basa en diversas consideraciones. Se debe tomar en cuenta si la especie en cuestión es susceptible a la enfermedad contra la cual estamos elaborando el producto. Es importante, además considerar el costo de los animales así como el de su mantenimiento, el tamaño y docilidad de los mismos, etc. Un factor importante en bioterios (unidades en donde se crían estos animales) y en laboratorios, es el manejo adecuado, tanto para evitar heridas por mordeduras y arañazos, etc., como para evitar el excesivo sufrimiento de los mismos. El manejo de estos animales varía de especie a especie. En las figuras 1-7 se muestra el manejo adecuado de las especies más comunes en el laboratorio. Las especies que más se utilizan en el laboratorio son el cobayo, ratón albino, rata albina y el Hamster, ofrecen mayor dificultad la rata y el ratón porque al sentirse



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capturados muerden. El cobayo y Hamster son sumamente dóciles, la manera más fácil de tomar una rata es con una mano y de la cola y con la otra sujetar la piel del cuello, así queda inmovilizada. El ratón se toma boca arriba, tomando la cola con los dedos medio e índice (como se toma un cigarro), y rodearlo con el resto de la mano. Para inyecciones o inoculaciones deberá tomarse de la piel del dorso con el pulgar y el índice, sosteniéndolo de la cola con el meñique y el anular apoyados en la palma de la mano. El Hamster únicamente se utiliza la sujeción por la piel del dorso, ya que. Tienen la cola muy pequeña. Los cobayos no ofrecen dificultad, basta con rodearlos por el dorso con una mano y ejerciendo poca presión porque fácilmente se asfixian. El uso de los animales de granja en investigación científica debe estar sujeto a las mismas consideraciones éticas que el uso de otros animales para el mismo propósito, sin importar los objetivos científicos del investigador ni las fuentes de financiamiento. Los sistemas de alojamiento para los animales de granja empleados en investigación biomédica pueden o no ser diferentes de los usados en investigación agrícola. Los animales utilizados tanto en investigación biomédica como agrícola pueden alojarse en jaulas, pesebres, o pastizales. Algunos estudios agrícolas necesitan condiciones uniformes para minimizar la variabilidad medio ambiental y algunos estudios biomédicos se llevan a cabo en circunstancias de granja. Las guías para la utilización de los animales en estudios de campo preparadas por las sociedades profesionales son útiles siempre que se adhieran a los principios humanitarios. OBJETIVO Aprender el manejo adecuado de los animales más comunes de laboratorio.

METODOLOGÍA 1) Después de observar el manejo de cada animal de laboratorio, tomarás

cada uno de ellos y practicarás su manejo, con mucho cuidado, evitando molestar a los animales y evitar salir lesionado (Figuras 1-7).

2) Se llevará a cabo toma de muestra (venopunciones) a cada animal.



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TECNICAS DE VENOPUNCIÓN (SANGRADO) E INOCULACIÓN 1. Venopunción o Inoculación intravenosa en conejos. El conejo se

inmoviliza como se muestra en la figura 2, se limpia la oreja en el margen exterior con una torunda y agua caliente, para favorecer la dilatación de la arteria central; posteriormente, con una torunda se desinfecta la zona, con la ayuda de una jeringa tipo tuberculina con aguja delgada, se procede a tomar una muestra sanguínea o inoculación, según sea el caso.

2. Inoculación intravenosa en ratas macho y cobayos. Anestesie al animal en cámara de éter. Después colóquelo en posición ventral, localice la vena dorsal del pene y administre con una aguja delgada la sustancia deseada.

3. Inoculación intravenosa en ratón. Introduzca al ratón en un tubo de paredes lisas y con un orificio de salida en la tapa donde se extrae la cola. Limpie la cola con una torunda y agua caliente, para que la vena caudal se dilate e inocule con una jeringa de tipo tuberculina usando una aguja del 25. No debe forzarse la jeringa en ningún momento. Para la venopunción se procede de la misma manera e incluso se puede cortar un pedazo de la cola.

4. Inoculación o venopunción intraperitoneal en ratón. Sujete al animal con la mano, como se muestra en la figura 6, con la parte ventral hacia arriba, incline la cabeza hacia abajo, con la idea de que las viseras se desplacen hacia abajo, limpie la región peritoneal con una torunda y agua caliente; posteriormente, con una torunda desinfecte la zona, con la ayuda de una jeringa tipo tuberculina con aguja delgada, se procede a tomar una muestra sanguínea o inoculación, al introducir la aguja debe percibir que perfora los dos planos (piel y pared abdominal).

5. Inoculación subcutánea en rata o ratón. Con la ayuda de unas pinzas, se inmoviliza al animal por atrás de las orejas, fije las pinzas del lado opuesto y jale la cola. Con los dedos pulgar e índice forme un pliegue de la piel e introduzca la guja por este pliegue.

6. Inoculación con sonda gástrica. Se usa para administrar líquidos en estómago y para eso se una aguja roma, del tipo de las que se utilizan para anestesia raquídea en humanos. Sujete al animal con la parte cefálica hacia arriba con el dedo índice y medio realice extensión del cuello e introduzca lentamente la sonda sin lastimar al animal. No es necesario anestesiar.

7. Sangrado en aves. Se inmoviliza el animal como muestra la figura 1. Se sube una de las alas y abajo se localiza la vena alar, es la vena más irrigada y se utiliza para realizar un sangrado exitosamente. Se limpia la zona con una rotunda y agua caliente,



20

así se estimula la dilatación, posteriormente se desinfecta con alcohol y se procede a tomar la muestra.

8. Para realizar punción cardiaca. Anestesiar al animal, limpiar la zona izquierda del tórax , localizar el corazón y extraer lentamente la sangre usando una jeringa con aguja del número 20 x 32

9. Sangrado de yugular. En chivos y en carneros es relativamente fácil de realizar. Derribe al animal e inmovilícelo, córtele el pelo en un lado del cuello y localice la yugular, limpie con benzal el área y ligue en la base del cuello lo que hace que se vea mejor la vena.

10. Corte de vena axilar. Este sangrado se puede realizar en ratón, rata, cobayo. Se anestesia el animal, colóquelo en posición ventral y con un bisturí realice una incisión en el área axilar, corte plexo axilar y colecte la sangre con una pipeta Pasteur.

11. Plexo venoso oftálmico. Es una técnica para obtener pequeñas cantidades de sangre en ratones y ratas. Anestesie al animal, introduzca una pipeta Pasteur en la parte interna del ojo girándola, después se retira un poco para que la sangre suba por capilaridad.

INVESTIGACIÓN PREVIA AL EXPERIMENTO 1. ¿Por que es importante en Inmunología conocer el manejo de animales

de experimentación?

2. ¿Qué es la bioética?

3. Investiga la Ley Federal de Sanidad Animal CUESTIONARIO PARA ANEXAR AL REPORTE 1) ¿Que animales encontraste más fácil de manejar, y porqué? 2) ¿Que animales encontraste más difícil de manejar, y porqué? 3) Realiza una lista de los animales manejados de acuerdo a su docilidad. 4) ¿Cuál es tu opinión acerca de la bioética y de la Ley Federal de Sanidad

animal? Explica 5) ¿Para que se realiza la inmunización de los animales y cuales son las

prácticas de inmunización usando modelos en animales? 6) ¿Cuáles son las especies que se usan con más frecuencia?



21



22



23



24

Posición de las inyecciones: a) intravenosa b) intraperitoneal

1.- Observar la manipulación adecuada del animal en cuestión.

2.- Evitar molestar a los animales, practicar su manejo con mucho cuidado.

Metodología

DIAGRAMA DE FLUJO



25

PRACTICA NO. 2

DILUCIONES En el laboratorio de Inmunología constantemente estarás realizando diluciones. Esto obedece a que, para determinar la cantidad de anticuerpos que tiene un animal, o la cantidad de antígeno que contiene una vacuna, etc., es necesario diluir éstos hasta el punto donde ya no es posible detectar actividad. A este proceso se le denomina titulación, y la última dilución que todavía muestra actividad se le denomina título. Aunque existen muchas maneras de efectuar diluciones, dos de ellas son las más utilizadas. Diluciones dobles Para iniciar una serie de diluciones dobles se mezcla una parte del líquido que se va a diluir en una parte del diluyente (por ejemplo, una parte de suero en una parte de solución salina fisiológica). A esta primera dilución se le denomina 1:2, porque hay en este caso, una parte de suero en dos partes de líquido. Una vez mezclado esto se pasa una parte de la mezcla a una nueva parte de diluyente, la dilución ahora es de 1:4 (Figura 1). Este tipo de diluciones son las más utilizadas en Inmunología, puesto que nos dan divisiones pequeñas entre un tubo y el siguiente, permitiendo así determinar con bastante exactitud el título de la muestra.

Diluciones Logarítmicas: Estas diluciones se hacen de la misma manera que las dobles, pero en este caso, la muestra se mezcla cada vez con nueve partes (Figura 2). De esta manera se obtienen diluciones de 1:10, 1:100, 1:1000, etc. Este tipo de diluciones no se usan mucho en Inmunología pero en ocasiones se recurre a ellas cuando se sospecha que el título será muy elevado, como por ejemplo, se titulan sueros de individuos sospechosos de Leptospirosis. El objetivo de esta práctica es aprender las técnicas de diluciones.



26

METODOLOGÍA 1) En una serie de 10 tubos, pon 0.25 mide agua en cada uno. 2) Deposita 0.25 ml de colorante en el primer tubo y mezcla muy bien. 3) Con una pipeta limpia, toma 0.25 ml del primer tubo y colócalos en el segundo tubo, mezclando bien.

4) Con una pipeta limpia, pasa 0.25 ml del segundo al tercer tubo, mezclando bien. 5) Repite el proceso en todos los tubos. 6) Observa y anota tus resultados. 7) En una serie de 10 tubos, coloca 2.25 ml de agua en cada uno. 8) Mezcla 0.25 ml de colorante en el primer tubo. 9) Cambia de pipeta y transfiere 0.25 ml de la mezcla de colorante del primer tubo al segundo tubo. 10) Repite el proceso en todos los tubos. 11) Observa y anota tus resultados. Realizar una dilución DOBLE (1:2) de ácido clorhídrico (HCl) en agua, en un volumen de 25 ml



27

PROPORCION VOLUMEN Soluto 1 parte de HCl 12.5 ml Diluyente 1 parte de agua 12.5 ml TOTAL 2 partes en total 25.0 ml Realizar una dilución QUINTUPLE (1:5) de ácido clorhídrico (HCl) en agua, en un volumen de 25 ml

PROPORCION VOLUMEN Soluto 1 parte de HCl 5 ml Diluyente 4 partes de agua 20 ml TOTAL 5 partes en total 25.0 ml Realizar una dilución 1:250 de ácido clorhídrico (HCl) en agua, en un volumen de 25 ml

PROPORCION VOLUMEN Soluto 1 parte de HCl 0.1 ml Diluyente 249 partes de agua 24.9 ml TOTAL 5 partes en total 25.0 ml De lo anterior se deduce que para obtener el volumen correspondiente a una parte de la dilución (parte correspondiente al soluto), bastará dividir el volumen deseado entre el total de partes de la dilución:

SOLUTO = VOLUMEN TOTAL / TOTAL DE Partes de la dilución

Posteriormente se multiplicará el valor de “una parte” por el número de partes que ocupa el diluyente, para determinar el volumen del mismo:

DILUYENTE = Valor de una parte × No. De partes del diluyente INVESTIGACIÓN PREVIA AL EXPERIMENTO 1) Investigue que es dilución. 2) ¿Que finalidad tiene el conocer el título en una aglutinación? 3) ¿Que diferencia habrá entre una dilución doble y una logarítmica? CUESTIONARIO PARA ANEXAR AL REPORTE 1) ¿Hasta que dilución llegaste en la primera serie de tubos?

2) ¿Hasta que dilución llegaste en la segunda serie de tubos?



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3) ¿Porque cambiaste la pipeta en cada uno?

Realizar una dilucion DOBLE (1:2) de HCl en agua.

H2O HCl 1

En un volumen de 25 mL.

Realizar una dilucion QUINTUPLE (1:5) de HCl en agua, en un volumen de 25 mL.

H2O HCl 1

20 mL 5 mL

Realizar una dilucion (1:250) de HCl en agua, en un volumen de 25 mL.

H2O HCl 1

24.9 mL 0.1 mL

DIAGRAMA DE FLUJO



29

En una serie de 10 tubos, coloca 0.25 de agua.

1 2 3 4 5

6 7 8 9 10

H2O1

En el tubo 1, deposita 0.25 mL de oolorante.

1 2

Con una pipeta limpia, toma 0.25 mL del primer tubo y colocalos en el segundo tubo. Mezclar muy bien.

2

2

Con una pipeta limpia, toma 0.25 mL del tubo 2, pasa al tercer tubo.

Mezclar muy bien.

3 3

Repite el poceso con todos los tubos. observa y anota tus resultados.


1 2 3 4 5

6 7 8 9 10

H2O


1

En el tubo 1, deposita 0.25 mL de oolorante.Mezclar muy bien.

2 12

Con una pipeta limpia, toma 0.25 mL del primer tubo y colocalos en el segundo tubo.

2

Con una pipeta limpia, toma 0.25 mL del tubo 2, pasa al tercer tubo.

Mezclar muy bien.

3 3

Repite el poceso con todos los tubos. observa y anota tus resultados.



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PRÁCTICA NO. 3

MÉTODO DE OUCHTERLONY

REACCIONES DE INMUNODIFUSIÓN Cuando una solución de antígeno soluble, es mezclado con un antisuero correspondiente, el antígeno se combina muy rápido con el anticuerpo y si las condiciones son las adecuadas los reactantes forman un precipitado. La velocidad de la reacción de precipitación está influenciada por factores físicos, químicos e inmunológicos. Ouchterlony en 1947, introdujo el método de inmunodifusión doble, es una técnica de doble difusión en agar, se fundamenta en que cuando el antígeno y el anticuerpo, se difunden en un medio semisólido (agar) forman un inmunoprecipitado, estable que se visualiza fácilmente. Antígeno y anticuerpo difunden simultáneamente a partir de pozos cercanos, de modo que a su alrededor se forme un gradiente de concentraciones que, al alcanzarse y llegar al punto de equivalencia, formen bandas visibles de precipitación. METODOLOGÍA 1. Se disuelve la Solución salina amortiguada y el agar con ayuda de calor, ya

disuelto totalmente, el volumen perdido se debe restituir con agua destilada. Para evitar la contaminación microbiana se agrega 1 ml de solución de timerosal 1:1000 en agua destilada.

2. Se disponen de portaobjetos o capas petri. Barnice los portaobjetos con

agarosa al 1% y séquelos al horno. Funda agarosa al 1% y en caliente se colocan 5 ml de la agarosa al portaobjeto, sin derramar. Deje que gelifique. Si usa caja petri se llenan hasta una altura de 1 a 2 mm con la solución de agar aún caliente.

3. Se deja solidificar el agar a temperatura ambiente y si no se van a utilizar el

mismo día, las cajas petri pueden guardarse en cámara húmeda a 4ºC. Al agar de la caja petri se le hacen varias perforaciones: una central y dos o más alrededor de ésta. En el pozo central se coloca el antígeno que se desea investigar, y en los pozos periféricos se colocan los diversos antisueros. Tanto los antígenos como los antisueros se difunden por el agar, separándose por su peso molecular, de tal manera que los que tienen menor peso se difunden más rápidamente. Cuando el antígeno y su anticuerpo específico se encuentran, se unen y precipitan. Este precipitado se ve como una estrecha banda blanca en el agar.

4. Perfore los portaobjetos con un sacabocados, distribuya los agujeros

alrededor de un pozo central (3 mm de diámetro aproximadamente), en



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donde se colocará el anticuerpo, el antígeno se coloca en pequeños pozos laterales. Se debe mantener una distancia de aproximadamente 0.5 cm entre pozo y pozo.

5. Incube en una cámara húmeda, a temperatura ambiente por 24 h. Observe las bandas de precipitación, los portaobjetos también se dejan reposar en una cámara húmeda y se deja proseguir la difusión a temperatura ambiente durante 24 h.

INTERPRETACIÓN Se busca la presencia de bandas opalescentes entre ambos pozos. El número de bandas indica la cantidad de sistemas antígeno-anticuerpo presentes en las preparaciones. Si se trata de comparar dos antígenos, habrá identidad total entre ambos si se establece la continuidad en el punto donde se alcanzan las bandas correspondientes a uno y otro; no hay identidad si ambas bandas sólo se cruzan y cada una continua en línea recta; identidad parcial si hay un fenómeno mixto. Si al cabo del período de incubación no aparecen las bandas de precipitación o éstas aún no son muy claras, puede proseguirse la incubación durante el tiempo que sea necesario. Debe siempre vigilarse que el agar no se deshidrate. Las bandas pueden teñirse con algún colorante de proteínas (amido negro, eosina, fucsina, etc.) para ser mejor observadas. VENTAJAS DE LA PRUEBA DE OUCHTERLONY a. Se puede ver de cuantos antígenos está compuesto un producto

(embutido, bacteria, etc.). b. Se pueden comparar antígenos y antisueros entre sí. En efecto, cuando

en dos pozos adyacentes existe un mismo anticuerpo contra el antígeno central, la línea de precipitación se une. A esta línea se le denomina identidad total. Cuando los anticuerpos son diferentes y reaccionan contra antígenos del pozo central, las líneas de precipitación se cruzan y se les denomina no identidad. Existe también la posibilidad de que se encuentren dos o más antígenos diferentes que tengan el mismo peso molecular y que uno de ellos tenga anticuerpos específicos en dos pozos adyacentes y el otro solo en uno. En este caso, la línea estará al mismo tiempo, unida y cruzada, denominándose a este fenómeno identidad parcial.



32

INVESTIGACIÓN PREVIA AL EXPERIMENTO 1. ¿A que se le llama precipitación?

2. Investigue el sistema de difusión de Oudin (1947)

3. Investigue las aportaciones de Grabar y Williams (1953)

4. Investigue el método de Manzini

5. Investigue el método de Ouchterlony CUESTIONARIO PARA ANEXAR AL REPORTE

A. Realiza un esquema de las perforaciones que realizaste señalando los diferentes antisueros y el antígeno que utilizaste

B. Efectúa un esquema de las líneas obtenidas en la precipitación en gel. C. Enumera las fuerzas fisicoquímicas que son responsables de la unión

antígeno-anticuerpo D. ¿Consideras que esta prueba puede utilizarse para la identificación de los

grupos sanguíneos en manchas de sangre en Medicina Legal, y porque?



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Soluciòn salina

Se disulve la soluciòn salina amortiguadora y el agar con ayuda del calor. Ya que este disuleto

totalmente, el volimen perdido se restituye con agua destilada.

H2ODestilada

Agrega 1 mL de soluciòn

timerosal 1:1000 en agua

destilada, p/evitar contaminaciòn microbiana. H2O

Destilada

Barnizar las cajas petri con agarosa al 1% y secarlos al horno.

Fundir agarosa al 1% y en caliente se colocan de 1 a 2 mm en la caja petri con una soluciòn de agar caliente.

Se seja solidificar el agar a temperatura ambiente, al agra de la caja de petri se le hacen varias perforaciones.

En el pozo central se coloca el antigeno que se desea investigar, y en los pozos perifericos se colocan se colocan los diversos antisueros.

Antigeno

Incube en una camara humeda, a temperatura ambiente por 24 horas, observe las bandas de precipitaciòn.

DIAGRAMA DE FLUJO

Antisuero



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PRÁCTICA NO. 4 DETERMINACIÓN DE INMUNOGLOBULINAS SÉRICAS

1° PRUEBA DE PRECIPITACIÓN DEL SULFITO DE SODIO OBJETIVO El alumno determinará la presencia de inmunoglobulinas (Ig’s) séricas llevando a cabo la prueba de precipitación de sulfito de sodio. FUNDAMENTO Esta prueba se basa en la precipitación de Ig’s del suero por sales de sulfito de sodio. Esta prueba es útil cuando se determina la presencia de Ig’s en recién nacidos hasta tres semanas de edad. Su interpretación es de tipo objetivo y tiene un porcentaje de confiabilidad de aproximadamente 93%. Es indispensable que la muestra sea de suero y no plasma, ya que este contiene proteínas que se precipitarían con las Ig’s, dando falsos resultados. La hemólisis parcial de la muestra parece no afectar los resultados de esta prueba. Esta prueba permite diagnosticar la Falla en la Transferencia de Ig’s (FTI). METODOLOGÍA Se preparan tres soluciones de sulfito de sodio al 14, 16 y 18% en agua destilada. Se colocan 1.9 ml de cada solución en tres tubos de ensaye (con capacidad de 3 a 5 ml) y se añade 0.1 ml de suero a cada uno de los tubos, mezclando perfectamente bien el contenido. INTERPRETACIÓN En caso de haber titulación de Ig’s, se observará turbidez en forma inmediata y la formación de un precipitado al cabo de 30 - 60 min. Los resultados se interpretan de la siguiente manera: Precipitación en los tubos con 14, 16 y 18%: ≥ 15 mg Ig/ml de suero. Precipitación en los tubos con 16 y 18%: 5 - 15 mg Ig/ml de suero. Precipitación en los tubos con 18% o ninguna precipitación: ≤ 5 mg Ig/ml de suero.



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ZnSO4

7H2O

Se preparan tres disoluciones de sulfito de sodio al 14, 16 y 18 % en agua destilada.

1

2

Sulfito de sodio14 %




Colocar 1.9 de cada solucion y colocar 0.1 ml de suero en cada tubo.

Mexclar perfectamente el contenido.

DIAGRAMA DE FLUJOPrueba de precipitación

del sulfito de sodio



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2° PRUEBA DE TURBIDEZ DEL SULFATO DE ZINC OBJETIVO El alumno determinará la presencia de Ig’s séricas llevando a cabo la prueba de turbidez de sulfato de zinc. FUNDAMENTO Esta prueba se basa en la precipitación de Ig’s del suero al entrar en contacto sales de sulfato de zinc. Esta prueba es útil cuando se determina la presencia de Ig’s en recién nacidos hasta tres semanas de edad. Su interpretación es de tipo objetivo, el grado de turbidez desarrollado por la reacción tiene una correlación de 0.96 con el contenido de IgG o IgM del suero. Sin embargo, esta prueba puede verse afectada por la temperatura ambiental, el periodo de incubación, la presencia de bióxido de carbono en el reactivo y el grado de hemólisis de la muestra. Es indispensable que la muestra sea de suero y no plasma, ya que esta última causa lecturas más altas en los resultados. Esta prueba permite diagnosticar la FTI. METODOLOGÍA 1. Se colocan 20.8 mg de Sulfato de zinc heptahidratado (ZnSO4 7 H2O) dentro

de un frasco color ámbar de 100 ml de capacidad, se añade agua destilada a temperatura ambiente (previamente hervida) hasta llegar a la marca de 100 ml. Inmediatamente se cierra el frasco con su tapón y se agita hasta lograr una disolución total de la sal. Se fija el tapón a la botella con cinta adhesiva para lograr un buen sellado.

La solución del reactivo debe sustituirse aproximadamente cada dos meses, ya esta absorbe gradualmente bióxido de carbono, lo que altera los resultados de la prueba. También la exposición excesiva a la luz afecta la solución, la solución debe guardarse en refrigeración a una temperatura de 4 a 7°C

2. Se toman 0.1 ml de suero y se colocan en un tubo de ensayo al que se agregan 6 ml de la solución de ZnSO4 7H2O.

3. Se agita suavemente la muestra y se deja incubar por una hora a 20°C.



37

4. Se calibra el espectrofotómetro a 0, utilizando un tubo control con el reactivo de ZnSO4 7 H4O. A continuación, se mezcla bien el contenido del tubo prueba y se lee en el espectrofotómetro.

5. Se lee el grado de absorbancia (turbidez) a una longitud de onda de 660 nm. 6. El resultado se multiplica por 10 y se expresa como el número de unidades de

turbidez del ZnSO4 7 H4O. El número de U. TSZ corresponde a los miligramos de Ig’s totales por mililitro de suero. El número de U. TSZ se ha relacionado con las posibilidades de supervivencia del neonato. Menos de 10 U. TSZ (menos de 10 mg/ml): estos niveles son insuficientes para una protección adecuada (septicemia, diarrea por E. coli, etc. De 10 a 20 U. TSZ (de 10 a 20 mg/mI): acción de organismos patógenos sobre la mucosa intestinal ocasionando diarreas, principalmente. Más de 20 U. TSZ (más de 20 mg/ml): lactación exitosa. A medida que aumentan los niveles de anticuerpos (Ab’s), la mortalidad por causas infecciosas, se reduce hasta eliminarse por completo cuando sobrepasan las 40 U. TSZ.

ZnSO4

7H2O

Colocar 20.8 mg de ( ZnSO4 7H2O), dentro de un frasco color ambar.

20.8

Añadir agua destilada (previamente hervida) 100 mL. Inmediatamente se cierra el frasco con su tapon, agitacndo hasta llegar a la dilusion total.

1

ZnSO4

7H2O

DIAGRAMA DE FLUJO



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Agregar 6 ml de la solucion de ( ZnSO4 7H2O), agiitar suavemente la muestra.. Incubar durante una hora a 20° C

ZnSO4

7H2OZnSO4

7H2O

AGITAR SUAVEMENTELeer al espectofotometro a 660 nm. el resultado se multiplica por 10.

Una vez separado el suero, tomar 0.1 mL y colocarlo en un tubo de ensayo.

2



39

3° PRUEBA DEL GLUTARALDEHÍDO Se colocan 50µl de una solución de glutaraldehído al 10% en un tubo de ensaye, agregar 0.5 ml de suero y mezclar perfectamente. El tiempo requerido para que ocurra la coagulación es inversamente proporcional a la concentración de Ig’s en suero. Las muestras séricas con alta concentración de Ig’s coagulan la muestra entre 5 y 15 min.

INVESTIGACIÓN PREVIA AL EXPERIMENTO

1. Investigue la estructura de una Ig 2. Describa las características de cada una de las Ig’s 3. ¿Porque es importante determinar la presencia de las Ig’s?



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PRACTICA NO. 5

BRUCELOSIS: Aspectos generales y Serodiagnóstico Aspectos generales: Se entiende por Brucelosis al conjunto de enfermedades provocadas por los microorganismos del género Brucella tanto en el hombre como en los animales. Investigaciones en historia de la medicina consideran que la brucelosis es una enfermedad conocida desde Hipócrates (400 a. C.); sin embargo, las primeras descripciones en las que se presenta con claridad son las de Cleghorn en 1751. Marston en 1863, realizó estudios clínicos cuidadosos y autopsias de fiebres de Malta remitentes y en 1863 presentó una descripción detallada de la enfermedad tal como ocurría en Malta, la que fue confirmada por otros investigadores, no solo en esas Islas sino en otras zonas, considerándose desde entonces como padecimiento endémico característico de los países del mediterráneo. Por otro lado, el agente causal de la Brucelosis fue descrito por Bruce en 1886, en el bazo de soldados muertos por esa enfermedad. El mayor impacto de esta enfermedad en el humano se debe al alto costo del tratamiento, la pérdida de horas de trabajo, los costos de hospitalización y diagnóstico. Es una enfermedad principalmente de animales y el hombre se infecta de manera accidental al estar en contacto con productos, subproductos o secreciones de animales infectados ya sea porque trabaja en ranchos ganaderos, empacadoras de carnes, queserías, rastros, frigoríficos o por consumir leche o sus derivados sin pasteurizar. El género Brucella incluye tres especies importantes: B. melitensis, que infecta primordialmente cabras, pero puede infectar bovinos y cerdos; es el agente más patógeno responsable de la mayoría de los casos humanos; B. abortus, responsable de la brucelosis bovina y de patogenicidad moderada para el hombre; B. suis, cuyo reservorio primario son los cerdos; B. neotomae que se aísla de la rata de bosque; B. canis de los perros. Actualmente, se ha aislado B. maris que se encuentra en los animales marinos. Dos nuevas especies han sido propuestas para ser adicionadas a este género, B. cetaceae y B. pinnipediae aisladas de mamíferos marinos, cetáceos y pinipedios, respectivamente. También la B. cetaceae se ha aislado de focas.



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1. Resistencia y sobrevivencia Comparada con otras bacterias patógenas no esporuladas, Brucella tiene la capacidad de sobrevivir y persistir en el medio ambiente bajo ciertas condiciones de humedad y temperatura (Cuadro 1). A baja temperatura, Brucella puede sobrevivir en la tierra más de 10 semanas y en el estiércol líquido más de 2 1/2 años. En canales congeladas puede sobrevivir por muchos años. La Brucella es bastante sensible al calor ya que muere a temperatura de pasteurización o a una exposición de 60 °C por 30 min o a 70 °C durante 10 min. Es bastante sensible a las radiaciones ionizantes y muere rápidamente al ser expuesta a los rayos ultravioleta o rayos Gama de tal manera que bastan 4 ó 5 h de exposición a la luz solar para que muera la bacteria. En leche a 15 °C puede sobrevivir durante 38 días y en queso a 4.4 °C hasta 180 días. En placenta y tejidos fetales expulsados por los animales durante la primavera y el invierno puede sobrevivir hasta por 135 días. 2. Desinfectantes empleados en el control de Brucelosis Las explotaciones pecuarias afectadas de brucelosis se deben desinfectar periódicamente de acuerdo a los resultados obtenidos en los muestreos serológicos, es muy importante la desinfección de los materiales posteriormente a los partos así como de otras áreas donde ocurren los nacimientos. Todas las especies de Brucella mueren al exponerse a los desinfectantes comunes tales como componentes fenólicos al 3%, solución de sosa cáustica al 2%, creolina al 5% así como formol al 2%. El material de laboratorio empleado debe enjuagarse y desinfectarse en una solución de fenol al 5% durante la ejecución de pruebas (Cuadro 2). Serodiagnóstico Debido a que el aislamiento de Brucella a partir de personas o animales infectados es difícil y prolongado se utilizan y se confía en las pruebas serológicas para el diagnóstico rutinario de Brucelosis. Las pruebas de aglutinación para el diagnóstico son las más utilizadas en México. Prueba rápida en placa con antígeno Rosa de Bengala Es una prueba rápida de aglutinación en la que se emplea una suspensión de células de B. abortus (99S) teñidas con colorante Rosa de Bengala y disueltas en ácido láctico a pH 3.6. Esta prueba ha sustituido a la prueba de Huddleson, por ser más sensible y específica.



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Se considera como prueba positiva cuando ocurre cualquier tipo de aglutinación y negativa cuando no hay aglutinación al cabo de 4 min. Prueba de fijación de complemento La finalidad de la reacción de fijación de complementos (FC) es descubrir si en el suero existen anticuerpos específicos contra un antígeno al comprobar que el complemento desaparece (fijación) cuando se mezcla con el suero (anticuerpo). Al formarse un complejo antígeno anticuerpo éste fija el complemento presente en el medio, una vez fijado, este complemento está incapacitado para la lisis de glóbulos rojos sensibilizados añadidos en una segunda fase. Esta prueba ha demostrado ser exacta y sensible. Es una prueba excelente, sólo que para su realización requiere de personal capacitado, así como material y equipo adecuados. Prueba de Coombs (prueba de la antiglobulina) Es una técnica muy laboriosa y se basa en la demostración de anticuerpos no aglutinantes que en general pertenece a las clases lgG e IgA. Cuando este método se compara con la prueba de aglutinación en tubo los títulos obtenidos por Coombs son superiores, sobre todo en pacientes con brucelosis crónica en donde pueden llegar a ser 200 veces mayor al título. La prueba tiene una limitante ya que como mínimo se requieren 48 h para obtener resultados, de tal manera que algunos investigadores lo han sustituido por el método de inmunofluorescencia indirecta que determina este tipo de anticuerpos. Esta prueba detecta anticuerpos específicos que se han unido al antígeno pero que son incapaces de aglutinar. La prueba emplea una antigammaglobulina que se une a los anticuerpos que previamente se unieron a las células de Brucella, lo que da por resultado una aglutinación visible. Para el caso de la prueba de Coombs aplicada a sueros se utiliza la antiglobulina bovina (Alton). Prueba de ELISA Los trabajos publicados indican que el método de Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA, por sus siglas en inglés), es una prueba muy sensible y específica y capaz de distinguir entre Brucelosis aguda y crónica. El antígeno más utilizado consiste en una suspensión de bacterias lisas o de extractos enriquecidos en lipopolisacáridos (LPS) así como algunos antígenos de proteínas exteriores de la membrana (OMP). Con este método se identifican



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inmunoglobulinas totales (lgG, lgM, e IgA principalmente) presentes en el suero o en liquido cefalorraquídeo. La prueba utiliza como reactivo anticuerpos antiinmunoglobulinas acoplados a una enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina, betaglucoronidasa, etc.) estos anticuerpos reaccionan con las inmunoglobulinas y su antígeno. La muestra problema se hace reaccionar con su antígeno que se halla fijo en una superficie y si posee anticuerpos que se unen al antígeno hay reacción la cual se pone en evidencia con el reactivo enzimático y su substrato. La prueba se lleva a cabo en placas de microtitulación de poliestireno. Después de varios períodos de incubación la lectura se realiza en un lector de ELISA en el cual se determina absorbancia a 492 nm. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Este método conocido como PCR, por sus siglas en inglés, permite la rápida amplificación del material genético para su posterior análisis. El DNA de la Brucella sp es extraído mediante la técnica de fenolcloroformo modificada; posteriormente el DNA purificado se amplifica con la PCR. La PCR permite ampliar el material genético de la Brucella sp para su posterior análisis. La técnica está basada en el hecho de que las enzimas que realizan la síntesis del DNA requieren de la presencia de un iniciador o “primer” para copiar la cadena que les sirve de molde y en que la capacidad del DNA de formar híbridos es dependiente. El DNA obtenido se conserva a temperatura menor de 20°C hasta su procesamiento. La prueba ha sido de gran impacto, ya que goza de una gran sensibilidad y especificidad, puede determinar género, especie y hasta variedad en un corto tiempo.

Cuadro 1: Tiempo de sobrevivencia de B. abortus bajo diversas condiciones ambientales (Gillespie y Timoney, 1981).

Medio Temperatura o

estación Condiciones ambientales

Tiempo de sobrevivencia (d)

Exudado uterino Febrero Sobre la tierra 10 Placenta, órganos

fetales Invierno y primavera Bajo las hojas en

el bosque 135

Leche 15ºC Muestras de leche de vacas infectadas

38

Mantequilla 142 Queso 4.4 ºC 180 Pasto 12-21 ºC Feb.

15 -27 ºC Mayo 152 mm de lluvia Exposición al sol

6 <1



44

2.2-21 ºC Nov. 5 Cultivos en placa

abierta Octubre y Nov. Exposición al sol 2 -3

Agua <40 ºC. 37 ºC, 25 ºC, 8ºC.

800 57

Cadáver de cobayo infectado

Enero (Wisconsin) Junio y Agosto (Wisconsin) Enero (Wisconsin)

Sobre la tierra Sobre la tierra Bajo la tierra

44 1

29 Carne y carne salada 0 -20ºC 65

Abono en seco 70ºC Muestra del fondo Muestra de la parte superior

< 4h 2

Abono colocado 12ºC 250

Cuadro 2: Productos recomendados para la desinfección en caso de brucelosis (Trejo, S. J.,

1988).

Desinfectante Concentración de solución en

%

Temperatura de la solución

Exposición (h)

Cloruro de calcio 2-2.5 20º 1 Solución de sosa caustica

2 70-80º 3

Cal recién apagada 10-20 Ambiente 3 Emulsión de creolina 5 70-80º 3 Solución de formol 2 70-80º 3



45

PRUEBA RAPIDA DE AGLUTINACIÓN EN PLACA (ROSA DE BENGALA (Card Test))

INTRODUCCION Se emplea para el diagnóstico de brucelosis, es una prueba de aglutinación en donde se emplea el antígeno rosa de Bengala, cuando esta reacción es positiva el diagnóstico se debe de complementar desarrollando las pruebas de aglutinación en tubo y/o microplaca y la prueba de aglutinación con 2-mercaptoetanol (2-Me) en tubo y/o microplaca. Anteriormente, se realizaba la prueba de Huddleson y fue muy utilizada en todo el mundo para diagnóstico de brucelosis, pero según observaciones de la Universidad de Minnesota, este método si se utiliza solo debe usarse como prueba de selección porque se han encontrado a menudo reacciones falsamente positivas. OBJETIVO Desarrollar la prueba de tarjeta rosa de bengala como prueba tamiz para diagnóstico de brucelosis. FUNDAMENTO Esta prueba se basa en la búsqueda de Ab’s que se ponen de manifiesto para hacerse reaccionar con los antígenos complementarios que existen en la superficie bacteriana. METODOLOGÍA 1) Centrifugar la sangre y separar el suero del paquete celular (1500 rpm). 2) Antes de utilizar cualquier antígeno se debe llevar a cabo una prueba del antígeno a utilizar con un suero control positivo y un suero control negativo. Se depositan 0.08 ml de suero positivo en un óvalo de la placa serológica y 0.08 ml de suero negativo en otro óvalo, se agrega una gota de antígeno en cada uno, se mezcla con aplicador y se somete a rotación mecánica o eléctrica durante cuatro min. 3) Con una pipeta serológica (Bang) se extrae suero (a temperatura ambiente) problema. Manteniendo la pipeta en ángulo de 45° se deposita en una placa de vidrio serológica, en el primer óvalo se depositan 0.08 ml, en el segundo 0.04 ml, en el tercero 0.02 ml, 0.01 y 0.005 ml.



46

4) El frasco que contiene el antígeno se homogeniza por agitación (a temperatura ambiente) y se deposita una gota (0.03 ml) del antígeno sobre cada una de las cantidades de suero problema. 5) Con un removedor o aplicador de madera se mezclan el antígeno y el suero (comenzando con la dilución más baja a la más alta), extendiéndose cada una de las mezclas en círculos. 6) Agitar la placa manualmente o por rotación mecánica, durante cuatro min. 7) Observar la placa sobre un fondo bien iluminado. 8) Anotar y registrar el grado de aglutinación en los primeros cuatro min. 9) Reportar el título del suero como recíproco de la última dilución donde se observe aglutinación.


1) ¿Que es aglutinación? 2) Describa el concepto de antígeno y anticuerpo. 3) Investigue que es Brucilla 4) Cuáles son las diferentes especies de Brucella? 5) Describa su morfología 6) Explique que es una reacción cruzada. 7) ¿Cual es el principal antígeno de superficie de Brucella? 8) ¿Con que bacterias Brucella presenta reacción cruzada? 9) ¿Cual es la Brucella que presenta mayor patogenicidad y porque evade la fagocitosis? 10) ¿Porque el antígeno de Huddleson ya no se utiliza para diagnóstico de Brucelosis?



47

CUESTIONARIO PARA ANEXAR AL REPORTE

1) ¿Qué es serología? 2) ¿Que resultado obtuviste en la prueba Rosa de BENGALA? 3) ¿Por qué solo se reporta esta técnica como positivo o negativo? 4) ¿Qué es el antígeno Rosa de Bengala? 4) ¿Anota 5 enfermedades que diagnosticarías por aglutinación?



48

PRACTICA NO. 6 INTRODUCCIÓN La brucelosis es una zoonosis que tiene una distribución mundial. La Brucelosis es una enfermedad infectocontagiosa y zoonótica de origen bacteriano que afecta al ser humano y a diferentes especies animales domésticas, sobre todo al ganado bovino, ovino y caprino. La enfermedad en los animales ocasiona grandes pérdidas económicas debido a disminución en la producción de leche, abortos e infertilidad en machos y hembras. Generalmente, la brucelosis bovina se caracteriza por provocar aborto en el último tercio de la gestación. El género Brucella está formado por bacterias parásitas intracelulares facultativas, que producen el aborto epizoótico en muchas especies domésticas de animales y una enfermedad febril septicémica o infecciones focalizadas en el hombre. Tiene una importante repercusión económica en la producción pecuaria, debido a que provoca abortos, metritis, infertilidad y el nacimiento de animales débiles, constituyendo un serio problema para la salud pública. La especie de Brucella que afecta al ganado bovino son B. abortus, al ganado caprino, B. melitensis, en borregos es B. ovis la que causa la infección, para perros B. canis, en cerdos B. suis y para roedores B. neotomae. B. abortus primeramente infecta a ganado bovino y puede ser transmitida a perros, caballos, borregos y al hombre. La prueba solamente detecta Ab’s del grupo lgG que están presentes en el suero de animales infectados, esta prueba nos diferencia los animales vacunados de los animales infectados con Brucella. Al respecto, es importante mencionar que esta diferenciación solo ocurre cuando el animal fue vacunado con la cepa atenuada 19 de B. abortus, al contrario que si fue vacunado con la cepa RB51 de B. abortus, la prueba diagnóstica de rivanol no diferenciará estos anticuerpos por no tener especificidad contra esta cepa y solo detectará animales infectados al igual que la prueba de tarjeta. Por lo tanto, es importante seguir investigando nuevas técnicas diagnósticas que sean capaces de detectar con gran confiabilidad cualquier tipo de reacción ya que existen una serie de factores que influyen en el control de la brucelosis. OBJETIVO Diagnosticar la brucelosis bovina y/o caprina en animales infectados con Brucella, con la técnica diagnóstica Rivanol.



49

FUNDAMENTO

El diagnóstico de brucelosis en los laboratorios se fundamenta en pruebas convencionales que identifican anticuerpos circulantes en sangre. La prueba se basa en la precipitación de la albúmina y las macroglobulinas por la acción del lactato-2-etoxi-6-9-diamino acridina (Rivanol®) poniendo de manifiesto la IgG. METODOLOGÍA a) El suero problema, el antígeno y la solución de rivanol deben estar a temperatura ambiente por lo menos una hora antes de realizar la prueba. b) Antes de procesar la prueba diagnóstica rivanol, se debe de realizar la prueba de tarjeta, como prueba tamiz capaz de identificar una mínima cantidad de sueros falsos negativos, ya que si esta prueba no manifiesta aglutinación (negativa) no es necesario realizar las pruebas confirmatorias como rivanol o fijación de complemento. c) En un tubo pequeño (13 x 100 mm), depositar 0.4 ml del suero problema. Agregar 0.4 ml de solución rivanol y mezclar bien agitando el tubo y dejar a temperatura ambiente no menos de 10 min y no más de una h. d) Centrifugar las mezclas a 1000 x g durante 5 a 10 min. e) Con pipeta serológica, aspirar el líquido sobrenadante y hacer una prueba de aglutinación similar al método de tarjeta. En una placa de vidrio clara y limpia, depositar cantidades de 0.08, 0.04, 0.02, 0.01 ml. f) Agregar una gota (0.03 ml) de antígeno rivanol a cada cantidad de líquido sobrenadante, mezclar con un aplicador de madera, removedor múltiple metálico ó agitador mecánico, comenzando con la cantidad más pequeña (0.01 ml). Cada dilución debe ser extendida de forma que cubra la superficie indicada para la prueba estándar de aglutinación en placa (18, 21, 24 y 27 mm, respectivamente). g) Si se usa removedor múltiple metálico, enjuagarlo y secano bien antes de pasar la siguiente muestra. h) Inclinar la placa imprimiéndole movimiento circular haciéndola girar 4 veces.



50

i) Transcurridos 6 min, girar 4 veces la placa. A los 12 min rotar nuevamente la placa y efectuar la lectura con luz indirecta sobre fondo negro. INTERPRETACION Para facilitar las lecturas y la comparación con los resultados en otras pruebas se acepta denominar a las diluciones obtenidas como de 1:25, 1:50, 1:100 y 1:200, respectivamente. El resultado se expresa en función de la dilución más alta en la que observa aglutinación. Cualquiera que sea el título de reacción, se interpreta como infectado (título ≥ 1:25), ya que la prueba solamente detecta anticuerpos del grupo lgG en la misma forma que en la prueba de 2-Me en animales vacunados. El rivanol puede causar cierta precipitación de lgG, por lo cual el título final puede ser inferior al obtenido con la prueba de 2-Me. Nota: 1:25 sospechoso en animales vacunados (Alton).


1) ¿En que casos es útil la prueba de rivanol? 2) ¿Que diagnosticamos en una prueba de rivanol? 3) ¿Cuales son los anticuerpos aglutinantes? 4) ¿Que anticuerpos se detectan en esta prueba? 5) ¿Como se da la respuesta inmunológica a la infección por Brucella? 6) ¿Que Brucella es la más resistente al mecanismo de muerte intracelular? 7) ¿Porque se debe suspender la administración de un antibiótico 48 h antes de tomar una muestra de sangre?

CUESTIONARIO PARA ANEXAR AL REPORTE

1) ¿Que inconvenientes encontró al realizar la prueba de rivanol? 2) ¿Porque no se utiliza esta prueba para diagnóstico de Brucelosis en el hombre? 3) ¿Que diferencia hay entre el fenómeno de prozona y postzona? Explique.



51

Suero problema

Rivanol1%Antigeno

El suero problema, el antigeno y la solucion de rivanol, deben estar a temperatura ambiente.

Depositar 0.4 ml de suero problema.

Depositar 0.4 ml de solucion rivanol al 1%.

Rivanol1%

Rivanol1%

Mezclar bien agitando el tubo. dejar a temperatura ambiente 10 minutos.

Centrifugar a 2000 rpm de 5-10 minutos.

Con pipeta serologica Bang, aspirar el liquido sobrenadante y hacer una prueba de aglutinacion.

En placa de vidrio, depositar 0.08, 0.04, 0.02, 0.01 ml.

DIAGRAMA DE FLUJO



52

Agregar 0.03 de antigeno rivanol a cada cantidad de liquido sobrenadante.

Rivanol1%

0.08 ml0.04 ml0.02 ml0.01 ml

Mezclar con aplicador de madera, trancurridos 6 minutos girar 4 veces la placa en forma indicada al punto anterior.

A los 12 minutos rotar nuevamente la placa y efectuar la lectura con luz indirecta sobre fondo negro.



53

PRACTICA NO. 7

PRIMERA PARTE

AGLUTINACION ESTÁNDAR EN TUBO INTRODUCCIÓN Las pruebas serológicas se efectúan para determinar la presencia de anticuerpos específicos anti-Brucella en el suero del paciente, para observar el incremento del título en la brucelosis aguda y para evaluar la eficacia del tratamiento. Dichas pruebas serológicas incluyen aglutinación con rosa de bengala, aglutinación estándar y aglutinación en presencia de 2-Me. La interpretación de los resultados es diferente en los casos de brucelosis aguda y crónica. En las etapas tempranas de la infección la aglutinación estándar es positiva mientras que la de 2-Me permanece negativa. Con la evolución de la enfermedad, se observa aumento en el título de la prueba de 2-Me, llegando a alcanzar títulos tan elevados como los de aglutinación estándar. Un título de 1:20 - 1:40 en la prueba de aglutinación estándar por sí solo puede ser sospechoso, pero no es definitivo, mientras que igual título en la prueba 2-Me indica una infección activa y requiere tratamiento; los resultados de la prueba de 2- Me indican en forma útil en lo que se refiere a la respuesta del paciente al tratamiento antimicrobiano. El antígeno usado en las pruebas de aglutinación para detectar Ab’s en contra de B. melilensis, B. abortus y B. suis se prepara con suspensiones lisas de B. abortus cepa 99 S (o con B. abortus 1119-3). Si se desea investigar anticuerpos contra B. canis se emplea un antígeno preparado con esta bacteria, no puede usarse el mismo antígeno de cepas lisas puesto que B. canis es rugosa natural. Lo mismo sucede si se desea investigar Ab’s contra B. ovis. Los antígenos producidos se someten a procedimientos de control de calidad, se ajustan a lo establecido en los manuales de los centros internacionales de referencia para la Brucelosis y se comparan con los antígenos de referencia. OBJETIVO Efectuar la técnica cuantitativa y confirmatoria, aglutinación estándar en tubo para diagnostico de brucelosis aguda humana.



54

FUNDAMENTO Esta prueba se basa en la búsqueda de Ab’s que se ponen de manifiesto al hacerse reaccionar con los antígenos complementarios que existen en la superficie bacteriana. Esta prueba detecta las Ig’s específicas totales (IgM, IgG, IgA) presentes en el suero. METODOLOGÍA A) Antes de procesar esta prueba debe realizar al suero problema la prueba de

rosa de Bengala [0.03 ml de suero problema y 0.03 ml de antígeno (una gota)], con esta dilución eliminará el fenómeno de prozona y postzona, interpretará el resultado y si es positivo se procesa la prueba de aglutinación en tubo con solución salina fenolada (SSF). Se efectúa haciendo primero una dilución 1:10 del suero problema con SSF y a partir de esta, diluciones seriadas con factor de dilución 1:2 en SSF. Se añade después un volumen igual de antígeno diluido.

B) El antígeno se diluye 1: 10 en SSF para la prueba estándar. C) PREPARACION DE LA SSF.

El antígeno normalizado deberá diluirse con una solución salina (SS) con 0.5% de fenol, la cual se preparará de la siguiente manera: a) Cloruro de sodio (NaCl)…………………………… 25.5 g b) Agua destilada……………………………………. 3000 ml

Esta SS ya preparada queda a una concentración del 0.85%, la cual deberá esterilizarse en autoclave a 121°C durante 10 min (de preferencia preparar volúmenes adecuados para almacenarlos).

c) Fenol………………………………………………… 15g

De esta manera queda lista la SSF que se empleará para diluir tanto el antígeno como el suero. 1) Etiquetar una serie de 10 tubos limpios (13 x 100 mm). 2) Colocar 0.9 ml de SSF al 0.5% en el primer tubo. 3) Añadir 0.1 ml del suero problema al primer tubo y mezclar perfectamente.



55

4) En el resto de los tubos colocar 0.5 ml de SSF. 5) Tomar 0.5 ml del primer tubo y pasar al segundo. 6) Mezclar bien y pasar 0.5 ml al tercero y así sucesivamente hasta el último. 7) Desechar los 0.5 ml del último tubo. 8) Agregar a cada tubo 0.5 ml de antígeno previamente diluido en SSF. 9) Incubar a 37°C durante 24 h (48 h). 10) Las diluciones finales son: 1:20, 1:40, 1:80, 1: 160, 1:320, etc. 11) Examinar sin agitar los tubos empleando una fuente luminosa colocada

detrás de los tubos. 12) Deberá procesar al mismo tiempo y siguiendo cada uno de los pasos un

suero negativo y otro suero positivo (testigo). INTERPRETACIÓN Medir el grado de aglutinación por la mayor o menor clarificación que se haya producido en los tubos en comparación con su testigo y la formación de una malla de aglutinación en el fondo del tubo. ++++ Aglutinación - sedimentación completas con clarificación total del líquido

sobrenadante. +++ Aglutinación casi completa, clarificación del 75% ++ Aglutinación pronunciada y transparencia del 50% + Sedimentación parcial y clarificación del 25% - Clarificación nula.

El título corresponde al último tubo donde hubo clarificación del 75 al 100%, y se considera positivo cuando el título es mayor o igual a 1:80, es importante señalar que cuando hay exceso de Ab’s se presenta fenómeno de zona, por lo que se recomienda emplear siempre una serie de cuando menos 10 tubos.



56

Realizar al suero problema la prueba de rosa de bengala, 0.03ml suero problema, 0.03 ml de antigeno.

Rosa de Bengala

Interprete el resultado si es positivo, procese la prueba de aglutinacion en tubo con solucion salina fenodala.

H2Odestilada

NaCl

Para preparar la solucion salina fenolada se agrega 25.5 g de NaCl y 3000 ml de agua destilada, se diluye el antigeno normalizado.

Soluciòn salina

fenolada 0.5%

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Colocar 0.9 ml de solucion salina fenolada en el primer tubo.

1


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1

Soluciòn salina

fenolada 0.5%

En el resto de los tubos colocar 0.5 ml de soluciòn salina fenolada.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Soluciòn

salina fenolada

0.5%

DIAGRAMA DE FLUJO

AB C

Realizar una dilución 1:10 del suero problema con solución salina fenolada y a partir de esta, diluciones seriadas con factor de dilución 1:2 en solución salina fenolada, se añade después un volumen igual de antígeno diluido.

PRIMER

1

23



57

Pasar 0.5 ml del primer tubo al segundo.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Mezclar bien y pasar 0.5 ml al tercero y asi sucesivamente hasta elultimo.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Desechar los 0.5 ml del ultimo

tubo.

SEGUNDA PARTE

AGLUTINACIÓN EN TUBO EN PRESENCIA DE

2-MERCAPTOETANOL INTRODUCCIÓN El 2-Me es un agente reductor (reduce los puentes de disulfuro de la IgM) que disocia la macroglobulina IgM, que es un pentámero, con lo que se inactiva su actividad de Ab, por lo que si observamos la presencia de Ab’s aglutinantes se deberá a las Ig’s IgG e IgA. La IgG es resistente a este tratamiento cuando se usan las diluciones correctas del reductor. Esta prueba se considera de utilidad para controlar la eficacia de la quimioterapia, ya que al alcanzar valores negativos de IgG se considera que el tratamiento fue el adecuado, y se estará evitando originarle al paciente una brucelosis crónica por proporcionarle tratamientos inadecuados e inespecíficos. En infecciones crónicas, los niveles de IgG son mucho más altos que los de IgM. FUNDAMENTO Se emplea para poner de manifiesto Ab’s de la clase IgG principalmente, ya que los de la clase IgM se inactivan por el tratamiento con 2-Me.

Agregar a cada tubo 0.5 ml del antígeno previamente diluido en solución salina fenolada. Incubar a 37ºC durante 24 horas. Examinar sin agitar los tubos empleando una fuente luminosa.

45



58

METODOLOGIA A) Esta prueba de debe de procesar al mismo tiempo que la aglutinación en tubo

con SSF o aglutinación estándar. B) Preparación de la SS con 2-Me

a) Pesar 0.85 g de NaCl y disolver en 100 ml de agua destilada.

b) Añadir 0.71 ml de 2 - Me. Agitar y colocar en un recipiente limpio. C) Hacer dilución 1:10 del suero problema en SS con 2 - Me. D) Diluir el antígeno 1:10 con SS (no fenolada). Se efectúa haciendo primero una dilución 1:10 del suero problema con SS con 2- Me y a partir de esta, diluciones seriadas con factor de dilución 1:2 en SS con 2 - Me. Se añade después un volumen igual de antígeno diluido. 1) Etiquetar una serie de 10 tubos limpios (13 x 100 mm). 2) Colocar 0.9 ml de solución salina 2-Me al 0.71 en el primer tubo. 3) Añadir 0.1 ml del suero problema al primer tubo y mezclar perfectamente. 4) En el resto de los tubos colocar 0.5 ml de SS con 2-Me. 5) Tomar 0.5 ml del primer tubo y pasar al segundo. 6) Mezclar bien y pasar 0.5 ml al tercero y así sucesivamente hasta el último. 7) Desechar los 0.5 ml del último tubo. 8) Agregar a cada tubo 0.5 ml de antígeno previamente diluido en SS. 9) Incubar a 37°C durante 24 h (48 h) y realizar la lectura. 10) Las diluciones finales son: 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, etc. 11) Examinar sin agitar los tubos empleando una fuente luminosa colocada

detrás de los tubos.



59

12) Deberá procesar al mismo tiempo y siguiendo cada uno de los pasos un suero negativo y otro positivo (testigo).

INTERPRETACION Cualquier título de aglutinación por este método se considera positivo y se debe a la presencia de Ig’s de la clase IgG.

H2Odestilada

NaCl

Para preparar la solucion salina-mercaptoetanol, pesar 0.85g de NaCl y disolver en 100 ml de agua destilada, añadir 0.71 ml de 2-Mercaptoetanol y colocar en un recipiente limpio.

Soluciòn salina 2-ME

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Colocar 0.9 ml de solucion salina 2-ME en el primer tubo.

1


1

Hacer dilución 1:10 del suero problema en solución salina con 2-mercaptoetanol. Diluir el antígeno 1:10 con solución salina (no fenolada)

1

23

DIAGRAMA DE FLUJO



60

Colocar 0.5 ml de solucion salina 2-ME en el resto de los tubos.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Soluciòn

salina 2-ME

Soluciòn salina 2-ME

Pasar 0.5 ml del primer tubo al segundo.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Mezclar bien y pasar 0.5 ml al tercero y asi sucesivamente hasta el ultimo.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Desechar los 0.5 ml del ultimo

tubo.

Agregar 0.5 ml de antigeno previamente diluido en solucion salina.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Antigeno

Incubar a 37°C durante 24 horas (48 horas) y realizar la lectura, las diluciones finales son: 1:20,1:40, 1:80, 1:160, 1:320, examinar sin agitar los tubos empleando una fuente luminosa colocada detrás de ellos.

4

5 6

7



61

PRACTICA NO. 8

PRIMERA PARTE

AGLUTINACIÓN ESTANDAR EN MICROPLACA Esta técnica es la adaptación como micrométodo de la aglutinación estándar en tubo, que detecta al igual que esta, inmunoglobulinas específicas totales (IgG, IgM, IgA) del suero. METODOLOGIA 1) Se utiliza una placa de 96 pozos con fondo en “U”. 2) Colocar 180 µL de SSF al 0.5% en el primer pozo. 3) Añadir 20 µL del suero problema al primer pozo y mezclar perfectamente. 4) En el resto de los pozos colocar 100 µL de SSF. 5) Tomar 100 µL del primer pozo y pasarlo al segundo. 6) Mezclar bien y pasar 100 µL al tercero y así sucesivamente hasta el último. 7) Desechar los 100 µL del último pozo. 8) Agregar a cada pozo 100 µL de antígeno previamente diluido en SSF. 9) Incubar a 37°C durante 24 h (48 h) y realizar la lectura. 10) Las diluciones finales son: 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, etc. 11) Examinar sin agitar la placa empleando una fuente luminosa colocada detrás

de la microplaca. 12) Deberá procesar al mismo tiempo y siguiendo cada uno de los pasos un

suero positivo y otro suero negativo (testigo). INTERPRETACION Medir el grado de aglutinación por la mayor o menor clarificación que se haya producido en los pozos en comparación con su testigo y la formación de una malla de aglutinación en el fondo del pozo.



62

++++ Aglutinación - sedimentación completas con clarificación total del líquido sobrenadante.

+++ Aglutinación casi completa, clarificación del 75% ++ Aglutinación pronunciada y transparencia del 50% + Sedimentación parcial y clarificación del 25% - Clarificación nula. La reacción positiva se observa como un conglomerado de células en el fondo del pozo formando una malla de aglutinación (la cual al inclinar ligeramente la placa permanece adherida al fondo del pozo). El título corresponde al último pozo donde hubo clarificación del 75 al 100%, y se considera positivo cuando el título es mayor o igual a 1:80, en el último pozo se forma una malla bien definida, es importante señalar que cuando hay exceso de anticuerpos se presenta fenómeno de zona, por lo que se recomienda emplear siempre una serie de cuando menos 10 pozos.



63

Soluciòn salina

fenolada 0.5%

Colocar 180 microlitros de solucion salina fenolada al 0.5% en el primer pozo.

Depositar 20 microlitros de suero problema.

Soluciòn salina

fenolada 0.5%

Colocar 100 microlitros de solucion salina fenolada al 0.5% en el resto de los pozos.

Tomar 100 microlitros del primer pozo y pasarlo al segundo.

Mezcalr bien y pasar 100 microlitros al tercer pozo.

Desechar los 100 microlitros del ultimo pozo.

Agregar a cada pozo 100 microlitros de antigeno previamente diluido en solucion salina fenolada.

Antigeno

PRIMERA PARTE Aglutinación Estándar en

microplaca

Incubar a 37°C durante 24 horas (48 horas) y realizar la lectura, las diluciones finales son: 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, examinar sin agitar la placa empleando una fuente luminosa colocada detrás de ellos. Deberá procesar el mismo tiempo y siguiendo cada uno de los pasos un suero negativo (testigo).

1 2 3

45 6

7

8

DIAGRAMA DE FLUJO



64

AGLUTINACIÓN EN PRESENCIA DE 2- Me EN MICROPLACA

SEGUNDA PARTE Esta técnica es la adaptación como micrométodo de la aglutinación en tubo en presencia de 2- Me, que detecta al igual que esta, inmunoglobulinas de la clase IgG principalmente ya que los de la clase IgM se inactivan con el 2-Me. METODOLOGIA 1) Se utiliza una placa de 96 pozos con fondo en U. 2) Colocar 180 µL de SS con 2-Me al 0.71% en el primer pozo. 3) Añadir 20 µL del suero problema al primer pozo y mezclar perfectamente. 4) En el resto de los pozos colocar 100 µL de SS con 2-Me. 5) Tomar 100 µL del primer pozo y pasarlo al segundo. 6) Mezclar bien y pasar 100 µL al tercero y así sucesivamente hasta el último. 7) Desechar los 100 µL del último pozo. 8) Agregar a cada pozo 100 µL de antígeno previamente diluido en solución

salina. 9) Incubar a 37°C durante 24 h (48 h) y realizar la lectura. 10) Las diluciones finales son: 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, etc. 11) Examinar sin agitar la placa empleando una fuente luminosa colocada detrás

de la microplaca. 12) Deberá procesar al mismo tiempo y siguiendo cada uno de los pasos un suero positivo y otro suero negativo (control). INTERPRETACION Cualquier título de aglutinación por este método se considera positivo y se debe a la presencia de inmunoglobulinas de la clase IgG, es importante recordar que



65

cuando hay exceso de anticuerpos se presenta fenómeno de zona, por lo que se

recomienda emplear siempre una serie de cuando menos 10 pozos. INVESTIGACIÓN PREVIA AL EXPERIMENTO 1) ¿Qué es Brucelosis? 2) ¿Porqué se debe utilizar por lo menos una serie de 10 tubos o pozos? 3) ¿Que anticuerpos detectamos en la prueba de aglutinación estándar? 4) ¿Porqué B. melitensis evade la fagocitosis? 5) ¿Cómo se da la respuesta inmunológica a la infección por Brucella? 6) ¿Cuáles son los componentes antigénicos de Brucella? 7) ¿Cuál es el tratamiento específico para una brucelosis? 8) ¿Qué anticuerpos detectamos en la prueba de aglutinación con 2-Me? 9) ¿Para qué fines diagnósticos se utiliza la prueba de aglutinación con 2-Me? 10) ¿Qué actividad presenta el 2-Me frente a IgM? CUESTIONARIO PARA ANEXAR AL REPORTE 1) ¿Cómo realizaría en su laboratorio de análisis bioquímico clínicos un

diagnóstico de Brucelosis? 2) ¿Recomendaría al paciente volver a su laboratorio a otra valoración al

terminar el tratamiento indicado por el médico?



66

Soluciòn salina

2-ME al 0.71 %

Colocar 180 microlitros de solucion salina 2-ME al 0.71% en el primer pozo.

Depositar 20 microlitros de suero problema al primer pozo, mezclar perfectamente.

Colocar 100 microlitros de solucion salina 2-ME al 0.71% en el resto de los pozos.

Soluciòn salina

2-ME al 0.71 %

Tomar 100 microlitros del primer pozo y pasarlo al segundo.

Mezcalr bien y pasar 100 microlitros al tercer pozo.

Desechar los 100 microlitros del ultimo pozo.

Agregar a cada pozo 100 microlitros de antigeno previamente diluido en solucion salina.

Antigeno

SEGUNDA PARTE Aglutinación en presencia de 2-Me en microplaca.

Incubar a 37°C durante 24 horas (48 horas) y realizar la lectura, las diluciones finales son: 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, examinar sin agitar la placa empleando una fuente luminosa colocada detrás de ellos. Deberá procesar el mismo tiempo y siguiendo cada uno de los pasos un suero negativo (testigo).

12

3

4 5 67

8

DIAGRAMA DE FLUJO



67

PRACTICA NO. 9

ANTÍGENOS DE SUPERFICIE DE GRUPOS SANGUÍNEOS

SISTEMA ABO INTRODUCCIÓN Los antígenos son proteínas, polisacáridos voluminosos o grandes complejos de lipoproteína, que se encuentran principalmente pero no exclusivamente en la superficie de las membranas celulares y están colocadas de tal manera que las cadenas glucosídicas polares se encuentran en el ambiente externo de las células. Las estructuras exactas de estos glúcidos unidos a lípidos y proteínas de membrana están determinadas genéticamente. Los componentes antigénicos de la membrana del eritrocito se han estudiado en detalle debido a su importancia en el tratamiento con transfusiones. Se han distinguido mas de 100 antígenos del eritrocito constituyendo por lo menos 15 sistemas de grupos sanguíneos genéticamente distintos; sin embargo, no todos desencadenan reacciones de transfusión tan severas como los antígenos que conforman el denominado sistema ABO y el sistema Rh. Los antígenos A, B y O son oligosacáridos estructuralmente relacionados que pueden estar unidos a lípidos o a proteínas. El antígeno O (también llamado antígeno H) es una cadena de fucosa, galactosa, N-acetilglucosamina y glucosa unido a un lípido ceramida (o un hidroxilo de la cadena lateral de una proteína) a la glucosa. El antígeno A difiere del O solamente en que contiene un resto de N-acetilgalctosamina unido al resto más externo de la galactosa, en cuanto al B que también es parecido al O se diferencia por poseer un resto más de galactosa unido a la galactosa exterior. Todas las personas tienen la enzima que produce el antígeno O, las personas con el grupo sanguíneo A tienen, además, la enzima que adiciona N-acetilgalactosamina de más, mientras que los de tipo B tienen la enzima que adiciona la galactosa extra; los que tienen el tipo AB sintetizan ambos antígenos, el A y el B, mientras que los que son del tipo O solo producen el antígeno O. Los Ab’s contra los antígenos ABO son isohemaglutininas, pues los antígenos son de origen humano (iso, de la misma especie) y se descubren ordinariamente por una reacción de aglutinación con células de un tipo ABO conocido; en otras palabras, el suero que contiene anticuerpos contra los antígenos A y B hace que se aglutinen los eritrocitos en cuya superficie existen dichos antígenos. Hay



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cuatro fenotipos ABO básicos, tipo O (eritrocitos sin antígenos A ni B), tipo A (eritrocitos con antígeno A), tipo B (eritrocitos con antígenos B) y tipo AB (eritrocitos con antígeno A y B). Los antígenos Rh de los grupos sanguíneos recibieron su nombre por haberse identificado inicialmente en los eritrocitos del mono Rhesus (Macaca mulata). Los hematíes Rh+ poseen un antígeno denominado Rho en una nomenclatura y D en otra. El antígeno D es el que determina que un individuo sea Rh+ ó Rh-, las personas con genotipo DD o Dd son de tipo Rh+, los individuos con genotipo dd pertenecen al tipo Rh-. El antisuero antiD es sinónimo de antisuero antiRh. Para determinar los grupos sanguíneos en la práctica se hacen pruebas con los antígenos ABO y Rh, provocando reacciones de antígeno-anticuerpo, mediante pruebas de aglutinación. El mecanismo de una reacción de aglutinación se produce por medio de anticuerpos multivalentes que se combinan con partículas de antígeno, formando complejos antígeno-anticuerpo. La reacción de aglutinación se da cuando en una mezcla de las partículas de antígeno con los antisueros específicos provoca una agrupación de dichas partículas de antígeno con los antisueros específicos provoca una agrupación de dichas partículas antigénicas. Por lo general la aglutinación es perceptible a simple vista, pero en ocasiones se requiere de observaciones al microscopio de la preparación estudiada.

METODOLOGÍA 1. Acomodar al paciente de manera que este cómodo, e inspirarle confianza. 2. Explicarle al paciente lo que se le va a practicar. 3. Colocar el torniquete aproximadamente a la mitad entre el codo y el hombro. 4. Inspeccionar el área que planeamos usar (vena cefálica, vena basílica, vena cubital mediana, vena mediana). 5. Retirar el torniquete, ya que no puede durar mucho tiempo. 6. Ya localizada la vena, nuevamente colocamos el torniquete. 7. Se hace la asepsia con una torunda alcoholada al 7O%, procurando limpiar de arriba hacia abajo y dejar que se seque.



69

8. Fijar la vena en posición sujetando el antebrazo del enfermo con la mano y comprimiendo y empujando los tejidos blandos con el pulgar justo por debajo del punto donde se va a intentar la punción. 9. Se empuja la aguja al interior de la vena con una punción directa única de piel y vena. 10. Hay que desatar el torniquete para que la sangre fluya libremente. 11. Se retira la jeringa y la aguja. 12. Se le aplica una presión suave (tres min) en el punto de la punción con una torunda sin friccionar, ya que la fricción provoca hematomas, también, se le pide al paciente mantener extendido el brazo, para prevenir la formación de un hematoma. 13. La sangre se coloca en sus respectivos tubos y en ese momento se etiqueta con el número de registro o las iniciales del nombre del paciente, los exámenes solicitados por el médico y la firma de quien hizo la extracción. 14. Si utiliza una lanceta estéril, se desinfecta el dedo medio y se pincha la yema del dedo, se colocan tres gotas en sobre una placa de vidrio, se añade una gota de antisuero A, Rh y B, con diferente aplicador se mezcla cada antisuero con la gota de sangre. Se observa la reacción de aglutinación por debajo de la placa a contra luz y de ser necesario en el microscopio. 15. Al terminar, se sumerge la placa de vidrio en una solución de cloro comercial al 50%. INVESTIGACIÓN PREVIA AL EXPERIMENTO

1. Describe la importancia que tiene conocer la técnica de extracción de sangre venosa y porque es necesario que un Químico conozca esta técnica.

2. Describe los grupos sanguíneos.



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Lau r

a Pe r

a l es M

o ta

Se colocan 3 gotas de sangre sobre una placa de vidrio.

Lau r

a Per

a les M

o ta

A

Añadir 1 gota de antisuero A, Rh, B. Observar la reaccion de aglutinaciòn.

DIAGRAMA DE FLUJO

SISTEMA ABO

6 7 8



71

PRACTICA NO. 10

REACCIONES FEBRILES

METODO: Inmunológico; Prueba rápida de aglutinación o placa INTRODUCCIÓN Esta prueba consiste en detectar en la sangre la presencia de anticuerpos o células de memoria, las que indican que el organismo ha estado en contacto previamente con diferentes tipos de bacterias, o bien que el organismo ha padecido ciertas enfermedades. Las reacciones febriles son particularmente útiles para apoyar el diagnóstico de padecimientos como la fiebre tifoidea, brucelosis, paratifoideas y de Rickettsiosis. FUNDAMENTO La fiebre tifoidea, la fiebre malta y la tifoidea (salmonelosis, brucelosis y Rickettsiosis respectivamente) se confirman demostrando la presencia de los anticuerpos homólogos en el suero del paciente. Las diferentes salmonelosis se detectan usando antígenos específicos de la bacteria correspondiente seleccionados según la clase de salmonelosis que son más comunes en la región y esta prueba se conoce como reacción de Widal. La Brucelosis se comprueba con la reacción de Rosa de Bengala usando antígenos de B. abortus. Las Rickettsiosis se detectan usando antígeno procedentes de algunas cepas de Proteus OX que comparten un antígeno común con las Rickettsias (como el Proteus OX-1 9), en la Reacción de Weil Félix. MUESTRA: Suero, Separarlo de 5 ml sangre sin anticoagulante previo reposo de 30 min. Para separarlo, centrifugar a 3,000 x g X 5 min. Antígenos: 1. Tífico O 2. Tífico H 3. Paratífico A 4. Paratífico B 5. Brucella 6. Proteus OX 19



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METODOLOGÍA: PRUEBA CUALITATIVA 1. Revisar la caducidad de los antígenos, los cuales deben estar a temperatura

ambiente. Marcar con el número del paciente una serie de 6 anillos de la placa de aglutinación y sobre estos anotar los números de los antígenos (1 al 6).

2. Trasladar a la placa de vidrio 0.08 ml. de suero x c/u de los 6 anillos. 3. Agregar una gota de cada antígeno previamente mezclado al anillo

correspondiente. 4. Mezclar con un palillo (1/óvalo). 5. Balancear la placa durante dos min. 6. Interpretar la prueba antes de tres min, con la ayuda del aglutinoscopio.

Anotar el número de los antígenos que den la reacción positiva (aglutinación franca).

7. Practicar la prueba con los antígenos que dieron la reacción negativa (falta de

aglutinación) usando 0.01 ml de suero. Anotar los números de los antígenos que den reacción positiva (aglutinación

franca). 8. Practicar la prueba cuantitativa usando los antígenos que aglutinaron con el

suero. PRUEBA CUANTITATIVA I.-Cuando los antígenos aglutinan con 0.08 ml de suero. a) Trasladar con pipeta de vidrio 0.04, 0.02, 0.01 y 0.005 ml de suero por óvalo. b) Mezclar el antígeno y agregar una gota a cada cantidad de suero. c) Mezclar con un palillo comenzando con el óvalo que tenga 0.005 ml de suero y terminando con el que tenga 0.04 ml de suero. d) Balancear la placa x dos min.



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e) Interpretar la prueba antes de 3 min con ayuda del aglutinoscopio para determinar la cantidad más pequeña de suero que da la aglutinación franca. II.-Cuando los antígenos aglutinan con 0.01 ó 0.005 mI: a) Preparar una dilución progresiva doble de suero (1:2,1:4., 1:8, 1:16) en albúmina bovina al 33% de la siguiente manera: - Trasladar 0.1 ml de albúmina a c/u de los 3 tubos de ensayo y etiquetados. - Agregar 0.1 ml de suero del paciente al primer tubo y mezclar para obtener la dilución 1:2 - Trasladar 0.1 ml de la dilución 1:2 al segundo tubo y mezclar para obtener la dilución 1:4 - Trasladar 0.1 ml de la dilución 1:4 al tercer tubo y mezclar para obtener la dilución 1:8, etc. b) Trasladar 0.01 de cada dilución a la plaza de vidrio. c) Agregar una gota del antígeno correspondiente (mezclado). Mezclar con palillo. Balancear x dos min. INTERPRETACIÓN Detectar la dilución mayor que de la reacción positiva (aglutinación franca). Reportar el número del antígeno y el título determinado: VOLUMEN DE SUERO (ml) TITULO

0.08------------------------------------------------------------------------1:20 0.04------------------------------------------------------------------------1:40 0.02------------------------------------------------------------------------1:80 0.01------------------------------------------------------------------------1:160 0.005 (0.01 de dilución 1:2) ----------------------------------------1:320 0.01 de dilución 1:4---------------------------------------------------1:640 0.01 de dilución 1:8---------------------------------------------------1:1280 0.01 de dilución 1:16-------------------------------------------------1:2560

NOTAS.- 1.-En días calurosos, las reacciones pueden ser falsamente positivas 2.-Títulos menores de 1:80 se pueden considerar normales. Tomar en cuenta

diagnóstico clínico.



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INVESTIGACIÓN PREVIA AL EXPERIMENTO 1) ¿Qué significa “reacciones febriles”? 2) ¿Para qué resulta útil la demostración de anticuerpos en el suero contra las

especies de Salmonella? 3) ¿Porqué en la actual serología de suero de Salmonella deben utilizarse

antígenos representativos de diversos grupos de Salmonella? 4) ¿Cuál es el (cuales son los) antígeno (s) de superficie de Salmonella? 5) ¿Cómo resultan los títulos de aglutininas O en el transcurso de la enfermedad? 6) ¿Cómo resultan los títulos de aglutininas H en el transcurso de la enfermedad? 7) ¿Porqué el título de aglutinina O constituye el indicador mas fiable en una

infección reciente de Salmonella? 8) ¿Qué puede enmascarar la respuesta de la aglutinina en el suero? 9) ¿Cuáles son las especies que reconoce el esquema taxonómico de Salmonella

y cual es la que contiene más de 1500 serotipos? CUESTIONARIO PARA ANEXAR AL REPORTE 1) ¿Qué parámetros debemos considerar al considerar un resultado serológico? 2) ¿En qué consiste la preparación de antígeno H y la del antígeno O? 3) ¿Qué enfermedades se diagnostican en la prueba serológica con cepas de

Proteus y en que consiste su preparación? 4) ¿Cómo diagnosticaría en su laboratorio una infección por Salmonella? 5) ¿Cuál es el tratamiento de elección contra Salmonelosis? 6) ¿Cuáles son los factores importantes en la profilaxis de la transmisión de la

fiebre tifoidea de hombre a hombre? 7) ¿Considera usted poder erradicar la enfermedad humana causada por

Salmonella que infectan los animales y al hombre?



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8) Investigue que es el fenómeno de prozona, postzona y zona de equivalencia. 9) ¿Por qué es más conveniente empezar a trabajar con la dilución 1:40? 10) ¿Qué es título? 11) ¿Qué títulos considera indicativos de presencia de enfermedad en las

reacciones febriles (positivos) y porque?

PRÁCTICA NO. 11

ANTIESTREPTOLISINAS INTRODUCCIÓN El anticuerpo estreptolisina O se encuentra presente en casi todas las personas en títulos bajos, debido a que las infecciones estreptocócicas son comunes. Sin embargo, un título alto o creciente de antiestreptolisina O, indica una infección reciente producida por estreptococo β-hemolítico de grupo A, como amigdalitis, escarlatina, sepsis puerperal, erisipela, etc. Tiene además especial interés en los procesos que aparecen como segunda enfermedad: fiebre reumática y glomerulonefritis aguda. Por lo tanto a pesar de no ser una prueba específica para fiebre reumática, apoya su diagnóstico cuando lo sugieren la historia y los signos clínicos. FUNDAMENTO La estreptolisina O, producida por el estreptococo β-hemolítico de grupo A, tiene la propiedad de producir hemólisis cuando se pone en contacto con glóbulos rojos. Al colocar distintas diluciones de un suero que contenga antiestreptolisina O en presencia de dosis constantes de estreptolisina O, se produce una reacción antígeno - anticuerpo que neutraliza la capacidad hemolítica de la misma. Este fenómeno se evidencia por una inhibición de la hemólisis al agregar suspensión de glóbulos rojos del 3 al 5%. El título de antiestreptolisina será la recíproca de la máxima dilución del suero del paciente capaz de neutralizar totalmente la estreptolisina.



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REACTIVOS Estreptolisina O: estreptolisina liofilizada titulada. Buffer concentrado: solución de buffer fosfatos conteniendo fosfatos 0.36 mol/l y cloruro de sodio 1.2 moI/l, para pH final 6.5 Agua destilada Eritrocitos frescos humanos de grupo O Solución fisiológica PREPARACIÓN Buffer: diluir el contenido del frasco con el volumen de agua destilada indicado en el rótulo. A baja temperatura el buffer concentrado puede cristalizar. En tal caso colocar en baño de agua a 37°C unos minutos mezclando por inversión hasta dilución completa. Estreptolisina O: disolver cada vial con el volumen de buffer indicado en el rótulo, mezclando por inversión hasta disolución completa. Suspensión de eritrocitos: lavar los mismos tres veces con solución fisiológica. Luego del último lavado centrifugar a 2000 x g durante 15 min. En el sobrenadante no debe aparecer hemólisis; caso contrario desechar. Con los eritrocitos lavados, una vez descartado el sobrenadante, preparar una suspensión del 3 al 5% con buffer pH 6.5 ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos provistos: son estables en refrigerador (2 - 10°C) hasta la fecha de vencimiento indicado en la caja. Estreptolisina O: Una vez preparada es estable 2 horas a temperatura ambiente, 5 días en refrigerador (2 - 10°C) o 2 meses congelada (-20°C) y fraccionada. Buffer: estable 1 año en refrigerador (2 - 10°C). Suspensión de eritrocitos: los eritrocitos pueden usarse hasta 48 horas después de preparada la suspensión si previamente se lavan una vez con buffer y no se observa hemólisis.



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MUESTRA Suero a) Recolección: debe obtenerse suero libre de hemólisis. b) Aditivos: no se requieren. c) Sustancias interferentes conocidas: muestras con hemólisis visible pueden

conducir a una interpretación errónea de los resultados, por lo que deben descartarse.

d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la antiestreptolisina en suero

es estable congelada por lo que puede mantenerse en estas condiciones hasta efectuar el ensayo.

PROCEDIMIENTO Preparar diluciones de la siguiente forma: 1:10 (0.2 ml de suero + 1.8 ml de Buffer) 1:100 (0.5 ml de dilución 1:10 + 4.5 mI de Buffer) 1:500 (1 ml de dilución 1:100 + 4 mI de Buffer) Luego proceder de la siguiente forma:

Dilución de suero 1 en 10 1 en 100 1 en 500 controlesTubo No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13Suero diluido (ml) 0.2 1 0.8 0.6 0.4 0.3 1 0.8 0.6 0.4 0.2 Buffer (ml) 0.8 0.2 0.4 0.6 0.7 0.2 0.4 0.6 0.8 1.5 1Estreptolisina O (ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Mezclar y mantener a baño María a 37°C 15 min (o incubadora)

Eritrocitos 3 - 5% (ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Mezclar agitando ligeramente y mantener en baño María a 37°C durante 15 min, agitar nuevamente y continuar en baño María durante 30 min más. Centrifugar 3 min a1500 x g y leer.

Unidades Tood/ml 50 100 125 166 250 333 500 625 833 1250 2500 (-) (+)



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MATERIAL

- Tubos de ensayo. - Material volumétrico apropiado. - Centrífuga. - Baño de agua a 37°C

CONDICIONES DE REACCIÓN

- Temperatura de reacción: 37°C - Tiempo de incubación: 60 min. - Volumen final de reacción: 2 ml

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS El título de la muestra se expresa mediante la inversa de la mayor dilución en la cual se observa ausencia total de hemólisis. El tubo 12 (control eritrocitario) no deberá presentar hemólisis mientras que el tubo 13 (control estreptolisina O) deberá mostrar hemólisis completa. MÉTODO DE CONTROL DE CALIDAD Para controlar el procedimiento y los reactivos es conveniente procesar simultáneamente un suero con cantidad conocida de antiestreptolisina O. VALORES DE REFERENCIA Normalmente, pueden existir en suero hasta 200 unidades de antiestreptolisina O. Títulos superiores son indicativos de un proceso infeccioso por estreptococo β-hemolítico de grupo A. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO En caso de conservar la estreptolisina O reconstituida congelada, se recomienda fraccionaria de modo de evitar los congelamientos y descongelamientos sucesivos que ocasionan su deterioro.



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INVESTIGACIÓN PREVIA AL EXPERIMENTO 1. ¿Qué es la Estreptolisina O? 2. ¿Cuál es el título de antiestreptolisina O (ASO) en adultos, que se considera como límite superior normal? 3. ¿Cómo es el título de ASO en un recién nacido, y porque? 4. ¿Cómo se obtiene el antígeno necesario para el método de medición del título ASO? 5. ¿Qué enfermedad presentan los pacientes con incidencia mayor de títulos elevados ASO? 6. ¿Cuáles son los anticuerpos utilizados más a menudo en situaciones clínicas?

= + = + = +

1:10

0.2 ml suero

1.8 ml Buffer 1:100

0.5 ml dilución

1:10 4.5 ml Buffer

1:5001 ml

dilución 1:100

4 ml Buffer

DIAGRAMA DE FLUJO



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Dilución en suero

1:10 1:100 1:500 Controles

Tubo no. 1

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Suero diluido (ml)

0.2 1 0.8 0.6 0.4 0.3 1 0.8 0.6 0.4 0.2

Buffer (ml) 0.8 0.2 0.4 0.6 0.7 0.2 0.4 0.6 0.8 1.5 1 Estreptolisisna O (ml)

0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Mezclar y mantener en baño maría a 37 ° C 15 min (o incubar) =

Eritro 3-5% (ml)

0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Tubo no.

1

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Incubadora

Mezclar agitando en el baño maría a 37° C durante 15 min., agitar nuevamente y permanecer 30 min Centrifugar 3 min a 1500 rpm

y leer



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PRACTICA NO. 12

DIAGNOSTICO PRECOZ DEL EMBARAZO INTRODUCCIÓN

La gonadotropina o gonadotrofina es una hormona secretada por la glándula pituitaria. En la mujer, estimula el crecimiento del folículo ovárico que contiene el óvulo. La concentración de la hormona estimulante del folículo (HFE o FSH) es máxima en la primera parte del ciclo, durante las primeras etapas de desarrollo del folículo. En el varón, la FSH es esencial para la espermatogénesis (formación de espermatozoides).

Una de las funciones principales de la gonadotropina coriónica humana (HCG, por sus siglas en inglés, Human Chorionic Gonadotropin), químicamente una glucoproteína, es administrar los factores nutricionales y estimular cantidades necesarias de otras hormonas. Es una hormona que se sintetiza en el cerebro, manifestando diferentes funciones en la mujer y en el hombre. Es producida por células trofoblásticas (del sinciciotrofoblasto) de la placenta de la mujer durante el embarazo; aumenta su concentración en la sangre y en la orina de la mujer poco tiempo después de la implantación, y su presencia sirve para realizar pruebas de diagnóstico de embarazo.

La HCG es la base histórica y actual del diagnóstico de embarazos, su diferenciación de los falsos embarazos que pueden constituirse en tumores, así como del diagnóstico del cáncer de próstata.

La HCG estimula la maduración del óvulo y en los varones la producción de testosterona dentro de los testículos. Una de las funciones más importantes es la de prevenir la involución normal del cuerpo lúteo al final del ciclo sexual femenino. El cuerpo lúteo, además de secretar esta hormona, secreta progesterona y estrógenos. Todos los tratamientos con HCG en hombres y en mujeres deben ser supervisados por el médico especialista, para evitar posibles interacciones. Existen dos formas de valorar la presencia de HCG en el laboratorio: en sangre y en orina.

Los años de función reproductiva de la mujer se caracterizan por cambios rítmicos en las tasas de secreción de las hormonas femeninas y por cambios correspondientes en los órganos sexuales. Las funciones sexuales y reproductivas en la mujer pueden dividirse en dos fases principales: la primera es la preparación del cuerpo para la concepción, la segunda es el periodo de gestación o embarazo.



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Durante el periodo de gestación en la mujer se producen grandes cantidades de estas hormonas: HCG, estrógenos, progesterona y somatotropina coriónica, ya que sus niveles son esenciales para la supervisión del embarazo.

Una función principal de la HCG consiste en administrar los factores nutricionales y estimular cantidades necesarias de otras hormonas para mantener en óptimas condiciones el endometrio y la cavidad uterina, lo que, en caso de no haber concepción o cantidad insuficiente de esta hormona, se perdería en forma de líquido menstrual.

La HCG tiene otras aplicaciones diagnósticas, aparte del monitoreo del periodo de gestación y sus consecuencias después de éste. También se utiliza como un marcador tumoral en diferentes padecimientos neoplásicos en la mujer y en el hombre.

Existen diferentes métodos cuantitativos de laboratorio para determinar la presencia y niveles de ésta hormona, ya que con los años se han actualizado y purificado para el estudio, valoración y diferenciación de diversos diagnósticos.

Definitivamente el patrón de estudio de esta hormona es de gran importancia, ya que nos proporciona aspectos clínicos importantes durante las diferentes etapas de la naturaleza del hombre y de la mujer.

FUNDAMENTO La gonadotropina coriónica humana (HCG), es una hormona que aparece en la orina de mujeres embarazadas o en ciertos procesos neoplásicos. La determinación de HCG se puede realizar inmunológicamente mediante una prueba de inhibición de la aglutinación pasiva. La HCG es una glucoproteina producida por las células trofoblásticas después de la concepción. Después de cinco semanas de gestación aumenta la HCG en la orina y alcanza su máximo a las 10 semanas. En la medida de que la producción de estrógenos y progesterona por la placenta aumenta, durante el segundo trimestre del embarazo, los niveles de HCG descienden. OBJETIVO Identificar la gonadotropina coriónica humana en orina.



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MATERIAL

- Orina problema - Suero anti – HCG - Suspensión de partículas de látex o eritrocitos recubiertos con GCFI - Aplicadores de madera - Pipetas graduadas de 1ml - Centrífuga

METODO 1. Realice todo el proceso a temperatura ambiente 2. Filtre la orina o centrifugar y usar el sobrenadante 3. Coloque una gota de orina sobre la placa de vidrio 4. Adicione una gota del suero anti-HCG y mezcle 5. Adicione 2 gotas de suspensión de partículas recubiertas con HGC y mezcle 6. Mezcle suavemente la placa por 2 min y lea 7. Una inhibición de aglutinación indica una prueba positiva.



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.

1.- Realice todo el proceso a

temperatura ambiente

2.- Filtre o centrifugue la orina

y utilice el sobrenadante

3.- Coloque una gota de orina sobre la placa de

vidrio

4.- Adicione una gota de suero anti-HGC y mezcle

5.- Adicione 2 gotas de suspensión de

partículas con HGC

6.- Mezcle la placa por dos min

(suavemente) e interprete

DIAGRAMA DE FLUJO



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INVESTIGACIÓN PREVIA AL EXPERIMENTO 1. ¿Que es la gonadotropina coriónica humana? 2. ¿Cómo es la estructura de la HCG? 3. ¿Cómo es la relación existente entre la HCG, pregnanediol y estriol en la orina? 4. ¿Cual es e! período en el cual el nivel de HCG es óptimo para obtener resultados con esta prueba? 5. La persistencia de HCG en niveles altos es sugerente de…

PRACTICA NO. 13

DIAGNOSTICO SEROLÓGICO DE SÍFILIS INTRODUCCIÓN La sífilis es una enfermedad infecciosa aguda o crónica cuyo agente causal es Treponema pallidum (T. pallidum ) perteneciente, junto con otros treponemas, Borrelias y Leptospiras, a la familia Treponemataceae. La enfermedad está clasificada como venérea y de declaración obligatoria, siendo su mecanismo de transmisión el contacto directo con una lesión productiva. Tras un período de incubación de 12 a 90 días (media de 21 días), aparece en el lugar de la inoculación una lesión primaria, rica en treponemas (el chancro), que desaparece espontáneamente a las pocas semanas. Durante este primer estadío, conocido como sífilis primaria, T. pallidum se multiplica en los linfáticos regionales distribuyéndose por la sangre a todos los órganos del individuo (infección sistémica). Generalmente las pruebas serológicas se hacen positivas en este período pasadas 3-4 semanas de la infección. En el paciente no tratado, el segundo estadío comienza con la aparición de una de las manifestaciones sistémicas de la enfermedad: una erupción en piel, palmas y plantas, la roseola sifilítica, acompañada de síntomas generales y frecuentemente, de otros signos localizados (condilomas genitales). Las lesiones abiertas de este período son muy contagiosas. Tras la primera desaparición espontánea de la misma y durante el primer y segundo año, pueden aparecen brotes similares cada vez de menor



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intensidad (fases de latencia precoz) hasta que desaparecen totalmente todos los signos y síntomas (fase de latencia tardía). El tercer estadío de la enfermedad, que solo se presenta en unos pocos pacientes, se caracteriza por la formación de lesiones granulomatosas destructivas (gummas) que, curiosamente, tienen escasa carga treponémica. En este período pueden aparecer síntomas y signos de focalización de la enfermedad: neurosífilis, sífilis cardiovascular, etc. La identificación del T. pallidum mediante el examen directo del exudado de la lesión (campo oscuro y/o fluorescencia directa) es una prueba definitiva para asegurar el diagnóstico, aunque un resultado negativo del mismo no descarta la posibilidad de la enfermedad, ya que la presencia de treponemas puede ser escasa dependiendo de los días de evolución y de tratamientos previos. Debido a las dificultades que puede presentar la realización del diagnóstico directo, la experiencia indica que el diagnóstico indirecto (serológico) se ha convertido en el procedimiento de uso más frecuente. Actualmente existen diferentes técnicas para el diagnóstico serológico de sífilis: las no treponémicas (reagínicas) no determinan anticuerpos específicos frente a T. pallidum y se basan en antígenos compuestos de soluciones alcohólicas con cantidades determinadas de cardiolipina, colesterol y lecitina. Miden anticuerpos frente a estas sustancias que son producidas por los tejidos dañados por el T. pallidum. Estas pruebas son: VDRL (Venereal Research Disease Laboratory), RPR (Rapid Plasma Reagin), TRUST (Toluidine Red Unheated Serum Test), USR (Unheated Serum Reagin) y ELISA (Enzimoinmunoensayo). Son de bajo costo, fáciles de efectuar, se utilizan como pruebas de inicio en la detección de sífilis y para evaluar la respuesta al tratamiento. La desventaja que presentan es que, debido a su inespecificidad, pueden arrojar falsos resultados positivos. Las pruebas treponémicas, en cambio, detectan específicamente los anticuerpos de T. pallidum y su utilidad en el laboratorio está orientada a confirmar los resultados arrojados por las pruebas no treponémicas. Las pruebas treponémicas más conocidas son: FTA-Abs (Inmunofluorescencia indirecta con absorción del suero), FTA-Abs 200DS (Inmunofluorescencia indirecta con absorción y doble tinción), TPHA (Microhemaglutinación), Captia syphilis M (ELISA de captura anti cadena pesada), ELISA IgG, y WESTERN BLOT, las cuales tienen muy bajo índice de falsos resultados, tanto positivos como negativos. Deben realizarse con una absorción previa del suero para eliminar la reacción cruzada con otras treponemas. Sin embargo, carecen de utilidad para monitorear los tratamientos, ya que suelen permanecer positivas en el 85/90% de los pacientes tratados y curados.



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FUNDAMENTO La prueba del VDRL es un procedimiento de floculación no treponémico usado para detectar anticuerpos en sueros de pacientes con sífilis designados como reaginas. Si el resultado no esta de acuerdo con la observación clínica, se debe hacer una prueba de inmunofluorescencia. MATERIAL Equipo de diagnostico para pruebas no treponémicas Suero problema, Suero testigo Placas de aglutinación Baño maría Microscopio y aplicadores de madera METODO 1. Inactive el suero a 56°C durante 30 min (para VDRL) 2. Adicione en las placas una gota de los siguientes sueros: suero problema, suero testigo positivo, suero testigo negativo. 3. Coloque una gota de emulsión del antígeno, en cada uno de los pozos de la placa. 4. Mezcle por tres min y lea de inmediato en un microscopio con objetivo 10X. La presencia de floculación se interpreta como una prueba positiva.



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1.- Inactive el suero para la VDRL

2.- Adicione a las placas una gota de los siguientes sueros: suero problema, suero testigo positivo y suero testigo negativo

3.- Coloque una gota de emulsión del antígeno en cada uno de los pozos de las placas

4.- Mezcle por tres min y lea de inmediato a en un microscopio a un objetivo de 100x. La presencia de floculación se interpretará como positiva

DIAGRAMA DE FLUJO



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INVESTIGACIÓN PREVIA AL EXPERIMENTO 1. ¿Qué es la Sífilis y cómo se puede prevenir? 2. ¿Cómo se diagnostica en un laboratorio clínico? 3. ¿Qué significa la prueba del antígeno no treponémico? 4. ¿Qué significa VDRL? 5. ¿Qué significa la prueba del antígeno treponémico? 6. Explique como se presenta una sífilis congénita.

PRACTICA NO. 14

DETERMINACION DEL FACTOR REUMATOIDE

INTRODUCCIÓN La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad autoinmune sistémica que afecta el 1% de la población adulta a nivel mundial , se caracteriza por inflamación crónica de la membrana sinovial que finalmente conduce a pérdida de la función, dolor crónico y fatiga, hasta incapacidad en las personas que la padecen. Su causa es desconocida, aunque múltiples factores están involucrados en la patogenia de la enfermedad. Características inmunitarias principales • Los factores reumatoides IgM, IgA e IgG monomérica y pentamérica, existen en suero y líquido sinovial • Clínicamente, hay vasculitis y sinovitis. Consideraciones generales La AR es una enfermedad inflamatoria crónica, recidivante y sistémica, que afecta principalmente las articulaciones. Afecta de 1 a 3% de la población de EUA, con una relación de mujeres a varones 3:1. Los síntomas constitucionales incluyen malestar general, fiebre y pérdida de peso. La enfermedad tiene un inicio característico en las articulaciones pequeñas de manos y pies, y progresa de manera centrípeta y simétrica. Los ancianos pueden presentarse con afección



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de las articulaciones grandes proximales. Son frecuentes las deformidades. Las manifestaciones extraarticulares son vasculitis, atrofia de piel y músculo, nódulos subcutáneos, linfadenopatía, esplenomegalia y leucopenia. Patogenia inmunitaria Se desconoce la causa de la AR. Cerca de 70% de los individuos con AR tienen un haplotipo HLA -DR4. Este haplotipo posee algunas variantes diferentes. Ciertos alelos HLA –DR determinan la susceptibilidad a la enfermedad, así como su intensidad. Es posible que éstos y quizás otros determinantes genéticos proporcionen susceptibilidad a un factor ambiental no identificado, como un virus, que inicia el proceso de la enfermedad. Aunque nunca se han identificado partículas virales, en teoría un estímulo antigénico origina la aparición de una IgG anormal, lo cual ocasiona la producción de factor reumatoide y el desarrollo eventual de la enfermedad. Cualquiera que sea el estímulo primario, los linfocitos sinoviales producen IgG, IgM monomérica e IgM pentamérica antiinmunoglobulina (es decir, factores reumatoides). La presencia de agregados de IgG o complejos de IgG factor-reumatoide, pueden activar el sistema del complemento e inducir diversos fenómenos inflamatorios, como liberación de histamina, producción de factores quimiotácticos para neutrófilos PMN y células MN y daño a la membrana con citólisis. Existe un marcado flujo de leucocitos hacia el espacio sinovial. Las prostaglandinas y los leucotrienos, producidos por células inflamatorias, se consideran que desempeñan una función principal en la mediación de los procesos inflamatorios. Además, los lisosomas activados y las enzimas liberadas al espacio sinovial por leucocitos, amplifican más aún la respuesta inflamatoria de la membrana sinovial. El infiltrado mononuclear que se observa de manera característica dentro del sino vio, incluye colecciones perivasculares de células CD4 y conjuntos intersticiales de células CD8, linfocitos B, linfoblastos, células plasmáticas y macrófagos. La interacción inmunitaria de estas células origina liberación de linfocinas, las cuales ocasionan acumulación de macrófagos dentro del sinovio. Las diversas células inflamatorias de la articulación producen proteínas y colagenasas que lesionan el cartílago y las estructuras de soporte celular. Los factores reumatoides pueden tener una función importante en la causa de la enfermedad extraarticular. Los sujetos con vasculitis reumatoide tienen títulos aumentados de factores reumatoides de IgG, IgM e IgA. Los complejos antígeno-anticuerpo aplicados a animales de experimentación en presencia de factor reumatoide IgM, originan vasculitis necrosante. En teoría, los complejos



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inmunitarios inician la inflamación vascular por la activación del complemento. La afección pulmonar se relaciona con el depósito de complejos 11S y 15S, que contienen agregados de IgG en las paredes de vasos pulmonares y alvéolos. El factor reumatoide IgM 19S también se ha detectado en arteriolas y paredes alveolares adyacentes a los nódulos cavitarios. Los factores reumatoides no inician el proceso inflamatorio que ocasiona la enfermedad reumatoide, pero quizá perpetúen y amplifiquen este proceso. Diagnóstico inmunitario El dato serológico más importante es el título aumentado de factor reumatoide, presente en más de 75% de los individuos. Los factores reumatoides son inmunoglobulinas con especificidad para el fragmento Fc de la IgG. La mayor parte de las técnicas de laboratorio detecta factor reumatoide de IgM pentamérica, pero las propiedades del factor reumatoide también se aprecian en IgG e IgA. El factor reumatoide de IgM pentamérica puede combinarse con moléculas IgG para formar un complejo soluble circulante de alto peso molecular de inmunoglobulinas en el suero. En la AR, la electroforesis de proteínas séricas puede mostrar incremento de alfa-2 -globulina, hipergammaglobulinemia policlonal e hipoalbuminemia. A menudo, se aprecian en la vasculitis reumatoide los crioprecipitados compuestos de inmunoglobulinas. Los valores séricos del complemento en general son normales, pero pueden estar reducidos cuando hay vasculitis activa. Muchos sujetos tienen anticuerpos antinucleares. Se dispone de varias pruebas para detectar factor reumatoide en el laboratorio. En la actualidad, el método más utilizado para detección de factor reumatoide es la prueba de fijación en látex. La gamma-globulina agregada (fracción II de Cohn) se absorbe en las Partículas de látex, que entonces se aglutinan en presencia del factor reumatoide; sin embargo, no es específica, aunque si muy sensible, lo que origina gran incidencia de resultados falsos positivos. La prueba de eritrocitos sensibilizados de abeja (prueba de Rose- Waaler) depende de la fijación de anticuerpo específico, y es más específica que el análisis de fijación de látex. Los eritrocitos de carnero se recubren con anticuerpo de conejo contra eritrocitos de carnero. Los eritrocitos de carnero sensibilizados se aglutinan en presencia de factor reumatoide. Otras técnicas capaces de detectar el factor reumatoide de



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todas las clases, incluyen RIA, inmunofluorescencia indirecta, ELISA y nefelometría con láser. Sin embargo, resultados negativos de una prueba de factor reumatoide realizada con los procedimientos usuales de laboratorio no excluyen el diagnóstico de AR. Cerca de 20% de los individuos con AR por otra parte clásica son seronegativos. Algunos de estos pueden tener IgG, IgA o factores reumatoides monoméricos. Por el contrario, los factores reumatoides no son únicos para la AR. El factor reumatoide también se encuentra en sujetos con lupus eritematoso sistémico (30%), en un gran porcentaje de sujetos con síndrome de Sjogren (90%), y con menor frecuencia, en individuos con esclerodermia o polimiositis. Las pruebas positivas de aglutinación con la prueba de látex, también se presentan en personas con cierto número de afecciones inflamatorias crónicas como hepatitis crónica activa, kala-azar, sarcoidosis, neoplasia y sífilis. La prueba de los eritrocitos de carnero sensibilizados, en general es negativa en esos trastornos. En algunas enfermedades infecciosas crónicas, como lepra y tuberculosis, pueden ser positivas la prueba de látex y la prueba del eritrocito de carnero sensibilizado. En la endocarditis bacteriana subaguda, ambas pruebas pueden ser positivas durante la enfermedad activa y es posible que se vuelvan negativas al mejorar el paciente. En los reclutas militares se ha notado la aparición transitoria de factor reumatoide después de vacunaciones. Los estudios epidemiológicos han mostrado que un número pequeño de gente normal tiene factores reumatoides. Gran proporción de los ancianos tiene prueba positiva de látex, aunque en general es negativa la prueba de eritrocitos de carnero sensibilizados. ARTRITIS JUVENIL Sus características inmunitarias principales son la existencia de factores reumatoides evidentes o “escondidos” y la presencia de anticuerpos antinucleares. La artritis juvenil consiste en un grupo de trastornos que se presentan en individuos menores de 16 años de edad. La incidencia de esta enfermedad tiene un punto máximo en los varones a la edad de dos años y de nuevo a los nueve años, mientras que en las niñas alcanza su punto mayor entre 1 y 3 años de edad. Esta enfermedad se puede presentar como una enfermedad sistémica (enfermedad de StiII), poliartritis o pauciartritis seronegativa, o bien poliartritis seropositiva idéntica a la artritis reumatoide del adulto. El pronóstico de las niñas con enfermedad pauciarticular es excelente, mientras que los varones con esta enfermedad pueden desarrollar finalmente espondilitis anquilosante.



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En cuanto a su patogenia inmunitaria. Se desconocen los mecanismos básicos inmunopatógenos de la artritis juvenil; sin embargo, se presentan defectos humorales y celulares. Está presente hipergammaglobulinemia difusa que incluye IgG, IgA e IgM. Se han detectado factores reumatoides de todas las clases de inmunoglobulinas. Cerca de 10% de los niños con artritis juvenil tiene una prueba positiva de fijación de látex para factor reumatoide IgM. El suero de algunas personas con pruebas negativas de fijación de látex puede contener factores reumatoides IgM. Se han ofrecido dos teorías principales es un intento de explicar la presencia de estos factores reumatoides “escondidos” en la artritis juvenil. Primero, el factor reumatoide IgM puede fijarse con avidez a la IgG nativa en el suero del enfermo y, por tanto, no tiene la propiedad de fijar la IgG que recubre las partículas de látex. Segundo, puede haber una IgG anormal que de preferencia se fija a la IgM y, por tanto, bloqueo la prueba de fijación de látex. Los factores reumatoides de IgM pentamérica que reaccionan en frío (4°C), llamados crioglobulinas se vinculan con la enfermedad grave. Están aumentados los componentes séricos de la vía clásica y alterna del complemento, aunque este aumento es menor en niños con factores reumatoides o enfermedad grave. El aumento del complemento sérico puede reflejar una sobre compensación secundaria en respuesta al incremento en el consumo o quizá un aumento general en la síntesis de proteínas. Los estudios de metabolismo del complemento, en realidad muestran hipercatabolismo. La depresión del complemento en el líquido sinovial tal vez sea secundaria a la activación del complemento, debida a complejos inmunitarios, similar a la que se aprecia en la artritis reumatoide. Los estudios sugieren que los pacientes con artritis juvenil poseen ciertos tipos tisulares de HLA con frecuencias mayores a las esperadas. De esta manera, las personas con la enfermedad pauciarticular de inicio temprano, tienden a ser positivos para los antígenos HLA -DR5 o HLA-DR8, mientras que aquellos con la enfermedad pauciarticular de inicio tardío, tienden a ser HLA -B27 positivas. Los individuos con enfermedad poliarticular positiva a factor reumatoide, tienden a ser HDL-D4 positivos, y aquellos con enfermedad sistémica tienden a resultar HLA-DR5 positivos. Finalmente, el diagnóstico inmunitario de la artritis juvenil, al momento, se basa en estudios clínicos. Aunque ciertas anormalidades de las inmunoglobulinas, complemento e inmunidad celular son compatibles con el diagnóstico de artritis juvenil, ninguna prueba inmunitaria específica es diagnóstica.



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FUNDAMENTO Las partículas de poliestireno cargadas con gamma-globulina humana son aglutinadas por las muestras que contienen factores reumáticos. OBJETIVO Procesar el estudio de laboratorio para identificar la presencia o ausencia de factores reumatoides en pacientes, así como establecer sus características y significado inmunitario. MATERIALES Y REACTIVOS 3 Pipetas serológicas de 1/100 ml 1 Placa plástica de prueba de factor reumatoide 3 Muestras séricas presuntamente positivas a factores reumatoides Aplicadores de madera o de plástico PROCEDIMIENTO 1. Llevar las muestras de los pacientes y/os reactivos a temperatura ambiente. 2. Colocar en uno de los campos de la placa de prueba, 40 µl de muestra sérica del paciente sin diluir; en otro campo, una gota (aproximadamente 40 µI) de suero control positivo y, finalmente, en un tercer campo, colocar una gota de igual magnitud que las anteriores de suero control negativo. 3. Colocar una gota (aproximadamente 40 µl) del reactivo comercial Rapi Tek-RF previa agitación, en cada una de las muestras; después, utilizando los aplicadores de madera o de plástico, mezclar estas soluciones. Al terminar, imprímale a la placa un movimiento de rotación con el fin de homogeneizar los componentes. 4. Al cabo de 2 min observe si se presenta una aglutinación (prueba positiva). INTERPRETACIÓN Una clara aglutinación indica la presencia de factores reumatoides. Las muestras que no reaccionan a la prueba no contienen factores reumatoides o estos se encuentran en una concentración menor a las 20 UI/ml.



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1. Describe que es la proteína C reactiva

2. ¿En que individuos encontramos esta proteína?

3. ¿Cómo se determina la presencia de esta proteína?

4. ¿En que casos aumentan los niveles de proteína C reactiva?

5. ¿Cuál es su utilidad más común?



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Llevar las muestras de los pacientes y/o los

reactivos a temperatura ambiente

Colocar en uno de los campos de la placa de

prueba, 40 µl de muestra sérica del

paciente sin diluir, en otro campo, una gota

del suero control positivo, y en otro

campo, colocar una gota de control negativo

Colocar

una gota del

reactivo Rapi Tek-

RF en cada muestra

Mezclar las soluciones con un agitador.

Enseguida imprimir movimiento para

homogenizar componentes

Al cabo de dos minutos observe si se presenta aglutinación (prueba

positiva)

DIAGRAMA DE FLUJO



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PRACTICA NO. 15

PROCEDIMIENTO PARA LA OBTENCIÓN DE CÉLULAS MONONUCLEARES A PARTIR DE SANGRE TOTAL POR EL MÉTODO FICOLL-HYPAQUE OBJETIVO Aprender la metodología para obtener células mononucleares (MN) a partir de sangre venosa. METODOLOGÍA La sangre periférica se colecta en tubos Vacutainer con EDTA y se procesa en un lapso no mayor de cuatro horas a temperatura ambiente. Posteriormente, la sangre total se centrifugó a 1500 x g durante 15 min, se recolectó el plasma y se colectó en un tubo cónico de 15 ml la capa de células MN o suspensión celular (SC) presente entre el plasma y el paquete globular, posteriormente la SC se resuspende en RPMI suplementado con suero fetal bovino (SFB) al 10% y 27 mM de bicarbonato de sodio llevándolo a 6 ml, después se pasa a otro tubo cónico con 3 ml de Ficoll-histopaque de una manera lenta por las paredes del tubo, se centrifuga a 1,500 x g durante 15 min (eliminar freno de la centrífuga), se obtienen 4 capas, Ficoll, MN, Ficoll y PMN con eritrocitos, respectivamente. Posteriormente, se recupera el anillo rico en células MN mediante aspiración con una pipeta Pasteur y se lava dos veces PBS estéril llevándolo hasta 10 ml para lavar del Ficoll que haya quedado, manteniendo en hielo y centrifugar a 1500 x g durante 5 min. Se elimina el PBS por decantación y el botón celular se resuspende con 1 ml (2 ml si es una SC grande) de medio de cultivo RPMI-1640 completo (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA) suplementado con SFB al 10%, inactivado por calor, se mezcló dentro del medio para no formar burbujas con la misma micropipeta.



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Viabilidad Celular Los botones celulares se resuspenden en RPMI completo con SFB, 100 U/ml de penicilina/100 µg/ml de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, 15 mM de hepes (2.38 g/l), aminoácidos esenciales y 50 µM de 2-Me. La viabilidad de las células se determina utilizando la prueba de exclusión del colorante azul de tripano. Se realiza en un hematocitómetro (cámara de Neubauer) de la siguiente manera: se preparan 100 µl de suspensión (1:10): en un tubo eppendorf se agregan 90 µl de PBS + 10 µl de SC, se mezcla y en otro tubo eppendorf se toman de esta suspensión 10 µl + 80 µl de PBS + 10 µl de azul de tripano, se mezcla e inmediatamente se toman 10 µl y se agregan a un hematocitómetro para determinar la viabilidad celular. Se realiza una dilución con 100 µl de SC: en un tubo eppendorf de adicionan 90 µl de PBS más 10 µl de SC (1:10), de esta suspensión se toman 10 µl y se pasan a otro tubo eppendorf con 80 µl de PBS más 10 µl de azul de tripano (1:100) e inmediatamente después se mezcla y se toman 10 µl para adicionarlos a un hematocitómetro para contar las células MN en un microscopio con el objetivo seco débil (10X), una vez contadas, la densidad celular se ajustó a una concentración de 1 x 106 células/ ml: Número de células / 4 x 104 x factor de dilución = cantidad de células/ ml Se incuban a 37ºC en una atmósfera húmeda con 5% de CO2, por ser una transformación blastoide con antígenos específicos (5 a 6 días). Después de haber incubado la SC, a cada pozo de la placa se le añaden 20 µl de bromuro de difeniltetrazolio (MTT) (5 mg/ml de RPMI 1640)/pozo y se incuban durante 60 min más; posteriormente, a las placas se les descarta el sobrenadante. Luego se adicionan 300 µl de Dimetil sulfóxido (DMSO)/pozo, para hacer liposolubles las células y se efectúa la lectura de la placa en un lector de ELISA a una densidad óptica (DO) de 570 nm.



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OBTENCION DE CELULAS MONONUCLEARES POR EL METODO FICOLLL-

HYPAQUE Sangre en tubo procesada Centrifugar 15 min.

Recolectar plasma Resuspender en RPMI

Pasar a un tubo Ficoll-histopaque y centrifugar

Recuperar el anillo de células mononucleares con una pipeta Pasteur

Centrifugar 5 min, suspender en medio de cultivo con cultivo RPMI-1640

Numero de células /factor de dilución = cantidad de células/ml

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CONGELACIÓN Y DESCONGELACIÓN DE CÉLULAS MONONUCLEARES Cuando sea necesario se lleva a cabo la congelación de linfocitos la cual consiste en que una vez obtenidos los linfocitos de sangre periférica se suspenden en 0.1 ml de RPMI 1640 a una concentración de 6 X 107 células/ml y se colocan en un criotubo, inmediatamente se adiciona 90% (90µl) de SFB y 10% (10µl) de DMSO y luego se congelan a -70°C. Para descongelar las células, se mantienen a temperatura ambiente durante 10 min y luego se centrifugan a 800 x g durante 10 min a 10°C; después se descarta el sobrenadante y el paquete celular se suspende en RPMI 1640, ajustando las células a la concentración deseada. Se efectúa la lectura de la placa en un lector de ELISA a una DO de 570 nm. Obtenidos los linfocitos se suspenden en RPMI

Se adiciona suero fetal bovino

Descongelar a temperatura ambiente 10 min

Centrifugar 10 min



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PRACTICA NO. 16

PRUEBAS CRUZADAS INTRODUCCIÓN La transfusión es uno de los modelos trascendentales que obligan a la aplicación rigurosa del control de calidad. Actualmente, hay una gran variedad de pruebas pretransfusionales que se han desarrollado para mejorar la seguridad y eficacia de una transfusión; si se efectúan de manera adecuada, establecen la compatibilidad ABO entre el donador y el receptor y detectan la mayoría de los anticuerpos clínicamente significativos. FUNDAMENTO: Este se logra a través de la detección de anticuerpos salinos y de anticuerpos incompletos. OBJETIVO: Establecer la aceptación o rechazo de una transfusión. METODO 1. Preparar una suspensión al 5% de hematíes en solución isotónica, tanto del donador como del receptor. 2. Usando tubos de ensayo pequeños: PRUEBA MAYOR PRUEBA MENOR Una gota de suero del receptor Una gota de suero del donador Una gota de suspensión de eritrocitos Una gota de suspensión de eritrocitos del del donador receptor AUTOTESTIGO Una gota de eritrocitos del receptor más dos gotas de suero del receptor - Agitar cada tubo y centrifugar inmediatamente a 1000 x g durante 1 min.



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- Remover suavemente los eritrocitos sedimentados y observar si hay aglutinación. - Si el resultado es dudoso, incubar a 37°C durante 20 min. - Centrifugar a 1000 x g durante 1 min y remover los eritrocitos sedimentados. Observar si existe hemaglutinación macroscópica. - Si la reacción continua siendo negativa, débil positiva o dudosa se lavan los eritrocitos 4 veces con solución isotónica a 0.9%. - Después del último lavado se elimina el sobrenadante (solución isotónica) y se resuspenden los eritrocitos en las ultimas 1 — 2 gotas de solución isotónica. - Agregar una gota de suero de Coombs a cada tubo. - Mezclar. Centrifugar a 1000 x g durante un min. - Remover suavemente los eritrocitos sedimentados y observar si existe la aglutinación macroscópica. También se puede observar al microscopio sin cubreobjetos. - Interpretación: en caso de compatibilidad, las reacciones o pruebas cruzadas no presentan ni hemólisis ni aglutinación. NO aglutinación en la prueba mayor y en la prueba menor, esto significa 100% de COMPATIBILIDAD SANGUÍNEA. Aglutinación en la prueba mayor: 75% de incompatibilidad Aglutinación en la prueba menor: 25% de incompatibilidad PRUEBAS CRUZADAS EN MEDIO PROTEINICO PRUEBA MAYOR PRUEBA MENOR Dos gotas de suero del receptor Dos gotas de suero del donador Una gota de suspensión de eritrocitos Una gota de suspensión de eritrocitos del del donador al 2% receptor al 2% - Agregar dos gotas de albúmina bovina al 22%



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- Incubar 15 min a 37°C - Mezclar y centrifugar durante un min a 3000 x g. - Remover suavemente los eritrocitos sedimentados y observar si existe aglutinación macroscópica. INVESTIGACIÓN PREVIA AL EXPERIMENTO

1. ¿Para que se realizan en un Banco de Sangre las pruebas cruzadas?

Suspensión de eritrocitos en solución isotónica

Prueba mayor Prueba menor

Agitar y centrifugar cada tubo

Remover eritrocitos y ver aglutinación

Si es dudoso el resultado, incubar. Centrifugar nuevamente resultado dudoso, lavar eritrocitos. Resuspender en solución isotónica y agregar suero de Coombs 1 gota Mezclar y centrifugar 1 min Remover eritrocitos sedimentados, observar. EN CASO DE COMPATIBILIDAD, NO PRESENTA HEMOLISIS NI

AGLUTINACION

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PRACTICA NO. 17

PRUEBA DE COOMBS El Fundamento de la Prueba de Coombs es que permite demostrar la presencia de anticuerpos incompletos mediante el uso de un segundo anticuerpo, que es una antiglobulina. La Prueba de Coombs directa se utiliza como método diagnóstico de enfermedades como las anemias hemolíticas, la enfermedad hemolítica del recién nacido y en las reacciones transfusionales. La Prueba de Coombs indirecta se usa para realizar tipificación de grupos sanguíneos, pruebas sanguíneas cruzadas y como método de rastreo para evitar reacciones transfusionales.

PRUEBA DE COOMBS DIRECTA FUNDAMENTO Se emplea la antiglobulina para detectar los anticuerpos incompletos antieritrocitarios, que ya se encuentran unidos in vivo a los eritrocitos. Es un procedimiento valioso en el diagnóstico de la anemia hemolítica del recién nacido y en la anemia hemolítica auto inmune. METODO EN TUBO - Colocar una pequeña cantidad de sangre completa en un tubo de ensayo. - Lavar con solución isotónica 4 veces, centrifugando en cada ocasión y eliminar el sobrenadante salino. - Preparar una suspensión de eritrocitos al 2% - Depositar una gota de la suspensión de eritrocitos en un tubo pequeño y añadir una gota de suero de Coombs. - Mezclar y centrifugar a 1000 x g durante 1 min. - Remover suavemente los eritrocitos sedimentados y observar si existe aglutinación macroscópica. INTERPRETACIÓN Aglutinación: significa prueba directa positiva.



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MÉTODO EN PORTAOBJETOS: - Preparar una suspensión de hematíes al 50%, lavando previamente los eritrocitos en 4 ocasiones. - Colocar una gota de la suspensión de hematíes en un portaobjetos. - Agregar a un lado 1 gota de suero de Coombs. - Mezclar con un agitador. - Rotar el portaobjetos - Observar si hay aglutinación dentro de los siguientes dos min.

Colocar una pequeña cantidad de sangre completa en un tubo de ensayo.

Solucion salina

Lavar con solucion salina 4 veces, centrifugar en cada ocasion y eliminar el sobrenadado.

Depositar una cantidad apropiada de sangre y solucion salina, centrifugar durannte 5 minutos.

Solucion salina

Decantar el sobrenadante e incorporar nuevamente solucion salina, centrifugar durante 5 minutos, realizar 1 vez mas.

PREPARAR SUSPENSION DE ERITROCITOS AL 2 %.

Depositar una gota de suspension de eritrocitos en un tubo pequeño y añadir una gota de suero de Coombs.

Mezcalr y centrifugar a 1000 rpm durante 1 minuto. Remover suavemente los eritrocitos sedimentados y observar si existe aglutinacion macroscopica.

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PRUEBA DE COOMBS INDIRECTA FUNDAMENTO Se emplea la antiglobulina para detectar la presencia de anticuerpos incompletos antieritrocitarios no unidos in vivo a los eritrocitos. Para detectar ciertos grupos sanguíneos como el Duffy, kell y kidd. Se realiza en dos fases, en la primera se enfrentan los anticuerpos frente a hematíes de antigeinicidad conocida para provocar su unión y posteriormente se añade al antiglobulina hemaglutinante. METODO EN TUBO - Preparar una suspensión de eritrocitos al 5% - Depositar una gota de la suspensión de eritrocitos a cada tubo pequeño - Mezclar y centrifugar a 1000 rpm durante un min. - Remover suavemente los eritrocitos sedimentados - Lavar con solución isotónica 4 veces, centrifugando en cada ocasión y eliminar el sobrenadante salino dejando 1 o 2 gotas para resuspender. - Añadir una gota de suero de Coombs. Mezclar y centrifugar. - Remover suavemente los eritrocitos sedimentados y observar si existe aglutinación macroscópica. INTERPRETACIÓN Aglutinación: significa la presencia de anticuerpos incompletos. MÉTODO EN PLACA: - Preparar una suspensión de hematíes grupo sanguíneo “O” factor Rh positivo - Agregar dos gotas de suspensión de eritrocitos al 50%, en un tubo. - Agregar cinco gotas de suero problema. Mezclar e incubar a 37°C durante 60 min.



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- Lavar los eritrocitos en cuatro ocasiones con solución isotónica y resuspender hasta obtener una suspensión de aproximadamente el 50%. - Depositar una gota de la suspensión de eritrocitos lavados y sensibilizados en un portaobjetos. - Depositar separadamente una gota de suero de Coombs. - Mezclar con un aplicador de madera y rotar el portaobjetos. - Observar si hay aglutinación dentro de los dos min siguientes. - Agregar a un lado 1 gota de suero de Coombs. - Mezclar con un agitador. - Rotar el portaobjetos - Observar si hay aglutinación dentro de los siguientes dos min.

Solucion salina

Lavar con solucion salina 4 veces, centrifugar en cada ocasion y eliminar el sobrenadado. dejando 1 gota para resuspender.

Depositar una cantidad apropiada de sangre y solucion salina, centrifugar durannte 5 minutos.

Solucion salina

Decantar el sobrenadante e incorporar nuevamente solucion salina, centrifugar durante 5 minutos, realizar 1 vez mas.

PREPARAR SUSPENSION DE ERITROCITOS AL 5 %.

Depositar una gota de la suspension de eritrocitos a cada tubo pequeño. mezclar y centrifugar a 1000 rpm durante 1 minuto.

DIAGRAMA DE FLUJO



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PRACTICA No. 18

PODER BACTERICIDA DEL SUERO NORMAL El suero normal contiene una serie de sustancias, que son capaces de destruir a las bacterias. Estas sustancias están presentes en mayor o menor grado en todos los sueros, y por lo tanto no son el resultado de una inmunización previa. Por esta razón están clasificadas dentro de las defensas inespecíficas del organismo La cantidad de las diversas sustancias presentes en el suero varía de especie a especie, y entre individuos. Su eficacia depende también del agente infeccioso que se trate. Sustancia Acción Lisozima Destruye pared celular de Gram +

Fagocitina Actúa sobre Gram - y algunos Gram +

Lisina Actúa sobre Gram +

Complemento Tiene varias acciones.

Leuquina Presente en los leucocitos

Espermita Presentes en los espermatozoides

Hematina Presentes en glóbulos rojos, puede

Polipéptidos básicos actuar como sustancia nutritiva

de algunas bacterias

Mesohematina Función similar a la hematina

Plaquina Presente en las plaquetas

Factor de Tillet Inhibe a Streptococcus pyogenes.

Interferón Protege a las células contra la infección viral.

Mucoproteinas Inhibe las bacterias y virus en combinación con

iones Mg 2-4-

Properdina Inhibe la neuraminidasa producida por los virus.

Peroxidasa Destruye el peróxido de hidrógeno que es el

producto final de la respiración de algunas

bacterias.

Peróxido de Hidrógeno Mata a bacterias catalasa negativas.



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Entre las sustancias más importantes se encuentran: Lisozima. Esta es una poderosa sustancia bactericida que actúa destruyendo la pared celular de un gran número de bacterias, sobre todo las Gram (+), se encuentra presente en forma abundante en las lágrimas (formando el mecanismo más importante de defensa del ojo), y en el suero. Se encuentra también en saliva y secreciones mucosas, aunque en menor concentración. Interferón. Esta es una sustancia viricida de gran poder, que se forma dentro de las células después de que éstas han sido infectadas. Actúa inespecíficamente contra todos los virus, y se puede utilizar como protección pasiva en individuos de la misma especie. Su papel como posible agente inmunizante a nivel de población está bajo estudio. Fagocitina, Leuquina: Estas sustancias juegan un papel importante en la actividad bactericida de las células fagocitarias, aunque su mecanismo de acción no se conoce con exactitud. OBJETIVO Evaluar la sobrevivencia de una bacteria patógena en suero hiperinmune, suero normal y solución salina fisiológica. METODOLOGÍA 1) Coloca 0.25 ml de solución salina (SS) estéril en el tubo A 2) Coloca 0.25 ml de suero 1 en el tubo B 3) Coloca 0.25 ml de suero 2 en el tubo C 4) Coloca 0.25 ml (o una asada) de cultivo de Salmonella en todos los tubos. 5) Incuba los tres tubos a 37°C durante 30 min. 6) Diluye el contenido de los tubos 1:20 con SS 7) Inocula 0.1 m de esta dilución en una caja de agar nutritivo. 8) Incuba tus cajas a 37°C durante 24 h. 9) Lee tus resultados y compara con tus compañeros.



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Nota: El procedimiento debe realizarse usando técnica estéril. INVESTIGACIÓN PREVIA AL EXPERIMENTO 1) ¿Qué es un suero hipermmune? 2) ¿Qué es el complemento? 3) Investiga que es la catalasa y el peróxido de hidrógeno 4) ¿Qué es lisozima? 5) ¿Qué es Salmonella? CUESTIONARIO PARA ANEXAR AL REPORTE 1) ¿Cuántas colonias crecieron en cada caja? 2) ¿En base a esa información, cual suero era hiperinmune y cual el normal? 3) ¿Porque? 4) ¿Cuál es la acción del complemento en el suero normal y en el hipermmune? 5) ¿Cuál es la relación entre catalasa y peróxido de hidrógeno desde el punto de vista patógeno? 6) Realiza una lista de cinco bacterias en orden decreciente de su sensibilidad a la lisozima.



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Glosario de términos Es importante, que para la mejor comprensión y conocimiento de la cátedra de inmunología, conocer el significado de la terminología utilizada durante el estudio de la inmunología. Adyuvante Cualquier sustancia que intensifica de manera inespecífica la respuesta inmunitaria frente a un antígeno o aumenta los efectos farmacológicos de un medicamento. Anergia Tolerancia inmunológica específica potencialmente reversible en la cual el linfocito pierde la capacidad de respuesta funcional. Anticuerpo (Ab) Proteína que posee las propiedades moleculares de una inmunoglobulina, sintetizada principalmente por las células plasmáticas como resultado del estímulo de un antígeno (agente infeccioso o una sustancia extraña). Un anticuerpo es producido por células plasmáticas derivadas de linfocitos B. Esta proteína tiene afinidad específica para el antígeno que estimuló la formación fijándose a él por su fragmento Fab en forma no covalente. Todos los anticuerpos IgG, IgM, IgA secretoria, IgA sérica, IgE e IgD pertenecen a las inmunoglobulinas, sin embargo no todas las inmunoglobulinas funcionan como anticuerpos. Moléculas proteicas producidas por el organismo como respuesta a un estímulo por un inmunógeno. Ante los inmunógenos que los originan, los anticuerpos tienen la propiedad esencial de reaccionar específicamente. Anticuerpo fluorescente Un anticuerpo conjugado con un colorante fluorescente como el FITC. Anticuerpo monoclonal Anticuerpo homogéneo derivado de una única clona celular B. Todos estos anticuerpos tienen idénticos sitios de fijación antigénica e isotipo.



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Antígeno (Ag) Término que se acuñó en el s. XIX para designar cualquier sustancia que introducida en el organismo era capaz de inducir una respuesta inmunológica. 1) en la actualidad el término se utiliza más ampliamente para referirse a cualquier sustancia o célula (e.g. bacterias, virus, glóbulos rojos, células de trasplantes o algunos componentes de estos como: proteínas, lipopolisacáridos) que es reconocida como extraña por el sistema inmune. 2) también se utiliza para designar a uno de los reactivos de las pruebas serológicas, e.g. antígeno Rosa de Bengala, antígeno Tífico. Según la definición clásica, es una sustancia capaz de provocar en el organismo la formación de anticuerpos que puedan unirse específicamente con ella, o de células que tengan una afinidad específica ante ella. De hecho, esta definición corresponde más bien al término de inmunógeno. Antígeno CD - Conjunto de diferenciación celular Designación de la aglomeración de diferenciación para moléculas de la superficie celular leucocítica que son identificadas por un grupo dado de anticuerpos monoclonales. Los linfocitos T se localizan predominantemente en los folículos y entre ellos, en la paracorteza. La mayoría (70% aproximadamente) de estas células T son linfocitos T colaboradores CD4+, entremezclados con escasas células CD8+. Las células CD4+ y CD8+ son proteínas de superficie moléculas de adhesión; integrinas. CD44 Isoforma CD45 principal (solo en seres humanos). La Isoforma de la molécula CD45 es identificada por anticuerpos específicos del segmento codificado por el exón A, por lo que recibe el nombre de CD45RA (restringida por A). Antígeno de Histocompatibilidad. Isoantígenos codificados por los genes del sistema mayor de Histocompatibilidad (HLA y H-2) que se localizan en la membrana celular de la mayoría de las células nucleadas. Son las responsables de la interacción y cooperación celular (Ag de la clase II), así como del rechazo de injertos (Ag de la clase I). Apoptosis Muerte celular programada que se caracteriza por la digestión endonucleásica del ADN. Proceso de muerte celular caracterizado por la escisión del ADN, condensación y fragmentación del núcleo y la vesiculación de la membrana plasmática que provoca la fagocitosis de la célula sin inducir una respuesta inflamatoria. Este tipo de muerte celular es



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importante en el desarrollo de los linfocitos, en la regulación de las respuestas linfocíticas a los antígenos extraños y en el mantenimiento de la tolerancia a los autoantígenos. Bacilo Calmette-Guérin (BCG) Mycobacterium tuberculosis o bovis atenuado que se emplea como vacuna específica contra la TB y también como un adyuvante. CD 4+ Glucoproteína de la superficie celular, usualmente en las células T cooperadoras, que reconoce las moléculas de la clase II del MHC en las APC. CD 8+ Glucoproteína de la superficie celular, usualmente en las células T citotóxicas, que reconoce las moléculas de la clase I del MHC en las dianas celulares. Células citocidas naturales (NK) Subpoblación de linfocitos derivados de la médula ósea, diferentes de las células T o B, que actúan en las respuestas inmunitarias innatas para destruir a las células infectadas por microorganismos mediante mecanismos líticos directos y secretando IFN-γ. Las células NK no expresan receptores para el antígeno de distribución clonal como los receptores Ig o los TCR, y su activación esta regulada por una combinación de receptores estimuladores e inhibidores; estos últimos reconocen moléculas del MHC propio. Secretan citoquinas e IFN-γ Células Dendríticas Células accesorias inmunitarias derivadas de la médula ósea presentes en los tejidos epiteliales y linfoides que se caracterizan desde el punto de vista morfológico por delgadas proyecciones membranosas. Actúan como APC para los linfocitos T no estimulados, y son importantes para el inicio de las respuestas inmunitarias adaptativas a los antígenos proteicos.



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Célula Dendrítica Folicular Células dendríticas negativas para la clase II del MHC y positivas para receptores de Fc que poseen inmunocomplejos en su superficie y probablemente participen en la generación de células secretoras de anticuerpos y en el mantenimiento de la memoria celular B en los centros germinativos. Célula Dendrítica Interdigitante Células dendríticas APC positivas para la clase II del MHC y negativas para receptores de Fc que se encuentran en las áreas celulares T de los ganglios linfáticos y el bazo. Células de Langerhans Son de las principales poblaciones celulares presentes en la epidermis, éstas son las células dendríticas inmaduras. Su función principal es atrapar y transportar antígenos proteicos a los ganglios linfáticos de drenaje. Durante su migración a los ganglios linfáticos, las células de Langerhans maduran a células dendríticas a los ganglios linfáticos, capaces de presentar eficazmente los antígenos a las células no estimuladas (“vírgenes”), positivas para la clase II del MHC y para receptores de Fc que se encuentran en la piel. Células M Son células de membrana especializadas. Células epiteliales especializadas utilizadas sobre las placas de Peyer del intestino que desempeñan un papel en la llegada de los antígenos a las placas de Peyer. Célula NK (destructora o citocida natural) Linfocito granular grande que no reordena ni expresa genes de inmunoglobulinas ni de receptores celulares T pero que es capaz de reconocer o destruir ciertas células tumorales o infectadas por virus de una manera independiente de los anticuerpos y el MHC. Célula presentadora de antígenos (APC) Célula que expone en su superficie fragmentos peptídicos de antígenos proteicos, asociados a moléculas del MHC, y activa las células T específicas de los antígenos. Además de presentar complejos péptido-molécula del



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MHC, las APC también deben expresar moléculas coestimuladoras para activar óptimamente a los linfocitos T. Célula presentadora de antígeno profesional (APC profesional) APC para los linfocitos T colaboradores, como las células dendríticas, los fagotitos mononucleares y los linfocitos B, que es capaz de expresar moléculas de clase II del MHC y coestimuladores. Las APC profesionales más importantes para el inicio de las respuestas de células T primarias son las células dendríticas. Células plasmáticas Linfocitos B; células que sintetizan y secretan anticuerpos específicos de una especificidad e isotipo. Los anticuerpos son sintetizados y secretados por las células plasmáticas. Las células plasmáticas maduras son de corta vida y liberan muchos miles de anticuerpos idénticos por segundo. Cada anticuerpo es capaz de reaccionar específicamente con el antígeno que inició la respuesta inmune. El origen de los anticuerpos son las células plasmáticas diferenciadas. Estas células se encuentran más frecuentemente en la pulpa blanca del bazo, médula de ganglios periféricos y otros tejidos linfáticos secundarios. Las células plasmáticas están caracterizadas por su retículo endoplásmico rugoso iniciador de la síntesis proteica activa, su cromatina nuclear marginada y por la presencia de un citoplasma fuertemente basófilo. Los gránulos plasmáticos son ricos en anticuerpos proteicos. Durante el curso de la respuesta inmune, las células plasmáticas producen anticuerpos. Células presentadoras de antígenos (APC) Denominación habitual para células que presentan péptido antigénico procesado y molécula de la clase II del MHC al receptor T en los linfocitos T CD4+. Son ejemplos macrófagos, células dendríticas y células B. La mayor parte de los tipos celulares es capáz de presentar péptidos antigénicos con la clase I del MHC a las células T CD8+, como ocurre con las células infectadas por virus. Células presentadoras de antígenos profesionales (APC profesionales) Son APC profesionales los linfocitos T colaboradores, como las células dendríticas, los fagotitos mononucleares y los linfocitos B, que es capaz de expresar moléculas de clase II del MHC y coestimuladores. Las APC



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profesionales más importantes para el inicio de las respuestas de células T primarias son las células dendríticas. Células T colaboradoras Subpoblación funcional de los linfocitos T cuyas funciones efectoras principales consisten en activar a los macrófagos en las respuestas inmunitarias celulares y promover la producción de anticuerpos por las células B en las respuestas inmunitarias humorales. Estas funciones efectoras están mediadas por citoquinas secretadas y por la unión del ligando de CD40 expresado en las células T al CD40 de los macrófagos o las células B. La mayoría de las células T colaboradoras expresa CD4. Células Th1 (Células T colaboradoras) Subpoblación funcional de células T colaboradoras que secreta un conjunto específico de citoquinas, como IFN- γ, y cuya función principal consiste en estimular la defensa mediada por los fagotitos contra las infecciones, especialmente las debidas a los microorganismos intracelulares. Células Th2 (Células T colaboradoras) Subpoblación funcional de células T colaboradoras que secreta un conjunto específico de citoquinas, como IL-4 e IL-5, y cuyas funciones principales consisten en estimular las reacciones inmunitarias medidas por IgE y por eosinófilos/mastocitos y regular negativamente las respuestas de Th1. Cininas Una familia de polipéptidos liberados durante las respuestas inflamatorias y que aumentan la permeabilidad vascular y la contracción del músculo liso. Citometría de Flujo Método para el análisis del fenotipo de las poblaciones celulares que requiere un instrumento especializado (citómetro de flujo) que detecta la fluorescencia en células individuales en una suspensión y, por lo tanto, determina el número de células que expresan la molécula a la que se une la sonda fluorescente. Las suspensiones de células se incuban con anticuerpos marcados fluorescentemente o con otras sondas, y la cantidad de sonda unida por cada célula de la población se mide haciendo pasar las células a través de un fluorímetro con un haz incidente generado por láser.



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Citoquinas (citocinas) Proteínas de bajo peso molecular que estimulan o inhiben la diferenciación, proliferación o función de las células inmunitarias. Proteínas producidas por muchos tipos de células distintos que median las reacciones inflamatorias e inmunitarias. La citoquinas son uno de los principales mediadores de la comunicación entre las células del sistema inmunitario. Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos Proceso por el cual las células citocidas naturales (NK) son dirigidas a las células recubiertas de anticuerpos. En la membrana de las células NK se expresa un receptor específico de la región constante de las IgG, denominado FcγRIII (CD16), que media la unión a la Ig. Coestimulador Molécula de la superficie de una célula presentadora de antígenos (APC) o secretada por esta que proporciona un estímulo (una “segunda señal”) necesaria para la activación de las células T no estimuladas (“vírgenes”), además del antígeno. Los coestimuladores mejor definidos son las moléculas B7 presentes en las APC profesionales que se unen a la molécula CD28 presente en las células T. Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC) Es un locus genético de gran tamaño localizado en el cromosoma 6 del ser humano y en el 17 del ratón, consta de genes muy polimórficos que codifican las moléculas de unión al péptido que son reconocidas por los linfocitos T. El locus CMH también contiene genes que codifican citoquinas, moléculas que participan en el procesamiento antigénico y proteínas del complemento. Complemento (C) Complejo proteico, presente en todo suero normal. Es inespecífico, es decir, existe en ausencia de toda inmunización. Se fija a la mayoría de complejos antígeno-anticuerpo. Completa, en cierta manera, la acción de los anticuerpos y es necesario en la hemólisis inmunológica y en la bacteriólisis. C´ es una serie de proteínas plasmáticas que, al activarse, operan como una “cascada” para efectuar la lisis de membranas celulares; pueden activarse por reacción entre antígeno en una membrana celular



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(vía clásica) o por polisacáridos bacterianos, como endotoxinas (vía alternativa). Determinante antigénico Una aglomeración de epítopos. ELISA Análisis de inmunoabsorción ligado a enzimas Método para cuantificar un antígeno inmovilizado en una superficie sólida utilizando un anticuerpo específico con una enzima unida covalentemente. La cantidad de anticuerpo que se une al antígeno es proporcional a la cantidad de antígeno presente, y se establece mediante la determinación espectrofotométrica de la conversión de un sustrato transparente en un producto coloreado por la enzima unida. Epítopo La parte de un antígeno que es reconocida por un receptor antigénico (determinante antigénico) Factor de Necrosis Tumoral (TNF) Citocina producida fundamentalmente por fagotitos mononucleares activados que actúa estimulando el reclutamiento de los neutrófilos y los monocitos a los sitios de infección y activando estas células para erradicar a los microorganismos. El TNF estimula a las células del endotelio vascular para que expresen nuevas moléculas de adhesión, induce la secreción de quimioquinas por los macrófagos y las células endoteliales y promueve la apoptosis de las células Diana. Factor de Necrosis Tumoral-alfa y beta (TNF-α y TNF-β) Dos citocinas emparentadas que originalmente fueron designadas así por sus efectos citotóxicos sobre ciertas células tumorales pero que también poseen funciones inmunorreguladoras. Fagocitosis Fenómeno que consiste en el englobamiento y destrucción por los fagocitos de partículas sólidas organizadas o inertes. Proceso por el que ciertas células del sistema inmunitario, incluidos los macrófagos y los neutrófilos, engloban partículas de gran tamaño (> 0.5 µm de diámetro), como



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microorganismos intactos. La célula rodea la partícula con extensiones de una membrana plasmática mediante un proceso dependiente de energía y del citoesqueleto; este proceso tiene como resultado loa formación de una vesícula intracelular denominada fagosoma, que contiene la partícula ingerida. Fagocitosis inducida Fagocitosis auxiliada por la acción de las opsoninas del suero sanguíneo. Fitohemaglutinina (PHA) Lectina vegetal que actúa como mitógeno para las células T. Fragmento Fab Obtenido por acción de la papaína. Esta formado por las dos mitades C terminales de las dos cadenas ligeras. Fragmento Fc Fragmento, llamado cristalizable, de la molécula de Ig. Fragmento que no fija antígenos, obtenido de una molécula de Ig tras la digestión con papaína. Consiste en la fracción C-terminal de ambas cadenas pesadas que se une a los receptores de Fc y al C1q. Hipersensibilidad Respuesta inmunológica inadecuada o exagerada que causa daño en un individuo inmunizado. Hipersensibilidad inmediata Sensibilidad anormal a un antígeno que se traduce por una reacción patológica (liberación de aminas vasoactivas) en los minutos que siguen a la unión de este antígeno con el anticuerpo específico correspondiente. Hipersensibilidad retardada Reacción inmunitaria, mediante células nucleadas de un mismo individuo, responsables de la reacción inmunitaria de rechazo de injertos. Corresponden a una especificidad del individuo.



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IgG (immunoglobulin G) inmunoglobulina G (γ-gamma). PM de 150,000, 80% del total de inmunoglobulina en plasma; protege los líquidos corporales internos contra bacterias y sus toxinas; puede cruzar la placenta y conferir defensas en las primeras semanas de vida. Inflamación La respuesta de los tejidos ante los traumatismos que se caracteriza por un aumento del flujo sanguíneo y el influjo de leucocitos en el sitio afectado y cuyas consecuencias son la tumefacción (tumor), el enrojecimiento (rubor), el aumento de la temperatura (calor) y el dolor. Inmune Protegido natural o artificialmente contra una enfermedad determinada. Inmunidad Conjunto de manifestaciones que un organismo vivo es capaz de desarrollar en su esfuerzo para adquirir un estado refractario frente a las infecciones. Inmunidad Activa (Inmunidad Actual) La debida a una reacción del organismo contra el agente nocivo, después de curado de una enfermedad infecciosa o de inoculado con la bacteria causante o sus productos. Inmunidad Adquirida (Inmunidad Artificial) Inmunidad mediada por linfocitos y caracterizada por especificidad antigénica y memoria. Es la que se obtiene naturalmente después de una enfermedad infecciosa o artificialmente por inoculación o vacunación. Inmunidad Antibacteriana o antitóxica Inmunidad contra la acción de las bacterias o las toxinas respectivamente.



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Inmunidad Celular Es la inmunidad mediada por células, alude a las respuestas inmunitarias mediadas por células T. Inmunidad en la que los factores activos son las células fagocitarias. Inmunidad de Comunidad La que por medidas higiénicas u otras se confiere a un grupo de individuos contra una enfermedad a la que particularmente cada individuo sigue siendo susceptible. Inmunidad Congénita (Inmunidad Natural, inherente o innata) Inmunidad que poseen ciertos individuos o especies de animales contra una enfermedad determinada, como la que tienen muchas especies respecto a la sífilis. Inmunidad Específica Inmunidad contra una enfermedad o antígeno particular. Inmunidad Familiar Inmunidad que existe como característica de algunas familias. Inmunidad Humoral Aquella cuyos factores activos son los anticuerpos en los humores orgánicos. Derivada de linfocitos B y síntesis de anticuerpos específicos solubles por las células plasmáticas; esto estimula la fagocitosis de células extrañas o la combinación con moléculas extrañas y su precipitación. Inmunidad innata Inmunidad que no es intrínsecamente afectada por el contacto previo con el antígeno, o sea todos los aspectos de la inmunidad no mediada de manera directa por los linfocitos. Inmunidad Opsónica La debida a la presencia de opsoninas que estimulan la fagocitosis.



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Inmunización Protección contra una enfermedad por medio de una vacuna, generalmente con una forma débil del agente que causa la enfermedad. Inmunoglobulina (Ig) Fracción de las proteínas plasmáticas ligada a la función anticuerpo; sinónimo de globulinas γ. Son globulinas séricas con propiedades de anticuerpo. Sin embargo, no todas las moléculas de inmunoglobulinas tienen una actividad de anticuerpo. Actualmente se conocen cinco variedades denominadas IgG, IgA, IgM, IgD e IgE. Inmunomoduladores Medicamentos que se espera fortalezcan el sistema inmunológico y ayuden al cuerpo a combatir las infecciones oportunistas u otras enfermedades. No son necesariamente usados para estimular el sistema inmunológico ya que puede ser perjudicial. Incluyen dos sub-grupos: las citocinas y los inmunomoduladores de amplia actividad. Los inmunomoduladores de amplia actividad son hormonas mensajeras químicas del cuerpo que regulan el sistema inmunológico, como las endorfinas que controlan el calor. Interferones (IFN) El IFN-α deriva de diversos leucocitos, el IFN-β lo hace de fibroblastos y el IFN-γ proviene de los linfocitos T. Los tres tipos inducen un estado antivirósico en las células y el IFN-γ actúa como una citocina en la regulación de las respuestas inmunitarias. Interferón-gamma (IFN-γ) Citosina producida por los linfocitos T y las células citocidas naturales (NK) cuya principal función consiste en activar a los macrófagos en las respuestas inmunitarias, tanto innatas como adaptativas. El IFN-γ también se denomina interferón inmunitario o de tipo II. Interleucina (IL) Designación de algunas citocinas secretadas por los leucocitos.



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Interleucina 1 Linfocina secretada por los macrófagos o células accesorias que tiene como acción biológica el activar los linfocitos T y linfocitos B contra los antígenos. Interleucina 2 Linfocina sintetizada por los linfocitos T cooperadores activados cuya función es la de causar la proliferación y activación de otros linfocitos T en forma no específica. Este factor es esencial para mantener en cultivo por tiempo prolongado a los linfocitos T. ITAM (Motivos de activación de inmunorreceptores basados en tirosina) Son secuencias concenso para la familia src de las tirosina cinasas. Estos motivos se encuentran en los dominios citoplasmáticos de varias moléculas de señalización, incluidas las unidades de transducción de señales de los receptores antigénicos linfocíticos y de los receptores de Fc. Knockout El uso de recombinación genética homóloga en células precursoras embrionarias para reemplazar un gen funcional por una copia defectuosa de ese gen. Los animales generados mediante esta técnica pueden criarse hacia la homocigosis, lo que permite la aparición de un fenotipo nulo para ese producto génico. Lectina Una familia de proteínas, en su mayoría de origen vegetal, que se unen a los carbohidratos específicosen glucoproteínas y glucolípidos. Algunas lecitinas también son mitógenos (PHA, conA). Linfocitos B Linfocitos timoindependientes o burso -o bone marrow- dependientes, precursores de los plasmocitos que producen los anticuerpos. Linfocitos T Linfocitos timoderivados o timodependientes, implicados en las reacciones inmunitarias de tipo celular.



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Linfocito T citotóxico Células T (por lo general CD8+) que destruyen dianas celulares tras el reconocimiento de moléculas del MHC-péptidos extraños en la membrana celular de la diana. Linfocitos T cooperador (auxiliar) TH

Linfocitos T que colaboran en la síntesis de anticuerpos frente a antígenos timodependientes. Linfocitos T supresores Linfocitos T que ejercen una acción supresiva ante respuestas inmunitarias humorales. Linfokinas Mediadores solubles producidos tanto por linfocitos T sensibilizados a un antígeno, durante la reacción inmunitaria celular, como por los linfocitos T no sensibilizados, bajo influencia de mitógenos no específicos. Lipopolisacárido (LPS) Endotoxina derivada de las paredes celulares de las bacterias Gramnegativas que tienen acciones inflamatorias y mitógenas. Macrófago (Mφ) Célula fagocítica grande, derivada del monocito de la sangre, que también funciona como célula presentadora de antígenos y puede mediar la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). Mycobacterium Género de bacterias aerobias, muchas especies de las cuales pueden sobrevivir en el interior de los fagocitos y provocar enfermedad. La principal defensa del huésped frente a las micobacterias como Mycobacterium tuberculosis es la inmunidad celular. NADPH Forma reducida del fosfato de dinucleotido de nicotinamida adenina.



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Opsoninas Sustancia termolábil del suero sanguíneo normal, que hace a los microbios o células sanguíneas más aptos para ser fagocitados por los leucocitos. Sustancias capaces de aumentar la fagocitosis. Son básicamente anticuerpos y fracciones del complemento. Opsonina específica o inmune Opsonina que se desarrolla en el suero sanguíneo como resultado de una infección, activa únicamente contra el organismo infectante. Opsonización Proceso en que un antígeno se combina con el anticuerpo opsonina para hacerlo más susceptible a la acción de englobamiento de los fagocitos. Organo linfoide central Organo bajo cuya influencia las células se hacen inmunológicamente competentes, es decir, capaces de reaccionar con el antígeno. Lo son la médula ósea, el timo y la bolsa de Fabricio (está únicamente en las aves). Órgano linfoide periférico Órgano en el que se realiza el contacto entre el antígeno y las células inmunológicamente competentes. Comprende los ganglios linfáticos, el bazo y las formaciones linfoides de las mucosas digestivas y respiratorias. Oxido Nítrico (NO) Molécula efectora biológica con una amplia gama de actividades que en los macrófagos actúa como un potente agente microbicida para destruir a los microorganismos ingeridos. Proteína fijadora de manosa Un miembro de la familia de las colectinas (lectinas calciodependientes) que es una proteína de fase aguda. Funciona como un estimulante de la activación de la vía clásica del C’ y como una opsonina para la fagocitosis a través de su unión a la manosa, un residuo de carbohidrato que suele hallarse en una forma expuesta solo en la superficie de los microorganismos.



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Quimioquinas Una familia de citocinas de bajo peso molecular, relacionadas estructuralmente que inducen con selectividad quimiotaxis y activación de las células fagocíticas y linfocitos. También son capaces de desencadenar rápidamente la adhesión leucicítica mediada por integrinas. Reacción inmunitaria Reactividad nueva y específica del organismo adquirida como consecuencia de la introducción de un inmunógeno. Se distingue la reacción inmunitaria humoral caracterizada por la producción de anticuerpos y la reacción inmunitaria celular, con producción de células mononucleadas que reaccionan específicamente con el antígeno. Receptor de célula T (TCR) El receptor antigénico heterodimérico del linfocito T existe en dos formas alternativas consistentes en cadenas α y β y en cadenas γ y δ. El TCR αβ reconoce fragmentos peptídicos presentados por moléculas del MHC en la superficie de las células. La función de los TCR γδ no está tan bien definida pero se sabe que puede reconocer proteínas nativas en la superficie celular. Receptores de Fc (FcRs) Receptores de la superficie celular que fijan la porción Fc de clases particulares de Ig’s. Reclutamiento Movimiento regulado por los linfocitos. Respuesta inmune primaria Es la respuesta inmunitaria relativamente débil que se produce en el primer encuentro de los linfocitos vírgenes con un antígeno dado. Respuesta inmune secundaria Es la respuesta inmunitaria con mejoras cualitativas y cuantitativas que ocurre en el segundo encuentro de los linfocitos programados con un antígeno dado.



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Separador celular activado por fluorescencia (FACS) Adaptación del citómetro de flujo que se utiliza para purificar las células de una población mixta en función de que sonda y que cantidad de la misma se une a las células. Las células se tiñen con una sonda marcada fluorescentemente, como un anticuerpo específico del antígeno de superficie de una población celular. Las células se hacen pasar entonces de una en una a través de un fluorímetro con un haz incidente generado por láser y son deflectadas diferencialmente por campos electromagnéticos cuya potencia y dirección varían de acuerdo con la intensidad medida de la señal de fluorescencia. Sintetasa de óxido nítrico inducible (iNOS) Es una enzima citosólica que no existe en los macrófagos en reposo, pero puede inducirse en respuesta al LPS en combinación con IFN-γ. La iNOS cataliza la conversión de arginina en citrulina, y se libera óxido nítrico que se difunde libremente. Telerógeno Antígeno utilizado para inducir tolerancia, a menudo depende de las circunstancias de la administración que de cualquier propiedad inherente a la molécula. Timo Sitio de maduración de los linfocitos T. Órgano linfoide llamado central en el que tiene lugar la diferenciación en los linfocitos T, responsables de la respuesta inmunitaria de tipo celular. Es un órgano glandular endócrino transitorio, propio de la infancia, del que solo quedan vestigios adiposos a los 10 o 12 años de edad, situado en la parte inferior del cuello y superior del mediastino anterior, formado por dos lóbulos alargados, compuestos cada uno de ellos por una serie de lobulillos dispuestos alrededor de un eje o cordón central conjuntivo. Cada lobulillo se halla dividido por un tabique de tejido conjuntivo en folículos formados de una sustancia cortical y otra medular con linfocitos, leucocitos y corpúsculos de Hassall (cuerpos pequeños en el Timo, estriados concéntricamente; restos del tejido epitelial que se encuentran en los primeros períodos de desarrollo de la glándula). Timocito Célula T en desarrollo en el timo.



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Vacuna Preparación microbiana que, introducida en el organismo, provoca en éste la inmunización activa contra una enfermedad determinada. Provoca una reacción en el organismo y es principalmente preventiva. Vías de Activación del Complemento La activación de los factores proteicos del complemento se hace secuencialmente según dos vías: en la vía clásica, el activador está constituido por complejos antígeno-anticuerpo; en la vía alterna, los activadores corresponden a las endotoxinas bacterianas, el zymosan, el veneno de cobra y agregados de determinadas inmunoglobulinas (IgA, IgE).

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