LABORATORIO DE INMUNOLOGIA.

Francisco Xavier López LaraJosé Galaor Gutiérrez Durante

Uso de laboratorios*

Diagnóstico

Diagnóstico

diferencial

Evaluar extensión

de enfermeda

d

Pronóstico

Seguimiento

*Con orientación clara en diagnóstico por clínica

En el laboratorio de Inmunología existen diferentes técnicas que permiten entregar resultados de exámenes para apoyo al diagnóstico y tratamiento clínico de las diferentes enfermedades inmunológicas, reumatológicas y mesenquimopatías en general.

Exámenes Generales

◦Básicos Hemograma completo Examen parcial y citoquímico de

orina Otras pruebas generales

◦Reumatológicos

Hemograma completoResultado Diagnóstico

diferencial

Anemia

Macrocítica

Anemia hemolítica• LES• Sales de oro

Hipocrómica MicrocíticaDeficiencia Fe• HVD

Normocítica Normocrómica

Enfermedad de curso crónico

Hemograma completo

Resultado Diagnóstico diferencial

Leucocitosis

+ 18000/mm3

Vasculitis necrotizanteAR juvenilEnfermedad de Still adultoArtritis séptica

Hasta 12000/mm3

Moderada

Espondiloartropatías seronegativasARCorticoesteroides (Neutrofilia)

Leucopenia

- 5000/mm3

Poliartrosis inflamatorias• LES• Enfermedad Mixta del

Tejido Conectivo (EMTC)

• Síndrome de Sjögren (SS)

• Síndrome de Felty (complicación AR)

Hemograma completo

Resultado Diagnóstico diferencial

Trombocitosis AR

Trombocitopenia

Síndrome de Felty (complicación AR)

Reticulocitos Anemia hemolítica

Parcial y citoquímico de orina

•LES•Vasculi

tis•Medica

mento: Sales de oro ó D-penicilina

Leucocituria

Cilindruria Proteinuria

•Acidosis tubular en Síndrome de Sjögren

•AINES

Elevación pH

Parcial y citoquímico de orina

Investigar alteraciones con:◦Creatinina◦Depuración de creatinina◦Albúmina en orina 24h◦Estudios de imágenes◦Biopsia renal

Compromiso renal = Mal pronóstico

Función hepáticaDescartar compromiso hepático

◦VasculitisDiagnóstico diferencial

◦CáncerDescartar compromiso hepático

◦Previo medicamente. Ej. Metotrexate, AINES.

Sedimentación globular

(VSG)

Ácido Úrico

AstoProteína C

reactiva(PCR)

Exámenes generales reumatológicos

Velocidad de SedimentaciónVelocidad con que los eritrocitos se

precipitan en 1 hora en una muestra de sangre no coagulada.

Es una prueba inespecífica.Detecta procesos inflamatorios, infecciosos y

neoplásicos.No es una prueba diagnóstica definitiva.

Velocidad de SedimentaciónEs un indicador de la evolución

de la enfermedad.Aumenta cuando empeora la

enfermedad y viceversa.Refleja modificaciones que sufren

las proteínas del plasma.Se eleva 48 h. después de

iniciarse la inflamación y se normaliza 10 días después de haberse terminado.

Valores normales:◦Hombres: Hasta 15 mm/h.◦Mujeres: Hasta 20 mm/h.◦Niños: Hasta 10 mm/h.◦Recién nacidos: 0 – 2 mm/h.

Velocidad de Sedimentación

ElevadaEmbarazoAnemia Infecciones agudas o crónicasEnfermedades inflamatorias Infarto miocardioTumoresHiper e hipotiroidismoMedicamentos: anticonceptivos orales

RetrasadaPolicitemiasDescenso de proteínas en el plasma: enf.

renales y hepáticasDisminución del fibrinógenoMedicamentos: aspirina, corticoides, quinina

Velocidad de Sedimentación

Proteína hepático Elevación temprana en proc.

InflamatoriosCiertos medicamentos afectan su

producciónCuantificar siempreValores normales <1mg/dl.

PCRProteína C Reactiva

Elevada•Fiebre reumática•AR•Vasculitis•Espondiloartropatias

Disminuida

•LES•Dermatopolimiositis•Escleroderma•Enfermedad mixta del tejido conectivo

PCR

Indica que la fiebre es por infección y no por actividad del LES

Fiebre por actividad de la enfermedad

• Paciente con LES, febril pueden estar activos como infectados, de manera que la prueba pierde valor Dx.

PCR en fiebre

Pruebas antiguas para diagnóstico de enfermedades reumáticas

Primeras en relacionar etiología y fisiopatogenia de estas enfermedades

El uso indiscriminado e inclusión en memoria cultural causa muchos diagnósticos erróneos

Asto y Ácido úrico

Sugiere diagnostico de Fiebre Reumática

Criterios de Jones: poliartralgias migratorias, carditis, corea menor, eritema marginado y nódulos subcutáneos.

Criterios menores: ASTO, fiebre y PCR positiva, presente usualmente en pacientes < 20 años.

Asto

HIPERSENSIBILIDAD- Hipersensibilidad Tipo I: son reacciones enlas que los Ag se combinan con Inmunoglobulinas(Ig) E específicos que se hallanfijados por su extremo Fc (Fracción cristalizable)a receptores de la membrana demastocitos y basófilos de sangre periférica.

- Hipersensibilidad Tipo II: son reaccionesmediadas por la interacción de Ac Ig G eIg M preformados con Ag presentes en lasuperficie celular y otros componentes tisulares.

- Hipersensibilidad Tipo III: son reaccionesproducidas por la existencia de inmunocomplejos(IC) circulantes de Ag- Ac queal depositarse en los tejidos provocan activaciónde fagocitos y daño tisular.

- Hipersensibilidad Tipo IV: son reaccionesde hipersensibilidad celular o mediada porcélulas, causadas por linfocitos T sensibilizadosal entrar en contacto con el Ag específico,pudiendo producir una lesión inmunológicapor efecto tóxico directo o através de la liberación de sustancias solubles.

Hipersensibilidad tipo IRinitis alérgica- Conjuntivitis alérgica- Asma alérgico- Alteraciones cutáneas: Urticaria- Angioedema- Dermatitis atópica- Alergia física (frío, luz solar, calor, traumatismo leve)- Alergia a alimentos- Alergia a fármacos: la más común es la penicilina, también los AINES, aspirina, sulfas, y otros antibióticos beta lactámicos- Alergia a las picaduras de insectos- Alergia al látex: produce urticaria de contacto ya sea por contacto directo o por inhalación de partículas de látex. También puede manifestarse como alergia alimentaria por reacción cruzada con frutas- Anafilaxia.

Prueba del pinchazo: se deposita una gota de antígeno sobre la piel y luego se pincha a través de la gota con una aguja o lanceta en forma perpendicular a la piel (ángulo de 90º).Los resultados se obtienen a los 15 o 30 minutos y la respuesta se considera positiva cuando la pápula es mayor de 3 mm con halo de hiperemia. Siempre es necesario la utilización de dos controles intrínsecos a las pruebas

Prueba Prick modificado (Método de Pepys):se coloca una gota del extracto en la piel y luego con una aguja hipodérmica fina se atraviesa la gota insertándola en la epidermis en un ángulo de 45º con el bisel hacia arriba, luego se levanta suavemente la punta de la aguja para elevar una pequeña porción de la epidermis sin que ella sangre.

Prueba intradérmica: se inocula una dosis de una dilución de un extracto estéril suficiente para provocar la formación de una ampolla de 1 o 2 mm. Es más sensible que el prick o la puntura pero es más dolorosa, causa irritación y mayor riesgo da reacciones anafilácticas. También se han reportado falsos positivos

La prueba prick by prick es un método alternativo utilizado para el diagnóstico de alergia alimentaria, consiste en punzar un alimento con una lanceta y luego realizar un prick en la piel del paciente. Tiene alta sensibilidad, pero también efectos adversos graves y anafilaxia en pacientes hipersensibilizados

Prueba de radioalergenoabsorción (RAST):detecta la Ig E sérica Ag- específica. Se utiliza cuando no es posible efectuar las pruebas cutáneas.

Prueba de liberación de histamina por losleucocitos: se realiza in vitro, y detecta la Ig EAg- específica sobre basófilos sensibilizados midiendo la liberación de histamina inducida por el Ag.

Pruebas de provocación: Son consideradasel “Gold estándar” del diagnóstico en las reacciones alérgicas a alimentos y medicamentos, se realiza mediante la administración por vía oral del producto sospechoso a dosis crecientes y se observa si hay reacción alérgica. Se utiliza cuando la positividad de una prueba plantea dudas.

Hipersensibilidad tipo IIReacciones transfusionales- Enfermedad hemolítica del recién nacido- Anemias hemolíticas- Púrpura trombocitopénica inducida por Ac- Leucopenia- Pénfigo- Penfigoide- Anemia perniciosa- Trombocitopenia neonatal- Rechazo del injerto agudo temprano de un riñón transplantado.- Síndrome de Goodpasture- Hipersensibilidad a fármacos (penicilina)- Miastenia grave- Enfermedad de Graves- Enfermedad de Raynauld- Diabetes- Tombocitopenia inducida por medicamentos

Prueba de Coombs directa: detecta el Ac y el complemento sobre los hematíes. Para la prueba se utiliza antisuero de conejo, uno para la Ig y otro para el complemento, cuando estos reactivos se mezclan con hematíes revestidos con Ig o complemento se produce la aglutinación

- Prueba indirecta de la antiglobulina: detecta el Ac circulante contra los Ag de los hematíes. Se utiliza suero del paciente que se incuba con hematíes del mismo grupo sanguíneo y se realiza la prueba de antiglobulina sobre los hematíes. La aglutinación confirma la presencia de Ac.

- Microscopía fluorescente: para detectar lapresencia de Ig o de complemento en el tejido (prueba directa), o Ac circulante (prueba indirecta)

- Pruebas antirreceptor: para detectar Accontra receptores.

Hipersensibilidad tipo IIIEnfermedad del suero: debido a suero, puede ocurrir por la administración de fármacos- Vasculitis cutánea: en su fisiopatogenia están implicados los medicamentos.- Eritema nodoso: se hallan implicados los anticonceptivos orales, sulfonamidas y bromuros- Lupus eritematoso sistémico- Artritis reumatoidea- Poliarteritis- Crioglobulinemia- Neumonitis por hipersensibilidad- Aspergilosis broncopulmonar- Glomerulonefritis aguda- Glomerulonefritis membranoproliferativa crónica- Enfermedad renal asociada.

Las pruebas diagnósticas que actualmente se han desarrollado para detectar los IC depende de la capacidad de éstos para reaccionar con el complemento (Pruebe de unión al Ciq) o bien en la interacción de los IC que contienen componentes del complemento, con los receptores celulares (Prueba con células Raji).

Hipersensibilidad tipo IV

-Dermatitis por contacto: Se ha demostrado cerca de 3000 sustancias químicas que son alérgenos por contacto Neumonitis por hipersensibilidad- Rechazo de un aloinjerto- Granulomas por organismos intracelulares- Encefalomielitis post vacunación antirrábica- Algunas enfermedades autoinmunes (Tiroiditis, esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria intestinal)- Hipersensibilidad medicamentosa: Reacciones liquenoides, necrólisis epidérmica tóxica, Síndrome de Stevens Jonhsons, exantemas cutáneos, eritema polimorfo y erupciones fijas por drogas: sulfonamidas, betalactámicos, antiepilépticos.- Fotoalergias por medicamentos de aplicación tópica o sistémica provocada por el contacto de una sustancia fotosensibilizante y exposición a radiación lumínica Nefritis intersticial aguda

Métodos epicutáneos (test del parche). Se utilizan los supuestos alergenos responsables sobre la piel del paciente empleando apósitos y manteniendo el contacto durante 48 horas, luego se retiran los alergenos y se evalúa la respuesta entre media y una hora y se reevalúa a las 72- 96 horas. La respuesta es positiva si aparece una reacción eccematosa en el lugar de la prueba consistente en un eritema con cierta induración y en ocasiones formación de vesículas.Pruebas intracutáneas el prototipo es la reacción de tuberculina y el método utilizado es la reacción de Mantoux, consiste en la inyección intradérmica de 0,05 a 0,10 ml de solución antigénica utilizando aguja con el bisel hacia arriba en ángulo de 15º a 20º con respecto a la piel. La reacción comienza en horas y alcanza su máximo a las 48 hs, momento para realizar la medición teniendo en cuenta solamente la pápula y no el eritema.

ESTAS TECNICAS LAS PODEMOS DIVIDIR EN 4

GRANDES GRUPOS

Exámenes Específicos.

1- TECNICAS DE AUTOINMUNIDAD:• DETERMINACION DE ANTICUERPOS ANTINUCLEARES (ANA). • DETERMINACION DE ANTICUERPOS ANTI DNA(n) (DNA)• DETERMINACION DE ANTICUERPOS ANTIMITOCONDRIALES

(AMA)

2- TECNICAS NEFELOMETRICAS:• CUANTIFICACION DE INMUNOGLOBULINA G (IgG)• CUANTIFICACION DE INMUNOGLOBULINA A (IgA)

• CUANTIFICACION DE INMUNOGLOBULINA M (IgM)• COMPLEMENTO C3 (C3)• COMPLEMENTO C4 (C4)• FACTOR REUMATOIDEO (FR)• ANTIESTREPTOLISINA O (ASO)

3- TECNICAS ELECTROFORETICAS:• ELECTROFORESIS DE PROTEINAS SERICAS (EF)

4- TECNICAS DE ESTUDIO DEL LIQUIDO ARTICULAR:

• FISICO-QUIMICO (LA)• CITOLOGICO (LA)• ESTUDIO DE CRISTALES CON LUZ POLARIZADA

1- TECNICAS DE AUTOINMUNIDAD

TECNICA DE INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI)

La IFI permite la detección de auto anticuerpos circulantes contra antígenos tisulares como:• Anticuerpos antinucleares (ANA)• Anticuerpos anti DNA(n) (DNA) • Anticuerpos antimitocondriales (AMA)

INFORME DE RESULTADO DE EXAMENES

Negativo (-)Positivo (+)

ANTICUERPOS ANTINUCLEARES (ANA)

La determinación de anticuerpos antinucleares es esencial para el diagnóstico

de:• Lupus eritematoso sistémico (LES).• Enfermedad mixta del tejido conectivo.• Lupus eritematoso sistémico inducido por

drogas.• Hepatitis crónica activa autoinmune.• Esclerosis sistémica progresiva.• Síndrome de Crest.• Artritis reumatoide.• Dermatomiositis.

PATRONES DE FLUORESCENCIA

HOMOGENEO: Se observa en el 60 a 70 % de los lupus eritematoso sistémico. En el 100 % del lupus inducido por drogas.

PERIFERICO: Se observa en proporción variable en el lupus eritematoso sistémico

MOTEADO: Se observa en el 100% de la enfermedad mixta del tejido conectivo.

NUCLEOLAR: Se observa en el 90 a 100 % en la esclerosis sistémica progresiva.

ANTICENTROMERO: Se observa en el 90 a 100% en el síndrome de Crest.

ANTICUERPOS ANTI-DNA(n)

La determinación de anticuerpos anti-DNA(n) de doble hebra, se utiliza para la confirmación de LUPUS ERITEMATOSO SISTEMICO ACTIVO.

ANTICUERPOS ANTIMITOCONDRIALES (AMA)

La determinación de AMA es de utilidad en el diagnóstico de :

• Cirrosis biliar primaria (altos títulos)• Hepatitis crónica activa (bajos títulos)

2- TECNICAS NEFELOMETRICASLa nefelometría es una técnica automatizada que permite cuantificar proteínas del suero y otros líquidos biológicos.

Tiene una alta sensibilidad y precisión.

Miden los niveles de Inmunoglobulinas, el sistema de complemento, el factor reumatoide y la antiestreptolisina O.

CUANTIFICACION DE INMUNOGLOBULINAS

IgG, IgA, IgMNos orienta como está reaccionando el sistema de defensa específico humoral.

Los niveles de cada una de ellas pueden estar aumentados o disminuidos dependiendo del tipo de patologías en las cuales estén involucradas.

CUANTIFICACION DE INMUNOGLOBULINAS

IgG, IgA, IgM

Hipogammaglobulinemia: Trastornos donde se pierden inmunoglobulinas en forma excesiva: síndrome nefrótico, quemaduras.

Síntesis defectuosa de inmunoglobulinas: agammaglobulinemia y hipogammaglobulinemia congénita.

Enfermedades linfoproliferativas: leucemia linfoide crónica, enfermedades de cadenas pesadas y mieloma de Bence-Jones.

Hipergammaglobulinemia  Policlonal: hepatopatías crónicas, enfermedades

autoinmunes (lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, síndrome de Sjögren y esclerodermia); infecciones crónicas (tuberculosis, paludismo, actinomicosis y mononucleosis infecciosa), Neoplasias (enfermedad de Hodgkin y metástasis).

Monoclonal. Mieloma múltiple, Macroglobulinemia de Waldenström y gammapatías monoclonales de significado indeterminado

Es un conjunto de unas 30 proteínas del plasma y otros líquidos orgánicos que interaccionan entre sí y con otros componentes del sistema de inmunidad innata y adaptativa, éstas se encuentran en forma inactiva y se activan de forma secuencial para mediar una serie de reacciones inmunológicas.

SISTEMA DEL COMPLEMENTO

Este es un sistema de activación enzimático en cascada, el producto de una reacción es a su vez una enzima para la siguiente reacción, produciéndose una respuesta rápida y amplificada del estímulo inicial, con la finalidad de producir la lisis celular.

SISTEMA DEL COMPLEMENTO

• La vía clásica que corresponde al sistema de inmunidad adaptativa

• La vía alternativa que corresponde al sistema de inmunidad innata

• La vía de las lectinas que corresponde al sistema de inmunidad innata

EL COMPLEMENTO SE ACTIVA POR

TRES VIAS DIFERENTES

El complemento C3 y C4 se encuentra:

Disminuido• Lupus eritematoso sistémico• Glomerulonefritis

Aumentado • procesos inflamatorios (artritis reumatoide)

COMPLEMENTO C3 COMPLEMENTO C4

FACTOR REUMATOIDEO

El FR son autoanticuerpos dirigidos contra los determinantes antigénicos del fragmento Fc de la molécula Ig G.

El FR puede ser IgG, IgM, IgA. El mas frecuente es el IgM.

Es de utilidad en el diagnóstico de Artritis Reumatoide donde se encuentra aumentado.

ANTIESTREPTOLISINA O

El Streptococcus B-hemolítico del grupo A, produce un número de exotoxinas, que pueden actuar como antígenos una de estas es la estreptolisina O.En una infección estreptocócica reciente la antiestreptolisina O se halla elevada en el 80% de los casos.Su determinación es importante en pacientes con: • Fiebre reumática• Glomerulonefrítis

3- TECNICAS ELECTROFORETICAS

La electroforesis de proteínas plasmáticas es la migración y separación de estas por la acción de un campo eléctrico.Las proteínas migran del polo (-) cátodo al polo (+) ánodo

La EF es muy importante en el diagnostico de:-Mieloma Múltiple-Hipogamaglobulinemias-Síndrome Nefrótico

4- TECNICAS DE ESTUDIO DEL LÍQUIDO ARTICULAR

•FISICO-QUIMICO (LA)

•CITOLOGICO (LA)

•ESTUDIO DE CRISTALES CON LUZ POLARIZADA (LA)

EL ESTUDIO DEL LA ES IMPORTANTE PARA EL DIAGNOSTICO DE

-Artritis inflamatorias-Artritis séptica-Artritis por cristales:

• Cristales de urato monosódico. Diagnostico de Gota

• Cristales de Pirofosfato de Calcio. Diagnostico de Seudogota o Condrocalcinosis

OTRAS TÉCNICAS INMUNOLOGICAS

Medición de Antígeno-Anticuerpo:◦Reacciones de aglutinación

donde se junta el reactivo con el suero del paciente y se ve a simple vista. (prueba de Coombs) ej. Anemia hemolitica.

◦Reacciones de precipitación que también se ven a simple vista. Como la citometría de flujo, que se utiliza para ver las células alteradas, anemias, para medir la CD4.

TÉCNICA DE ELISA Consiste en una reaccion antigeno

anticuerpo.

Cambio de color positivo. Sin cambio es negativo.

BIBLIOGRAFIA Fundamentos de interpretación clínica de los exámenes

de laboratorio. Guillermo Ruiz Reyes / Alejandro Ruiz Argüelles. Edición: 2ª, Editorial Panamericana: 2010.

Roitt - Inmunología. Fundamentos 11ª edición Delves / Martin / Burton / Roitt, (aut.)Médica Panamericana11ª ed. (2008)

Inmunologia de Kuby. 6 edicion Thomas J. Kindt ,Mcgraw-Hill Interamericana