Manual de laboratorio de inmunologia ULA

Manual de prácticas de inmunología

MANUAL DE PRÁCTICAS

DE INMUNOLOGÍA

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOANÁLISIS ESCUELA DE BIOANÁLISIS CÁTEDRA DE INMUNOLOGÍA

PROF. BENIBELKS ALBARRAN

PROF. ZULAY LABRADOR

PROF. CESAR PEREZ MALDONADO

TECNICO: REINALDO LOPEZ

MÉRIDA, FEBRERO 2013


Índice pag Normas Internacionales de Bioseguridad

1

Normas de Bioseguridad en el laboratorio de Inmunodiagnóstico

2

Instrucciones para descartar material

3

Practica 1 órganos y células del sistema inmunológico

4

Práctica 2. Células que participan en el proceso inflamatorio

8

Práctica 3. Detección de inmunoglobulina G por inmunodifusión radial

11

Práctica 4. Inmunodiagnóstico de la infección por Treponema pallidum mendiante la prueba VDRL

16

Práctica 5. Detección del factor reumatoide por la prueba de látex

22

Práctica 6. Determinación del título de antiestreptolisina O (ASO) mediante la inhibición de la hemólisis

25

Práctica 7.- Determinación de anticuerpos anti- Toxoplasma gondii por inmunofluorescencia indirecta

29

PRÁCTICA 8. Determinación de anticuerpos anti- toxoplasma gondii por hemoaglutinación pasiva

33

PRÁCTICA 9. ELISA (enzyme linked inmuno sorbent assay) para la detección de IgE

39

NORMAS INTERNACIONALES DE BIOSEGURIDAD PARA LABORATORIOS

CLÍNICOS -Es obligatorio el uso de:

Bata manga larga Guantes Zapatos cerrados Cabellos recogidos Dispositivo para pipetear (Propipeteador) PROHIBIDO PIPETEAR CON LA BOCA

- No se permite el uso del teléfono celular en el

laboratorio. - Lavarse las manos al finalizar el trabajo de

laboratorio. - Acatar las instrucciones para el uso de cada

instrumento del laboratorio. - Descartar el material en el sitio adecuado, de

acuerdo con las instrucciones sugeridas. - Mantener ordenado el área de trabajo y una vez

finalizada la actividad, descontaminarla con una solución con cloro.

- En el área de trabajo está prohibido: Ingerir, preparar o almacenar alimentos. Fumar. El acceso y la permanencia de niños y otras

personas no adscritas al servicio. El acceso de personas con mascotas.

Nota: El uso de los guantes y de las batas, queda restringido solo para los ambientes dentro del laboratorio.

1


NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE INMUNODIAGNÓSTICO

- Cumplir con las normas internacionales de

Bioseguridad.

- Colocar los bolsos y otros útiles en el estante

indicado.

- Traer el manual de prácticas, propipeteador y

estuche con lápices, marcadores y bolígrafos de

uso exclusivo para el laboratorio.

- Al finalizar cada sesión de trabajo:

Descartar el material de acuerdo con las

instrucciones.

Colocar el resto de materiales y reactivos en el

sitio de trabajo.

Descontaminar el área de trabajo con solución

con cloro.

Quitarse la bata de laboratorio.

Lavarse las manos en el sitio indicado.

INSTRUCCIONES PARA DESCARTAR

MATERIAL EN EL LABORATORIO DE

INMUNODIAGNÓSTICO

- Descartar las muestras de suero provenientes de

tubos y pipetas, en el envase que contiene una solución de jabón y cloro.

- Descartar las pipetas de vidrio, puntas de las pipetas de precisión y los dispensadores de plástico en el envase de mayor tamaño que contiene una solución jabonosa.

- Descartar las soluciones de los tubos de vidrio en el envase que contiene jabón y cloro.

- Colocar los tubos en la bandeja que contiene una solución jabonosa.

- Lavar las láminas de vidrio con agua de chorro, seguido de una solución jabonosa.

- Enjuagar bien con agua de chorro y luego con agua destilada.

- Colocar las láminas en posición vertical sobre papel absorbente para su secado.

LOS TELÉFONOS CELULARES DEBEN SER APAGADOS EN:

Áreas de trabajo de los laboratorios. Salones de clase. Reuniones de trabajo.

1

2 3

4


PRÁCTICA 1. ÓRGANOS Y CÉLULAS DEL SISTEMA INMUNE

El Sistema inmune consta de una serie de órganos, tejidos y células ampliamente repartidos por todo el cuerpo. Funcionalmente,

los órganos se clasifican en primarios y secundarios.

I. Órganos linfoides primarios o centrales, que

A. proporcionan el entorno para la maduración de linfocitos

(linfopoyesis), de modo que los linfocitos adquieren su repertorio de

receptores específicos para cada tipo de antígeno;

B. los linfocitos se seleccionan de modo que poseen autotolerancia (evitación

de la autoinmunidad).

Los órganos linfoides primarios son:

el timo, donde maduran los linfocitos T la médula ósea en el adulto como órgano de maduración de los linfocitos B En el feto temprano esta función la toma el hígado, aunque paulatinamente se ve

sustituido por la medula. En las aves, el equivalente funcional de la

médula es la Bolsa de Fabricio.

II. Órganos linfoides secundarios o periféricos, que

A. proporcionan el entorno para que los linfocitos interaccionen entre sí, o

con las APC y otras células accesorias, y para que entren en

contacto con el antígeno; B. diseminan la respuesta inmune al

resto del cuerpo.

Los órganos linfoides secundarios

son:

los ganglios linfáticos, que recogen Ag de los tejidos

el bazo, que recoge Ag de la sangre tejidos linfoides asociados a mucosas

(MALT), que recogen Ag de las mucosas en la respuesta secundaria, la médula ósea

actúa igualmente como órgano secundario Por otra parte, se sabe que todas las células del sistema inmune se desarrollan a partir de las células pluripotenciales presentes en la médula ósea. La diferenciación de los glóbulos blancos se da a través de dos principales vías. La línea linfoide que genera a linfocitos T, B y células asesinas naturales (NK) y la línea mieloide que a su vez produce dos estirpes celulares, los granulocitos y los monocitos. Los primeros están representados por neutrófilos, eosinófilos y basófilos. La estirpe monocítica genera a su vez a los monocitos/macrófagos.

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Material y métodos Reactivos Materiales

Solución salina fisiológica (SSF)

Cajas de Petri

PBS

Bulbos de succión

Alcohol

Portaobjetos

Azul de Tripano

Cubreobjetos

Tubos de ensayo de 13 x 100 mm

Centrífuga

Microscopio Material proporcionado por el alumno

Ratones BALB/c

Estuche de disección

Navajas para rasurar

Gasas Dos jeringas de 5 mL

Procedimiento

1. Una vez sacrificado el ratón se procede a observar los órganos protegidos por la cavidad torácica, localizar el timo (se encuentra en el mediastino descansando sobre la parte apical del corazón, en la región anterior de los grandes vasos)

2. El bazo se localiza en la cavidad peritoneal. Se procederá a extirpar el órgano. Separar este

órgano del tejido conectivo que lo fija al estómago y al intestino delgado.

3. El bazo extirpado es depositado en una caja de Petri que contiene 4 mL de PBS o Solución Salina Fisiológica.

4. Posteriormente, se homogeniza el bazo con el apoyo de dos agujas dobladas en la punta y acompañadas de las jeringas.

5. Con la pipeta Pasteur se toma el material celular, se colocado en un tubo de ensayo de 13 x 100 mm (capacidad de 10 mL) y se centrifuga a 1500 rpm por 10 minutos a temperatura ambiente.

6. Se decanta el sobrenadante. Se extrae el paquete celular para ser observado en el microscopio. En un portaobjetos se agrega una gota de suspensión celular y una gota de Azul Tripano al 3 %, se coloca el cubreobjetos y se observa al microscopio. Las células que captan el Azul Tripano presentan muerte celular.

Cuestionario: 1. ¿Cuál es la función del sistema inmunológico? 2. Realice un esquema donde mencione cuáles son los órganos del sistema inmunológico? 3. Esquematice la ontogenia de las células del Sistema Inmunológico? 4. Resalte la importancia de esta práctica en su formación como futuro bioanalista.

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PRÁCTICA 2. CÉLULAS QUE PARTICIPAN EN EL PROCESO INFLAMATORIO

La inflamación es una de las primeras respuestas del sistema inmune que se da por la presencia de un agente externo, como bacterias, radiaciones, traumatismos, toxinas, alteraciones vasculares (isquemia) o alteraciones inmunitarias. Los síntomas clásicos de la inflamación son calor, dolor, rubor y tumor. El rubor y el calor se deben a un aumento del flujo sanguíneo en el área lesionada y a la constricción de las vénulas. Los cambios de la microcirculación son inducidos por mediadores químicos. Estos mediadores, además, aumentan la permeabilidad capilar con lo que los líquidos y las células sanguíneas pasan al espacio extravascular provocando tumefacción y un aumento de la presión local que es el que origina el dolor. Ante un proceso inflamatorio se lleva a cabo la migración o extravasación de leucocitos mediante un proceso preciso pero complejo, en el que participan en forma concertada y secuencial diversas moléculas tales como histaminas, 5-hidroxitriptamina, prostaglandinas (prostaflandina E2, PGE2), prostaciclinas, troboxanos (troboxano A2, TXA2), leucotrienos (B4, LTB4). Citoquinas (como TNFa, IL-1), Factores que quimiotacticos (como IL-8) y se induce la expresión de moléculas de adhesión, tales como las selectinas P y E, la molécula de adhesión intercelular-1 y el receptor de integrinas VCAM-1 que hacen posible el desarrollo de las siguientes fases:

Interacción y adhesión inicial de los leucocitos con el endotelio

Rodamiento de leucocitos sobre el endotelio Activación de los leucocitos Adhesión firme al endotelio y Extravasación y migración transendotelial a tejidos.

Los leucocitos (neutrófilos, monocitos o linfocitos) migran hacia otros tejidos y órganos abandonando el torrente sanguíneo y/o retornan a él desde la periferia. Las células que primero llegan al foco inflamatorio son los neutrófilos, después lo hacen los monocitos y los linfocitos.

Luego de la infiltración de las células sanguíneas, se produce el crecimiento del tejido fibroso en días o semanas que ayuda a la cicatrización y resolución de la inflamación PRINCIPIO BÁSICO DEL MÉTODO Una óptima respuesta inflamatoria generada por una molécula o patógeno extraño depende de los mecanismos efectores de los mediadores de la inflamación y de las células que participan en este proceso de tal forma que se resalta la importancia de conocer e identificar los principales componentes que participan en dicha respuesta. MATERIALES Y MÉTODO Material que proporcionará el laboratorio

Colorante Wrigth

Portaobjetos

Agua destilada

Caja de Petri

Cubreobjetos

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Alcohol Material que deberá traer el alumno

Un paquete de algodón

Cinta micropore PROCEDIMIENTO

1. Seleccionar a una persona por grupo. 2. Con un portaobjeto estéril se hará una lesión de

raspado en la piel del antebrazo previamente desinfectado con alcohol.

3. Colocar una lámina cubreobjeto sobre la lesión. Fijar con una cinta adhesiva micropore.

4. La lámina cubreobjeto se cambia a las 2, 6, 12, 24 y 48 horas, identificando cada una de ellas

5. Se procederá a realizar la tinción de Wrigth-Giemsa

Cuestionario: 1. Defina que es inflamación

2. Explique los tipos de inflamación

3. ¿Cuál es el fundamento de la tinción Wrigth?

4. Describa detalladamente las cuatro etapas de

extravasación de los leucocitos.

PRÁCTICA 3. DETECCIÓN DE

INMUNOGLOBULINAS POR INMUNODIFUSIÓN RADIAL

Las inmunoglobulinas (lgs) o anticuerpos constituyen el componente humoral de la respuesta inmune específica en todos los vertebrados. En el humano se reconocen cinco clases o isotipos de lgs denominados lgG, IgA, lgM, lgD e IgE, diferenciables gracias a las propiedades es tructurales y antigénicas particulares de sus cadenas pesadas. Debido a su gran heterogeneidad estructural y funcional (probablemente la más notable de todas las proteínas séricas) las Igs solamente pueden ser cuantificadas mediante técnicas inmunoquímicas entre las que se se destacan tres: la inmunodifusión radial, la inmunoelectroforesis en cohete o electroinmunoensayo, y la inmunonefelometría. Fundamento de la Inmunodifusión radial: La prueba de inmunodifusión radial para uso clínico fue introducida por Mancini en 1965. La técnica se basa en la difusión de la muestra conteniendo el antígeno a medir (inmunoglobulinas ó antígenos solubles) en una matriz semisólida de agar en la que se encuentra disuelto el anticuerpo específico. La muestra biológica se introduce en los orificios cilíndricos excavados en el agar y a medida que el antígeno difunde en forma radial, se alcanza la relación Ag-Ac que permite la formación de precipitados visibles. Una vez finalizada la difusión se mide el diámetro (D) de los precipitados que es proporcional a la concentración de antígeno (C). La concentración de proteína en la muestra biológica (Cx) se calcula realizando una curva de calibración

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utilizando muestras patrones de concentración conocida.

Aplicación Clínica La prueba de inmunodifusión radial se emplea para la cuantificación de inmunoglobulinas, componentes del complemento, diversas proteínas como fetoproteínas, lactoferrinas, proteínas de fase aguda que se encuentran presentes en plasma y otros fluidos biológicos (saliva, líquido cefalorraquídeo), donde la concentración de estas sustancias pueden sufrir alteraciones debido a diversas patologías, las cuales incluyen: enfermedades del colágeno vascular, inmunodeficiencias primarias y secundarias y procesos infecciosos de origen viral, bacteriano o parasitario. Principio del método para la detección Inmunoglobuilinas. la inmunodifusión radial se basa en la difusión libre de la muestra en un gel que contiene los anticuerpos contra la Ig que se desea cuantificar, lo que da lugar a la formación de un anillo o halo de precipitación alrededor del punto de aplicación, cuya área guarda

proporcionalidad con la concentración de antígeno en la muestra. La cuantificación de las lgs séricas tiene interés tanto desde el punto de vista clínico como de investigación. Sus principales indicaciones clínicas son: a) En el estudio por inmunodeficiencia, ya sea primaria o secundaria, sugerida por infecciones frecuentes y/o debidas a microorganismos de baja virulencia. b) En la vigilancia de pacientes que sufren formas graves de hipogammaglobulinemia y que reciben terapia de sustitución con preparaciones de lgs. c) Para distinguir las gammapatías monoclonales idiopáticas “benignas” de las paraproteinemias causadas por mielomas. d) Para ayudar al diagnóstico de infecciones congénitas, la determinación de IgM en sangre de cordón de recién nacidos. En otras condiciones patológicas esta determinación posee actualmente muy poco valor diagnóstico y su realización obedece más bien a fines de investigación. Material que deberá traer el alumno

Papel milimetrado

Materiales, equipos y reactivos:

Materiales Equipos Reactivos

Placas plásticas de fondo plano Micropipetas (5-200 µL) Moldes para la perforación de geles

Baño de María a 56 ºC Cámara húmeda

Base niveladora Visor graduado Lámpara con fondo oscuro

Antisuero C4 Buffer fosfato salino (PBS) pH 7.2

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Base niveladora Baño de María Método:

Preparar las placas plásticas de fondo plano, dividirlas en 4 cuadrantes, rotularlas y colocarlas sobre una superficie perfectamente nivelada.

Colocar 2 mL de agarosa (previamente preparada VER ANEXO 1).

Dejar solidificar a temperatura ambiente e incubarlas en cámara húmeda.

Perforar los pozos con una cánula de 12 G 5 mm de diámetro dejar una separación de unos 20 mm entre cada pozo (ver esquema)

Agregar 5 µL de las muestras y los controles en el pozo correspondiente, tapar bien la placa, dejarla en reposo a temperatura ambiente durante 15 minutos.

Incubar la placa en cámara húmeda a temperatura ambiente por 48 horas.

Placa y visor de precisión

La lectura se realiza con la ayuda del visor de precisión, el cual permite medir el diámetro de los halos de precipitación alrededor de cada pozo. Anotar la lectura y determinar la concentración de las muestras en la gráfica de referencia (VER ANEXO 2).

Cuestionario:

1. Mencione los factores que influyen el las pruebas de precipitación

2. Explique las diferentes pruebas de difusión pasiva 3. ¿Mencione cuales son los valores normales de IgM

y explique en que patologías puede aumentar o disminuir?

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PRÁCTICA 4. INMUNODIAGNÓSTICO DE LA

INFECCIÓN POR Treponema pallidum mendiante la prueba VDRL

La prueba de los Laboratorios de investigación de las enfermedades venéreas VDRL por sus siglas en ingles es de tipo tamizaje para sífilis y mide los anticuerpos reagínicos, los cuales son producidos en la sífilis como resultado de la interacción de la bacteria causante de dicha enfermedad (Treponema pallidum) y el propio cuerpo del paciente. Este examen es una herramienta de tamizaje útil para la sífilis, aunque su capacidad de detección depende de la etapa de la enfermedad. En la etapa más temprana (sífilis primaria), el examen es reactivo en aproximadamente el 60% de las ocasiones. Su utilidad aumenta en etapas posteriores como sífilis secundaria y sífilis latente donde puede ser positivo en el 70 a 90% de las ocasiones; en las etapas finales (sífilis terciaria) el examen es reactivo en sólo el 60%

de los casos. Actualmente existen diferentes técnicas para el diagnóstico serológico de sífilis: las pruebas no treponémicas (reagínicas) no determinan anticuerpos específicos frente a Treponema pallidum y se basan en antígenos compuestos de soluciones alcohólicas con cantidades determinadas de cardiolipina, colesterol y lecitina. Miden anticuerpos frente a estas sustancias que son producidas por los tejidos dañados por el T. pallidum. Estas pruebas son: VDRL (Venereal Research Disease Laboratory), RPR (Rapid Plasma Reagin), TRUST (Toluidine Red Unheated Serum Test), USR (Unheated Serum Reagin) y ELISA

(Enzimoinmunoensayo). Son de bajo costo, fáciles de efectuar, se utilizan como pruebas de inicio en la detección de sífilis y para evaluar la respuesta al tratamiento. La desventaja que presentan es que, debido a su inespecificidad, pueden arrojar falsos resultados positivos. Las pruebas treponémicas, en cambio, detectan específicamente los anticuerpos de Treponema pallidum y su utilidad en el laboratorio está orientada a confirmar los resultados arrojados por las pruebas no treponémicas. Las pruebas treponémicas más conocidas son: FTA-Abs (Inmunofluorescencia indirecta con absorción del suero), FTA-Abs 200DS (Inmunofluorescencia indirecta con absorción y doble tinción), TPHA (Microhemaglutinación), Captia syphilis M (ELISA de captura anti-cadena pesada), ELISA IgG, y WESTERN BLOT, las cuales tienen muy bajo índice de falsos resultados, tanto positivos como negativos. Deben realizarse con una absorción previa del suero para eliminar la reacción cruzada con otros treponemas. Sin embargo, carecen de utilidad para monitorear los tratamientos, ya que suelen permanecer positivas en el 85 a 90% de los pacientes tratados y curados En esta práctica el VDRL se realiza añadiendo el suero, generalmente sobre un portaobjeto con pozos de vidrio y se mezcla con una suspención acuosa de antígeno de cardiolipina y lecitina purificados. Tras una rotación de 4 min a temperatura ambiente, se lee la prueba al microscopio, y si existe aglutinación, nos indica que el suero es reactivo. (VER ANEXO 3, preparación de antígeno y calibración de agujas).

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Limitaciones del procedimiento La hemólisis o hiperlipidemia pueden ocasionar resultados erróneos. Resultados falsamente positivos pueden ser observados en individuos con cuadros patológicos diversos como hepatitis, influenza, brucelosis, lepra, malaria, asma, tuberculosis, cancer, diabetes y enfermedades autoinmunes.Estos casos generalmente presentan reacciones con títulos muy bajos y una historia clínica que no coincide con las características de sifilis. Materiales, equipos y reactivos:

Método: 1. Identificar una lámina para VDRL y agregar en cada

círculo 0.05 mL (50 µL) de los sueros controles (reactivo, débilmente reactivo, no reactivo) y del paciente (previamente inactivado a 56 ºC 30 minutos)

2. Añadir una gota de la emulsión de antígeno a cada suero con una aguja calibre 18.

3. Rotar las láminas durante 4 minutos a 180 r.p.m en el rotador de VDRL.

4. Observar cada suero en un microscopio, usando el objetivo de 10X.

5. Reportar los resultados usando la siguiente tabla para interpretar los mismos:

Reactivo No Reactivo Débil Reactivo


Pipetas de precisión para 50 µL. Pipetas de vidrio de 0.2, 0.5,1.0 mL. Propipeteadores. Láminas planas para VDRL. Aguja despuntadas calibre 18, 19 y 23. Frasco para preparar antígeno

Microscopio con objetvo de 10X Rotador mecánico con revoluciones de 180 rpm

Sueros controles: Reactivo, débil reactivo y no reactivo Antígeno de VDRL

Reacción Reporte

Ausencia de Flóculo o de grumos

No reactivo

Pequeños grumos

Débilmente reactivo (DR)

Grumos medianos y grandes

Reactivo (R)

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PRUEBA DE VDRL CUANTITATIVA EN MUESTRAS DE SUERO Todos los sueros que den resultado reactivo o débilmente reactivo al realizar la prueba cualitativa deber ser examinados de nuevo usando el método cuantitativo en lámina. Método: Se realiza según el siguiente esquema:

Nota: una gota equivale aproximadamente a 0,01 mL

Una vez que se agrega el antígeno, la lámina se lleva al rotador durante 4 minutos y se lee inmediatamente en el microscopio (10X). Si todas las diluciones arrojan resultados reactivos se realiza una dilución 1/8 y se repite el procedimiento indicado en el esquema obteniéndose diluciones 1/8, 1/16, 1/32. El reporte de los resultados se realiza según las normas de la OMS:

Cuestionario: 1. ¿Explique cual es la importancia de la prueba de

VDRL en embarazadas y recién nacidos? 2. Mencione cual es la importancia del VDRL y de

otras pruebas inespecíficas 3. ¿Qué se recomienda en los casos de VDRL con

resultados reactivos en personas que no presentan clínica ni antecedentes epidemiológicos de sífilis?

4. Mencione la importancia de las pruebas específicas

Círculo 1 Círculo 2 Círculo 3

Suero 0.04 mL 0.02 mL 0.01 mL

solución salina (aguja

21 ó 23)

-

2 gotas

3 gotas

Antígeno (aguja 19)

1 gota 1 gota 1 gota

Dilución Sin diluir ½ ¼

Prueba

cualitativa

Prueba cuantitativa Dilución del suero

Reporte

Sin diluir

½ ¼

Reactiva R R DR Reactivo 2 diluciones

Reactiva

R

R

R

No reportar, seguir diluyendo hasta conseguir el NR

Débil Reactivo DR NR NR Débil reactivo 0 dilución

Débil Reactivo DR DR NR Débil Reactivo 1 dilución

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PRÁCTICA 5. DETECCIÓN DE FACTOR REUMATOIDE POR LA PRUEBA DE LÁTEX

Los factores reumatoides son inmunoglobulinas que reaccionan con antígenos situados en la fracción constante (Fc) de la inmunoglobulina G, existen varios factores, que pertenecen a las cinco clases de inmunoglobulinas, siendo la de la clase IgM el que más se ha estudiado. Los métodos más utilizados para la determinación del factor reumatoide son los de aglutinación. Intervienen en estas reacciones tres elementos:

El factor aglutinante o factor reumatoide

Partículas inertes

Gammaglobulinas sensibilizantes de estas partículas

Estas reacciones se dividen en dos grupos según la procedencia de las gammaglobulinas sensibilizantes. En la prueba de Waaler-Rose se utilizan gammaglobulinas animales (conejos) y en la prueba del látex gammaglobulinas humanas. El principio de estas técnicas es descubrir la presencia de factor reumatoideo IgM con alto poder aglutinante según su capacidad de aglutinar partículas de látex o hematíes recubiertos de IgG. Prueba de látex: El método se basa en una reacción de aglutinación, entre los factores reumatoides y sus correspondientes anticuerpos (IgG humana) fijados en partículas de látex. Se utilizan sueros controles positivos y negativos. La reacción será negativa si la suspensión se mantiene homogénea y positiva si aparece aglutinación. Las

muestras positivas deben ser valoradas mediante una determinación cuantitativa. Otras técnicas: Los factores reumatoides también pueden ser determinados por técnicas cuantitativas de nefelometría y turbidimetría, las cuales tienen las ventajas de la automatización. Valores de referencia: En la prueba de látex, se considera un valor positivo cuando la dilución en la que se observa aglutinación es igual o superior a 1/64. Significado clínico: Puede aparecer positivo en las siguientes patologías: Artritis reumatoide Dermatomiositis Infección viral crónica Mononucleosis infecciosa Leucemia Lupus eritematoso sistémico Sífilis Escleroderma Materiales, equipos y reactivos:

Materiales Reactivos

Micropipetas (5-200 µL) Lámina porta-objeto

Reactivo de látex Tampón de glicina-solución salina concentrado (20X) Control positivo Control negativo

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Método: - Agregar 50 µL de la muestra, control positivo,

control negativo en cada uno de los círculos de la lámina.

- Mezcle bien el reactivo de látex y agregué 50 µL de este sobre cada uno de las muestras problemas.

- Mezcle bien las dos gotas que están sobre la lámina y extienda la mezcla sobre el área de prueba.

- Con un movimiento en forma de número 8, rote la lámina suavemente durante dos minutos.

- Observar si hay presencia (positivo) o no (negativo) de aglutinación. Paciente + Control - Control+

Cuestionario: 1.- Realice un cuadro donde mencione las enfermedades asociadas con FR positivo? 2.- ¿Explique la etiopatología de los factores reumatoides? 3.-¿Tipos de muestras que se utilizan para determinar Factor reumatoide? 4.- ¿Que aplicación clínica tiene esta metodología?

PRÁCTICA 6. Determinación del título de antiestreptolisina O (ASO) mediante la inhibición de la hemólisis

Fundamento del método: La estreptolisina O, producida por el estreptococo β-hemolítico de grupo A, tiene la propiedad de producir hemólisis cuando se pone en contacto con glóbulos rojos. Al colocar distintas diluciones de un suero que contenga antiestreptolisina O en presencia de dosis constantes de estreptolisina O, se produce una reacción antígeno anticuerpo que neutraliza la capacidad hemolítica de la misma. Este fenómeno se evidencia por una inhibición de la hemólisis al agregar suspensión de glóbulos rojos del 3 al 5%. El título de antiestreptolisina será la recíproca de la máxima dilución del suero del paciente capaz de neutralizar totalmente la estreptolisina. Valores de referencia Normalmente pueden existir en suero hasta 240 unidades de antiestreptolisina O ó unidades Todd. Títulos superiores son indicativos de un proceso infeccioso por Streptococcus β hemolítico del grupo A. Significado clínico Títulos elevados indican que las secuelas por infección estreptocóccica están presentes. Entre el 80 al 85% de pacientes con fiebre reumática y el 95% de pacientes con glomerulonefritis aguda, presentan títulos representativos. En endocarditis bacteriana y escarlatina los títulos se modifican.

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Valor alto no es específico para una determinada enfermedad. Sólo indica infección por este estreptococo. Los valores se modifican en la convalecencia, siendo inferiores cuando el tratamiento es acertado. Los niveles altos de betalipoproteínas dan falsos resultados elevados y los antibióticos y adrenocorticoides niveles bajos. En amigdalitis, sepsis puerperal y erisipela por estreptococos A, los valores están elevados. Materiales, equipos y reactivos:


Placa de micropozos con fondo en forma de U Micropropipetas (1-200 µL) Dispensadores de 25 µL

Estufa a 37ºC

Buffer fosfato salino (PBS) pH 7.2 Reactivo de estreptolisina Glóbulos rojos de carnero al 2.5%

Método 1. Por cada muestra realizar 3 diluciones en tubos de

12 x 75 mm:

1:10 (0.9 mL de buffer + 0.1 mL de suero)

1:60 (1.0 mL de buffer + 0.2 mL de la dilución 1:10)

1:85 (1.5 mLde buffer + 0.2 mL de la dilución 1:10)

2. Marcar en la placa de microtitulación 2 hileras por cada muestra (6 pozos por cada hilera) y 3 pozos para los controles: a) Control de suero b) Control de enzima c) Control de glóbulos rojos

3. Agregar 25 µL de buffer a los pozos del 2 al 6 de ambas hileras.

4. Añadir 25 µL de la dilución 1:60 a los pozos 1 y 2 de la hilera A.

5. Adicionar 25 µL de la dilución 1:85 a los pozos 1 y 2 de la hilera B.

6. Con una pipeta de precisión de 25 µL realizar las diluciones al doble a partir del pozo Nº 2 de cada hilera hasta el pozo 6.

7. Agregar 25 µL de estreptolisina O. 8. Mezclar, tapar la placa con plástico adherible o

tapas de plástico especiales para placas. Incubar en estufa a 37ºC durante 15 minutos.

9. Añadir 25 µL de glóbulos rojos humanos o de carnero previamente lavados y preparados al 2%.

10. Sellar nuevamente la placa y mezclar e incubar durante 45 minutos a 37ºC, agitando la placa cada 15 minutos.

11. Guardar las placas en refrigeración durante toda la noche o centrifugarlas durante 5 minutos a 2000 rpm.

12. Leer con ayuda del espejo visor para determinar la más alta dilución del suero que mostró inhibición total de hemólisis. Reportar el inverso de la dilución en unidades Todd.

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Esquema de trabajo:

Control de suero

Control de enzima

Control de GR

Buffer 25 µL 50 µL 75 µL

Suero diluido 50 µL - -

Estreptolisina - 25 µL -

G. R al 2 % 25 µL 25 µL 25 µL

Lectura No hemólisis Hemólisis No hemólisis

Esquema de la lectura

Cuestionario: 1. ¿Cuales son los valores de referencia de esta prueba segun la edad? 2. ¿Cuáles son los controles utilizados en esta prueba, y cual es su utilidad? 3. Defina que es estreptolisina y antiestreptolisina O 4.- ¿Cuales son los factores que influyen en esta prueba?

PRÁCTICA 7.- DETERMINACIÓN DE ANTICUERPOS ANTI- Toxoplasma gondii POR INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA

Fundamento de la Inmunofluorescencia: La Inmunofluorescencia se basa en una reacción antígeno-anticuerpo, la cual se hace visible por la incorporación de un marcador fluorescente (fluorocromo) que no modifica la especificidad del anticuerpo. Esta técnica fue introducida por Coons y colaboradores en 1941 y desde entonces se ha utilizado tanto en el diagnóstico como en la investigación. Puede ser aplicada a técnicas histoquímicas para la detección y localización de antígenos en células o tejidos. Los marcadores fluorescentes mediante combinaciones químicas pueden marcar proteínas, incluyendo anticuerpos, sin producir efectos en las propiedades biológicas o inmunológicas de las proteínas; pudiendo ser observadas en preparaciones microscópicas mediante el uso de microscopios de fluorescencia. Aplicación Clínica En el diagnóstico de laboratorio la Inmunofluorescencia desempeña un rol importante en las pruebas de rutina como por ejemplo, el test de anticuerpos fluorescentes anti-treponema, para confirmar el diagnóstico serológico de sífilis, o pruebas de anticuerpos en enfermedades autoinmunes, reconocimiento de depósitos de inmunoglobulinas en biopsias renales, demostrar microorganismos o células relacionados antigénicamente o específicos, además permite detectar y cuantificar drogas, hormonas, proteínas, péptidos en fluidos biológicos; menos común es el uso

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de la fluorescencia donde proteínas coloreadas con fluorocromos son inyectadas dentro de animales, determinando su distribución en el cuerpo mediante secciones subsecuentemente observadas al microscopio. Fundamento para anticuerpos anti-Toxoplasma gondii: Es una prueba que se usa para determinar anticuerpos específicos de la clase IgG o IgM. Los anticuerpos anti-Toxoplasma gondii presentes en el suero de los pacientes reaccionarán contra los antígenos del parásito fijado sobre una lámina portaobjeto. La reacción antígeno-anticuerpo se pondrá de manifiesto mediante la adición de un suero de conejo o cabra que contiene anti-inmunoglobulina humana anti IgG o anti IgM conjugada con Isotiocianato de Fluoresceína. Al observar en el microscopio de fluorescencia, en las muestras positivas, los parásitos emitirán fluorescencia de color verde manzana; en las muestras negativas, se observarán de color rojo. Significado Clínico: Anticuepos IgM Clásicamente, su detección es marcador de la fase aguda de la enfermedad. El principal valor de las IgM radica en que su ausencia prácticamente descarta la infección reciente. La presencia de IgM, por el contrario, implica la necesidad de proseguir el estudio de un paciente determinado. Anticuerpos IgG La presencia de anticuerpos IgG implica que ha habido contacto entre el paciente y el parásito en algún momento de la vida. Si existe la evidencia de una

seroconversión o de un aumento significativo del título de IgG entre dos muestras separadas 3-4 semanas, es diagnóstico de infección reciente. En las embarazadas y en los pacientes con inmunodeficiencia grave, el principal valor de las IgG consiste en la discriminación de individuos seronegativos. Materiales, equipos y reactivos:


Láminas portaobjeto fijadas con la suspensión de Toxoplasma gondii. Micropipetas (1-200 µL)

Estufa a 37 ºC Microscopio de fluorescencia Cámara húmeda

Anti-inmunoglobulina humana IgG o IgM obtenida en cabra y conjugada con isotiocianato de fluoresceína Buffer fosfato salino (PBS) pH 7.2 Sueros controles positivos y negativos Azul de Evans diluido Líquido de montaje

Método: 1. Identificar una hilera de 8 pozos de la microplaca

para cada paciente. 2. Realizar diluciones seriadas al doble a partir de 1/2

con un volumen final de 25 µL en cada pozo (desde el pozo 1 al pozo 8)

3. Agregar 10 µL de las diluciones 1/64 (pozo 6) y 1/256 (pozo 8) de cada paciente al círculo

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previamente identificado en la lámina que contiene Toxoplasma gondii.

4. Incubar en cámara húmeda, durante 30 minutos a 37ºC

5. Introducir las láminas en un envase con PBS 7.2 durante 10 minutos. Repetir el procedimiento una vez más.

6. Preparar la dilución óptima del conjugado fluorescente anti-IgG o anti-IgM. Una vez preparada la dilución, colocar 10 µL de azul de Evans y agregarlo a cada círculo de la lámina.

7. Repetir los pasos 4 y 5 8. Secar la lámina, aplicar una gota del fluido de

montaje, colocar el cubreobjeto y observar al microscopio de fluorescencia a 40X.

9. Reportar los resultados. Muestra positiva Muestra Negativa

Cuestionario: 1. Esquematice la tinción de inmunofluorescencia

indirecta 2. ¿Mencione cual es el antígeno que se utiliza en la

prueba de inmunofluorescencia? 3. Cual es la importancia de detectar anticuerpos de

tipo IgM e IgG en mujeres embarazadas? 4. Cuál es la utilidad del azul de Evans

PRÁCTICA 8. DETERMINACIÓN DE ANTICUERPOS ANTI- Toxoplasma gondii POR HEMOAGLUTINACIÓN PASIVA

Fundamento de la aglutinación: Se denomina aglutinación a la interacción secundaria in vitro de un antígeno particulado (por lo general células) con su anticuerpo específico. Cuando la molécula antigénica con la que interacciona el anticuerpo específico no forma parte de la estructura nativa de la partícula, sino que se incluye artificialmente en su superficie, la aglutinación que tiene lugar se denomina genéricamente aglutinación pasiva o indirecta. Los soportes utilizados pueden ser inertes como partículas de látex o glóbulos rojos, en cuyo caso el método recibe el nombre de hemoaglutinación pasiva o indirecta. Estas metodologías son ampliamente utilizadas en el laboratorio clínico para la detección serológica de anticuerpos en diferentes patologías infecciosas Fundamento del método: Se basa en la propiedad que tienen los anticuerpos anti-T gondii de producir aglutinación en presencia de glóbulos rojos sensibilizados con antígenos citoplasmáticos y de membrana del parasito. El empleo de ambos tipos de antígenos incrementa la sensibilidad del método permitiendo la detección precoz de la infección. Tanto la presencia de anticuerpos heterófilos como la aparición de IgM, características del período agudo de la parasitosis, se investigan empleando tratamiento con 2 mercaptoetanol (2 ME) y eritrocitos no sensibilizados para control y absorción de

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heterofilia. Los anticuerpos heterófilos se absorben con eritrocitos no sensibilizados. En los sueros de pacientes con infección aguda se observa una caída del título en por lo menos 2 diluciones comparado con los mismos sueros sin tratar con 2 ME. Las muestras de suero que contienen anticuerpos específicos anti-toxoplasma gondii reaccionan con hematíes sensibilizados con antígenos solubles del parásito, provocando su aglutinación (formación de una malla).

Significado Clínico:

Una muestra considerada como positiva, indica que el paciente está o estuvo en contacto con el parásito

Una muestra negativa o ausencia de aglutinación demuestra que el paciente no está o estuvo en contacto con el parásito

Materiales y reactivos:

Materiales Reactivos

Placa de micropozos Micropipetas (1-200 µL)

Buffer fosfato salino (PBS) pH 7.2 Células sensiblizadas Células No sensibilizadas Suero control positivo Suero control negativo

Método:

1. Identificar una hilera de la placa de micropozos para cada paciente y para los respectivos controles

2. Preparar las diluciones seriadas desde 1:2 hasta 1:64 de la siguiente manera: agregar 25 µL de solución buffer desde el pozo 1 al 6, en el pozo 1 agregar 25 µL del suero, transferir 25 µL desde el pozo 1 al 2, mezclar y repetir el procedimiento hasta el pozo 6, en este pozo descartar 25 µL.

3. Adicionar 25 µL de las células no sensibilizadas (previamente resuspendidas con movimientos de frotación) a los pozos 1 y 2.

4. Agregar 25 µL de las células sensibilizadas (previamente resuspendidas con movimientos de frotación) al resto de los pozos .

5. Mezclar, colocando la placa sobre un rotador o apoyándola sobre el mesón para darle ligeros golpes con el dedo.

6. Tapar la microplaca e incubarla a temperatura ambiente entre 1-2 horas.

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7. Observar la reacción de los sueros problema y compararlo con los sueros controles. Las muestras que en la dilución 1:16 presenten sedimentación de los glóbulos rojos formando un botón en el fondo del micropozo, se consideran negativas y se reportan. Las muestras que presenten aglutinación en las células sensibilizadas y botón en las no sensibilizadas, se procesan de nuevo, aumentando las diluciones hasta obtener la mayor dilución del suero que muestre aglutinación. Las muestras que presentan aglutinación en la dilución 1:16 para las células sensibilizadas y para las no sensibilizadas, deben ser sometidas al proceso de absorción para eliminar los anticuerpos heterófilos.

Absorción de los anticuerpos heterófilos:

1. Mezclar con suavidad el frasco identificado como absorbente (es una suspensión al 10% de glóbulos rojos no sensibilizados) o el de células no sensibilizadas.

2. En un tubo de 12 x 75 mm, mezclar volúmenes iguales del suero y de las células absorbentes

3. Tapar el tubo, mezclar bien y dejar en reposo a temperatura ambiente entre 2-24 horas.

4. Centrifugar durante 5 minutos. 5. En un vial, separar el sobrenadante y procesar

de nuevo siguiendo el protocolo de la prueba de descarte.

6. Los sueros deben presentar un botón en el pozo de las células no sensibilizadas como indicativo

de absorción efectiva. La reacción en las células sensibilizadas, dependerá de la presencia o ausencia de anticuerpos específicos para los antígenos de Toxoplasma gondii.

Cuestionario:

1. Defina: Células sensibilizadas Células no sensibilizadas Anticuerpos heterófilos Absorbente Suero control Positivo Suero control negativo

2. ¿Qué importancia tiene detectar anticuerpos contra toxoplasma gondii de tipo IgG en pacientes con VIH?

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PRÁCTICA 9. ELISA (enzyme linked inmuno sorbent assay) para la detección de IgE

La técnica de ELISA (enzyme linked inmuno sorbent assay) es un procedimiento de ensayo inmunoenzimatico, concebida independientemente en 1971 por Engvall y Perlmann, en Suecia y por Van Weemen y Schuurs, en Holanda, siendo aplicada posteriormente a la revelación y a la cuantificación de diversos tipos de sustancias presentes en líquidos orgánicos. Se fundamenta en la reacción antígeno-anticuerpo, en donde el anticuerpo (o el antígeno) se fijan a una superficie, ya sea un contenedor de una placa de microtitulación o una partícula de plástico. El especimen a prueba se aplica y el material adherido se detecta y caracteriza través de un anticuerpo secundario marcado enzimáticamente. Las reacciones alérgicas, por ejemplo el asma, la dermatitis y alergia al polen son usualmente diagnosticada en base a la historia medica y a los síntomas clínicos. La medición de la Inmunoglobulina E (IgE) es muy importante para comprobar las suposiciones clínicas. Altas concentraciones de IgE pueden ocasionar hipersensibilidad contra si misma, lo que puede ser causa de diferentes reacciones alérgicas. Además algunas infecciones parasitarias también pueden incrementar los niveles de IgE Aplicación Clínica del ELISA: Sus aplicaciones se han expandido en forma sostenida, siendo utilizadas actualmente en endocrinología para la cuantificación de hormonas, en

inmunología para la medición de inmunoglobulinas, C1q e inmunocomplejos y en microbiología para la identificación y cuantificación de antígenos o anticuerpos en infecciones bacterianas, micóticas, parasitarias o virales. Materiales, equipos y reactivos:

Método:

1. Dispensar 20 µL de calibradores, controles y

muestras en el pozo correspondiente. 2. Dispensar 100 µL del buffer Zero en cada uno de

los pozos. 3. Mezclar por 30 seg. 4. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente

(TA). 5. Descartar el contenido de los micropozos y lavar 5

veces con 300 µL de agua destilada. 6. Agregar 150 µL del conjugado enzimático en cada

pozo, mezclar por 10 seg. 7. Incubar durante 30 min a TA. 8. Descartar el contenido de los micropozos y lavar 5

veces con 300 µL de agua destilada. 9. Agregar 100 µL de sustrato por pozo


Placas plásticas de fondo plano Micropipetas (5-200 µL) Pipetas graduadas

Lector de ELISA

Buffer fosfato salino (PBS) pH 7.2

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10. Incubar durante 20 min a TA. 11. Detener la reacción agregando 100 µL de solución

stop por pozo. 12. Leer a 450 nm Cuestionario:

1. Mencione los métodos para determinar anticuerpos por ELISA

2. Defina: Conjugados Sustratos 3. ¿Que muestras se pueden usar para la prueba? 4. ¿Como se determinan los valores positivos y

negativos de las Muestras?

ANEXOS

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ANEXO 1. PREPARACIÓN DE LA AGAROSA Materiales para preparar 100 mL de agarosa:

85 mL de Buffer fosfato salino (pH 7.0; 0,1 M)

1.4 g de Agarosa (Sigma Chemical reactive)

g de Dextrán (Sigma Chemical reactive)

10 mL de EDTA Na2 (pH 7.7; 0,1 M)

5 mL de Azida de sodio (0.65%)

0.5 mL de Antisuero anti-PCR Procedimiento: Disolver la agarosa en el buffer fosfato salino sobre una plancha magnética con calor, con agitación constante, agregar el dextrán; una vez disueltos, agregar el EDTA y la azida de sodio (para evitar la evaporación colocar sobre el elenmeyer un embudo con una perla de cristal) Una vez preparada la agarosa colocar en baño de maría a 56 ºC, al estabilizar la temperatura, agregar el antisuero anti-PCR en volúmenes proporcionales para obtener una concentración al 0.5%

ANEXO 2.- DETERMINACIÓN DE LA CURVA PATRÓN DE CONCENTRACIÓN DE PCR

Para cada lote de placas se debe realizar una curva patrón de concentración de Proteina C Reactiva, donde se podrá determinar la concentración de PCR en las muestras que presenten halos de precipitación. Se usa un suero de referencia de concentración conocida (120 µg/mL) al cual se le realizan diluciones seriadas al doble es decir 1:2, 1:4, 1:8, 1:16; 1:24 obteniéndose concentraciones de 60, 30, 15, 7.5 y 5 mg/mL respectivamente. Tomar una placa del lote recien preparado y comprobar que no este deshidratada, ni contaminada y perforar los pozos con una cánula de 12 G, 5 mm de diámetro, dejar una separación de unos 20 mm entre cada pozo. Agregar 5 µL de cada dilución en cada pozo, tapar bien la placa, dejar reposar 15 minutos. Incubar la placa en cámara húmeda a temperatura ambiente por 48 horas. Realizar la lectura con la ayuda del visor de precisión y anotar los resultados. Graficar en papel milimetrado colocando en el eje de las ordenadas el diámetro al cuadrado y en el eje de las abscisas la concentración de los controles. Unir los puntos y escoger la línea que abarque el mayor rango de valores. Ejemplo:

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Diluciones del suero de

referencia

Concentración g/mL

Diámetro mm

Diámetro2

1:2 60 7.0 49

1:4 30 5.0 30.25

1:8 15 3.9 15.21

1:16 7.5 3.0 9.0

1:24 5.0 2.0 4.0

ANEXO 3.- PREPARACIÓN DE LA EMULSIÓN DE ANTÍGENO:

1. Agregar 0.4 mL de solución salina en el fondo de un

frasco de tapa de rosca de 30 ml de capacidad. 2. Añadir 0.5 mL del antígeno directamente sobre la

solución salina, mientras se agita la botella con movimientos rotatorios suaves sobre una superficie plana. El antígeno se debe añadir gota a gota pero rápidamente.

3. Rotar el frasco rápidamente durante 30 seg 4. Añadir 4.1 mL de la solución salina 5. Tapar el frasco y agitar la solucion unas 30 veces

CALIBRACIÓN DE LAS AGUJAS: Es importante que se use una cantidad apropiada de la emulsión del antígeno, por esto que la aguja que se usa para agregarla, debe chequearse periodicamente, para obtener gotas de tamaño constante.

1. En la prueba cualitativa, la emulsión de antigeno se agrega con una aguja de calibre 18 sin punta, la cual descarga 60 gotas por mL de la emulsión de antígeno, cuando la jeringa este colocada en posición vertical.

2. En la prueba cualitativa, la emulsión del antígeno debe ser repartida con una aguja de calibre 19 sin punta, la cual descargará 75 gotas por mL de la emulsión de antígeno, cuando la jeringa este colocada en posicion vertical.

3. La solución salina usada para la prueba cuantitativa debe ser repartida con una aguja de calibre 21 o 23, esta descargará 100 gotas por ml de solución salina cuando la jeringa este colocada en posición vertical.

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Manual de laboratorio de inmunologia ULA

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