Manual Cultivo Celular

Manual de Prácticas de Cultivo de Células Animales. Prof. Leticia Bucio Ortiz.

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MANUAL DE PRÁCTICAS

CULTIVO DE CÉLULAS ANIMALES

Leticia Bucio Ortiz, Verónica Souza Arroyo, Luis E. Gómez Quiroz, Ma. de los Angeles Aguilar Santamaría y Ma. Concepción Gutiérrez Ruiz.

2013


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ÍNDICE. Nombre de la Práctica Pág.

1. Material de Laboratorio de Cultivo y Prueba de Esterilidad.

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2. Descongelación y Cultivo de Células Celulares.

5

3. Resiembra, Conteo de Células Cultivadas y Viabilidad Celular

con un Colorante de Exclusión. 9

4. Prueba de Citotoxicidad del MTT, en Cultivo Celular In Vitro.

14

5. Prueba de Citotoxicidad del Rojo Neutro, en Cultivo Celular In

Vitro.

19

6. Determinación de Proteína (Método BCA).

23

7. Cultivo de Linfocitos Humanos de Sangre Periférica y

Obtención de Cromosomas.

30

8. Congelamiento de Líneas Celulares.


2

Introducción:


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PRACTICA 1. MATERIAL DE LABORATORIO DE CULTIVO Y PRUEBA DE ESTERILIDAD.

Introducción.

El cultivo celular in vitro es una técnica de laboratorio que consiste en la proliferación de una gran cantidad de células a partir de unas pocas, en condiciones controladas de temperatura, nutrientes, pH, humedad, etc.

Surge desde principios del siglo XX, cuando Harrison en 1907 cultiva fibras nerviosas de embriones de rana y se ha perfeccionado día con día.

Es una técnica de gran importancia ya que en la actualidad se realizan cultivos in vitro de diferentes tipos celulares, tejidos y órganos, normales o tumorales, así como de diferentes especies de tipo animal, vegetal o de vertebrados e invertebrados. Que se emplean en investigación científica para realizar diversos estudios de: Inmunología, Farmacología, Toxicología, Genómica, Actividad intracelular, Flujo de sustancias intracelulares, Interacciones entre célula- célula, Obtención de productos celulares, e Ingeniería de tejidos.

En la realización del cultivo celular adecuado, se debe considera la asepsia y el uso de material y un ambiente estéril, ya que la tasa de crecimiento de las células en cultivo es muy inferior al de los contaminantes habituales: hongos, levaduras, bacterias y micoplasma.

Existen diversos métodos para esterilizar los materiales y soluciones empleadas para el cultivo, éstos pueden ser por: Calor Seco, Calor Húmedo, Irradiación, Métodos Químicos, o Filtración.

También es importante que la persona conozca algunas generalidades del laboratorio de cultivo, el material y el equipo, que se enlistan a continuación:

Requerimientos básicos Benéficos, no esenciales Complementos útiles Campana de flujo laminar Contador de células Máquina lavadora de equipo de vidrio

Incubadora Bomba de vacío Congelador a -70°C Tanques de CO2 Pipeteador automático Medidor de conductividad

Autoclave Potenciómetro Osmómetro Refrigerador Horno para esterilizar Centrifuga de alta capacidad

Congelador (-20°C) Termómetros Contador de colonias Microscopio invertido con Microscopio de contraste de

fases Cámara digital y monitor para

microscopio invertido Equipo de filtración Microscopio de fluorescencia Equipo de video con time-lapse

Centrifuga Dispensadores automáticos Esterilizador de plásticos Termo con N2 Líquido Carros con ruedas FACS

Purificador de agua Hornos de secado Microscopio confocal Parrillas de agitación

Hemocitómetro

Baño María Material de vidrio


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Objetivos. Conocer el principal material y equipo para realizar cultivo celular. Hacer pruebas de esterilidad de medios y soluciones empleadas en el cultivo celular. Hipótesis. Material. Todo el material debe estar en condiciones estériles. 5 Viales de 15-20 ml. 6 Pipetas serológicas de 10 ml. 1 mechero Incubadora Pipeteador automático o perillas. Reactivos. Solución Buffer de fosfatos (PBS). Medio de cultivo (específico para su cultivo celular). Suero Fetal de Bovino (SFB), (o bien el requerido para su cultivo). Solución de tripsina. Medio nutritivo, enriquecido. Nutrient Broth no. 3, Vegitone. De Sigma-Aldrich Procedimiento. A. Conocimiento del laboratorio de cultivo celular. 1.- Hacer un reconocimiento del laboratorio de cultivo celular, enumerando los equipos y material, empleado en esta técnica, así como su función. B. Prueba de esterilidad. 1.- En la campana de flujo laminar, se colocan los frascos con medio y soluciones a los que se desea realizar la prueba de esterilidad, así como el medio nutritivo. Los frascos deben estar a temperatura ambiente y limpiarse con alcohol antes de introducirse a la campana. 2.- Para cada solución o medio se debe emplear una pipeta específicamente. Al utilizar cada pipeta o abrir y cerrar cada frasco se debe flamear con la llama del mechero. 3.- Etiquetar los viales según corresponda a cada solución o medio así como un control. 4.- Colocar 3 ml medio nutritivo al vial que dice control y 2 ml a cada uno de los viales de la prueba de esterilidad.

Manual de Prácticas de Cultivo de Células Animales.

5.- Colocar a su vial correspondiente: 1 ml de solución de PBS, o 1 ml de Medio celular, o 1 ml de SFB o 1 ml de solución de tripsina.

6.- Cerrar los viales sin olvidar flamear la boca del frasco y la tapadera. Incubar por 48 h mínimo. Resultados. Has un listado de los equipos y materiales empleados en el cultivo celular.

Equipo Función Indica las observaciones de cada uno de los viales donde se realizó la prueba de esterilidad. Viales a las 72h de incubación. ________________________________

Transparentes.

de Células Animales. Prof. Leticia Bucio Ortiz.

Colocar a su vial correspondiente: 1 ml de solución de PBS, o 1 ml de Medio celular, o 1 ml de SFB o 1 ml de solución de tripsina.

viales sin olvidar flamear la boca del frasco y la tapadera. Incubar por 48 h

Has un listado de los equipos y materiales empleados en el cultivo celular.Función Material Función

las observaciones de cada uno de los viales donde se realizó la prueba de

Viales a las 72h de incubación.

______________________________________________________________ ________________________

Transparentes. Contaminado

Prof. Leticia Bucio Ortiz.

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Colocar a su vial correspondiente: 1 ml de solución de PBS, o 1 ml de Medio

viales sin olvidar flamear la boca del frasco y la tapadera. Incubar por 48 h

Has un listado de los equipos y materiales empleados en el cultivo celular. Función

las observaciones de cada uno de los viales donde se realizó la prueba de

__________


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Análisis de Resultados. Conclusión. Bibliografía.

• Freshney, R. I. 2005. Culture of animal cells: A manual of basic technique. John Wiley & Sons Wiley-Liss, Inc. 5th ed. New York, USA.

• Cultek. Sección Técnica de Células Madre. [Electrónico]. Obtenido el 26 de septiembre de 2012 de: http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/celulas%20madre/celulas_madre_tecnicas.pdf

Cuestionario. 1. Define los siguientes términos:

a. Cultivo celular in vitro. b. Medio de cultivo. c. Solución buffer. d. Condiciones de esterilidad. e.

2. En tus propias palabras, responde a. ¿Cuáles son los principales requerimientos para realizar un cultivo celular? b. Menciona que factores o acciones erróneas son más comunes de cometer

en el cultivo celular. c. ¿En qué consiste la prueba de esterilidad y cual es su importancia?

3. ¿Qué tipo de contaminación se puede dar en los cultivos celulares?


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PRACTICA 2. DESCONGELACIÓN Y CULTIVO DE CÉLULAS CELULARES.

Introducción.

El cultivo celular puede ser realizado a partir de células disgregadas de tejido, al cual se le denomina: cultivo primario. Una vez que las células cultivadas han proliferado y alcanzan la confluencia celular son subcultivadas (pasaje), mediante la disgregación enzimática y resiembra en un área mayor, de 1:2, o hasta 1:4 para continuar el cultivo.

Las células subcultivadas durante varios pasajes pueden llegar a mantener estables ciertas características de tipo morfológico, bioquímico y genético, es cuando se les considera una Línea celular.

Las líneas celulares pueden ser adquiridas comercialmente y se venden tubos criogénicos con células congeladas, a partir de las cuales se inicia y establece la proliferación celular.

Estas líneas celulares las hay de diferentes tipos celulares normales o tumorales, de diversos órganos y especies, según los requerimientos del investigador.

La criopreservación celular a -80 ºC o -196 ºC disminuye las funciones vitales de las células y las mantiene en condiciones de vida suspendida por tiempos prolongados, estas células al colocarse en condiciones adecuadas de temperatura, medios, nutrientes y humedad son cultivadas y proliferan activamente con la finalidad de tener una población celular suficiente para realizar diversos estudios en investigación e incluso al tener una buena cantidad celular poder congelar células para su almacenamiento. Objetivos. Aprender y manejar la técnica de descongelamiento de células criopresevadas en nitrógeno líquido.

Aprender y realizar el cultivo in vitro de una línea celular. Hipótesis. Material. Todo el material debe estar en condiciones estériles. Pipetas serológicas de 10 ml o 5 ml. 1 Tubo cónico para centrífuga de 10 ml.


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Campana de Flujo laminar. Incubadora. Baño María (BM). Microscopio invertido. 1 Mechero. Pipeteador automático o perillas. 1 Vaso de precipitados o frasco para contener desechos. 1 Piseta con alcohol al 70%. 1 Botella de cultivo de 75 cm2 o a una caja Petri. Reactivos. Solución Buffer de fosfatos (PBS). Medio de cultivo (específico para su cultivo celular). Suero Fetal de Bovino (SFB), (o bien el requerido para su cultivo). Solución e antibiótico al 10%.

Alcohol al 70 % Procedimiento.

A. Preparación de medio de cultivo suplementado. 1. A una botella de medio con 500 ml, agregar Suero Fetal de Bovino (o el

requerido) para tener una concentración al 8-10%. Recuerde que previamente realizó a cada solución su prueba de esterilidad.

2. Agregar solución antibiótico al medio de cultivo, a una concentración final del 1%. Etiquetar con Nombre del medio, Fecha de realización, persona responsable del medio.

3. En caso de que el medio se haya preparado con anterioridad y se haya almacenado en refrigerador, colocar en B.M. a 30-37oC, para que tenga una temperatura más templada.

B. Descongelamiento de Células. 1. Colocar previamente dentro de la campana, todos los medios, frascos, vasos,

etc. limpios, para ello limpiar con alcohol al 70%. 2. Remover el criotubo con las células del nitrógeno líquido. 3. Limpiar el tubo con alcohol al 70% y colocarlo en la campana, se puede utilizar

un pequeño BM para llevar el tubo a 37oC, tratar de hacer este paso en forma rápida pero sin que sea un cambio de temperatura brusco.

4. Una vez que el contenido del criotubo se ha descongelado, vaciarlo en el tubo de centrífuga de 10 ml.

5. Agregar medio suplementado para complementar un volumen de 10 ml. 6. Centrifugar a 1000 rpm, durante 5-8 min. 7. Después de centrifugación seguir trabajando en la campana. Desechar el

sobrenadante, puede ser por decantación o bien por aspiración cuidando de no llevarse el paquete celular.


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8. Agregar 10 ml de medio suplementado fresco y homogenizar el botón celular. 9. Una vez homogenizado, pasar el medio con las células a una botellas de cultivo

o a una caja Petri. 10. Colocar en la incubadora a 37oC, 5 % de CO2 y humedad a saturación. 11. Realizar observaciones cada 24 h, utilizando el microscopio invertido. 12. Durante el cultivo, cambiar el medio por medio fresco, cada 48 h.

Resultados. Durante 8-10 días, realiza observaciones utilizando el microscopio invertido cada 24 h y anota los cambios que se pueden apreciar en cada uno de ellos Día: cero

Día: 3

Día: 6

Día: 1

Día: 4

Día: 7

Día: 2

Día: 5

Día: 8



• Cultek. Banco de muestras biológicas. Criopreservación. [Electrónico]. Obtenido el 13 de octubre de 2012 de: http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/celulas%20madre/celulas_madre_tecnicas.pdf


8

• Wikipedia. Criopreservación.[Electrónico]. Obtenido el 13 de octubre de 2012 de: http://es.wikipedia.org/wiki/Criopreservaci%C3%B3n

• Ramos Gómez M, Martínez-Serrano A. 2008. Universidad Autónoma de Madrid. Curso de Cultivos Celulares. [Electrónico]. Obtenido el 13 de octubre de 2012 de: http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/ldesviat/_private/BIOQ%20EXPIII/CursocultivosUAM2008.pdf

• López Göerne T, Ortiz Isla E, Alvarez Lemus M, López Gonzalez M. 2012. Laboratorio de Nanotecnología UAM- Xochimilco. Instituto Nacional de Neurología y Neurocirugía. [Electrónico]. Obtenido el 13 de octubre de 2012 de: http://www.labnano.org.mx/esp%20lineas%20celulares.htm

Cuestionario.

1. Define: a. Línea celular. b. Criopreservación.

2. ¿Cuál es la importancia de realizar una descongelación celular adecuada?

3. ¿Qué factores influyen para realizar un cultivo celular óptimo?


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PRACTICA 3. RESIEMBRA, CONTEO DE CÉLULAS CULTIVADAS y VIABILIDAD CELULAR.

Introducción. Una vez que el cultivo celular llega a confluencia, las células son expuestas a tripsina para disgregar y homogenizar en un medio de cultivo, el cual es distribuido a un área mayor de 1:2 o 1:3 para incrementar el número de células disponibles, o bien para sembrar un número específico de células para realizar un ensayo. Cuando las células son resembradas para la realización de un ensayo o prueba bioquímica, es necesario sembrar un número definido de células para lo cual es necesario hacer el conteo celular, el cual se realiza de una alícuota del homogenado celular, utilizando la cámara de Neubauer (hemocitómetro) o bien por métodos automáticos como es la utilización de un equipo contador de células (Coulter Contens). También es importante que las células que se siembran sean viables, lo cual es posible cuantificar mediante la utilización del colorante de exclusión azul de tripano, que tiñe células no viables y las viables permanecen sin color ya que la membrana impide la incorporación del colorante. Objetivos. Hacer resiembra de células cultivadas in vitro. Conteo de células y resiembra para incrementar el no. de células. Hipótesis. Material. Todo el material debe estar en condiciones estériles. Campana de Flujo laminar. Incubadora. Baño María (BM). Microscopio invertido. Pipetas serológicas de 10 ml o 5 ml.

1 Mechero. 1 Cámara de Neubauer.

Pipeteador automático o perillas. 1 Vaso de precipitados o frasco para contener desechos. 1 Piseta con alcohol al 70%. Botellas de cultivo de 75 cm2 o cajas Petri para cultivo.


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Soluciones: Solución Buffer de Fosfatos (PBS). Medio de cultivo (específico para su cultivo celular). Suero Fetal de Bovino (SFB), (o bien el requerido para su cultivo). Solución de antibiótico al 10%.

Tripsina 2 mM Buffer de PBS con EDTA al 2 mM. Alcohol al 70 % Azul de tripano al ----.

Procedimiento.

A. Resiembra de células. 1. Una botella o caja Petri de cultivo con células formando una monocapa o en

crecimiento exponencial. 2. Desechar el medio de cultivo. 3. Agregar una alícuota de buffer de PBS, para lavar las células y desechar. 4. Repetir el lavado con PBS y desechar el excedente. 5. Agregar una alícuota de PBS con EDTA y dejar reposar 2-3 min, y desechar.

Este paso depende del tipo celular, se emplea para cultivo de la Línea celular HepG2.

6. Agregar una alícuota de Tripsina, (0.5-0.8 ml). Incubar 1-3 min, dependiendo de que tan activa está la tripsina.

7. Una vez despegadas las células, re-suspenderlas en un volumen de Medio de cultivo y homogenizar.

B. Conteo Celular. 1. Homogenizar las células, tomar una alícuota y colocarla en lado A de la

cámara de Neubauer. 2. Repetir el procedimiento anterior y colocar una muestra en el lado B. 3. Contar las células de los 9, 5, 3 o un cuadrante (esto depende la densidad

celular) del lado A y del lado B. Se tiene que tener un número similar en ambos lados (por ejemplo 89 con 80, o 120 con 130), y obtener un promedio el cual se multiplica por el factor 1 X 104, para obtener el número celular por ml de medio. Sí el valor es muy diferente (por ejemplo 80 con 40 o 120 con 80) repetir el conteo.


4. Obtener el número total de células, considerando el volumen total.5. Realizar los cálculos para re

cm2. 6. Colocar en la incubadora a 377. Realizar observaciones cada 24 h, utilizando el microscopio invertido.8. Durante el cultivo, cambiar el medio por medio

C. Viabilidad Celular.

1. A una alícuota detripano.

2. Realizar el conteo celular en la cámara de Neubauer, contando sólo las células refringentes (vivas).

3. Si se requiere determinar el númobservan en color obscuro (células muertas).

Resultados.

A) Observaciones: Tomar una fotomicrografía de células en cultivo, antes de exponerlas a la tripsina y posteriormente de despegarlas.

Células en cultivo

B) Conteo celular.

No. de células

A

B


Obtener el número total de células, considerando el volumen total.los cálculos para re-sembrar un número específico de células por

Colocar en la incubadora a 37oC, 5 % de CO2 y humedad a saturación.Realizar observaciones cada 24 h, utilizando el microscopio invertido.Durante el cultivo, cambiar el medio por medio fresco, cada 48 h.

A una alícuota de 1 ml de homogenado celular agregar 100 ul de azul de

Realizar el conteo celular en la cámara de Neubauer, contando sólo las células refringentes (vivas). Si se requiere determinar el número de células muertas, contar las que se observan en color obscuro (células muertas).

Tomar una fotomicrografía de células en cultivo, antes de exponerlas a la tripsina y posteriormente de despegarlas.

Células tripsinizadas

Promedio No. de céls/ml No. Total de Céls.


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Obtener el número total de células, considerando el volumen total. sembrar un número específico de células por

y humedad a saturación. Realizar observaciones cada 24 h, utilizando el microscopio invertido.

fresco, cada 48 h.

1 ml de homogenado celular agregar 100 ul de azul de

Realizar el conteo celular en la cámara de Neubauer, contando sólo las

ero de células muertas, contar las que se

Tomar una fotomicrografía de células en cultivo, antes de

No. Total de Céls.


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C) Viabilidad Celular:

No. de células vivas Promedio No. de céls/ml No. Total de Céls.

A

B

No. de células muertas Promedio No. de céls/ml No. Total de Céls.

A

B

Porcentaje de Viabilidad Celular: ____________________________.


• Bastida O. 2012. Technical Note - Neubauer Chamber Cell Counting. Celleromics. . [Electrónico]. Obtenido el 19 de septiembre de 2012 de: http://www.celeromics.com/en/resources/Technical%20Notes/cell-article-chamber.php

• Cultek. Sección Técnica de Células Madre. [Electrónico]. Obtenido el 19 de septiembre de 2012 de: http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/celulas%20madre/celulas_madre_tecnicas.pdf


• Ramírez Romero P, Mendoza Cantú A. 2008. Ensayos toxicológicos para la evaluación de sustancias químicas en agua y suelo. La experiencia en México. Instituto Nacional de Ecología, SEMARNAT. 1ra ed. México D.F., México. Electrónico]. Obtenido el 20 de octubre de 2012 de: http://books.google.com.mx/books?id=wdJWUOj81isC&pg=PA247&lpg=PA247&dq=azul+de+tripano+preparar&source=bl&ots=DwWbWs0aqR&sig=xVL9MDSp6X5HZrT2AazMke8euh4&hl=es&sa=X&ei=9SSGUNSQFsalqQGeo4GIAg&ved=0CFAQ6AEwBg#v=onepage&q=azul%20de%20tripano%20preparar&f=false


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Cuestionario. 1.- ¿Indica que es la tripsina y cual es su efecto en las células en cultivo? 2.- ¿Qué es el EDTA y cual es su función en las células en cultivo? 4. ¿Qué es el azul de tripano y su función en la viabilidad celular? 4.- ¿Cuál es la importancia de realizar un conteo celular y en que casos tiene importancia?


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PRACTICA 4. PRUEBA DE CITOTOXICIDAD DE MTT, EN CULTIVO CELULAR IN VITRO.

Introducción. Las pruebas de citotoxicidad son muy variadas y permiten conocer si las células están siendo afectadas en su funcionalidad por la exposición a un agente físico o químico En algunos casos estas pruebas permiten conocer que organelo o parte celular es la que se está alterando específicamente. Para determinar si las células están experimentando citotoxicidad, es posible medir metabolitos o enzimas, dentro de las células o bien que sean excretados al medio, como lo son la Lactato deshidrogenasa, o bien las transaminasas glutámico pirúvica o la glutámico oxaloacética, las cuales si están incrementadas son muestra del daño que ha experimentado las células por acción de un xenobiótico. Otra prueba utilizada para determinar citotoxicidad y viabilidad celular el del MTT, la cual es específica para detectar un daño celular a nivel mitocondrial.

Nota: Estas pruebas son utilizadas para determinar la funcionalidad celular ante la exposición de un tratamiento citotóxico, por lo que es necesario contar con un control negativo (células que han sido cultivadas en ausencia del agente citotóxico). Objetivos. Determinar la funcionalidad celular, mediante las pruebas del MTT. Hipótesis. Material. Campana de Flujo laminar. Incubadora. Baño María (BM). Microscopio invertido. Pipetas serológicas de 10 ml o 5 ml. 1 Mechero. Pipeteador automático o perillas. 1 Vaso de precipitados o frasco para contener desechos. 1 Piseta con alcohol al 70%. Placas multipozos o Cajas Petri.


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Reactivos:

• Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil tetrazolium. (MTT).

• HCL.

• Isopropanol.

• Etanol.

Soluciones:

• Solución Buffer de Fosfatos (PBS).

• Medio de cultivo (específico para su cultivo celular).

• Suero Fetal de Bovino (SFB), (o bien el requerido para su cultivo).

• Solución de antibiótico al 10%.

• Tripsina 2 mM

• Buffer de PBS con EDTA al 2 mM.

• Alcohol al 70 %.

• Solución de MTT: 0.5 mg/ml en PBS a pH=7.5.*

• Solución de HCl 0.04N en 2-isopropanol.

*Se recomienda preparar un estock 10X en PBS y diluir posteriormente en medio de cultivo celular.

Procedimiento.

A. Prueba de MTT. 1. Sembrar las células en placas de cultivo de 6 pozos ----cm2, a una densidad

de 50 000 células /cm2. 2. Incubar en las condiciones estándar y dejar que se adhieran al menos 24 h. 3. Ya adheridas las células. Aplicar un tratamiento con un agente citotóxico (el

que es de su interés), contar con el cultivo celular que servirá como control (No contiene el agente citotóxico). El tratamiento puede ser dependiente de diversos agentes, concentraciones o tiempos de exposición.

4. Al término del tratamiento, lavar las células con una alícuota de solución de PBS y desechar el excedente.

5. Agregar una alícuota de la solución de MTT, suficiente para cubrir la monocapa celular.

6. Incubar las células con el MTT por 3 h a 37oC y 90 % de humedad. 7. Posteriormente, desechar la solución de MTT. Lavar las células con PBS y

desechar el volumen restante.


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8. Agregar 500 µL de una solución de HCl 0.04N en 2-isopropanol, y agitar la placa durante 15 min.

9. Obtener el formazán solubilizado y leer en espectrofotómetro a una longitud de onda de 570 nm.

10. Expresar la funcionalidad celular (mitocondrial) como porcentaje de la absorbancia con respecto a la absorbancia del control.

Resultados.

Observaciones: Tomar una fotomicrografía de células en cultivo, del control y las expuestas a los diferentes tratamientos, antes de extraer los colorantes.

MTT

Control Tratamiento 1 Tratamiento 2

Graficar los resultados para MTT Análisis de Resultados. Conclusión. Bibliografía.


• Gómez Lechón M J, Avilés Martín P M. 2010. Hospital la Fe. Valencia y Laboratorios Glaxo. Modelos in vitro y cultivos celulares/tisulares [Electrónico]. Obtenido el 28 de octubre de 2012 de: http://minnie.uab.es/~veteri/00009/cap21.pdf

• Loumbourdis N, Danscher G. 2008. Autometallographic tracing of Hg-S quantum dots in foros exponed to inorganic mercury. Biometals, 21: 311-319.

• Mosmann T. 1983. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assay. J. Inmunol. Methods 65: 55–63.

• Omata, S., Kasama, H., Hasegawa, H., Hasegawa, K., Ozaki, K., Sugano, H. 1986. Species difference between rat and hamster in tissue accumulation of mercury after administration of methylmercury, Arch. Toxicol. 59: 249-254.


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• Santos, A.C., Uyemura, S.A.,Santos, N.A., Mingatto F.E., Curti, C. (1997) Hg(I1)- induced renal cytotoxicity: in vitro and in vivo implications for the bioenergetic and oxidative statuso f mitochondria, Mol. Cell. Biocllemi. 177: 53-59.

Cuestionario. 1.- Indica que es el MTT y la reacción en que se basa su funcionalidad. 2.- Indica cual fue el agente citotóxico empleado y su efecto sobre las células.


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PRACTICA 5. PRUEBA DE CITOTOXICIDAD DE ROJO NEUTRO, EN CULTIVO CELULAR IN VITRO. Introducción. Las pruebas de citotoxicidad son muy variadas y permiten conocer si las células están siendo afectadas en su funcionalidad por la exposición a un agente físico o químico En algunos casos estas pruebas permiten conocer que organelo o parte celular es la que se está alterando específicamente. La prueba de Rojo neutro permite conocer si las células han experimentado citotoxicidad particularmente a nivel de lisosoma.

Nota: Estas pruebas son utilizadas para determinar la funcionalidad celular ante la exposición de un tratamiento citotóxico, por lo que es necesario contar con un control negativo (células que han sido cultivadas en ausencia del agente citotóxico). Bibliografía.


• Gómez Lechón M J, Avilés Martín P M. 2010. Hospital la Fe. Valencia y Laboratorios Glaxo. Modelos in vitro y cultivos celulares/tisulares [Electrónico]. Obtenido el 28 de octubre de 2012 de: http://minnie.uab.es/~veteri/00009/cap21.pdf

• Loumbourdis N, Danscher G. 2008. Autometallographic tracing of Hg-S quantum dots in foros exponed to inorganic mercury. Biometals, 21: 311-319.

• Mosmann T. 1983. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assay. J. Inmunol. Methods 65: 55–63.

• Omata, S., Kasama, H., Hasegawa, H., Hasegawa, K., Ozaki, K., Sugano, H. 1986. Species difference between rat and hamster in tissue accumulation of mercury after administration of methylmercury, Arch. Toxicol. 59: 249-254.

• Santos, A.C., Uyemura, S.A.,Santos, N.A., Mingatto F.E., Curti, C. (1997) Hg(I1)- induced renal cytotoxicity: in vitro and in vivo implications for the bioenergetic and oxidative statuso f mitochondria, Mol. Cell. Biocllemi. 177: 53-59.


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PRACTICA 6. DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA (MÉTODO BCA).

Introducción. Las proteínas son las moléculas orgánicas más abundantes en la célula, constituyen más del 50% del peso seco de la célula. Cada tipo celular, tiene un papel específico determinado por su composición proteica. Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas, basados en: a) La propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV. b) La formación de derivados químicos. c) La capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes. El primer método para cuantificar proteínas, fue establecido en 1959 por Biuret, el cual se hiso más eficiente y sensible por Lowry y posteriormente se utiliza el de Bradford, cada uno de ellos con ventajas y desventajas. Actualmente es posible utilizar el método del ácido bicinconínico que permite determinar la cantidad de proteínas en una muestra de hasta 5 uL, en placas multipozos con ahorro de tiempo y una mayor sensibilidad.

Objetivos. Determinar la cantidad de proteínas en una muestra celular. Hipótesis. Procedimiento. A). Extracción de proteínas.

Material. Soluciones:

(A). Buffer de lisis para obtener proteína: (Puede usarse las proteínas para WB) Agregar 80 uL de Complete / ml buffer lisis

Complete: una pastilla en 2 ml de agua desionizada y estéril. Hacer alícuotas y guardar en frasco obscuro a - 4oC.

Buffer de lisis 50 mM tris-HCl 120 mM NaCl 0. 05% IGEPAL

pH= 8

0.394 g tris-HCl 0.197 g 0.350 g NaCl 0.1753 g 0.250 uL IGEPAL 0.125 g

50 ml 25 ml

100 mM NaF 200 uM NaOV3

Inhibidores de fosfatasas

0.210 g NaF 0.1049 g 0.0012 g NaOV3 0.0006 g Ajustar a pH 8.0 (ya agregado)


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1. Caja Petri de células en semiconfluencia (2.5 x 106 células). 2. Lavar con PBS frío. Poner previamente la botella de PBS en hielo. 3. Quitar el exceso de PBS con micropipeta. 4. Agregar 200 mL de buffer de lisis (A), (contiene inhibidor de proteasas), a cada

una de las cajas Petri. 5. Dejar las cajas con el buffer de lisis, sobre hielo durante 15’, moviendo cada 5

minutos para que se lisen las células. 6. Raspar con gendarme y homogenizar con la punta (20-30 veces). 7. Poner todo el volumen en un eppendorf de 1.5 - 2 ml. 8. Centrifugar durante 15 min a 14 000 rpm a 4oC. 9. Recuperar el sobrenadante con cuidado de no tomar el pellet y alicuotar:

B). Cuantificación de proteína.

Material: • 1 Multicámara de 96 pozos.

• 1 Micropipeta de 100-1000 uL

• 1 Micropipeta de 1-20 uL.

• Puntas para micropipeta.

• 1 Bureta de 10 0 25 mL

• Kit comercial BCA Protein Assay Kit (Pierce).

Soluciones: • Reactivo de BCA (preparado 50:1 con los reactivos A y B).

1.- Se cuantificará la cantidad de proteína en muestras de homogenado celular o de tejido, mediante la utilización del Kit comercial BCA Protein Assay Kit (Pierce), para ello, se utilizará una curva estándar de albúmina con diferentes concentraciones:

Estándar Concentración final de BSA (µL/mL)

A 2,000 B 1,500 C 1,000 D 750 E 500 F 250 G 125 H 25 I 0


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2.- Se colocarán 25 µL de cada estándar en una placa multipozos, y 5 µL de las

muestras problema más 20 µL de agua destilada.

3.- Adicionar 200 µL del reactivo de BCA (preparado 50:1 con los reactivos A y B), y se

incuba a 37ºC por 30 minutos.

4.- Posteriormente se lee la placa en un lector de placas DTX Multimode Detector

(Beckman Coulter) a 562nm.

Se realizan los cálculos para determinar la cantidad de proteína / mL de muestra.

Resultados.

a) Hacer una tabla con los datos de absorbancia correspondientes a la curva patrón y a los problemas.

b) Hacer la gráfica de la curva patrón.

c) Mediante la ecuación de la línea recta correspondiente a la curva patrón, determinar la cantidad de proteína para cada una de las muestras problemas.



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• Universidad Nacional de Quilmes. 2010. Extracción y cuantificación de proteínas. Introducción a Biología Celular y Molecular. [Electrónico]. Obtenido el 1 de noviembre de 2012 de: http://ibcmunq.files.wordpress.com/2010/03/tp2.pdf

• Fernández Reyes E. Galván Cejudo A. 2010. Métodos para la cuantificación de proteínas. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Campus Universitario de Rabanales. Córdoba. España.

Cuestionario. 1.- Indica que es una curva patrón. 2.- Refiere en que se basa la técnica del BCA para reaccionar con las proteínas. 3.- Por qué se leen las muestras a una longitud de 562 nm. 4.- Qué ventajas ofrece este ensayo con respecto al método de Bradford y Lowry. PRACTICA 7.


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CULTIVO DE LINFOCITOS HUMANOS DE SANGRE PERIFERICA Y OBTENCION DE CROMOSOMAS. Introducción. A mediados del siglo pasado gracias al avance de la biología, específicamente de la genética y la citología, surgió una nueva ciencia, la llamada citogenética, que tiene como objetivo el estudio de los cromosomas y de sus alteraciones, así como el estudio de la relación de estas alteraciones y la sintomatología que presentan los pacientes. Es por tanto una ciencia de gran aplicación en biología y medicina, ya que muchas enfermedades tienen un origen citogenético, al igual que muchos abortos espontáneos o malformaciones fetales. Desde mediados del siglo XIX hasta mediados del XX no se supo el número de cromosomas del ser humano, porque entre otras cosas, no se sabía si el número de cromosomas era constante. EL problema era que en la placa metafásica los cromosomas están muy juntos y es difícil verlos separados. En diversos recuentos se obtenían números dispares: 29, 80, 48 etc. Hoy en día sabemos que el número de cromosomas es característico de cada especie y que además, hay genotipos muy variados. Pero no fue hasta 1956, cuando fue establecido por los investigadores Levan y Tijo, que la especie humana tenía 46 cromosomas. Este descubrimiento fue posible gracias a diversos avances técnicos y metodológicos:

• Técnicas de cultivo de tejidos: primero se realizaron con células de pollo, y posteriormente mamífero. Con estas técnicas desarrolladas ya en 1930 y 1940, se permitió cultivar células vivas in vitro.

• La técnica de choque hipotónico, que fue la más importante. Esta técnica consiste en suspender las células en una suspensión hipotónica, con la que se hinchan las células consiguiendo la separación de los cromosomas. Aprovecharon además la colchicina para inhibir la polimerización de microtúbulos y por lo tanto, destruir el huso mitótico.

En 1960 Moorhead describió que los linfocitos se en la sangre periférica, pero que podían entrar en mitosis en condiciones, in vitro. Con este descubrimiento, se pudo realizar el cariotipo a partir de sangre periférica, lo que tuvo varias ventajas:

• Es un tejido fácil de obtener.

• Permite la obtención de un gran número de células con lo que se obtienen abundantes metafases (Navarro López, 2011).

Los linfocitos son las células responsables de las respuestas inmunitarias (inmune, del latín, 'estar libre de carga'). Se desarrollan a partir de progenitores linfoides inmaduros y se dividen en dos grandes grupos, linfocitos B y linfocitos T, según que estos progenitores linfoides maduren en la médula ósea (B) o en el timo (T), respectivamente. Los linfocitos B están especializados en la producción de anticuerpos. Los linfocitos T son responsables de las respuestas inmunes mediadas por células, así como de funciones de cooperación para que se desarrollen todas las formas de respuestas inmunes, incluida la respuesta de anticuerpos por los linfocitos B. Los linfocitos han sido intensamente estudiados y desde hace muchos años son utilizados para una gran diversidad de investigaciones biológicas. En el campo de la genética los linfocitos han


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sido de gran utilidad, particularmente para la obtención de cromosomas mitóticos, cuyo estudio representan la parte fundamental de la citogenética. El cultivo de linfocitos, por lo tanto es una práctica rutinaria en un gran número de laboratorios de genética. Las técnicas para cultivar linfocitos se basan en la capacidad que tienen estas células para proliferar en presencia de agentes inductores de la división celular (mitógenos) y el desarrollo de un gran número de medios de cultivos (Verma, 1995).

Objetivos.

Conocer las bases del cultivo en suspensión mediante un cultivo de linfocitos en sangre periférica.

Observar en el microscopio los cromosomas obtenidos para calcular el índice mitótico. Hipótesis. Material. Todo el material debe estar en condiciones estériles.

Pipetas serológicas de 10 ml o 5 ml. 1 Tubo cónico para centrífuga de 15 ml. Campana de Flujo laminar (opcional se puede trabajar entre 2 mecheros). Incubadora. Microscopio invertido. 2 Mecheros. 2 Jeringas 1 Vaso de precipitados o frasco para contener desechos. 1 Piseta con alcohol al 70%.

Centrífuga Pipetas Pasteur y bulbos Láminas portaobjetos y cubreobjetos

Reactivos y Soluciones.

Sangre completa. Medio Mc Coy 5A. Fitohemaglutinina. Solución de antibiótico al 10%. Sol. Hipotónica: KCl 0.4 %. Etanol. Acido acético. Alcohol al 70 %. Colorante de Giemsa.


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Procedimiento. A. Cultivo o siembra 1) La muestra de sangre humana completa se obtiene en una jeringa estéril heparinizada.

2) Se vacían en un tubo de 15 ml estéril y etiquetado las siguientes soluciones en el orden aquí establecido:

• 2.5 ml de Medio Mc Coy 5a

• 0.16 ml de Fitohemaglutinina

• 0.016 ml de sol. antibiótica

• 3 ml de sangre completa (6 gotas), las gotas de sangre se vacían quitando la punta metálica de la jeringa, para no romper más la muestra celular.

Se cierra el tubo y se homogeniza suavemente la mezcla. 3) Se lleva el cultivo a una incubadora a 37% C por 72 o 96 hrs máximo.


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B. Cosecha y obtención de cromosomas 1) Una hora antes del cultivo se añaden 2ml o 4 gotas de colchicina al cultivo.

2) Se saca el tubo de siembra de las condiciones de esterilidad y se centrifuga a 1,500 rpm por 10 minutos y el sobrenadante se elimina. (Es posible apreciar el buffy coat o la fase en donde se encuentran los linfocitos)

3) Se vacía una solución hipotónica de KCl al 0.4 % hasta llegar a 10 ml y se introduce a la incubadora durante 30 minutos. (Se recomienda vaciar un poco de solución, resuspender y después vaciar el resto y volver a resuspender y homogenizar)


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4) Se centrifuga la muestra a 1500 rpm por 10 minutos y el sobrenadante se elimina

5) Se vacía solución fijadora compuesta de etanol: ácido acético en proporciones 3:1 hasta llegar a 10 ml y se centrifuga a 1,500 rpm por 10 minutos. Se elimina el sobrenadante.

6) Se repite el lavado con solución fijadora hasta 10m l(x 2) y se centrifuga a 1,500 rpm por 10 minutos. Se elimina la mayor cantidad de sobrenadante y el botón celular se resuspende con lo que queda en el tubo de fijador.


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7) El botón celular se gotea sobre láminas portaobjetos sumergidas en solución fijadora enfriada en el congelador a una distancia de altura considerable para favorecer el rompimiento de las células.

8) Se sopla un poco el contenido para distribuirlo y se espera a que seque. 9) Se tiñe la muestra con Giemsa al 4% durante 20 minutos. Y se llevan las preparaciones al microscopio de campo claro para monitorear la dispersión de los cromosomas en la metafase y el índice mitótico.


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Resultados.

Determinar el Índice mitótico. Utilizando el microscopio de campo claro a un aumento de 100X para observar bien las mitosis. Elegir varios campos y calcular del índice mitótico usando la siguiente fórmula:

Í�� ú��

�ú�� é�� 100



• Navarro López Carlos. Universidad de Valencia. Departamento de Biologia. El cariotipo humano. [Electrónico]. Obtenido el 6 de noviembre de 2012 de: http://mural.uv.es/monavi/disco/primero/biologia/Tema35.pdf

• Verma, R.S., y Babu, A.1995. Human Chromosomes. Principles and Techniques. 2ª Ed. Mc Graw-Hill. Estados Unidos. 419p.


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PRACTICA 8. CONGELAMIENTO DE LINEAS CELULARES.

Introducción. La criopreservación tiene como objetivo el mantenimiento de la viabilidad y funcionabilidad celular a temperaturas bajas. La criobiología se refiere a entender los efectos de las temperaturas bajas sobre los sistemas celulares ya que el tiempo biológico es una consecuencia de determinadas reacciones bioquímicas y el frío prolonga el tiempo biológico puesto que enlentece estas reacciones. Sin embargo, este no es un proceso exento de problemas, ya que puede inducir variaciones extremas en las propiedades químicas, térmicas y eléctricas las cuales pueden alterar las membranas celulares, los organelos y la delicada interacción célula-célula inherente en las células y tejidos a criopreservar.

La estructura y composición de las membranas plasmáticas determinan los principales eventos celulares que tienen lugar durante los procesos de criopreservación, su comportamiento durante la congelación y descongelación definirá los índices de súpervivencia de la célula congelada. Los periodos críticos para la sobrevida celular durante la criopreservación son la fase inicial del congelamiento y el periodo de retorno a condiciones fisiológicas.

El entender y aplicar adecuadamente la criopreservación de material biológico es fundamental para los bancos de células de humanos y de células animales, los laboratorios de cultivo celular (mantener una línea celular en cultivo continuo por largos periodos de tiempo es costosa, hay un gran riesgo de contaminación así como la posibilidad de una alteración genética) y los laboratorios de farmacia, por lo cual hay una especial atención a la conservación de tejidos, órganos y embriones humanos para ser utilizados en investigación y su posterior aplicación terapéutica (trasplantes) llegando a crear verdaderos archivos biológicos. Sin embargo, aunque desde hace mucho tiempo se han implementado protocolos para criopreservación, estos son aún subóptimos en la mayoría de los casos.

La obtención de un protocolo ideal para criopreservar es dependiente del conocimiento de las propiedades fisicoquímicas de la célula y o el tejido puesto que este proceso está afectado por diferentes variables como especie, tipo y estadio de la célula a congelar. Las células tienen diferente tamaño y manejan diferente composición de solutos y en general el éxito de la criopreservación es inversamente correlacionado con la complejidad de los sistemas biológicos congelados (Ávila-Portillo Bacter, 2006).

Uno de los métodos de preservación por tiempo indefinido de células es por medio de la congelación en nitrógeno líquido. Los pasos cruciales dependen de adecuadas velocidades de congelamiento y descongelamiento de las células. Para congelar las células los protocolos más exitosos bajan la temperatura lentamente hasta los –70ºC evitando de esta manera la formación de cristales intracelulares que puedieran dañar a las células. Cuando la temperatura se baja bruscamente la velocidad de formación de cristales intracelulares se incrementa y la viabilidad decae en forma considerable. En la preparación se incluye, además, un agente que limita la cristalización, como el dimetil sulfóxido (DMSO). Para el descongelado en cambio, se incrementa abruptamente la temperatura para evitar que las células sufran grandes cambios de volumen y estallen (Universidad de Quilmes, 2010.


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Objetivos. Realizar el congelamiento de una línea celular para preservación por tiempos prolongados (días, meses, años). Hipótesis. Material. Todo el material debe estar en condiciones estériles. Pipetas serológicas de 10 ml o 5 ml.

1 Tubo cónico para centrífuga de 15 ml. Campana de Flujo laminar. Incubadora. Baño María (BM). Microscopio invertido. Mechero. Hemocitómetro o cámara Neubauer. Pipeteador automático o perillas. 1 Vaso de precipitados o frasco para contener desechos. 1 Piseta con alcohol al 70%. 1 Botella de cultivo de 75 cm2 con células HepG2 confluentes

1 Víal de plástico Criotubos, etiquetados con la línea celular, el pasaje, la fecha y la persona que realizó el congelamiento.

Reactivos. Solución Buffer de fosfatos (PBS). Solución Buffer de fosfatos con EDTA (PBS-EDTA).

Medio de cultivo: Medio Williams (específico para su cultivo celular). Suero Fetal de Bovino (SFB), (o bien el requerido para su cultivo). Solución de antibiótico al 10%.

Alcohol al 70 % Solución de tripsina. Dimetil sulfóxido (DMSO) Células: línea celular en confluencia.

Procedimiento. A. Tripsinización y conteo celular 1) Observar al microscopio el frasco (Superficie: 75 cm2) que se va a congelar para asegurarnos que no está contaminada y se puede congelar.


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2) Flamear el frasco y decantar medio de cultivo en el matraz de desechos.

3) Lavar dos veces con PBS entre 5 y 10 ml, cubriendo monocapa y agitando suavemente. Decantar.

4) Lavar una vez con 4ml de PBS-EDTA, cuidando que cubra por completo la superficie de la monocapa y dejar actuar durante 1 minuto.


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5) Cubrir la monocapa con una cantidad menor a 1ml de solución de tripsina (0.5 a 0.8 ml aproximadamente) e incubar por dos minutos aproximadamente. Observar atentamente la monocapa una vez agregada la tripsina, esta tiene un tiempo de acción entre 2 y hasta 5 minutos.

6) Agregar 12 ml de medio Williams y homogeneizar la monocapa pipeteando enérgicamente. Teniendo cuidado de deshacer los cúmulos celulares pipeteando reiteradamente.

7) Medir el volumen de la suspensión con la pipeta y tomar una alícuota de 500ul para contar las células en el hemocitómetro.


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B. Congelamiento 1) Vaciar la suspensión celular a un tubo de 15 ml estéril y centrifugar a 3,000 rpm durante 8 o 10 minutos.

2) Dividir el número de células obtenida en el conteo entre 5 millones, para saber cuántos tubos se van a preparar. Para cada tubo considere que se van a vaciar en total 1.5 ml que se componen de lo siguiente:

80 % de Medio Williams. 10% de SFB (suero fetal bovino).

+ 10% de DMSO. 100% de medio para congelar.

3) Etiquetar los criotubos con datos de la línea celular pasaje fecha y quien congela dicha muestra.


4) Regresar a trabajar en la campana de agregar el 80% de medio y homogenizar. Después añadir 10% de SFB y finalmente 10% de DMSO para tener un 100%. Homogenizar.

5) Vaciar en cada criotubo 1.5 ml de suspensión. Cerrar bien cada criotubo y llevar al congelador REVCO a -80°C.

Resultados.


4) Regresar a trabajar en la campana de flujo, desechar el sobrenadante. Primero agregar el 80% de medio y homogenizar. Después añadir 10% de SFB y finalmente 10% de DMSO para tener un 100%. Homogenizar.

5) Vaciar en cada criotubo 1.5 ml de suspensión. Cerrar bien cada criotubo y llevar al 80°C.


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flujo, desechar el sobrenadante. Primero agregar el 80% de medio y homogenizar. Después añadir 10% de SFB y finalmente

5) Vaciar en cada criotubo 1.5 ml de suspensión. Cerrar bien cada criotubo y llevar al


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• Ávila-Portillo Bacter LM, Madero J I, López Bacter C, León Bacter M F, Acosta Bacter Lucía, Gómez C, Delgado L G, Gómez C,Lozano J M, Reguero M T. 2006. Fundamentos de criopresrvación. Revista Colombiana de Obstetricia y Ginecología 57: 291-300.


• Universidad Nacional de Quilmes. 2010. Mantenimiento de líneas celulares. Biología Celular y Molecular. [Electrónico]. Obtenido el 5 de noviembre de 2012 de: http://cancer.unq.edu.ar/Tpnro2bis.pdf

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