fundamentos de cultivo celular

Óscar Jodra

Laboratorio clínico y biomédico

INTRODUCCIÓN

El cultivo de células es una técnica muy empleada en investigación, biología molecular,biotecnología y otras ciencias experimentales.

Los primeros experimentos de cultivo de tejidos fueron llevados a cabo por Roux, quien en 1885pudo cultivar una placa neural de embrión de pollo en una solución salina caliente. Entre 1885 y1907 muchos investigadores tuvieron ciertos logros en el cultivo de diferentes tejidos, pero es enesta fecha cuando Harrison ideó una técnica sencilla y eficaz que permitiera a las partesexplantadas, crecer y desarrollarse fuera del organismo: el cultivo en gotas de linfa coagulada.

Pero quien realmente puso los cimientos de todas las técnicas de cultivo de tejido fue Carrel, quiendesde 1912 realizo un gran número de experimentos en cultivo de tejidos y perfeccionó un tambiénnumeroso grupo de técnicas.

Otro gran paso en el avance de estas técnicas supusieron los estudios de Earle, quien consiguió elcultivo de células transformadas e ideo la tripsinización como forma de separar las células.

Los cultivos de tejidos tienen una gran cantidad de aplicaciones, como los estudios genéticos,investigación en morfogénesis y diferenciación celular, ensayos farmacológicos, estudiostoxicológicos e histopatológicos y sobre todo como medio de cultivo para virus.

CONDICIONES DE TRABAJO

El cultivo de células y tejidos es muy delicado, y debe realizarse bajo unas condiciones de trabajomuy estrictas. Los dos principales requerimientos son: extremada limpieza y completa asepsia.

Respecto a la limpieza, es preferible la utilización de material de plástico desechable, que vienelisto para su uso.

Si el material es de vidrio, éste debe ser de borosilicato, ya que el vidrio de carbonato cálcico esblando y puede ser parcialmente solubilizado, liberando al medio componentes extraños. Lalimpieza del material de vidrio debe ser muy cuidadosa, y debe realizarse no solo tras su uso, sinotambién cuando va a utilizarse por primera vez, ya que puede contener ciertos residuos provenientesdel proceso de fabricación. Los detergentes empleados deben ser completamente atóxicos, ya quelas células en cultivo son muy sensibles, y además hay que enjuagar bien todo el material con aguadestilada tras su limpieza.

La asepsia es también uno de los requisitos importantes en el cultivo de tejidos. Para lograrla, serealiza todo el trabajo en campanas de flujo laminar que se encuentran situados en habitaciones conlamparas germicidas.

Los medios de cultivo y soluciones de trabajo son filtrados por filtros millipore para evitar lacontaminación, y el personal que trabaja en estos cultivos debe emplear guantes y mascarillas, estasúltimas muy importantes, ya que uno de los grandes enemigos de los cultivos de células son losmicoplasmas, que pueden contaminar un cultivo provenientes de la garganta del manipulador.

MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO

En los primeros tiempos, los medios nutritivos empleados para el cultivo de células animales invitro se derivaban del organismo, y consistían en plasma, suero, otros líquidos corporales yexudados, y extractos de tejidos y órganos. Pero la complejidad y variabilidad de estos materialesnaturales hacia difícil usarlos en experimentos ideados para determinar los sustancias nutritivasrequeridas por las células y el efecto de estas sustancias sobre ellas.

Los primeros intentos para idear medios químicamente definidos fueron hechos por Lewis y Lewisy por Baker y Carrel en 1911 y 1912. Pero no es hasta 1950 cuando Morgan, Morton y Parkerlogran un medio satisfactorio, el 199, que se componía de ocho unidades:

1. aminoácidos proteicos2. vitaminas, un grupo completo3. constituyentes de ácidos nucleicos4. solución equilibrado de siete sales 5. glucosa, como fuente de energía nutritiva 6. factores de crecimiento (seis) 7. bicarbonato, como regulador del pH 8. rojo fenol, como indicador de pH

Poco o poco estos medios fueron mejorándose y apareció el medio de Eagle, modificadoposteriormente por Dulbecco, en cuya composición aparecen:

1. aminoácidos, tan solo 15 son necesarios2. vitaminas, solo ocho3. solución de siete sales4. glucosa, como fuente energética5. antibióticos para evitar la contaminación: penicilina y estreptomicina6. factores de crecimiento: piruvato sódico7. rojo fenol como indicador8. suero de ternera en un 5-10%, que aporte otros factores de crecimiento

Existe una clara diferencia en el requerimiento de sales de las células que crecen adheridas a unsoporte sólido y las células que crecen en suspensión. Los medios para este ultimo tipo de cultivono contienen calcio y tienen aumentada la concentración de fosfatos.

En el medio de cultivo va disuelto un tampón para fijar el pH a un valor de 7.2. Habitualmente eltampón empleado era el bicarbonato, que exige cultivo en estufas de incubación en atmósfera conun 5% de CO2. La dificultad de manejo de estos cultivos, debido a la facilidad con que puedenperder CO2 gaseoso y alterarse el pH, hace que cada vez más se vaya imponiendo el uso de lostampones Hepes y Tris.

El sistema indicador de pH, normalmente rojo fenol, es indispensable para seguir el estado delmedio. Cuando la actividad metabólica de las células hace disminuir el pH, el rojo fenol vira delrojo al amarillo, indicando la necesidad de reemplazar el medio de cultivo por otro fresco. Si elcolor que adquiere es fucsia, se debe a una exposición al aire por que el sistema no está bien cerradoo por toxicidad celular.

El suero, normalmente suero bovino fetal (SBF), adicionado al medio en un 5-20% mejora elcrecimiento y supervivencia de los cultivos al proporcionarles factores hormonales estimuladores,factores que facilitan la adhesión y expansión del cultivo y otra serie de factores como proteínas,lípidos, minerales… Al ser el suero un elemento no estandarizado, cada lote es distinto y hay quecomprobar sus propiedades antes de su uso generalizado.

Los cultivos de células de mamíferos se realizan a 37 ºC, aunque puede hacerse variar entre 21 y 41ºC según convenga. Si los frascos de cultivo permiten la evaporación del medio, se colocan en laestufa unas bateas con agua para producir una atmósfera húmeda, aunque esto facilita lacontaminación y por ello se suele colocar en la batea algunos elementos de cobre que dificultan elcrecimiento microbiano en el agua.

Para contrarrestar posibles fallos de esterilidad (todos los medios ysoluciones empleadas en el cultivo de tejidos han de estar estériles, yasea por filtración o en autoclave), se introducen en el medio antibióticosinofensivos para las células, y también algunos fungicidas, comomicostatina o fungizona. La contaminación mas difícil de evitar y dedetectar es la producida por los micoplasmas, que pueden serintroducidos en el cultivo provenientes del operador, o con el suero, queen ocasiones viene contaminado por micoplasmas.

Cuando se prepara un medio y antes de su utilización, hay que hacer uncontrol de esterilidad, incubándolo en condiciones análogas a las de uncultivo durante 2-3 días.

soluciones salinas

Las soluciones salinas equilibradas que se usan en cultivo de tejidos tienen tres funcionesprincipales:

sirven como líquidos de dilución y de irrigación, manteniendo al mismo tiempo latonicidad de las células.

proporcionan capacidad de tamponamiento proporcionan el agua y los iones necesarios para el metabolismo normal.

Los líquidos que bañan a las células cultivadas, deben ser isotónicos. Es la primera característicaque deben cumplir estas soluciones. También deben ser equilibradas, es decir con lasconcentraciones de los cationes Na+, K+ y Ca2+ perfectamente calculadas, de forma que un catión escapaz de antagonizar o neutralizar los efectos tóxicos de otro.

La primera solución equilibrada fue la de Ringer, que fue posteriormente mejorada por Tyrode. Lasolución de Tyrode se empleo ampliamente en los primeros tiempos del cultivo de tejidos, peroposteriormente surgieron otras soluciones equilibradas con sustanciales mejoras. Estas soluciones,de uso corriente actualmente son por ejemplo la de Earle y la de Hanks, más normalmente llamadaHBSS (por Hanks balanced salt solution)

La formula de la solución HBSS es:

NaCl 8.00 g/1KCl 0.40 g/1CaCl2 0.14 g/1MgSO4 · 7H2O 0.20 g/1Na2HPO4· 12 H2O 0.12 g/1KH2PO4 0.06 g/1NaHCO3 0.35 g/1Glucosa 1.00 g/1

Otra solución similar y también de bastante uso es el PBS, compuesto de cloruro sódico, cloruropotásico, fosfato sódico y fosfato potásico. Este PBS (Phosphate buffer saline), carente de Ca2+ yMg2+, se emplea para la dilución de enzimas digestivos, ya que se ha comprobado que laeliminación de estos cationes favorece la capacidad dispersante de la solución.

CULTIVO PRIMARIO Y SECUNDARIO

Se denomina cultivo primario el derivado directamente de un tejido, y cultivo secundario al que estáderivado de un cultivo que ha sido tripsinizado para individualizar sus células. Con frecuencia lamorfología de los cultivos primarios y secundarios es diferente.

cultivo primario

Hay diversos métodos de iniciar un cultivo a partir de un órgano o tejido. Es frecuente en laactualidad comenzar el cultivo primario liberando las células del explante tisular mediante tripsina,aunque en algunos casos se prefiere realizar esta preparación desmenuzando finamente el fragmentocon un bisturí. Los cultivos primarios están formados normalmente por diferentes tipos de células,por lo que también se les llamó cultivos mixtos.

El primer paso para llevar a cabo el cultivo es la extracción del órgano que queremos cultivar, porejemplo un riñón. Inmediatamente después del sacrificio del animal ha de extraerse el órgano ysumergirlo en PBS u otra solución salina, para que no se reseque.

El tejido es desmenuzado con ayuda de un bisturí y son llevados los fragmentos a un matraz, dondese lavan varias veces con solución salina tamponada. A continuación se lleven a un matraz detripsinización que contiene una solución al 1:500 de tripsina estéril y se incuba. La incubaciónpuede hacerse durante poco tiempo a 37 ºC (unos diez minutos) o durante 68 horas a 4 ºC.

Manteniendo en agitación la solución de tripsina, las células liberadas se mantienen en suspensión,mientras que los fragmentos mayores de tejidos se depositan en el fondo, de modo que es posiblerecoger con una pipeta el sobrenadante turbio de tripsina con células libres, y renovar sobre losfragmentos grandes la solución de tripsina.

Todos las células cosechadas en el sobrenadante son lavadas por centrifugación en PBS por tresveces, y resuspendidas finalmente en un volumen de medio de cultivo 10-20 veces superior elvolumen de células sedimentadas. Se hace un recuento en una cámara hemocitométrica y sepreparan cultivos con una densidad inicial de 3· 105 cél./ml

La solución salina diluyente de la tripsina debe estar libre de iones calcio y magnesio, ya que estosiones fortalecen el cemento intracelular.

Los cultivos se realizan en unos frascos especiales de plástico de fondo plano, llamadoscomúnmente “flasks” o “falcon”. Antes se utilizaban de vidrio, por ejemplo los frascos de Roux olos matraces tipo T de Earle.

Las células se adhieren a la superficie del vidrio o el plástico y comienzan a multiplicarse y crecerformando una monocapa. El cultivo se mantiene por renovación del medio nutritivo cada 3-4 días.Cuando la monocapa se ha extendido por todo la superficie del matraz es necesario realizar unsubcultivo, liberando las células y volviéndolas a cultivar. Los cultivos primarios suelen ser decrecimiento lento.

cultivo secundario

Cultivo secundario es el que proviene de realizar un subcultivo ya sea de un cultivo primario o deotro cultivo secundario. Se realiza para amplificar la población de células en cultivo.

Es necesario individualizar las células de la monocapa del cultivo que queremos subcultivar ydespués se resuspenden las células en medio de cultivo, se hace un recuento y se preparan losnuevos cultivos secundarios.

Tras varios subcultivos o “pases”, los cultivos primarios dan lugar a líneas celulares, quenormalmente degeneran al cabo de cierto número de pases (líneas finitas). En raras ocasiones seconsigue que la línea no degenere y se mantenga multiplicándose de forma indefinida (líneascontinuas) como consecuencia de cambios genotípicos bastante drásticos.

TÉCNICAS DE CULTIVO

Existen diversos métodos de cultivo, algunos ya tradicionales y en desuso y otros con pleno vigor.Cada modalidad de cultivo puede tener distintas finalidades.

cultivo en cubreobjetos

Los cultivos en cubreobjeto son útiles cuando se desea hacer un estudio el microscopio óptico bajocondiciones que restringen el espesor total de la preparación. Son especialmente útiles para estudiosde discriminación del efecto de productos químicos sobre las células.

El método básico consiste en cultivar un diminuto fragmento de tejido en gota pendiente sobre unporte excavado. La gota puede ser de plasma coagulado, o directamente de medio de cultivo.

En los cultivos con plasma, la coagulación de éste proporciona la consistencia necesario paramantener el fragmento de tejido en su sitio. Para dar mayor poder nutritivo el plasma, se mezcla conuna gota de extracto embrionario. En los cultivos que no emplean plasma, antes de invertir el portacon el cubreobjetos que lleva el cultivo hay que esperar 24 horas, para dar tiempo a que el cultivo seadhiera al cristal.

Si es necesario, se pueden subcultivar este tipo de cultivos realizando con una hoja muy afiladadiversos cortes, y tomando los fragmentos adecuados para su subcultivo.

cultivo en tubos y matraces

El cultivo en tubos y matraces tiene distintas utilidades que el cultivo en cubreobjetos. La superficiede crecimiento es mayor y el medio nutritivo se administra en cantidades mas grandes; esto permiteun mayor control en la composición del medio que llega a las células, y un mayor tiempo decrecimiento sin necesidad de subcultivar, que permite un estudio más continuado.

Otra utilidad es precisamente la producción de células en si misma, que es una de las aplicacionesque tiene el cultivo de tejidos y células.

Este tipo de cultivo puede, igual que el anterior, realizarse sobre plasma. Es decir que el tejido estaembebido en un coagulo semisólido y permeable que es bañado por el medio líquido que puede serintroducido y eliminado a voluntad.

Para los subcultivos, se extrae el coagulo que ha formado una fina capa sobre el fondo del matraz, yse procede a cortar el tejido con una hoja de bisturí.

Los cultivos en medios líquidos se emplean actualmente con mucha mayor frecuencia, hasta elpunto que han sustituido casi completamente a los anteriores. Estos cultivos se llevan a cabopermitiendo que el tejido se adhiera el vidrio o al plástico y que crezca por su superficie, y lossubcultivos se realizan por tripsinización.

cultivos de células en suspensión

Para muchas investigaciones, especialmente sobre fisiología y bioquímica de poblaciones de célulasanimales, es útil poder obtener muestras a intervalos durante la incubación. Es también útil poderpreparar subcultivos por simple dilución, con el menor grado de lesión para las células. Ambasoperaciones son posibles fácilmente con células que crecen en suspensión agitada. También puedeusarse para establecer cultivos estacionarios.

Como resulta muy poco practico reemplazar periódicamente el medio de cultivo, hay que prever losrequerimientos nutritivos de los cultivos y añadir a intervalos ulteriores aquellos sustancias quedesaparecen mas rápidamente del medio. Earle propuso aumentar la concentración de glucosa en losmedios utilizados para cultivos agitados, y Thomas observó que añadiendo Arg en días alternosaumenta grandemente el numero de células.

Para el cultivo en suspensión no son validas todas las células. Las que más eficazmente semultiplican son células derivadas de líneas establecidas.

técnica del subcultivo

El mantenimiento de los cultivos celulares implica el proceso de realizar los subcultivos o “pases”.El procedimiento de estos “pases” es el siguiente:

1. Se ponen a atemperar en un baño a 37 ºC el medio de cultivo, suero bovino (normalmente seemplea suero bovino fetal -SBF-) y tripsina (1:1000), cuidando de que esta no permanezca mástiempo del necesario, ya que sufre inactivación.

2. Se prepara el medio fresco, añadiendo la proporciona adecuada de SBF, entre el 5-10 %,dependiendo del tipo de células. La cantidad a preparar depende del número y tamaño de los“flask” a emplear.

3. Se tira el medio de los cultivos viejos y se añade tripsina para eliminar los restos de medio ycélulas desprendidas (lavado). La tripsina necesaria es de aproximadamente un 10-20 % lacapacidad del flask. El lavado puede realizarse también con PBS.

4. Se elimina esa tripsina y se vuelve a añadir tripsina fresca, realizando aspiraciones yexpulsiones con una pipeta estéril, hasta que se empieza a desprender el tapiz, lo que se nota porla aparición de zonas más claras, como puntas de alfiler. La tripsina rompe las uniones proteicasentre las células.

5. Se elimina la tripsina y se añade la cantidad de medio de cultivo adecuada para realizar lossubcultivos que se desee. La poca tripsina que pudiera quedar se inactiva al añadir el medio.

6. Se vuelve a realizar aspiraciones y expulsiones con la pipeta, para dispersar totalmente lascélulas.

7. Se pipetean a cada flask vacío, los mililitros necesarios de suspensión celular y se completa conmedio+suero preparado con anterioridad.

8. Se rotulan los subcultivos indicando tipo de célula, número de pase y fecha.

Hay que tener la precaución de pipetear siempre por el lado en el que no están las células, y utilizarpipetas nuevas cada vez.

Otra forma de liberar las células de la monocapa es mediante tratamiento con EDTA. Se preparauna solución 0.1 M de EDTA y se lleva a neutralidad con NaOH. Esta solución es estable atemperatura ambiente, y debe diluirse para su utilización hasta la concentración de 0.002 %.

Se realiza un lavado previo con este solución y después se cubre la monocapa con la solución deEDTA y se procede igual que en el caso de la tripsinización.

Los iones Ca2+ y Mg2+ estabilizan las uniones celulares, por lo que se recomienda que el tampón detripsinización carezca de estos cationes. Precisamente el efecto separador del EDTA consiste enquelar estos iones para desestabilizar la matriz celular, por lo que en muchos casos se utiliza unacombinación tripsina-EDTA.

conservación

Las células pueden mantenerse vivas sin una multiplicación activa importante, con fines detransporte o de conservación, en medios de cultivo exentos de extractos embrionarios o suero.

También es posible mantener viables durante años células en congelación. La congelación debe serlenta, ya que de este manera los cristales de hielo que se formen son extracelulares, mientras que sila congelación es rápida los cristales se forman el azar y son por tanto principalmente intracelulares,que pueden provocar la rotura de las células por mecanismos físicos.

El efecto protector de la glicerina consiste en que difunde bastante fácilmente el interior de la célulay tiene la capacidad de acaparar agua. Esto tiene el doble efecto de dejar menos agua disponiblepara la formación de hielo, y de mantener un cierto grado de capacidad solvente para hacer que laconcentración de electrolitos no alcance niveles letales.

protocolo de congelación/descongelación de células

1. Se lava el tapiz celular con medio fresco atemperado a 37 ºC y después se tripsinizan lascélulas para romper las uniones.

2. Se elimina la tripsina, y con nuevo medio fresco se levanta el tapiz y se resuspenden lacélulas de forma homogénea.

3. Se extrae una alícuota del medio y se hace un recuento, de forma que se puedan hacer loscálculos para conseguir una suspensión final de 3·106 cél./ml, por adición de medio decultivo, tras concentrar por centrifugación (10’/1500 rpm) si fuera necesario.

4. Se alicuota en criotubos, a razón de 1 ml por cada uno, rotulándolos con todos los datosnecesarios.

5. Se añade a cada criotubo un 10 % (100 µl) de SBF y otro 10 % (100 µl) de DMSO.

6. Se realiza una disminución progresiva de la temperatura: 4 ºC - 20 ºC - 80 ºC

7. Se pasan finalmente a nitrógeno líquido.

En este proceso es importante no congelar todas las células disponibles, por si la congelación resultamal, no perder la línea. Esto se comprueba descongelando un vial al día siguiente y comprobandoque las células recuperan su vitalidad.

Para descongelar se saca el vial y se pone en un baño a 37 ºC. Cuando se descongela, se trasvasa aun tubo de centrífuga se añaden 15 volúmenes de medio de cultivo, se centrifuga (5’/1500 rpm) yse resuspende el sedimento en medio de cultivo con SBF para su siembra. Existe el riego depenetración de nitrógeno líquido durante su almacenamiento; para evitar la explosión del vialdurante la descongelación hay que asegurarse de que se ha eliminado.Se debe calcular el número de células viables mediante recuento en homocitómetro con azul tripanal 0,2% en PBS, mezclando la suspensión celular con el colorante en proporción 1:1. Las célulasmuertas se tiñen de azul y las vivas permanecenn sin teñir.

Se pueden eliminar las células muertas centrifugando la suspensión a través de un “cojín” de suero.Las células muertas flotan sobre el suero y las vivas sedimentan.

CLONES CELULARES

Un clon es una población de células procedentes de una célula original. Son todas ellos idénticasgenéticamente.

En 1948 Sandford, Earle y Likely comunicaron la primera cepa o clon derivado de una única célulaaislada. Su procedimiento estaba basado en alimentar a la célula inicial con medio de cultivoempleado previamente en cultivos en plasma, ya que tenían la teoría de que una célula aislada nopuede crecer ni en el mejor de los medios de cultivo, ya que necesitan un acondicionamientoproporcionado por las mismas células, de forma que emplearon medio de cultivo “acondicionado”previamente.

Ahora se sabe que los cultivos iniciados a partir de una única célula tienen requerimientos nutritivosespeciales, como colesterol y oxalacetato.

La primera tarea a realizar para la obtención de un clon es el aislamiento de la célula. El primermétodo de aislamiento consistió en aspirar las células con un capilar muy fino observándolo almicroscopio.

Otro método consistía en hacer un cultivo partiendo de una concentración de una 10 cél./m1 y elcabo de un tiempo observar el cultivo el microscopio y destruir por aplicación de calor local todoslas células excepto una y a partir de ella desarrollar el clon.

LINEAS CELULARES ESTABLECIDAS

Los cultivos celulares no tienen todos una capacidad indefinida de crecimiento. Después de undeterminado número de subcultivos, estos envejecen y pierden su capacidad de multiplicarse yterminan muriendo.

Sin embargo hay determinados células que son inmortales, tienen la propiedad de multiplicarse sinque el cultivo envejezca a pesar de que se realice un gran numero de subcultivos. Estas células, unavez clonadas constituyen lo que se denominan líneas celulares establecidas, que suelen ser menosdependientes del suero en el medio.

La primera línea celular establecida fue la cepa HeLa, extraída por Gey y col. de un tumor de cérvixhumano en 1952 y denominadas así en honor de la paciente Henrietta Lacks, que falleció de dichocáncer. Esta línea sigue conservando caracteres propios y exclusivo de las células humanas, pero sunúmero de cromosomas no es de 46 y varía continuamente. Dos años después de establecer Gey lascélulas HeLa, Eagle derivo otra línea “inmortal” humana, la KB, procedente de un carcinomanasofaríngeo. La tarea de establecer nuevas líneas con células de tejido no canceroso es más difícil,aunque se ha logrado con algunas.

Las líneas celulares suelen ser depositados (el igual que las cepas de cualquier otro tipo: bacterias,protozoos ... ) en bancos de cepas, de los cuales el mas importante es el ATCC (American TypeCulture Collection).

Otras líneas celulares establecidas son por ejemplo las CV1 y BSC, de riñón de mono y quepresentan la característica de que están adaptados a crecer adheridas a superficies y detienen sucrecimiento cuando han recubierto todo el espacio libre. La BHK son fibroblastos de riñón dehámster, las células Vero son de riñón de mono, 3T3, 2T6 y 3T12 son líneas derivadas defibroblastos de ratón, con características distintas a pesar de que proceden del mismo explante.Estas características las han adquirido durante sus cultivos y subcultivos, por alguna modificacióngenética.

CULTIVO DE RUDIMENTOS DE ORGANOS

Los cultivos de tejidos organizados son un campo de gran futuro dentro de la medicina, comodeposito o fondo de órganos para transplantes, y como medio de investigación del efecto dedeterminadas sustancias, como hormonas, vitaminas... sobre los órganos.

Actualmente se están llevando a cabo con gran éxito el cultivo de explantes de piel, para sutrasplante en el mismo individuo, lo que reduce el rechazo y es de una gran utilidad en cirugíaplástica y de quemados.

CULTIVO PARA EL ESTUDIO DE VIRUS

Casi desde su comienzo los cultivos de tejidos han proporcionado un medio útil para el estudio delos virus, ya que permite eliminar el empleo de animales o plantas vivos.

Los virus deben cultivarse sobre una cepa celular sensible, así si el virus es humano deberácultivarse sobre una cepa de células humanas o tal vez de mono. Según el tipo de virus puede seraconsejable una cepa más que otra debida a las peculiaridades del virus.

La aplicación en el estudio de virus consiste en la observación de los efectos citopáticos, elaislamiento e identificación para diagnóstico, la titulación, determinación de la infecciosidad yfinalmente una aplicación muy importante es la multiplicación vírica para la producción de vacunas.

ANTICUERPOS MONOCLONALES

La producción de anticuerpos monoclonales es una de las aplicaciones mas recientes del cultivo decélulas, y que ha surgido con gran empuje debido el auge de la inmunología.

Un anticuerpo monoclonal es un Ab producido por un único clon de linfocitos, con lo que seconsigue que todos las moléculas de Ab sean iguales y la especificidad sea única.

Los Ab monoclonales son producidos por lo que se denomina hibridoma. Esta técnica fue puesta apunto por Milstein y Köhler y consiste en inmunizar un ratón frente el Ag que deseamos. De estaforma conseguimos enriquecer la población de linfocitos sensibilizados que nos interesa.

Se sacrifica el ratón y se le extirpa el bazo, macerándolo para liberar los linfocitos. Estos linfocitosson células capaces de producir Ab pero no son células inmortales, por lo que para proporcionarlesestas característica se les fusiona con una célula de un clon inmortal derivado de un linfoma deratón, de este modo se forma lo que se denomina “hibridoma”, que consiste en un célula híbridaentre un linfocito sensibilizado, que le confiere la capacidad de producir Ab, y entre una célulatumoral, que le proporciona la capacidad de multiplicar se indefinidamente.

Los hibridomas son cultivados en medio para el cultivo de células, y liberan al sobrenadante los Abmonoclonales que son recuperados y purificados.

Óscar Jodra – 2018