Curso de cultivo celular

Curso de cultivo Curso de cultivo celularcelularCurso de cultivo Curso de cultivo celularcelular

Dr. Juan Carlos Munévar Niño

BIOLOGIA DE LAS CELULAS ANIMALES in vitroin vitro

LA CELULA

Las células son altamente complejas y organizadas.

Átomos moléculas polímeros biológicos

Complejos subcelulares organelos células

Cada célula tiene una apariencia compleja: localización y forma de los organelos y cada organelo tiene una

composición consistente y similar de macromoléculas.

Ej. Células epiteliales intestinales.

Cultivos celulares: células HELA

Las células poseen un programa genético y los mecanismos para utilizarlo.

Las células se reproducen por división, proceso en el cual una célula madre da origen a dos células hijas

BIOLOGIA DE LAS CELULAS ANIMALES.

Juan Carlos Munévar N


LA CELULA Las células adquieren y utilizan energía.

En los animales la glucosa se encuentra empacada.En los humanos la glucosa es liberada por el

hígado a la sangre para distribuirse a las células del cuerpo. ATP

Las células efectúan reacciones bioquímicas: necesita energía. Metabolismo

Actividades mecánicas: transporte de materiales, ensamble y desensamble de estructuras.

Cambios dinámicos y mecánicos dentro de la célula . Desplazamiento

Las células son capaces de responder a estímulosReceptores para hormonas, factores de

crecimiento etc. Vías de señalización en respuesta a estímulos: Actividades metabólicas, división celular, movimiento celular, apoptosis, envejecimiento.

Autorregulación: reparación del DNA, apoptosis, Juan Carlos Munévar N


PROCARIOTAS- EUCARIOTAS SIMILITUDESSIMILITUDESMembrana plasmática de diseño similar

Presencia de ADN

Mecanismos de trascripción y transducción similares

Vías metabólicas compartidas: glicólisis, ciclo de krebs

Aparatos similares para la conservación de la energía química como ATP

PROTEOSOMAS

PROCARIOTAS- EUCARIOTAS DIFERENCIASDIFERENCIASDivisión de la célula en núcleo y citoplasma, separadas por una envoltura nuclear que

contiene un complejo de poros

Cromosomas complejos: ADN + proteínas asociadas

Complejos organelos membranosos citoplasmáticos: RER, Aparato de Golgi,Lisosomas, endosomas, peroxisomas, glioxisomas

Organelos citoplasmáticos especializados en la respiración aerobia

Sistema de citoesqueleto: Microfilamentos, filamentos intermedios, microtubulos

Flagelos y cilios

Endocitosis y fagocitosis

Paredes celulares que contiene celulosa

Diploidia. Meiosis

INTRODUCCION

Curso de cultivo celularCurso de cultivo celular


BIOLOGIA DE LAS CELULAS ANIMALES in vitro

INTRODUCCION ¿Validez de la célula cultivada como modelo de

la función fisiológica in vivo? Las células no expresan las

mismas propiedades in vitro que in vivo.

El ambiente celular se modifica:1. Proliferación celular2. Interacciones célula – célula, célula – matriz extracelular (M.E.C.)3. La arquitectura 3D y heterogeneidad in

vivo4. El medio nutricional y factores solubles (estímulos)(estímulos)


50 µm


Se crea un microambiente in vitro que favorece la diseminación, migración, y proliferación de células no especializadas

pero no favorece la expresión de funciones diferenciadas.

LA INFLUENCIA DEL MEDIO AMBIENTE EN UN CULTIVO

CELULAR DEPENDE DE:

1. La naturaleza del sustrato o fase.2. La composición fisicoquímica y

fisiológica del medio de cultivo.3. La constitución de la fase

gaseosa.4. La temperatura de incubación.

Proveer el ambiente apropiado: adhesión al sustrato, nutrientes, factores solubles y sustrato es fundamental para la expresión de funciones especializadas.



La regulación del fenotipo celular en cultivo esta influenciado por:

Interacciones célula – célula

Interacciones célula – M.E.C.

Factores solubles (hormonas,

factores de crecimiento,

nutrientes, iones inorgánicos)

Proveer el ambiente apropiado: adhesión al sustrato, nutrientes, factores solubles y sustrato es fundamental para la expresión de funciones especializadas.

Afectara:

La adhesión celular

La proliferación

La diferenciación

La morfología celular

La migración celular


Percepción y Transducción de señales; Cross-talk

Las principales vías de señalización se intercomunican


ADHESION CELULAR



Membrana plasmática

Bicapa fosfolipídica: compartimentos, superficie para reacciones bioquímicas esenciales.

Integridad estructural de la célula

Control del paso de sustancias: permeabilidad selectiva

Regula las interacciones entre las células

Reconocimiento por medios de Rc de Ag, células extrañas y alteradas.

Interfase entre le citoplasma y el ambiente externo.

Sistema de transporte para moléculas específicas

Efectúa transducción de señales físicas, químicas, mecánicas en acontecimientos intracelulares.




En la membrana celular existen otras moléculas anfipáticas: glucolípidos y colesterol.

Los ácidos grasos insaturados la fluidez de la membrana y el colesterol la disminuye: difusión lateral de proteínas de membrana y movilidad celular.

Proteínas Integrales: transmembrana que a menudo forman canales iónicos o sirven como transportadores. Proteínas de membrana multipaso. Receptores de membrana

Proteína de superficie: periféricas. Ubicadas sobre la cara citoplasmática de la membrana celular, en

ocasiones en la superficie extracelular. A menudo se relacionan con el sistema de segundos mensajeros o con el citoesqueleto.

COMPOSICION MOLECULAR Y BIOQUÍMICA


GLUCOCALIZ Cubierta externa de la membrana celular.

Constituida por carbohidratos unidos covalentemente a las proteínas transmembranales y a los fosfolípidos de la cara externa.

Protegen contra la interacción con proteínas inapropiadas, lesiones químicas, físicas.

Reconocimiento y adhesión entre células.Neutrófilo-EndotelioCascada de coagulación sanguíneaProceso Inflamatorio


Las células que provienen de tejidos sólidos crecen en MONOCAPA, después de la disgregación necesitan anclaje para diseminarse sobre el SUSTRATO, antes de comenzar a proliferar.

excepto las células transformadas (anclaje independientes)


ADHESION CELULAR

La adhesión celular está mediada por receptores de superficie celular específicos para moléculas de la M.E.C.

la diseminación está precedida por la secreción de proteoglicanos y proteínas de la M.E.C.

Las células en cultivo adhieren a

1. Vidrio

(carga negativa)

2. Plástico (polistireno)(descarga eléctrica radiación ionizante)



La superficie del vidrio o plástico puede condicionarse mediante:

Previo crecimiento celular

Pre - tratamiento del

sustrato

Al lograr la adhesión al sustrato las células comienzan a crecer y posteriormente proliferan.

Provee una superficie

adecuada para la

adhesión celular

Moléculas de la M.E.C.

Colágeno,Fibronectina,lam

inina, gelatina

Para las células semejantes a fibroblastos:Adhesión al sustrato

diseminaciónPara las células epiteliales:

Correcto contacto célula – célula

crecimiento

PRINCIPAL REQUISITO



TIPOS DE PROTEINAS TRANSMEMBRANALES

MOLECULAS DE ADHESION CELULAR

Interacciones célula – célula y célula M.E.C. Moléculas de adhesión celular (CAM’s)

(Ca2+ independientes)

Cadherinas

(Ca2+ dependientes)

Integrinas.

(Receptores para M.E.C.)

Proteoglicanos

(Receptores para factores de crecimiento)

INTERACCIONES ENTRE

CELULAS HOMOLOGAS

Proteínas interactivas

INTERACCIONES CELULA

SUSTRATO

Motivo RGD.

INTERACCIONES CELULA SUSTRATO



Familia de proteínas que permiten contacto célula-célula o célula-matriz extracelular.

GlicoproteínasGrupo COOH unido al citoesqueletoGrupo NH2 especificidad de unión al ligando .

MonoméricasMonoméricas (Cadherinas), diméricas,diméricas, heterodiméricasheterodiméricas (integrinas). Uniones homofílicasUniones homofílicas (Cadherinas),

heterofílicasheterofílicas (integrinas)



Selectinas: LectinasL-selectina: Leucocitos, adhesión al endotelio en procesos inflamatorios.

E-selectina: Endotelio, permite la unión de neutrófilos

P-selectina: Plaquetas y endotelio.



Funciones:Funciones: desarrollo tisular, migración celular, procesos inflamatorios e inmunológicos.


Súper familia de las Inmunoglobulinas ICAM, VCAM, pueden secretarse y anclarse a la MEC.

Integrinas: son GP de membrana, son heterodímeros, uniones covalentes.La unión del ligando-integrina resulta en reorganización del citoesqueleto, migración o división celular, apoptosis.

Β1 Integrinas: crecimiento, maduración, migración, proliferación, citotoxicidad y fagocitosis.



Β2 Integrinas: quimiotaxis del fagocito. Adhesión al endotelio.

Β3 Integrinas: permiten la unión al MEC, su ligando es colágeno o fibronectina.

Proteoglicanos: Interactúan con las proteínas de MEC y factores de crecimiento.




Tight junctions: (Zonula occludens)

Fusión de las membranas celulares como “cremallera”.Previenen el movimiento de material entre las células.

Adhering junctions: (Zonula / Macula)

- Se conserva un espacio de 20 nm entre membranas opuestas

- Ocupado por material filamentoso anclados al lado citoplásmico de la unión (Zonula adherens)

- Desmosomas, hemidesmosomas (Macula adherens)

Gap junctions: Región de unión de 2 membranas opuestas, en donde se

conserva un espacio de 3 nm. Permite el paso de iones / moléculas hidrofilicas

UNIONES INTERCELULARES


Las uniones intercelulares se clasifican según su forma y extensión:Zonula (Zonula adherens, zonula occludens)Macula (Macula occludens, macula adherens)


LA DISOCIACION ENZIMATICA DE UN TEJIDO O DE UNA MONOCAPAdigiere la M.E.C.dominios extracelulares de proteínas transmembranales

1. LAS CELULAS EPITELIALESSon resistentes a la disociación

enzimáticaPoseen fuertes uniones intercelulares

Desmosomas, uniones adherentes, uniones estrechas

Las células deben volver a sintetizar las proteínas de la M.E.C. antes de adherirse o debe incorporarse un sustrato revestido con M.E.C

2. LAS CELULAS MESENQUIMATOSASSon fáciles de disociar enzimáticamente

Dependen de interacciones con la M.E.C.Colágeno, fibronectina, entactina, laminina, nidogéno, etc.

Las moléculas de adhesión celular están unidas a elementos del citoesqueleto.

Red de filamentos proteicosRed de filamentos proteicos que presenta funciones mecánicas;

1. Mantener la forma celular, 2. Movimiento celular,3. Desplazamiento intracelular

organélos

CITOESQUELETO



Sus estructuras principales son: Microtúbulos Filamentos intermedios Microfilamentos

CITOESQUELETO


Integrinas.

Microfilamentos de ACTINA

CadherinasMicrofilamentos de ACTINA

Filamentos intermedios.

(Placa intracelular)

ADHERENS JUNCTIONS

Morfología celular

DESMOSOMAS

¿Estructural / Señalización?

SEÑALIZACION

Superficie celular - Núcleo


MICROTUBULOS Se encuentran dispersos en el

citoplasma, o formando estructuras estables como cilios, flagelos o centríolos.

Pueden formarse y destruirse según las necesidades de la célula.

Tubulina, (a-tubulina y b-tubulina) protofilamento, y cada microtúbulo consta de 13 protofilamentos paralelos que forman un cilindro



MICROTUBULOS Brindan rigidez y conservan la forma celular

Regulan el movimiento intracelular de organelas y vesículas

Contribuyen a formar los compartimentos intracelulares

Constituyen el huso mitótico, responsable de organizar el movimiento de los cromosomas durante la división celular

Distribuyen el retículo endoplásmico y aparato de Golgi en los lugares apropiados

Son los elementos estructurales y generadores del movimiento de cilios y flagelos (MOVIMIENTO CELULAR)


FILAMENTOS INTERMEDIOS FUNCIONES:

° brindar sostén estructural a la célula. ° resistencia tensil.° protección celular contra las presiones y las tensiones.

Específicos de líneas celulares. (Marcadores)

ق Queratina (células epiteliales), ق Vimentina (células mesenquimatosas),ق Desmina (células musculares)ق Filamentos de la lámina nuclear (Refuerzan la

membrana nuclear)ق Neurofilamentos (ubicados en células nerviosas), etc.



MICROFILAMENTOS Filamentos delgados

(microfilamentos)

Formados por dos cadenas de subunidades globulares, actina G, enrolladas entre sí para formar una proteína filamentosa o actina F.



ACTINA Contracción muscular, al asociarse a

filamentos de miosina y otras proteínas.

Fagocitosis mediante la formación de seudópodos

Citocinesis: forman el anillo contráctil que finalmente da lugar a la separación de las células hijas durante la mitosis

Refuerzan la membrana plasmática, formando justo por debajo de la misma una densa red de filamentos conocida como cortex celular



PROLIFERACION CELULAR



G1

G0

6-8 h

ADN, ARN, Proteína

3-4 h

ARN, Proteína

1 h

Mitosis, Cytocinesis

S

G2 Cyc D’sCDK4,6

Cyc B/ACDK1

Cyc ACDK2

M

Cyc ECDK2

6-12 h ARN, Proteína

p53pRb

LaminaH1Abl

CICLO CELULAR



pRbpRb

CDK2

CE

E2FEnzimas para síntesis DNA

Paso de G1 a S

Daño al DNA

1. fosforilación CDC

2. Degradación ciclinas

3. C & CDK síntesis

4. Inhibición CDC

pRbpRb

P

Activa p53

p21

pRb

REGULACION DEL CICLO CELULAR


CICLO CELULAR


La capacidad de renovación celular está relacionada con su potencial de diferenciación.

Clasificación de acuerdo a la capacidad

de PROLIFERACIÓN

1. CELULAS LABILES.

2. CELULAS ESTABLES.

3. CELULAS PERMANENTES.

DIFERENCIACION CELULAR



DIFERENCIACIÓN CELULAR

La expresión de propiedades diferenciadas en cultivo celular a menudo depende de la promoción de la proliferación celular.

* Necesario para propagar la línea celularNecesario para propagar la línea celular

* La expansión de stocks para el laboratorio* La expansión de stocks para el laboratorio

Condiciones para inducir diferenciación in vitro:* Elevada densidad celular* Elevada densidad celular

+ Promoción de interacciones célula – célula / célula – + Promoción de interacciones célula – célula / célula – M.E.C.M.E.C.

* Factores de diferenciación.* Factores de diferenciación.



CONDICIONES REQUERIDAS PARA LA DIFERENCIACION

1. Optimizar la proliferación celular

2. Optimizar la diferenciación celular

CONDICIONES REQUERIDAS PARA LA DIFERENCIACION

1. Optimizar la proliferación celular

2. Optimizar la diferenciación celular

DIFERENCIACIÓN CELULARMecanismo por el cuál una célula

adquiere un fenotipo específico.La morfología de una célula varia, pero el

material genético permanece intacto.Las células madre primordiales o Stem

cells definidas como células clonogénicas + capaces de auto-renovarse

+ de diferenciarse en múltiples líneas celulares según el estímulo recibido



Thomson y col. 1998. Embryonic stem cells lines derived from human

blastocysts. SCIENCE.

Autorenovación ilimitada. Potencial de diferenciación

Stem cells: Scientific progress and future research directions. NIH, 2001

In situ. In vitro.

Las células madre responden a señales externas

Células vecinas

Factores solubles

CELULAS MADRE BIOLOGIA DE LAS CELULAS ANIMALES in vitro

CELULAS MADRE

TOTIPOTENCIALES: es decir, que pueden dar lugar a todo un individuo

PLURIPOTENCIALES: capacidad de una célula para convertirse en todas las posibles líneas celulares.

MULTIPOTENCIALES: capacidad de generar células, pero sólo del tipo celular del tejido al que pertenecen o en donde residen



Embrionarias

Germinales Embrionarias

Adultas

Stem cells: Scientific progress and future research directions. NIH, 2001

STEM CELLS BIOLOGIA DE LAS CELULAS ANIMALES in vitro

DIFERENCIACIÓN El citoplasma de una célula puede contener moléculas

que controlen los genes expresados en el núcleo. Generar señales para la síntesis de diferentes clases de

proteínas y factores de transcripción.


Proteínas intracelulares

Destino celular Auto-renovación

Factores de transcripción

Expresión individual.

RELOJES

(+) cul-1 C. elegans

(-) CDK inhibidor p27/Kip1

Act. telomerasa

FACTORES DE TRANSCRIPCION

Ovario de Drosophila: Ovario de Drosophila:

incs, espectrosoma (espectrinas y ciclina A)incs, espectrosoma (espectrinas y ciclina A)Mamíferos: CSL/tal-1, Tcf/Lef. Mamíferos: CSL/tal-1, Tcf/Lef.

CONTROLES EXTERNOSCONTROLES EXTERNOS-Factores secretados: TGFß y Wnts-Interacciones célula - célula-Integrinas y matriz extracelular

CONTROLES INTERNOSCONTROLES INTERNOS

M. Fiona, y col. Out of Eden: Stem cells and their niches. Science 2000 287: (25). 1427-1430

MECANISMO INVARIANTE

División asimétrica

Células Stem Progenitores

M. Fiona, y col. Out of Eden: Stem cells and their niches. Science 2000 287: (25). 1427-1430

DIFERENCIACIÓNAUTORENOVACIO

N

MECANISMO REGULADO

Células Stem Progenitores

División simétrica


IMPLICACIONES CLINICAS


Resultado

Obtener células madre

para la investigación y

terapia


para la investigación y

terapia


genéticamente compatibles con un receptor para la investigación

y terapia

Producir embriones

para implantarlos

in utero

Aislar células madre de

tejidos fetales y adultos

Células de embriones o estado de

blastocisto de fertilización in

vitro

Células de un blastocisto

desarrollado de un cigoto enucleado

suplementado con un núcleo de una célula somática del pcte (SCNT)

Cigoto enucleado

con núcleo de una célula

somática del donante(SCNT)

Células producidas en cultivo para repoblar un

tejido enfermo o lesionado





Embriones derivados de

un cigoto, implantado y

evaluado

Uso

Fuente

Células madre

fetales y adultas

Células madre

embrionarias

Células madre embrionarias producidas por técnica SCNT

Clonación: embriones producidos por técnica

SCNT



DESDIFERENCIACION

La incapacidad de las líneas celulares de expresar el fenotipo in vivo de las células de donde derivan:

Las células diferenciadas pierden sus propiedades especializadas in vitro.

Las células indiferenciadas de la misma línea originan células terminales diferenciadas con capacidad proliferativa reducida.

La ausencia de estímulos apropiados causan desadaptación.

•La continua proliferación selecciona los precursores indiferenciados.

•En ausencia de un microambiente inductor adecuado no se diferencian.



DESDIFERENCIACION Desdiferenciación

Pérdida irreversible de las propiedades especializadas de la célula

Hepatocito pierde enzimas características (aminotransferasas) y no

almacena glicógeno ni secreta proteínas séricas.

Desadaptación

Síntesis de productos específicos o la expresión de funciones

especializadas reguladas pueden reinducirse si se crean las

condiciones adecuadas.

Presencia de una matriz de colágeno induce la tirosina

aminotransferasa en hepatocitos

El Matrigel estabiliza el fenotipo diferenciado de los hepatocitos.

Selección.Establecer las condiciones adecuadas para favorecer la proliferación

de un tipo celular específico.

Incapacidad de expresar las propiedades de los hepatocitos por

crecimiento de fibroblastos o endotelioJuan Carlos Munévar N

METABOLISMO ENERGETICO



La mayoría de los medios de cultivo contienen 4 a 20 mM de glucosa, utilizado como la principal fuente de carbono para la glicólisis.

genera ácido láctico como producto final.


METABOLISMO ENERGETICO

En ausencia de un transportador apropiado (hemoglobina) que mantenga la tensión de O2

Se generan ROS tóxicos para la célula

En condiciones normales de

cultivo

1. Oxígeno atmosférico

2. Cultivo sumergido

El O2 se conserva a niveles atmosféricos, generando condiciones anaeróbicas y la glicólisis para el metabolismo energético.



El uso de dipéptidos (glutamil-alanina / glutamil–glicina)Minimiza la producción de amoníaco Es más estable en el medio de cultivo.

El ciclo del ácido cítrico permanece activo

Los aminoácidos

Glutamina; Pueden

utilizarse como fuente de

carbono

Oxidación de glutamato por la glutaminasa.

Entrada en el ciclo de Krebs por transaminación a 2- oxoglutarato

La desaminación de la glutamina produce amoniaco

tóxico para la célula,

limitando el crecimiento celular



Las células normales tienen un número limitado de mitosisLas líneas celulares derivadas de tejidos normales mueren

después de un número limitado de divisiones

Evento determinado genéticamente:

SENESCENCIA

EXCEPCIONES:1.1. LAS CELULAS GERMINALESLAS CELULAS GERMINALES2.2. LAS CELULAS MADRE (STEM CELLS)LAS CELULAS MADRE (STEM CELLS)3.3. LAS CELULAS NEOPLASICAS.LAS CELULAS NEOPLASICAS.

Determinado por la incapacidad de replicarse las secuencias terminales del ADN en el TELOMERO en cada división celular

Acortamiento progresivo del TELOMERO

Finalmente la célula no puede dividirse

SENESCENCIA

Actividad Telomerasa +

Los telómeros representan secuencias repetitivas de ADN que se encuentran en los extremos de los cromosomas.


Humanos ATTAGGG Estabilidad a los cromosomas “Antipegajoso"

TELOMERASA Ribonucleoproteína

Función:

Síntesis y adición de secuencias teloméricas.

SENESCENCIABIOLOGIA DE LAS CELULAS ANIMALES in vitro

CONCLUSIONES





CONCLUSIONESTrabajar en condiciones estándar (componentes celulares)(componentes celulares)

Células finitasCélulas finitasLíneas celulares de proliferación continúa.Líneas celulares de proliferación continúa.

Capacidad de expresar marcadores de diferenciación celular bajo la influencia de condiciones inducidas puede significar:

Las células cultivadas son maduras

Requieren inducción para sintetizar proteínas especializadas

Las Stem cells o células precursoras.

Proliferan indefinidamente permaneciendo indiferenciadas hasta aplicar las condiciones inductoras adecuadas para adquirir un fenotipo especifico En un cultivo celular se mantiene un equilibrio entre

Células madre multipotentesCélulas madre multipotentesCélulas precursoras comprometidas pero Células precursoras comprometidas pero

indiferenciadas.indiferenciadas.Células maduras diferenciadasCélulas maduras diferenciadas

Condiciones ambientales



CONCLUSIONES Subcultivos en serie a bajas densidades celularesSubcultivos en serie a bajas densidades celulares Promueven la proliferación celularPromueven la proliferación celular

Restringen la diferenciación celular.Restringen la diferenciación celular.

LA IDENTIDAD DE LAS CELULAS EN CULTIVO DEPENDE DE:Línea celular in vivo

(hepatocitos, epidermis, cartílago)La posición dentro de la línea celular

(Stem cell, célula precursora, célula madura)

Subcultivos en serie a elevadas densidades celulares, < Subcultivos en serie a elevadas densidades celulares, < [suero]°[suero]°

Promueven la diferenciación celularPromueven la diferenciación celularInhiben la proliferación celular.Inhiben la proliferación celular.

La fuente del cultivo determina los componentes celulares presentes: EmbriónEmbrión Células madre y precursoras AUTORENOVACION Células madre y precursoras AUTORENOVACION TejidosTejidos Células lábiles / estables Células lábiles / estables RENOVACION LIMITADA RENOVACION LIMITADA

Células precursoras comprometidasCélulas precursoras comprometidas



CONCLUSIONES

LAS CELULAS TRANSFORMADAS: (Neoplásicas)Hepatoma (rata)

Proliferan in vitroExpresan aspectos de diferenciación.

A mayor similitud con células de fenotipo normalMayor grado de diferenciación inhibirá la proliferación

No es probable que las células se transdiferencienPosiblemente cambian de posición en la línea celular.

(reversiblemente)

EL ÉXITO EN EL MANEJO DE LOS PROTOCOLOS DE CULTIVO CELULAR EL ÉXITO EN EL MANEJO DE LOS PROTOCOLOS DE CULTIVO CELULAR DEPENDE EN GRAN PARTE DE LA COMPRENSION DEPENDE EN GRAN PARTE DE LA COMPRENSION DE LA BIOLOGIA DE LA BIOLOGIA

DE LAS CELULAS ANIMALES in vitro.DE LAS CELULAS ANIMALES in vitro.


¡GRACIAS!¡GRACIAS!


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