Manual de Cultivo Celular en Investigación · 2017. 10. 18. · El cultivo celular es el proceso...
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Manual de Cultivo Celular en Investigación Diego Herrera Estudiante de XI° Colegio San Agustín Dr. Gerald Moncayo Investigador de INDICASAT 2017
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Manual de Cultivo Celular en Investigación
Diego Herrera
Estudiante de XI° Colegio San Agustín
Dr. Gerald Moncayo
Investigador de INDICASAT
2017
Prólogo
El propósito de este manual de técnicas de cultivos celulares es brindar al estudiante de
nivel medio de un recurso útil para el aprendizaje de cultivos celulares. Es un complemento
a la pasantía en un laboratorio de investigación biotecnológica y constituye una manera de
fomentar el interés en las ciencias y en la investigación.
Las investigaciones actuales en bioingeniería y biotecnología son el futuro de la Medicina
ya que hace falta mayor investigación para poder avanzar en la reconstrucción y reemplazo
de órganos y tejidos.
El tener la oportunidad de aprender todas las actividades relacionadas con el cultivo celular
y poder visualizar las oportunidades de investigación con un equipo multidisciplinario de
investigadores y con equipos de alta tecnología es muy importante para jóvenes orientados
al estudio de la ciencia y la tecnología.
Contenido
Capítulo I Consideraciones éticas en la Investigación con Cultivos Celulares
Capítulo II Normas de Bioseguridad, asepsia, antisepsia y esterilización
Capítulo III Equipos e insumos necesarios para un laboratorio de cultivo celular
Capítulo IV Cultivos Celulares Primarios y Líneas Celulares
Capitulo V Aplicaciones de los cultivos celulares
Glosario
Capítulo I
Consideraciones éticas en la Investigación con Cultivos Celulares
Objetivos:
1. Que el estudiante reconozca las responsabilidades éticas que se tienen cuando se
trabaja con células con fines de investigación.
2. Que el estudiante investigue sobre las regulaciones internacionales y nacionales
para la investigación con cultivos celulares.
El cultivo celular es el proceso mediante el cual ciertas células son cultivadas en condiciones
controladas. Se pueden obtener células idénticas por lo que los cultivos celulares permiten
disponer de diversos tipos celulares especializados que son supremamente útiles en la
investigación en cáncer. Las células pueden ser almacenadas en nitrógeno líquido de forma
indefinida y permite la experimentación con un gasto mínimo en fármacos o agentes en
estudio.
Aun cuando la experimentación con cultivos celulares no tiene las mismas consideraciones
éticas y legales que regulan los estudios con animales de experimentación o los estudios
clínicos con humanos, se deben seguir ciertas normativas.
Para la obtención de las muestras en humanos es importante que la persona apruebe el uso
de su tejido mediante un documento de consentimiento informado. Cualquier información
que identifique al paciente debe ser manejada de forma confidencial y no incluirla a menos
que sea esencial para el flujo de información. En animales, hay regulaciones cuando se
toman biopsias de animales vivos, cuando se le administran sustancias o cuando se pretende
introducir alteraciones genéticas en animales, introduciendo células en trabaja con
animales un embrión animal o en un animal vivo.
La Declaración de Helsinki establece que toda investigación biomédica debe basarse en
principios científicos y asociarse a una extensa revisión bibliográfica. Debe redactarse un
protocolo donde se expliquen objetivos, beneficios y riesgos de la experimentación. Además
el protocolo debe ser aprobado por un Comité de Bioética Institucional.
Todas las guías éticas utilizadas se basan en los Cuatro Principios de Beauchamp y
Childress:
1. Respeto a la Autonomía: Se basa en respetar las capacidades para la toma de decisiones
de las personas, luego de un amplio proceso de información sobre las diversas opciones y
reconociendo su autonomía.
2. Beneficiencia: Siempre se debe pensar primero en el beneficio de las personas luego de
considerar el beneficio de una intervención así como los riesgos y costos.
3. No maleficiencia: No se debe causar daño al individuo. Aunque ciertos procedimientos
representan un riesgo, éste no debe ser mayor que los beneficios de la intervención.
4. Justicia: Los individuos en situaciones similares deben ser tratados en forma similar,
distribuyendo beneficios, riesgos y costos apropiadamente.
Estados Unidos, Canadá y el Reino Unido son algunos países cuyas legislaciones garantizan
la trazabilidad de todos los tejidos y células obtenidos, distribuidos y almacenados en sus
territorios. Todavía en Centroamérica y Panamá la legislación es limitada en esta materia.
Actividades sugeridas
Realizar lecturas de bioética en experimentación animal y humana.
Realizar lecturas sobre beneficios y riesgos de las investigaciones en cultivos
celulares.
Bibliografía
1. htttp://www.ukcen.net/ethical_issues/ethical_frameworks/the_four_principles_of_bi
omedical_ethics
2. Gerraghty RJ, Capes-Davis A , Davis JM , Downward J, Freshney RI, Knezevic I,
Lovell-Badge R, Masters JRW, Meredith J , Stacey GN, Thraves P, Vias M
Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. British Journal of Cancer
(2014) 111, 1021–1046 doi: 10.1038/bjc.2014.166
3. UKCCCR Guidelines for the Use of Cell Lines in Cancer Research. British Journal
of Cancer (2000) 82(9), 1495–1509 doi: 10.1054/ bjoc.1999.1169
4. Berger J. Current ethical problems in cell biology. J Appl. Biomed (2005) 109-113.
Capítulo II
Normas de Bioseguridad, Asepsia, Antisepsia y Esterilización
Objetivos:
1. Que el estudiante conozca las normas de bioseguridad de un laboratorio donde se
realizan cultivos celulares.
2. Que el estudiante conozca la importancia de mantener una técnica aséptica en el
laboratorio de cultivos celulares para evitar contaminaciones.
El establecer un código de práctica segura y mantener normas de conducta en los laboratorios
de cultivos celulares permite trabajar en un ambiente seguro evitando peligros y riesgos para
el personal y manteniendo los cultivos libres de contaminantes. Para el manejo seguro de los
cultivos celulares es necesaria una valoración adecuada de los riesgos, una buena
organización del trabajo y la aplicación de los principios de las buenas prácticas en el
laboratorio.
Para trabajar en un laboratorio hay que conocer la clasificación de los niveles de bioseguridad
de los laboratorios. Esta clasificación comprende 4 niveles de bioseguridad y está basada en
las características de diseño, construcción, medios de contención, equipo, prácticas y
procedimientos de operación necesarios para trabajar con agentes patógenos de riesgos
distintos.
Nivel 1
En este nivel se trabaja con agentes que presentan un peligro mínimo para el personal del
laboratorio y para el ambiente. En este nivel no se requiere equipo especial ni tampoco un
diseño específico de las instalaciones. Incluye ciertos tipos de virus y bacterias de baja
patogenicidad así como algunos cultivos de células. Los procedimientos de
descontaminación para este nivel son básicos como lavarse las manos con jabón
antibacteriano y lavar todas las superficies expuestas del laboratorio con desinfectantes.
Nivel 2
Es similar al nivel 1 y en él se manejan agentes de peligro moderado hacia el personal y el
ambiente, pero difiere del nivel 1 en que el personal de laboratorio tiene entrenamiento
específico en el manejo de agentes patógenos, el acceso al laboratorio es restringido cuando
se está realizando algún trabajo, se toman precauciones extremas con instrumentos
punzocortantes contaminados y se trabaja en gabinetes de trabajo biológico cuando hay
procedimientos generadores de aerosoles o salpicaduras.
Nivel 3
Este nivel incluye a los laboratorios clínicos, de diagnóstico, algunos laboratorios
universitarios y también de investigación en los que se trabaja con agentes biológicos que
pueden causar una enfermedad grave en el hombre y representan un serio peligro para los
trabajadores, con riesgo de que se propague a la colectividad y existiendo generalmente una
profilaxis o tratamiento eficaz.
El laboratorio cuenta con un diseño y características especiales y todos los materiales son
manipulados utilizando vestimenta y equipo de protección personal. El personal de
laboratorio tienen una formación específica en el manejo de patógenos y agentes
potencialmente letales, y son supervisados por científicos competentes con experiencia en el
trabajo con estos agentes. Todos los procedimientos que implican la manipulación de
materiales infecciosos se llevan a cabo dentro de los gabinetes de seguridad biológica,
campanas de diseño especial, u otros dispositivos de contención física, o por personal que
use el equipo de protección personal y equipos.
Nivel 4
Este nivel es el que se utiliza para trabajar con agentes biológicos que representan un alto
riesgo individual de contagio y que además son muy perjudiciales para la vida. El personal
de estos laboratorios cuenta con entrenamiento específico en el manejo de agentes
infecciosos y cuentan con entrenamiento para trabajar en el ambiente estéril y controlado de
los mismos. En este laboratorio se utilizan trajes especiales que cubren la totalidad de sus
cuerpos . Los laboratorios están en áreas controladas y se mantienen con una presión de aire
negativa, lo cual ayuda a impedir que los agentes nocivos escapen al ambiente.
En el laboratorio de cultivo celular, el apego a las técnicas de asepsia y antisepsia ayuda a
eliminar los riesgos de contaminación ya sea por bacterias, hongos, levaduras o micoplasma.
La asepsia y antisepsia comprenden una serie de procedimientos destinados a evitar o
disminuir la contaminación como los son el lavado de manos, el uso de guantes, mascarilla,
lentes, bata, etc. Es de suma importancia lavarse las manos antes, durante y después del
trabajo con cultivos. Se debe hacer uso de bata, guantes, mascarilla y lentes protectores.
Hay que trabajar siempre con material estéril (pipetas, puntas) y abrirlo dentro de la campana
de flujo laminar. No se sebe utilizar la campana como área de depósito. En caso de
contaminar algo involuntariamente se debe alertar al responsable del laboratorio, para hacer
los correctivos y evitar afectar a otros usuarios del laboratorio.
La superficie de trabajo debe estar limpia y ordenada. Hay que limpiarla con alcohol al
70%. Sólo colocar en la mesa el material para utilizar en el procedimiento. Tener una
superficie de trabajo al centro, libre de equipos y cosas que puedan contaminar. Si algo se
derrama, hay que limpiarlo inmediatamente con alcohol. La mesa de trabajo y las campanas
se descontaminarán antes y después de trabajar con material biológico. Cualquier material
biológico derramado deberá ser descontaminado inmediatamente.
En la manipulación de cultivos celulares deberán minimizarse todas las tareas que
contribuyan a la formación de aerosoles y hay que evitar las salpicaduras. El uso de agujas y
otros dispositivos cortantes se debe limitar si hay otras alternativas.
Es necesaria la existencia de normas para la descontaminación de todos los materiales
utilizados en relación con los cultivos celulares . Es importante adoptar procedimientos de
separación que prevengan la transmisión accidental de agentes infecciosos de un cultivo a
otro.
Se deben utilizar frascos de cultivo sellados siempre que sea posible, especialmente para
cultivos por largo tiempo. No se debe verter medio de cultivo sino utilizar pipetas. Se deben
mantener los recipientes abiertos el menor tiempo posible.
Se deben limpiar las incubadoras en forma periódica. El agua de los baños usados para
atemperar los medios debe ser cambiada periódicamente. Los frascos deben secarse
cuidadosamente antes de usarse. Los contenedores de pipetas de desecho y otros
contenedores de basura deben ser vaciados en forma diaria
El laboratorio debe mantenerse limpio y en orden.
Actividades sugeridas
Identificar los diferentes tipos de agentes biológicos que pueden poner en riesgo al
personal que trabaja en un laboratorio de cultivo celular.
Describir los tipos de protección que se deben tener al vestir y manipular sustancias
en los laboratorios biomédicos
Consultar el manual de bioseguridad para laboratorio de investigación biomédica
de INDICASAT.,
Realizar una visita guiada a un laboratorio de cultivo celular para conocer los
equipos e insumos con los que se trabaja.
Solicitar una pasantía en un laboratorio de cultivo celular.
Bibliografía
1. Freshney RI. Culture of animal cells, a manual of basic technique. Wiley;
2005.Referencias:
2. Manual de Bioseguridad de INDICASAT disponible en indicasat.org.pa/wp-
content/uploads/2017/.../MANUAL-de-bioseguridad-V-21.0.pdf 3. Manual de Bioseguridad del ICGES disponible en
http://www.saladesituacion.gob.pa/index.php?option=com_content&task=view&id
=31&Itemid=61
Capítulo III
Laboratorio de Cultivo Celular: Equipos e Insumos
Objetivo:
1. Que el estudiante sea capaz de conocer y utilizar adecuadamente los diferentes
equipos que se utilizan en un laboratorio de cultivo celular.
El equipamiento básico de un laboratorio de cultivo celular comprende:
1. Incubadora de CO2
2. Campana de Flujo laminar
3. Microscopio Invertido
4. Centrífuga
5. Congeladores e instalación de criogenia
6. Baño termostático
Incubadora de CO2
Es una cámara con condiciones controladas cuyo propósito es conservar los cultivos en un
ambiente adecuado para su crecimiento. Las incubadoras se clasifican de acuerdo a la
temperatura a la cual operan, la composición atmosférica utilizada, si tienen o no agitación,
y el tipo de ambiente (húmedo o seco). La mayoría de las células de mamífero en cultivo,
requieren una incubadora con ambiente húmedo, sin agitación, con 5% de CO2, a 37° C.
Tanque de CO2
Campana de Flujo Laminar
La campana de flujo laminar es una cabina con circulación limitada que proporciona un
área libre de partículas o de probables contaminantes que puedan alterar el producto con
el cual se trabaja, afectar la salud del usuario o contaminar al medio ambiente. El flujo
laminar se consigue mediante un motor ventilador de impulsión de aire controlado, un
distribuidor de aire y un filtro HEPA (High Efficiency Particulate Air).
Se debe limpiar la superficie de trabajo con alcohol etílico al 70%. Hay que descontaminar
el material que se introduce en la cabina. Al finalizar el trabajo, la superficie de trabajo se
debe limpiar con alcohol etílico al 70%.
Microscopio Invertido
Es el que se utiliza de forma rutinaria para examinar los cultivos celulares. El control de la
morfología de las células se realiza mediante el uso de un microscopio. El hecho de que las
muestras a observar se encuentren en recipientes gruesos hace que un microscopio
convencional no sea adecuado. Por lo tanto, se utiliza un microscopio que se denomina
invertido ya que a diferencia del microscopio convencional, este microscopio tiene los
objetivos abajo y la iluminación proviene de arriba. Es un microscopio compuesto, ya que
la imagen se forma mediante la utilización de tres sistemas de lentes: el condensador, los
objetivos y el ocular.
Las células se observan con ausencia de color, y con poco contraste. El microscopio se
equipa con el dispositivo de contraste de fases, de esta forma el contraste de la imagen
aumenta y la calidad obtenida es muy superior. Es útil disponer de un dispositivo de
captación de imágenes, fotográfico o de video acoplado al microscopio a fin de documentar
el estado de los cultivos.
Centrífuga
En el laboratorio de cultivo de tejidos es necesario disponer de una centrífuga refrigerada,
preferentemente con posibilidades de usar en ella desde tubos de pequeño volumen (1 a 2
ml) a botellas de gran capacidad (250 a 500 ml) Se debe instalar alejada de las cabinas de
flujo laminar. La centrífuga refrigerada a 4° C se utiliza para separar las células del medio
de cultivo o solución amortiguadora de lavado en una suspensión celular. La velocidad no
puede ser muy alta ya que las células podrían lisarse, y el aumento de la fuerza de gravedad
en el proceso de centrifugación induce un aumento de calor en la suspensión celular que
también podría dañarlas. Toda centrífuga requiere mantenerse limpia y libre de residuos,
para eliminar potenciales fuentes de contaminación. Los tubos que se utilicen deben resistir
la fuerza centrífuga que se aplique y su colocación debe ser de forma equilibrada.
Congeladores e instalación de criogenia
Los congeladores y la instalación de criogenia deben ubicarse en un área separada a la
unidad de cultivo ya que los ventiladores y compresores son una fuente de contaminación
en el laboratorio. Se requiere almacenar soluciones y células a diferentes temperaturas por
lo que se necesitan: neveras (4ºC) para el almacenamiento de medios y sueros,
congeladores de -20ºC para el almacenamiento de suero, aditivos y soluciones enzimáticas,
congeladores de -80ºC para el almacenamiento a largo plazo de los aditivos del medio de
los factores de crecimiento, y una unidad de almacenamiento en nitrógeno líquido (-
196ºC), para el almacenamiento de las líneas celulares.
Baño termostático
El baño termostático es útil para mantener una solución a una temperatura constante. En
cultivo celular se usan a 37°C.
Insumos
1. Recipientes
Existen diferentes recipientes para el cultivo de células. La elección del recipiente va a
depender de las células que se deseen cultivar y de la escala deseada. Generalmente se
inicia con cultivos a pequeña escala. Por ejemplo, en un recipiente típico de 175cm2
pueden obtenerse aproximadamente 1x107 células adheridas, y unas 1x108 células cuando
se trata de líneas que crecen en suspensión. Hay que tomar en cuenta que en estos frascos
no es posible producir cantidades mayores de células, dada la cantidad de tiempo
consumida para los repetidos pases necesarios, la demanda de espacio en la incubadora y el
costo de los insumos. Existen muchos sistemas para escalar los cultivos celulares como lo
son los arreglos de frascos triples y botellas cilíndricas. En todos los casos, es necesario
asegurar el correcto intercambio gaseoso y la disponibilidad de nutrientes.
2. Medios de Cultivo
El más utlilizado es el DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium )
3. Cámara de Neubauer
Se trata de un portaobjetos con una depresión en el centro que está hundida 0.1 mm
respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos el volumen
comprendido entre la superficie y el cubreobjetos es de 0.1 milímetro cúbico. Por lo que si
se cuentan cuatro áreas sombreadas (L) observando un total de x células entre las cuatro
áreas, la concentración en la suspensión celular es (células / mL) = 10000 (x/4)
4. Pipetas Automáticas
Las pipetas automáticas son dispositivos que se caracterizan por carecer de depósito y se
utilizan principalmente para medir o transvasar pequeños volúmenes de líquido de un
recipiente a otro con gran exactitud.
Actividades sugeridas
Realizar una revisión de los aspectos de seguridad en el uso de los equipos para
cultivo celular.
Observar el video sobre uso de centrífuga y pipetas automáticas en
https://www.youtube.com/watch?v=3aM4QomtW5g
Realizar un poster sobre los equipos más utilizados en cultivo celular
Referencias:
1. https://sctsaiumu.wordpress.com/trabajo/instalacion-e-instrumentacion/
2. http://www.monografias.com/trabajos35/laboratorio-biotecnologia/laboratorio-
biotecnologia.shtml
3.http://www.ibt.unam.mx/embrion/002.Docencia/002.B.FolderTutoriales/TutorialBioDes/
P%87ginasTutorialBioDes/1.2.BioDes.InstalEquip.html
Capítulo IV Cultivos Celulares Primarios y Líneas Celulares
Objetivos:
Que el estudiante reconozca los principales aspectos en la obtención de un cultivo
primario.
Que el estudiante pueda desarrollar cultivos y líneas celulares a partir de células
mesoteliales peritoneales de ratón.
El cultivo celular es un modelo de estudio in vitro constituido por células que pueden
mantenerse o crecer en monocapa o suspensión por más de 24 horas en condiciones
controladas. Además, las células pueden mantenerse viables en un congelador por un
tiempo prolongado.
Los cultivos celulares pueden ser obtenidos por la propagación de células que migraron de
un fragmento de tejido o por la dispersión enzimática o mecánica de un tejido, o de fluidos
corporales como la sangre, líquido pleural o líquido peritoneal.
Existen dos categorías de cultivo celular: el cultivo primario y la línea celular. El cultivo
primario está formado por células indiferenciadas que se diferenciarán en forma similar al
tejido que les dio origen. El cultivo primario es el inicio de una serie de procesos selectivos
que pueden dar lugar a una línea celular uniforme y con una capacidad ilimitada de
proliferación. Con las líneas celulares pueden realizarse múltiples pasajes o subcultivos. En
estos subcultivos deben persistir las propiedades conferidas por diferencias en la dotación
cromosómica, por mutación o por trasformación genética
Un cultivo primario está constituido por células seleccionadas con base a su capacidad para
migrar de un fragmento de tejido, o bien, a su capacidad para sobrevivir a la técnica de
disgregación y adherirse al sustrato. Después de obtener la muestra, un cultivo primario
puede lograrse permitiendo que las células migren a partir de un fragmento de tejido
adherido a un sustrato adecuado o mediante la disgregación del tejido mecánica o
enzimáticamente, para producir una suspensión celular. El procedimiento más sencillo de
disgregación tisular es por métodos enzimáticos, a partir de una solución de tripsina o
tripsina/EDTA, donde se pueden agregar otras proteasas.
Una vez que las células del cultivo primario llenan el recipiente donde estaban creciendo,
se realiza un primer subcultivo, que consiste en tomar una muestra de esas células y
ponerlas a crecer en otro recipiente.
Cuando se transfieren células de un recipiente de cultivo a otro, ellas tienen que volver a
adherirse antes de proliferar, por lo que secretan proteínas de adhesión denominadas CAMs
(cell-cell adhesion molecules) y moléculas dependiente de calcio denominadas cadherinas,
que participan en interacciones entre células homólogas. Para las interacciones célula-
sustrato secretan unas moléculas denominadas integrinas y proteoglicanos. La adhesión
célula-célula en los tejidos está mediada por una variedad de moléculas deadhesión,
algunas de las cuales son dependientes de calcio (cadherinas) y por lo tanto son
sensibles a los agentes quelantes como EDTA o EGTA.
Otro componente importante en los cultivos es la matriz extracelular ya que promueve la
proliferación al favorecer la unión entre células. Los cultivos primarios requieren una
provisión de matriz extracelular (ácido hialurónico, fibronectina, colágeno, proteoglicanos)
a diferencia de las líneas celulares que generan su propia matriz. La matriz extracelular
incrementa la proliferación, la diferenciación y la sobrevida del cultivo celular. El
citoesqueleto también es importante porque las moléculas de adhesión se unen a él.
Es importante tomar en cuenta ciertas consideraciones a la hora de manipular un tejido para
cultivo celular. Se debe esterilizar el sitio de resección, retirar el tejido asépticamente y
transferirlo al laboratorio en medio de transporte tan pronto como sea posible. Hay que
remover el tejido necrótico, lesionar mínimamente el tejido, centrifugar suavemente para
eliminar proteasas y utilizar un medio rico.
Para la disgregación, se incuba el tejido con tripsina a 37° C por 30 min. La disgregación
enzimática puede combinarse con métodos mecánicos como la agitación con pipeta o con
agitador magnético.
Cuando se obtiene una suspensión celular homogénea, se siembra en recipientes adecuados
para incubación. En esta etapa hay que vigilar por aparición de contaminantes. Una vez
que el cultivo primario ha ocupado todo el sustrato, se subcultiva. Incluso los cultivos no
proliferativos requieren una rutina de mantenimiento donde se cambia periódicamente el
medio porque las células no lo metabolizan. La frecuencia del cambio de medio va a
depender de la línea celular. Las deficiencias del medio pueden iniciar la apoptosis.
Hay que examinar el cultivo para buscar signos de deterioro como vacuolización
citoplasmática, granularidad perinuclear y redondeamiento con despegamiento del sustrato,
que puedan corresponder a medio deficiente, contaminación bacteriana o senescencia.
Al utilizar el microscopio invertido para examinar los cultivos es importante revisar la fase
de crecimiento, el estado de las células y el medio de cultivo. Es muy útil llevar un registro
fotográfico, por lo que se debe contar con un adaptador para cámaras réflex o aprender a
utilizar el celular para tomar fotos desde el ocular.
Hay que familiarizarse con el ciclo de crecimiento de cada línea celular. Si las células están
creciendo correctamente, deben alcanzar la misma concentración celular después del
mismo tiempo en cada ciclo dado, si la concentración de sembrado y el intervalo de
subcultivo permanecen constantes.
La propagación de los cultivos en suspensión es menos traumática y no requiere proteasas
para realizar subcultivos.
Recordemos que las líneas celulares se pueden clasificar según su capacidad de anclaje.
Están las dependientes de anclaje que crecen en monocapa y están las independientes de
anclaje que crecen en suspensión.
La mayoría de las células de vertebrados son dependientes de anclaje y deben ser cultivadas
en un sustrato que permita la adhesión y siembra.
Pasos en el Cultivo Celular para Células dependientes de Anclaje
Antes que nada, recordar lavarse las manos con agua y jabón, rociarse con alcohol al 70% y
colocarse lentes, bata y guantes. Colocar todo el material dentro de la campana de flujo
laminar y prender la luz UV por 10 minutos.
Paso 1: Observación de las células en el microscopio invertido
Si las células se encuentran cercanas a la confluencia continuar con el paso 2. Si no
entonces hay que cambiar el medio de mantenimiento.
Paso 2: Tripsinización
Se retira el medio de mantenimiento
Se agrega solución salina en la pared opuesta a la monocapa
Se realizan movimientos circulares suaves
Se retira la solución salina
Se agrega la tripsina
Se incuba a 37°C
Paso 3: Inactivación de la tripsina
Agregar medio de mantenimiento para inactivar la tripsina
Resuspender suavemente las células para obtener la total disgregación de la
monocapa y evitar cúmulos de células
Paso 4: Recuento de células
Tomar una alícuota de la suspensión celular
Diluir la alícuota de la suspensión celular
Resuspender
Colocar en una cama de Neubauer
Contar las células viables en los cuatro cuadrantes
El número de células por mililitro se calcula con el número de células observadas en los
cuatro cuadrantes por 1000 entre la superficie contada en mm2 por la profundidad de la
camára (mm) por dilución.
Paso 5 : Siembra para mantenimiento
Se agrega medio de mantenimiento en una nueva botella
Se coloca una alícuota de la suspensión celular que contenga el número adecuado de
células
Paso 6: Revisión en el microscopio invertido
Antes de cultivar las células se observa su morfología al microscopio
Paso 7: Incubación
Las células se incuban a 37° en incubadora de CO2
Cultivo de Células Mesoteliales
El cultivo de células mesoteliales peritoneales constituye un modelo in vitro para estudiar
los efectos de varios agentes en funciones celulares como proliferación, viabilidad y
síntesis de proteínas y se ha convertido en una herramienta útil para un sinnúmero de
investigaciones en el área temática de biología y salud. Diversos estudios han señalado las
ventajas del cultivo de células mesoteliales peritoneales ya que estas células en cultivo
poseen marcadores inmunohistoquímicos idénticos a las células madre mesoteliales.
Las células mesoteliales son células epiteliales que tapizan cavidades corporales como la
pleura, el pericardio y el peritoneo. Su función más reconocida es la de proveer una
superficie no adhesiva para el movimiento de los órganos que ocupan esas cavidades
(pulmones, corazón, intestinos). En los últimos 30 años diversos estudios han demostrado
la importancia de estas células en los mecanismos de inflamación, infección y cicatrización.
En condiciones normales, las células mesoteliales muestran una proliferación limitada pero
en condiciones de estrés la tasa de mitosis puede cambiar de 0,5% a 60%. Las células
mesoteliales poseen un diámetro de 25 µm y son aplanadas y alargadas, aunque también se
han identificado células cuboidales.
Las células mesoteliales para cultivo se pueden obtener de:
epiplón de humanos o de animales
líneas celulares mesoteliales establecidas
fluído de diálisis peritoneal.
Cultivo de células mesoteliales de epiplón de humanos o de animales
Cuando se obtienen del epiplón de pacientes sometidos a cirugía abdominal hay que tener
un consentimiento informado del paciente. Este tejido se puede almacenar a 4° C hasta por
24 horas, pero lo mejor es lavarlo abundantemente con PBS (buffer fosfato salino) para
eliminar los glóbulos rojos, luego cortarlo en muestras de 5 cm2 e incubarlo a 37°C con
agitación constante durante 15 minutos en un medio con tripsina 0.125% y EDTA ( ácido
dietilenaminotetracético) al 0.01%. Luego se centrifugan y se cultivan con medio M199
suplementado con suero bovino fetal al 10%, penicilina 100 IU/ml, estreptomicina 100
mg/ml, L-glutamina 2 µg/ml, insulina 5 µg/ml, transferrina 5 µg/ml, e hidrocortinona
0.4µg/ml. Hay que nutrir a las células cada 3 dias ya que los componentes del medio se
agotan por la rápida proliferación de las células.
Las células mesoteliales humanas cambian su morfología durante su progresión a una
monocapa. Al principio adoptan una apariencia de fibroblasto y cuando alcanzan
confluencia se vuelven poligonales.
Para subcultivar estas células hay que remover el medio de cultivo lavándolo con PBS e
incubando en solución enzimática con PBS con tripsina 0.125% y EDTA ( ácido
dietilenaminotetracético) al 0.01%, 1ml por 1 minuto a 37°C hasta que se observe el
desprendimiento de las células. Luego se procede a la centrifugación y siembra de las
células.
En cuanto a las desventajas del uso de células mesoteliales humanas está que tienen una
expectativa de vida limitada in vitro y los estudios sugieren que su fenotipo sólo se preserva
hasta el tercer pase. Otros factores a considerar que pueden afectar los resultados es la
contaminación de los cultivos con otras células que pueden encontrarse en el epiplón como
son los fibroblastos y células endoteliales, las variaciones entre los diferentes donantes
humanos, las diferencias entre los diversos sitios del epiplón y el trauma causado por el
procedimiento quirúrgico y por la preparación del tejido.
Diversos estudios han demostrado que las células mesoteliales humanas tienen similitudes
morfológicas e histológicas con las de algunos animales como: rata, ratón, conejo, cobayo,
perro y caballo.El uso de células mesoteliales de animales se ve favorecido por la facilidad
de obtener las células en forma frecuente.
Líneas Celulares Mesoteliales
Las líneas celulares tienen la ventaja que constituyen un suministro permanente de células
que mantienen sus características por mucho tiempo a diferencia de la de los cultivos
primarios que tienen limitaciones en cuanto a su potencial proliferativo y expectativa de
vida.
Antes de seleccionar una línea celular se debe considerar la fuente y el procedimiento para
inmortalizar las células. Actualmente se están utilizando las células MeT-5A que muestran
las mismas características que las células mesoteliales peritoneales primarias y que
comparten también los mismos procedimientos para su cultivo. Las células MeT-5A son
células mesoteliales aisladas de los fluídos pleurales de pacientes sanos y se prefiere a las
células derivadas de mesoteliomas pleurales.
Cultivo de células mesoteliales aisladas de fluido de diálisis peritoneal
Estas células se pueden obtener de ratones que una vez sacrificados se exponen sus
cavidades peritoneales. Se utilizan 4 ratones. Las cavidades son inyectadas con 10 ml de
suero bovino fetal y este suero es removido para eliminar los macrófagos y linfocitos.
Luego se inyectan 10 ml de solución tibia de EDTA 0.02% y tripsina 0.25% y se colocan
los ratones por 10 minutos bajo una lámpara de calor. Las superficies se mantienen
húmedas con suero bovino fetal y se masajean las cavidades para promover el
desprendimiento de las células peritoneales. Se procede a la colección de la solución en las
cavidades peritoneales y se tranfiere a un tubo. Se inyecta 10 ml de suero de becerro fetal
FCS) al 15% para neutralizar la tripsina. Esto se añade a la colección anterior y se
centrifuga a 200g por 5 minutos. Luego las células se resuspenden en medio y se cultivan
por 8 dias. Durante las primeras etapas del cultivo celular, las células se ven alargadas con
forma de huso o de estrella. Estas células se van agrupando y antes de confluir forman una
monocapa. Para confirmar que las células mesoteliales conservan sus propiedades se
utilizan estudios inmunocitoquímicos como citoqueratinas, calretinina y vimentina.
Videos Sugeridos
Curso Teórico de Técnicas Básicas en Cultivos Celulares de la Universidad Miguel
Hernández
https://www.youtube.com/watch?v=jgAiBrvBJ6E
Video sobre equipos, insumos y técnicas para cultivo celular en laboratorio de
investigaciones biomédicas.
https://www.youtube.com/watch?v=ohglytKW2zQ
Video práctico sobre la tripsinización y pase de mantenimiento de células
https://www.youtube.com/watch?v=dfRNGHXyl3M
Protocolo de mantenimiento de células en cultivo
https://www.youtube.com/watch?v=7d_kDu-P964
Principios de Recuento Celular
https://www.youtube.com/watch?v=qFMMlwLwIGI
Cambio de medio
https://www.youtube.com/watch?v=zBejJC-zIAI
Laboratorio de Cultivo Celular
https://www.youtube.com/watch?v=CA5fVLK5zAE
Errores en la técnica de Cultivo Celular
https://www.youtube.com/watch?v=hXolHjx2ZXc
Actividades sugeridas
Observar diversos cultivos bajo microscopio invertido en el laboratorio.
Llevar un registro fotográfico de los cultivos.
Capítulo V
Aplicaciones de los Cultivos Celulares
Existen múltiples aplicaciones que utilizan los cultivos celulares entre los que se destacan: la
ingeniería de tejidos, ingeniería de proteínas, estudios de señalización celular, estudios con
virus, producción de vacunas, estudios de trasplantes, ensayo de nuevos medicamentos,
estudio de toxinas.
La ingeniería de tejidos tiene como objetivo la regeneración funcional del tejido
dañado utilizando células cultivadas para reparar o reemplazar tejido dañado de un
paciente. A partir de un fragmento de tejido se puede lograr reestablecer la funcionalidad de
un tejido u órgano. Ya existen múltiples estudios con logros significativos en cultivos de
piel, córnea, cartílago, hueso, músculo, tejido nervioso y tejido glandular. Primero se
realizan pruebas in vitro para evaluar el desempeño fisiológico de las células y el andamio.
Luego se realizan pruebas en modelos animales para demostrar la habilidad del tejido
artificial de integrarse al tejido huésped y promover la regeneración del tejido dañado.
Posteriormente se realizan pruebas en humanos para comprobar los resultados en animales.
Para la obtención de un tejido con fines terapéuticos se llevan a cabo diversos pasos donde
el principal es el cultivo primario. Luego viene la etapa de celularización que consiste en
realizar el crecimiento celular en andamios generados a partir de biomateriales que deben ser
biocompatibles. Luego viene la maduración fenotípica que va a depender de la colonización
exitosa de las células en los andamios, la viabilidad de las células durante su cultivo, de la
habilidad de las células de mantener su fenotipo diferenciado y de su habilidad para
interactuar con el biomaterial de forma funcional. Por último, la microperfusión donde se
generan estímulos mecánicos, eléctricos y químicos/hormonales para que se pueda dar el
desarrollo funcional del tejido.
.
Las células que pueden utilizarse son:
Células maduras diferenciadas: provienen de ciertos tejidos mediante
biopsias autólogas (del mismo individuo) o heterólogas (de otro individuo de la
misma especie). Tienen un bajo potencial de diferenciación y proliferación.
Células troncales hematopoyéticas: se obtienen de médula ósea, sangre periférica,
sangre del cordón umbilical y la placenta.
Células troncales mesenquimales: Son precursoras de todos los tipos de tejido
conectivo no hematopoyéticos. Son uno de los tipos celulares más empleados en
terapia celular. Son capaces de inhibir la respuesta inmunitaria. Pueden dar origen a
células especializadas como los osteocitos, condrocitos y adipocitos.
Células Troncales Somáticas Adultas: se diferencian para formar los tejidos. Tienen
la capacidad de autorenovarse. Son multipotentes, es decir, pueden formar a casi
todas las células dentro de un tejido en particular.
Células fetales: Células germinales embrionarias del primer trimestre o de tejido
fetal específico. Son similares a las células troncales hematopoyéticas y a las
mesenquimales, aunque están menos desarrolladas inmunológicamente.
Células embrionarias tempranas: Células troncales derivadas de la pre-implantación
del blastocisto. Son células inmaduras, indiferenciadas que permiten la
autorenovación o la reparación de un tejido debido a que son capaces de dividirse
para producir células hijas idénticas a las células troncales. Son totipotenciales es
decir, pueden formar todos los tipos celulares
La ingeniería de tejidos ha pasado progresivamente por varias etapas. En un principio se
usaban materiales inertes como estructuras sustitutivas de algunas partes del cuerpo
dañadas. Luego se inició la aplicación de una matriz biodegradable que se coloca en el
tejido dañado para promover, en el microambiente apropiado, el crecimiento y propagación
de las células sanas circundantes o bien de células troncales implantadas. Finalmente, con
la aparición de la nanotecnología se han desarrollado nuevos materiales que prometen
elevar la eficiencia de la terapia celular, aumentando la capacidad regenerativa del
organismo.
La ingeniería de tejidos tiene retos por vencer entre los que se encuentran: las
reconstrucciones de microambientes para el desarrollo de las funciones de los tejidos,
lograr números adecuados de células útiles clínicamente, llevar las necesidades de la
Medicina de Rehabilitación a los laboratorios.
Actividades sugeridas
Realizar una búsqueda sobre los diferentes andamios biológicos utilizados para
generar tejidos, y hacer una tabla comparativa describiendo sus características y
composiciones.
Hacer un listado de los órganos del cuerpo más susceptibles a lesiones.
Videos recomendados:
Ingeniería de tejidos en https://www.youtube.com/watch?v=7Q3S6q97FiU
Ingeniería tisular en reconstrucción facial en
https://www.youtube.com/watch?v=PlEb50m7v_k
Construcción de tejidos humanos en
https://www.youtube.com/watch?v=ofiLcTs7_Ys
Glosario
Alícuota: Muestra tomada de un volumen inicial, cuyas propiedades físicas y
químicas son iguales a las de la sustancia original.
Amortiguador: Solución que afecta la concentración de iones de hidrógeno en el agua. Ya
que el pH es el potencial de hidrogeniones, esta sustancia regula el pH.
Andamio: Estructura hecha de biomaterial natural o sintético, la cual da forma y soporte
mecánico para la regeneración de un tejido a partir de células.
Apoptosis: Muerte celular programada.
Asepsia: Método o procedimiento para evitar que los gérmenes infecten una cosa o un
lugar.
Cadherina: Proteína que media la adhesión celular dependiente de calcio.
Cariotipo: Cantidad y características del juego completo de cromosomas de un organismo.
Célula eucariota: Célula caracterizada por un núcleo diferenciado, protegido por una
membrana y con citoplasma organizado.
Célula madre: Célula capaz de dar lugar a diferentes células en un tejido. Son células
indiferenciadas, capaces de producir células semejantes y diferenciarse en 2 o más tipos
celulares.
Célula madre embrionaria: Célula que tiene la capacidad ilimitada de diferenciación.
Cepa celular: Subpoblación de una línea celular seleccionada.
Ciclo celular: Secuencia de acontecimientos por los que una célula duplica su dotación
cromosómica completa y se divide en 2 células semejantes, con el mismo material genético.
Citoesqueleto: Red estructural de organización interna que presentan las células
eucarióticas y que se encuentra implicada en el transporte interno, en la motilidad y en la
morfología celular.
Confluencia: Estado en que las células de un cultivo ocupan todo el sustrato disponible.
Concentración celular: Número de células por ml de medio.
Cultivo celular: Técnica usada para crecer células disociadas fuera del organismo.
Cultivo primario: Etapa en que las células son extraídas del tejido y son proliferadas en
las condiciones adecuadas.
Cultivo secundario: Cultivo realizado cuando las células del cultivo primario alcanzan
confluencia y son pasadas a otro medio para su crecimiento.
Cultivo en suspensión: Cultivo en el que las células se multiplican suspendidas en un
medio de crecimiento.
Diferenciación: Conjunto de procesos por los que las células precursoras adquieren
características fenotípicas y funcionales propias y especializadas.
Densidad celular: Número de células por cm2 de superficie de crecimiento o sustrato.
Explante: Fragmento de tejido trasplantado de su sitio original y mantenido en un medio
artificial.
Factor de crecimiento: Proteína de señalización intercelular que proporciona un estímulo
para impulsar la progresión a través del ciclo celular y la entrada en mitosis.
Fase S: Etapa del ciclo celular eucariótico en la cual se produce la síntesis de ADN.
Fenotipo: Características observables de una célula o un organismo que son el resultado de
la expresión del genotipo celular.
Fibroblastos: Tipo celular del tejido conjuntivo que secreta proteínas, como el colágeno.
Fibronectina: Proteína de adhesión de la matriz extracelular. Su función es anclar células
al colágeno.
Flujo laminar: Movimiento de un fluido en láminas paralelas, que permite un flujo estable
y ordenado como el que se obtiene en campanas o cabinas destinadas a mantener la
esterilidad.
Genotipo: composición genética de una célula o un organismo.
HEPA: Filtro de aire de alta eficiencia que evita la propagación de bacterias y virus a
través del aire.
Inmortalización: Adquisición de una capacidad de división celular infinita.
Integrina: Proteína de adhesión responsable del establecimiento de interacciones
específicas.
In vitro: “En vidrio”. Se utiliza para referirse a procesos realizados en tubos de ensayo o
fuera del huésped como los cultivos celulares. Los cultivos de células in vitro consisten en
un sistema formado por células provenientes de un órgano o un tejido, normal o tumoral,
mantenidas en medios de cultivo de composición química definida y en condiciones de
temperatura, pH, aireación y humedad controladas.
Línea celular: Progenie de un cultivo celular primario cuando es subcultivado. Puede ser
finita o continua.
Línea celular continua: Línea celular finita que ha pasado transformaciones y se vuelve
duradera en el tiempo.
Matriz extracelular: Macromoléculas secretadas por que forman una región de material no
celular en el intersticio entre las células.
Micoplasma: Bacteria delimitada por una membrana celular resistente a la lisis osmótica, y
que atraviesa fácilmente filtros bacteriológicos.
Microfilamentos: Estructuras citoesqueléticas compuestas por un polímero de doble hélice
de actina.
Microtúbulos: Estructuras proteicas cilíndricas que contribuyen a formar el citoesqueleto
y afectan la capacidad de andamiaje.
Mitosis: Mecanismo por el cual una célula sufre división nuclear para producir 2 células
idénticas con complementos cromosómicos iguales.
Pase: Transferencia o subcultivo de células de un recipiente de cultivo a otro.
pH: Medida estándar de la acidez relativa, que en términos matemáticos es igual a –log[H+]
p53: Gen o proteína oncosupresora que tiene un rol importante en los mecanismos de
reparación del ADN y en la apoptosis celular.
Senescencia: Proceso por el cual las células pierden su capacidad de proliferación luego de
un número determinado de divisiones.
Subcultivo: La trasnferencia de células de un cultivo a otro por disociación del sustrato en
caso de monocapa o por dilución en caso de crecimiento en suspensión.
Sustrato: Matriz o base sólida sobre la cual un cultivo en monocapa crece.
Transformación: Alteración permanente del fenotipo celular, por un cambio genético
irreversible. Por lo general produce líneas celulares con mayor tasa de crecimiento. Se
utiliza para describir alteraciones en el crecimiento asociadas a malignidad.
Tripsina: Endoproteasa de origen pancreático que participa en la digestión de las proteínas
a nivel intestinal.
