Técnicas de Cultivo Celular

Laboratorio de Hematopoyesis y Leucemia

Mantener células “in vitro” conservando al maximo sus propiedades fisiologicas, bioquimicas y genéticas.

Cultivo Celular

Cultivos Celulares•Cultivos Primarios: Derivan de tejidos animales normales o embriones enteros. Periodo de tiempo limitado. Senectud celular (Hepatocitos, neuronas, etc.)

•Cepa Celular: Linaje de células originario a partir de un cultivo primario

•Linea Celular: Cultivo de células con un período de vida indefinido, se le considera inmortal. (tumorógenicas o trasformadas)

Establecidos a partir de tejidos u órganos…

Lodish, et al. Biología Celular y Molecular

Disgregación celular ya sea por medios enzimáticos o mecánicos. Se puede cultiva como capa adherente o en suspensión en el medio de cultivo, aumentando la masa celular a lo largo de las generaciones.

Técnica sensible

Cantidad y costo

Inestabilidad (no están reguladas por otras células y tejidos.)

Permite un control preciso y fino del medio ambiente

Caracterización y homogeneidad de la muestra

Motivaciones éticas

Disgregación celular

Aumentan en número aquellas que tienen mayor tasa de crecimiento.

Confluencia, momento necesario para resembrar en una nueva placa. Se reduce la densidad en un porcentaje desde 80% a 90% (1/5 – 1/10)

Una línea celular será más fácil de cultivar cuanto más indiferenciada sea, con excepciones de líneas tumorales de células diferenciadas.

Circulantes, células hematopoyéticas.

Tisulares, o tumorales adherentes.

Las líneas celulares suelen mantener la naturaleza de las células “in vivo”

Mezcla de componentes purificados o de soluciones orgánicas complejas

Instrumentos que mantienen las condiciones fisico-químicas adecuadas

•Naturaleza del sustrato o fase en que crecen las células.

•Condiciones fisico-químicas y fisiológicas del medio.

Soportes o recipientes que los contienen y aíslan del medio exterior.

Medios artificiales

Condiciones Fisiológicas.

•Soluciones salinas equilibradas •Aminoacidos•Vitaminas•Glucosa•Suplementos organicos•Hormonas y factores de crecimiento (Suero)

• Medio Basal de Eagle (BME) Fibroblastos de ratón y células HeLa• Medio mínimo esencial de Eagle (MEM) • Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) • Modificación de Iscove del medio DMEM (IMDM) Cultivo de linfocitos en medio libre de suero

Principal dificultad obtener medios nutritivos adecuados que sean capaces de reemplazar al medio "natural"

Medios de cultivo

Proteínas Polipéptidos Hormonas Nutrientes y metabolitos MineralesInhibidores

Suero

Inactivación: 56° C 30 min (Sistema del complemento)

• Tipo de linaje celular• Tipo del cultivo• Composición química del medio• Objetos de la investigación o utilización

Esterilidad: Filtros de 0,22 µm

•Bacterias (0,5 - 5 µm) Mycoplasma (0,2 – 0,8 µm)•Mohos (2 – 10 µm)•Levaduras (1-10 µm)•Virus (20 – 300 nm)

En los medios no definidos las hormonas y factores de crecimiento los aporta el suero.

•Suero de ternera (más utilizado)•Suero bovino fetal (líneas más exigentes•Suero de caballo•Suero humano (líneas humanas)

Gran cantidad de componentes presentes en cantidades variables que pueden influir en el cultivo (hormonas, factores de crecimiento.)

Fase gaseosaO2 y CO2

O2: Tensión atmosférica

CO2: influye CO2 disuelto, el pH y iones HCO3

-

Cada medio tiene una concentración recomendada de HCO3- en fase

acuoso y tensión de CO2 en fase gaseosa para alcanzar el pH correcto.

Temperatura fisiológica. ( 37 ° C )

Humedad ambiental elevada.

Superficies de cultivo

El pH óptimo para la mayoría de tipos celulares es de 7,4 (fisiológico) aunque existen pequenas variaciones.

Indicador Rojo fenol: 7,4 7,0 6,5 El cambio de color se debe a un cambio estructural inducido por la protonación o desprotonación de la especie.

• Inhibidores del crecimiento de contaminantes (antibióticos y antifúngicos)

Controles de esterilidad disenados para detectar contaminantes de crecimiento en el medio de cultivo, incubando alícuotas de medio en la incubadora durante 24 o 48 h

Asepsia Esterilización

Cabinas de flujo laminar

RecuentoAzul de tripano se introduce en el interior de células no viables.

Cristal violeta: Tine células cultivadas

Se emplean diferentes técnicas para determinar la densidad celular: cámara de Neubauer… Equipos automáticos “Cell Coulter”

Cámara adaptada a microscopio de contraste de fases, cuadricula de medidas definidas, volumen a contar mediante la cuadrícula de recuento ( volumen de muestra celular).

Profundidad de la cámara: 0,1 mm

(superficie contada * profundidad de la cámara)

# cel. ⁼ (# cel. Conteo)(Factor de dilución)(volumen de muestra)( 10 000) # de cuadrantes⧸

Conservación

• Dimetilsulfóxido (DMSO) Agente penetrante, evita formación de cristales

• Neveras (4°C) para el almacenamiento de medios, PBS, ... •Congeladores de -20°C para el almacenamiento de suero, aditivos (glutamina, antibióticos) y soluciones enzimáticas (tripsina, colagenasa,...). •Congeladores de -80°C para el almacenamiento a largo plazo de los aditivos del medio (suero, glutamina, antibióticos,...) y de sustancias especialmente sensibles (factores de crecimiento, mitógenos, inductores,...). •Unidad de almacenamiento en nitrógeno líquido (-196°C), para el almacenamiento de las líneas celulares.