Cultivo Celular Por Antonio Crespo Gomez

7/25/2019 Cultivo Celular Por Antonio Crespo Gomez

1/12

ANTONIO CRESPO GOMEZ

INTRODUCCIN AL CULTIVO CELULAR

El cultivo de tejidos ha sido considerado durante mucho tiempo como una mezcla deciencia y arte Inicialmente !ue considerada inicialmente como una t"cnica

particularmente di!#cil de aprender Sin em$ar%o& ho' en d#a estas di!icultades est(nsuperadas %racias a !actores como los medios de composici)n de!inida& la

disponi$ilidad de anti$i)ticos& las instalaciones as"pticas *salas de cultivo limpias&

ca$inas de !lujo laminar& incu$adores est"riles& etc+& dispositivos de cultivo *$otellas con

tapones !iltrantes& placas de Petri ventiladas& etc+

1.- Introduccin !i"trica

El cultivo de tejidos se desarroll) a #artir de lo" $ltimo" a%o" del "i&lo 'I' como unacontinuaci)n de las t"cnicas de la em$riolo%#a ,ilhem Rou- mantuvo en el a.o /001

c"lulas de em$ri)n de pollo en soluci)n salina durante unos d#as Se considera al

2o)lo%o americano R G 3arrison como el iniciador de los cultivos de tejidos animalesEn /456& 3arrison !u" el primer cient#!ico 7ue emple) t"cnicas in vitropara el estudio

de !en)menos in vivo& reali2ando cultivos de m"dula espinal em$rionaria de an!i$ios

Pudo o$servar el crecimiento de los a-ones de los neuro$lastos& ' esta$leci) 7ue el a-)n

se !orma$a por e-pansi)n a partir del cuerpo neuronal ' no por !usi)n de una cadena de

c"lulas El cultivo se reali2a$a en una %ota de lin!a del an!i$io 7ue col%a$a de un

cu$reo$jetos so$re una c(mara sellada

8a primera limitaci)n para el esta$lecimiento de cultivos era lo&rar un medionutriti(o adecuado 9urro:s */4/5+ emple) plasma de pollo para nutrir los e-plantesde tejidos em$rionarios de pollo Este medio se revel) mucho mejor 7ue los

anteriormente pro$ados& lo 7ue le permiti) o$servar el crecimiento del tejido nervioso&

cora2)n ' piel

9urro:s ' Carrel demostraron 7ue la (ida del culti(o "e #uede #rolon&ar mediante"u)culti(o 8os medios empleados !ueron plasma suplementado con e-tractos deem$ri)n

Rous ' ;ones */4/


2/12


En /4@0& Earle ' col aislaron c"lulas de la l,nea celular L ' mostraron 7ue erancapaces de !ormar clones en el cultivo de tejidos Bemostraron 7ue para 7ue una c"lula

lle%ue a dividirse necesita ser alimentada con lo" nutriente" correcto"

En /41& Gr' ' col esta$lecen la primera l#nea celular continua& las c*lula" eLa El

medio empleado era e-tremadamente complejo ' poco de!inido plasma de pollo&e-tracto de em$ri)n $ovino ' suero de cord)n um$ilical humano

En /41@& Rita 8eviDMontalcini ' col esta$lecen 7ue el !actor de crecimiento nervioso

estimula el crecimiento de lo" aone" en te/ido" en culti(o Este tra$ajo supuso elPremio No$el para 8eviDMontalcini en /40


3/12


Culti(o de r&ano"

Se coloca el )r%ano so$re una rejilla situada en la inter!ase l#7uidoD%as de un medio del

7ue o$tiene los nutrientes ' al 7ue puede li$erar los desechos Este tipo de cultivo

permite mantener& al menos en parte& la ar0uitectura caracter#stica del tejido in vivoHSe conservan las interacciones histol)%icas '& %racias a ello& este tipo de cultivo permite

mantener lo" ti#o" celulare" di+erenciado"& por lo 7ue representan una $uena r"plicadel tejido de ori%en Sin em$ar%o& no crecen muc!o *la proli!eraci)n celular se limita alas c"lulas em$rionarias de la peri!eria+ ' no "e #ueden #ro#a&ar Se necesita un nuevo

e-plante par cada e-perimento lo 7ue supone mucho m(s tra$ajo ' una limitadareproduci$ilidad de la muestra Cuanti!icar es di!#cil ' la cantidad de material 7ue se

puede cultivar es reducida

E#lante" #rimario"

Se coloca un +ra&mento de te/ido o de r&ano en la inter!ase s)lidoDl#7uido de unsoporte de vidrio o de pl(stico 8as c"lulas se adhieren a la super!icie ' la" c*lula" de la#eri+eria del e#lante #ueden mi&rar y #roli+erarpor la super!icie del soporte

Culti(o celular #rimario

Es el tipo de cultivo m(s utili2ado Se puede o$tener a partir de e-plantes primarios o de

suspensiones de c"lulas dis%re%adas 8a di"&re&acin celular se reali2a por m"todosen2im(ticos o mec(nicos En estos cultivos se pierden las interacciones c"lulaDc"lula '

las interacciones de la c"lula con la matri2 e-tracelular Sin em$ar%o& las c"lulas son

capaces de #roli+erar ' la po$laci)n celular crece nota$lemente Cuando las c"lulasocupan toda la super!icie disponi$le se dice 7ue han alcan2ado la con+luencia En estaetapa& las c"lulas esta$lecen contactos entre ellas 7ue inhi$en su proli!eraci)n ' el

crecimiento se detiene Por eso& al ca$o de un tiempo ha' 7ue transplantar las c"lulas aun nuevo soporte Esta operaci)n se denomina "u)culti(o o #a"e


4/12


E-isten dos tipos de cultivo celular primario

I Cultivos en monoca#a las c"lulas crecen ad!erida" "o)re un "o#orte "lido*pl(stico o vidrio+ El anclaje al sustrato es un prerre7uisito para la proli!eraci)n

celular Es el m"todo utili2ado para la ma'or#a de las c"lulas e-cepto para las

hematopo'"ticasI Cultivos en "u"#en"in las c"lulas se encuentran di"#er"a" en el medio de

culti(o Su crecimiento no depende del anclaje Este tipo de cultivo se restrin%ea las c"lulas hematopo'"ticas& c"lulas madre& l#neas celulares trans!ormadas '

c"lulas tumorales Alcan2an la con!luencia cuando el n>mero de c"lulas es

%rande ' los nutrientes son insu!icientes

5u)culti(o" y l,nea" celulare"

8as c"lulas del cultivo primario en monocapa se dispersan por m"todos en2im(ticos ' se

pasan a un nuevo !rasco de cultivo En el caso de c"lulas en suspensi)n& sencillamente

se dilu'en en medio !resco 8os sucesivos cultivos as# !ormados se denominan una l,neacelular 8a !ormaci)n de una l#nea celular a partir de un cultivo primario implica 7ue

I aumenta el n$mero de c*lula" o$tenidasI aca)an #redominando uno o do" ti#o" celulare" los 7ue tienen ma'or tasa de

crecimiento

I la po$laci)n celular se hace uni+orme y !omo&*neaI "u" caracter,"tica" "e con"er(an durante las sucesivas %eneraciones '& si se

conservan en nitr)%eno l#7uido& de !orma inde!inida

Normalmente& las l#neas celulares tienen una vida !inita 7ue& se%>n el tipo de c"lula& se

puede prolon%ar entre 5 ' /55 %eneraciones Superado ese l#mite& las c"lulas entran en

una etapa 7ue se denomina "ene"cencia en la 7ue pierden su capacidad de proli!erar&supuestamente por el acortamiento de los tel)meros& ' mueren Sin em$ar%o& al%unas

c"lulas *como las c"lulas de roedores ' las c"lulas tumorales+ evitan la senescencia '

dan lu%ar a l,nea" celulare" continua"& 7ue crecen inde!inidamente Estas c"lulaspueden sur%ir de !orma e"#ont4nea *e-posici)n a radiaciones ioni2antes o acarcin)%enos 7u#micos+ o inducida *in!ecci)n v#rica o trans!ecci)n de ABN+ ' son elresultado de un cam$io %enot#pico denominado tran"+ormacin


5/12


8as c"lulas trans!ormadas se caracteri2an por7ue

I Son inmortale" crecen inde!inidamenteI

5u crecimiento e" a)errante se pierde la inhi$ici)n por contacto& la limitaci)nde la densidad celular durante la proli!eraci)n ' la dependencia del anclajeI Son mali&na" invaden tejidos ' dan lu%ar al crecimiento de tumoresI Son &en*ticamente ine"ta)le" son heteroploides *var#a el n>mero de

cromosomas+ ' presentan a$erraciones cromos)micas

En /41 se o$tuvo la primera l#nea celular continua humana Son las denominadas

c*lula" eLa& c"lulas e-tra#das a partir de un tumor de cuello del >tero de una pacientea!roamericana 7ue se llama$a 3enrietta 8acs

Culti(o" !i"tot,#ico" y or&anot,#ico"

8os culti(o" !i"tot,#ico" son cultivos de un solo tipo celular 7ue consi%ue alcan2ar unaelevada densidad celular *tal ' como ocurre en los tejidos+ 8os culti(o" or&anot,#ico"constan de varios tipos celulares 7ue interaccionan entre s# de una !orma 7ue intenta

parecerse lo m(s posi$le a la ori%inal El o$jetivo !inal de este tipo de cultivos es la

creaci)n in vitroH de tejidos u )r%anos completamente !uncionales 7ue puedan ser

utili2ados en injertos o en transplantes 8os cultivos or%anot#picos constitu'en la $ase

de una nueva disciplina denominada in&enier,a de te/ido"


6/12


6.- 7iolo&,a de la" c*lula" en culti(o

Al esta$lecer un cultivo celular "e "eleccionan la" c*lula" 7ue van a crecer en !unci)nde numerosos criterios s)lo !ormar(n parte del cultivo a7uellas c"lulas 7ue sean

capaces de superar el proceso de dis%re%aci)n& de adherirse al sustrato ' de proli!erar

*$ien en !orma de monocapa& $ien en suspensi)n+

El crecimiento en monoca#a si%ni!ica 7ue las c"lulas se adherir(n al sustrato ' en esa!orma inician la proli!eraci)n Muchas l#neas celulares son anclajeDdependientes& es

decir& no inician la proli!eraci)n hasta 7ue se han adherido al sustrato Este es el modo

normal de proli!eraci)n de la ma'or parte de las c"lulas& con e-cepci)n de las c"lulas

hematopo'"ticas maduras

El crecimiento en "u"#en"in es propio de a7uellas c"lulas capaces de proli!erar sinnecesidad de adherirse al sustrato& independientes de anclaje Es propio de las c"lulas

hematopo'"ticas& al%unas l#neas celulares trans!ormadas ' de c"lulas procedentes detumores Es de destacar 7ue en todo tejido e-iste una !racci)n o tipo celular 7ue es

capa2 de crecer en suspensi)n A pesar de 7ue su ori%en no est( claro se cree 7ue se

trata de c"lulas madre *Jstem cellsJ+ indi!erenciadas

Cuando se mantiene el cultivo se esta$lece una nueva selecci)n aumentan en n$meroa0uella" c*lula" 0ue tienen una mayor ta"a de crecimiento As# pues& ha' 7ueconsiderar al cultivo como un ente din4mico en el 7ue las proporciones relativas de losdi!erentes elementos 7ue lo !orman var#an en el tiempo en !unci)n de la presi)n

selectiva a la 7ue est"n sometidos En %eneral& se alcan2a la con!luencia de las c"lulas&

"stas detienen su crecimiento& aun7ue pueden e-istir tipos celulares neopl(sicos 7ue

si%an duplic(ndose hasta despla2ar a los otros tipos celulares del cultivo

Al alcan2ar la con+luencia en el cultivo es cuando muchas l#neas celulares e#re"an"u" a"#ecto" m4" caracter,"tico" Es en este estado cuando su mor!olo%#a ' !isiolo%#ason m4" #arecida" a "u e"tado ori&inal Es tam$i"n el momento en el 7ue "e detiene elcrecimiento ' se hace necesario dividir& repla7uear o propa%ar las c"lulas

A partir del tercer repla7ueo& el culti(o "e e"ta)iliza y !omo&eneiza el tipo celular dema'or tasa de crecimiento ha ocupado completamente el cultivo& despla2ando a los

otros tipos celulares En %eneral& si no se esta$lecen condiciones selectivas& las c"lulas

del tejido conjuntivo *especialmente los !i$ro$lastos+ ser(n las seleccionadas Para

evitar 7ue las c"lulas m(s especiali2adas del cultivo se vean despla2adas de "ste por los!i$ro$lastos o por otras c"lulas de r(pido crecimiento se han esta$lecido protocolos

detallados de medios selectivos

En los cultivos primarios& las c"lulas crecen durante un cierto n$mero de #a"e" 7uedepende& so$re todo& del tipo celular ' de las condiciones de cultivo As#& los

hepatocitos de adultos s)lo se mantienen como cultivo primario& las c"lulas endoteliales

de cord)n um$ilical humano *3=KEC+ permanecen en cultivo de ? a 4 pases ' los

!i$ro$lastos d"rmicos humanos pueden superar los 5 pases Sin em$ar%o& al !inal todas

ellas entran en una +a"e de "ene"cencia en la 7ue se acumulan numerosasanormalidades ' se pierden las !unciones especiali2adas& lo 7ue conduce a la muerte delcultivo


7/12


S)lo ocasionalmente puede mantenerse un cultivo primario durante m(s %eneraciones

de las esperadas Es de$ido a la aparici)n en el cultivo de c"lulas inmortales Estas

c"lulas !orman l,nea" e"ta)le" o cultivos celulares permanentes En la ma'or#a de loscasos se desconoce la ra2)n de la aparici)n de c*lula" inmortale"pero se ve !avorecida

por in!ecciones virales ' por tratamientos con mut(%enos& lo 7ue podr#a estar

relacionado con la #*rdida3 e"#ont4nea o inducida3 de la" (,a" de control celular 8acapacidad de un cultivo celular primario para esta$lecerse como l#nea esta$le est(relacionada directamente con su varia$ilidad %en"tica 8as l#neas celulares 7ue nunca

se esta$lecen como esta$les se mantienen euploides& como es el caso de !i$ro$lastos

humanos& !i$ro$lastos de pollo ' la %lia humana 8as l#neas 7ue& con !recuencia& se

convierten en aneuploides son las 7ue suelen trans!ormarse en l#neas celulares esta$les&

como es el caso de las c"lulas epid"rmicas En %eneral& una l#nea celular ser( tanto m(s

!(cil de esta$lecer o cultivar cuanto m(s indi!erenciada sea& con las e-cepciones de las

l#neas tumorales de c"lulas di!erenciadas

8os cultivos primarios de muchos tipos celulares son posi$les por7ue las c"lulas

#ierden al&una" de "u" #ro#iedade" di+erenciada"& entre ellas la incapacidad dedividirse Esta p"rdida de al%unas de sus propiedades caracter#sticas puede de$erse a

desdi!erenciaci)n o a desadaptaci)n 8a de"di+erenciacin implica una p"rdidairre(er"i)le de una propiedad di!erencial del tipo celular Por ejemplo& un hepatocito encultivo puede perder al%unas an2imas *como la ar%inasa o las aminotrans!erasas+& o ser

incapa2 de almacenar %luc)%eno o de sinteti2ar las prote#nas del suero En la

de"ada#tacin& la p"rdida no es irreversi$le 'a 7ue se de$e a la ausencia de al%>n tipo ese.al *hormonal& nerviosa& etc+ ' 7ue $asta con recuperar esa se.al para 7ue la

caracter#stica se vuelva a e-presar Por ejemplo& cuando crecen so$re una matri2 de

col(%eno& los hepatocitos de rata pueden volver a e-presar la en2ima tirosina

aminotrans!erasa en presencia de ciertas hormonas *insulina e hidrocortisona+

8.- A#licacione" del culti(o celular

8os cultivos celulares se utili2an tanto en la investi%aci)n $(sica como en la aplicada

En la in(e"ti&acin )4"ica& permiten estudiar !en)menos complejos como& por ejemplo

I la acti(idad intracelular transcripci)n de BNA& s#ntesis de prote#nas&meta$olismo ener%"tico& ciclo celular& di!erenciaci)n& apoptosis& etc

I el +lu/o intracelular de )iomol*cula" procesamiento del ARN& el movimientodel ARN desde el n>cleo hacia el citoplasma& el movimiento de las prote#nashacia diversos or%(nulos& el ensam$laje ' desensam$laje de los microt>$ulos&

etc

I &enmica y #rotemica an(lisis %en"tico& in!ecci)n& trans!ormaci)n celular&inmortali2aci)n& senescencia& e-presi)n %"nica& rutas meta$)licas& etc

I ecolo&,a celular el estudio de las condiciones am$ientales responsa$les delmantenimiento de la !uncionalidad celular ' de su di!erenciaci)n& el estudio de

las necesidades nutricionales& la cin"tica de la po$laci)n celular& etc


8/12


I la" interaccione" celulare" mor!o%"nesis& proli!eraci)n celular& adhesi)ncelular& interacciones con la matri2& invasi)n celular& etc

En la in(e"ti&acin a#licada& las t"cnicas de cultivo celular utili2an en (reas tan

diversas como

I Virolo&,a Cultivo de virus animales ' de plantas& producci)n de vacunas& etc

I 7iotecnolo&,a producci)n industrial de !(rmacos en $iorreactores *inter!er)n&insulina& hormona de crecimiento& etc+

I Inmunolo&,a Producci)n de anticuerpos monoclonales& se.ali2aci)n&!en)menos de in!lamaci)n

I 9armacolo&,a E!ecto de diversos !(rmacos& interacciones con el receptor&!en)menos de resistencia& etc

I In&enier,a de te/ido" Producci)n de tejidos arti!iciales *piel& cart#la%os+ para eltratamiento de %randes 7uemados& injertos o autotransplantes& desdi!erenciaci)n

' di!erenciaci)n inducida& etc

I Toicolo&,a citoto-icidad& muta%"nesis& carcino%"nesis& etc


9/12


:.- Venta/a" e incon(eniente" de lo" culti(o" celulare"

Como (enta/a"podemos citar

a; n animal& pero con ellos se pueden

ensa'ar un elevado n>mero de condiciones e-perimentales 7ue& en otras circunstancias&

supondr#an el sacri!icio de decenas o cientos de animales de e-perimentaci)n


10/12


8os cultivos celulares tam$i"n pueden suponer al%unas de"(enta/a"

a; T*cnica "en"i)le

El crecimiento de las c"lulas animales se tiene 7ue reali2ar en e"tricta" condicione" dea"e#"ia por7ue su crecimiento es mucho m(s lento 7ue el de los contaminantes m(sha$ituales *hon%os& levaduras& $acterias& micoplasmas& etc+ Adem(s& las c"lulas

animales son incapaces de mantenerse vivas en ausencia de la compleja me2cla de

nutrientes presente en el plasma o en el !luido intersticial Todo esto condiciona en %ran

medida el instrumental re7uerido ' el %rado de preparaci)n del personal encar%ado delos cultivos

); Cantidad y co"te

Producir / %ramo de c"lulas en cultivo cuesta /5 veces menos 7ue o$tenerlas a partir del

tejido de un animal En un la$oratorio normal se pueden conse%uir hasta /5 %ramos de

c"lulas sin 7ue se resienta mucho el presupuesto de investi%aci)n Para producir hasta

/55 %ramos de c"lulas ha' 7ue incrementar tanto el instrumental como el personal Para

producir cantidades ma'ores se necesitan instalaciones de tipo industrial

c; Ine"ta)ilidad

Muchas l#neas celulares continuas son inesta$les ' adoptan una dotacin cromo"micaaneu#loide& lo 7ue a!ecta tanto a su velocidad de crecimiento como a su capacidad paradi!erenciarse Es posi$le& por tanto& encontrar di!erencias si%ni!icativas en la l#nea

celular de una %eneraci)n a la si%uiente 8a >nica manera de evitarlo es emplear l#neas

esta$les 7ue se resiem$ran cada determinado tiempo o despu"s de un determinado

n>mero de %eneraciones a partir de un stoc con%elado


11/12


d; De"di+erenciacin e identi+icacin de la" c*lula"

Al propa%arse la l#nea celular& las c"lulas #ierden la" caracter,"tica" +enot,#ica"propias del tejido de procedencia Este !en)meno se denomina desdi!erenciaci)n '&

entre otras& cosas se hacen m)viles e inician su proli!eraci)n 8a relaci)n entre las

c"lulas cultivadas ' las c"lulas ori%inales del tejido puede perderse En este caso "enece"itan marcadore" e"ta)le" 0ue #ermitan identi+icar la #rocedencia de la"c*lula" En al%unos casos es posi$le revertir la desdi!erenciaci)n& $ien por

procedimientos de di!erenciaci)n inducida por hormonas& $ien por compuestos

7u#micos *"steres de !or$ol+ pero no est( claro si el estado redi!erenciado es e7uivalente

al estado de di!erenciaci)n in vivoH

e; Validez del modelo 2in vitro2

En realidad& un cultivo celular es un dis%re%ado celular de un tejido ' se di!erencia de

"ste en 7ue

I "e !a #erdido la or&anizacin e"#acial tridimen"ionalpropia del tejido 'a 7ue"stas se propa%an en dos dimensiones

I "e !an #erdido la" interaccione" entre los distintos tipos celulares ' entre lasc"lulas ' la matri2 e-tracelular Adem(s& al !ormarse una l#nea celular s)lo se

conservan uno o dos tipos celulares *los 7ue proli!eran a ma'or velocidad+

I

carece de lo" com#onente" "i"t*mico" im#licado" en la re&ulacin de lahomeostasis in vivoH& especialmente los sistemas nervioso ' endocrino


12/12


I 8a #re"in #arcial de O e" reducida& 'a 7ue no ha' un transportador deo-#%eno como la hemo%lo$ina Por tanto& la ener%#a se o$tiene principalmente atrav"s de la %licolisis& 'a 7ue el ciclo de Fre$s jue%a un papel mu' reducido

Por tanto& hemos de ser precavidos en cuanto a la valide2 de los resultados o$tenidos in

vitroH por7ue pueden di!erir de lo 7ue pueda o$servarse in vivoH

Cultivo Celular Por Antonio Crespo Gomez

Documents

Transcript of Cultivo Celular Por Antonio Crespo Gomez