Manual Biologia Celular

Universidad Autónoma de Baja California

Facultad de Medicina y Psicología

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ML – Manual de Laboratorio de Biología Celular Página 1 de 68

GC-FR-012 Rev. 3

Manual de Laboratorio de Biología Celular

Clave de la materia: 11268

Plan de estudios 2010-1

Laboratorio 3

Autor o autores: Dr. Carlos Vera

Dra. Diana Bueno Dr. Horacio Almanza

Elaboró Revisó Autorizó

Dr. Horacio Almanza M. C. Christian Rodríguez A DR. Renán González Ramírez



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ÍNDICE

Sesión No.

Nombre de la sesión Pagina

1 Encuadre, clasificación y separación de Residuos Peligrosos Biológico-Infecciosos (RPBI) generados en el Laboratorio

5

2 Uso del microscopio óptico y técnicas avanzadas de microscopía 14

3 Preparación de soluciones y manejo de báscula analítica y pHmetro 21

4 Fragilidad osmótica del eritrocito 23

5 Tecnología del DNA recombinante (clase teórica) 25

6 Manejo de Micropipetas 29

7 Purificación de DNA 36

8 Enzimas de restricción 39

9 Electroforesis de ADN en gel de agarosa 42

10 Gráfica de resultados de electroforesis 44

11 Bases teóricas de la electroforesis de proteínas (clase teórica) 46

12 Electroforesis de Proteínas 48

13 Transfección de bacterias con plásmido pGLO 57

14 Observación de resultados de transfección 60

15 Cultivos celulares (clase teórica/practica) 62

16 Resultados del mantenimiento de cultivos celulares (clase teórica/practica) 66



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PRÓLOGO El principal motivo de publicar este manual es proveer a los estudiantes de la Facultad de Medicina y Psicología de la Universidad Autónoma de Baja California campus Tijuana, con una guía útil sobre los protocolos que actualmente se aplican en el Laboratorio de Biología Celular. En esta edición del manual se incorporan las diferentes competencias de forma clara, a la vez que proporciona información experimental esencial. I. Introducción. Este Manual de Laboratorio de Biología Celular está destinado a los estudiantes del curso de Biología Celular y está escrito en un estilo interesante y expresivo. Presenta, de modo condensado y claro, una descripción de las relaciones estructurales y funcionales más importantes entre los procesos celulares. Cubre un amplio espectro: desde las bacterias hasta las formas especializadas de las células de los animales y las plantas superiores, y desde los componentes de las biomembranas hasta las complejas estructuras implicadas en las interacciones entre las células. Proporciona información sobre las bases químicas, físicas, metodológicas y posibilidades de la biología celular. Incluye numerosos esquemas y en algunas sesiones figuras originales, a dos colores, que contribuyen a dar mayor claridad al texto. II. Competencia general de la asignatura. Comprender la célula como unidad funcional de un organismo complejo (como el ser humano), a través de los mecanismos moleculares que integran la estructura y función celular, para así poder comprender el funcionamiento de tejidos, órganos y sistemas en condiciones normales e inferir las causas que originan un estado patológico, con una actitud responsable y de compromiso hacia su formación. III. Reglamento de laboratorio de biología celular. Normas de orden. a) Los alumnos deben esperar fuera del laboratorio hasta que el maestro o instructor

llegue y éstos les indiquen que pueden entrar. Si los maestros o instructores no se presentan al laboratorio las prácticas no podrán realizarse, y es responsabilidad de los técnicos de laboratorio que los alumnos permanezcan fuera de él.

b) Los alumnos deben solicitar autorización al profesor de la materia para salir del laboratorio. Los alumnos deberán presentarse con un máximo de 10 minutos de retardo, con más tiempo de retardo el alumno perderá el derecho a la práctica correspondiente.

c) Los alumnos deben usar BATA BLANCA, LARGA Y LIMPIA, para ingresar al laboratorio. Deben ponerse la bata antes de ingresar así como quitársela a la salida, la cual doblarán y colocarán en una bolsa de plástico para su lavado en casa.

d) Deben presentarse al laboratorio adecuadamente preparados con su manual, previamente consultado sobre la sesión o práctica correspondiente. De no cubrir este requisito no podrán efectuar la práctica.

e) Debe leer con detenimiento la técnica a seguir, en caso de existir dudas consultar antes de iniciar la práctica al instructor o el profesor.

f) El trabajo de laboratorio requiere de orden y silencio, por lo que cualquier alumno que juegue o altere el orden dentro del laboratorio podrá ser expulsado de la práctica y se



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le anotara inasistencia. Si reincide podrá ser sujeto a suspensión temporal o permanente del curso, sujeto a criterio del maestro.

g) El aseo del laboratorio es de primordial importancia, por lo que los alumnos deben cooperar a mantener limpia su mesa de trabajo y el material que así se lo requiera. La basura debe depositarse en los basureros.

h) Por ningún motivo pueden permanecer los alumnos en el laboratorio después de la salida del maestro o instructor.

IV. Mecanismos de evaluación y evidencia de desempeño en el laboratorio de biología celular. El laboratorio de Biología celular se evaluara bajo el siguiente esquema:

Evaluación Tópico a evaluar

Valor Descripción del tópico a evaluar

Asistencia Puntualidad y asistencia 5 % El alumno se presenta oportunamente a la práctica y con la indumentaria

y los requerimientos solicitados.

Participación en la sesión

Evaluación de destrezas

65%

El alumno identificara y dispondrá de los residuos peligrosos biológico-infecciosos (RPBI) en la estación de destreza y evaluación de RPBI con una eficiencia del 100%.

Exposición de articulo de

investigación

Se asignara a los alumnos un artículo (en ingles) de investigación en un tema relevante a biología celular. Se evaluara a través de la traducción del artículo y la exposición.

Cuestionario

El alumno interpretara los resultados de las diferentes sesiones con responsabilidad y ética.

Calidad del reporte

El alumno elaborara una conclusión sobre la competencia aprendida en las diferentes sesiones.

Examen Examen departamental 30

Comprender la célula como unidad funcional de un organismo complejo (como el ser humano), a través de los mecanismos moleculares que integran la estructura y función celular, para así poder comprender el funcionamiento de tejidos, órganos y sistemas en condiciones normales e inferir las causas que originan un estado patológico, con una actitud responsable y de compromiso hacia su formación en las diferentes sesiones realizadas en el laboratorio de biología celular.



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IV. PROGRAMACIÓN DE PRÁCTICAS 1. Sesión 1: Encuadre, clasificación y separación de Residuos

Peligrosos Biológico-Infecciosos (RPBI) generados en el Laboratorio y bioseguridad en la práctica médica.

2. Competencia a desarrollar en la sesión. Manejar los RPBI, identificando, separando, disponiendo en los recipientes adecuados y anotando en la bitácora correspondiente, para mantener el sitio de trabajo tal y como está consignado en la NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002 y la guía de cumplimiento de la Norma Oficial Mexicana y evitar la contaminación y los accidentes, con responsabilidad, disciplina y honradez. 3. Mecanismos de evaluación y evidencia de desempeño. Que el alumno identifique y disponga los residuos peligrosos biológico-infecciosos (RPBI) en la estación de destreza y evaluación de RPBI con una eficiencia del 100%. 4. Fundamento teórico e información de apoyo.

En la sesión 1: Encuadre: • Normatividad en el laboratorio • Responsabilidades ante el SGC • Buenas prácticas de laboratorio • Criterios de evaluación del laboratorio • Características del reporte de prácticas • Uso del manual de prácticas • Sanciones • Para primero y segundo semestre realizar la sesión de RPBI dando a conocer la

NOM-087-SSA-SEMARNAT-2002 en estaciones y descripción de su aplicación. Para tercer, cuarto y quinto semestre hablar sobre la importancia de manejo adecuado de RPBI y su aplicación en hospitales, consultorio y casa; además de señalar los que se generan en el laboratorio específico (Nota: hay libre practica para cada maestro adapte le sesión a su semestre).

En la realización de las prácticas del Laboratorio de Biología Celular, se generan RPBI por lo que es importante conocer y aplicar las Normas Oficiales Mexicanas en especial la NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002 y la guía de cumplimiento de la Norma Oficial Mexicana. Los generadores de RPBI son los lugares públicos, sociales o privados, fijos o móviles cualquiera que sea su denominación, que estén relacionados con servicios de salud y que presten servicios de atención médica ya sea ambulatoria o para internamiento de seres humanos y utilización de animales de bioterio o zooterio. En las áreas de generación de los establecimientos generadores, se deberán separar y envasar todos los residuos peligrosos biológico-infecciosos, de acuerdo con sus características físicas y



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biológicas infecciosas, conforme a la Norma Oficial Mexicana. Durante el envasado, los residuos peligrosos biológico-infecciosos no deberán mezclarse con ningún otro tipo de residuos municipales o peligrosos.

Los generadores y prestadores de servicios, además de cumplir con las disposiciones legales aplicables deben: cumplir con las disposiciones correspondientes a las siguientes fases de manejo, según el caso:

a) Identificación de los residuos.

b) Envasado de los residuos generados.

c) Almacenamiento temporal.

d) Recolección y transporte externo.

e) Tratamiento.

f) Disposición final.

El laboratorio debe contar con señalamientos y letreros alusivos a la peligrosidad de los mismos, en lugares y formas visibles, el acceso a esta área sólo se permitirá al personal responsable de estas actividades. Algo importante para considerar es minimizar la generación de RPBI identificando y segregando los materiales que NO los contengan, por ejemplo: papel de envoltura de gasa estéril, envoltura de la jeringa, protector de las agujas, etc. En el desarrollo de las actividades se deberá separar adecuadamente los materiales que son reciclables, depositándolos en los recipientes destinados para su posterior tratamiento y recuperación (Ejemplo: tubos de ensayo, matraces, etc.). En el manejo de RPBI se deberán utilizar los implementos de protección personal para su manejo e identificar los sitios designados en el laboratorio para depositarlos.

En esta práctica se dará disposición a los residuos biológicos peligrosos basándonos como lo menciona la NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002 según corresponda al tipo de contenedor y color. Los RPBI que se generan en el desarrollo de una práctica de los laboratorios (Microbiología, Parasitología, Biología Celular, Patología, Histología) pueden ser los siguientes: tubos con sangre, jeringas, algodones, como se realiza el envasado de los residuos según la clasificación.

Los tubos con las muestras de sangre en recipiente hermético Rojo, si los tubos son de plástico se pueden envasar en una bolsa Roja y depositar en el área de RPBI en trancito dentro del laboratorio para que posteriormente pase al área de almacén temporal general de la Facultad. Cultivos y cepas que se generan en diferentes prácticas se envasaran en bolsa de plástico roja, cumpliendo las especificaciones que marca la NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002. Patológicos en este laboratorio se pueden generar líquidos patológicos, los que se envasarían en recipientes rígidos amarillos y cuando fuesen sólidos patológicos se envasarían en bolsa amarilla, para depositarlo en el almacén temporal del laboratorio.



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Los punzocortantes se envasan en contenedor rígido rojo como los portaobjetos, cubreobjetos, agujas, lancetas, estos se depositan en el área de almacén temporal del laboratorio. En caso de tener algún incidente respecto a los RPBI se debe de seguir el manual de bioseguridad (LC-ML-002_Manual_de_bioseguridad) donde se cuenta con las instrucciones dependiendo del incidente que se trate y se soluciona con el material para esta contingencia que se encuentra localizado en el área de manuales de laboratorio. Residuos no anatómicos se generan guantes gasas, abate lenguas, cubre bocas, etc., los cuales se envasan en bolsa roja en la área de almacén temporal del laboratorio.

TABLA No. 1: ENVASADO DE RPBI

Denominación Estado físico Envasado Descripción

Sangre

Liquido

Envase Rojo Hermético

La sangre y sus componentes, sólo en su forma líquida, así como sus derivados no comerciales, incluyendo las células progenitoras, hematopoyéticas y las fracciones celulares o acelulares de la sangre resultante (hemoderivados), Suero y plasma tubo de vidrio.

Sólido y líquidos en recipientes con tapa

Bolsa roja

Coágulo, suero y plasma en tubo de plástico con tapadera.

Cultivos y cepas de agentes infecciosos

Solidó

Bolsa roja

Cultivos en caja y placas de Microescan

Solidó

Recipiente hermético

Cultivos en Tubos de vidrio

Sólidos

Guantes contaminados, medios de transporte, asas de plástico.



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El área temporal de depósito se encuentra previamente señalada en el Laboratorio con el símbolo universal que lo identifica, todos los recipientes que contienen RPBI deben ser colocados en estos sitios.

Ejemplos de áreas temporales (RPBI) previamente señaladas en el laboratorio

Bolsa roja

Liquido

Recipiente hermético

Colorantes y líquido de enjuague de tinciones.

Patológicos

Sólido/liquido

Bolsa Amarilla / Envase amarillo

Biopsias, órganos, animales, tejidos.

Residuos no anatómicos

Sólido

Bolsa Roja

Gasas, hisopos, papel, guantes, algodón que se encuentre empapado de sangre u otro contaminante, Tiras reactivas, asas de plástico, placas de reacción, cubetas de plástico para el espectro, jeringas, pipetas transfer de plástico, abatelenguas

Residuos punzocortantes

Sólido

Envase rojo hermético para punzocortantes

Lancetas, agujas, agujas de bolsa de sangría, capilares de hematocrito, aplicadores, tubos rotos, portaobjetos y cubreobjetos, puntillas, jeringas de insulina.



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De acuerdo a la NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002 el personal responsable del manejo de los RPBI (sangre, cultivos y cepas de agentes infecciosos, patológicos, residuos no anatómicos y objetos punzocortantes), realiza otras actividades como es: recolección y transporte al almacén general (por el personal de mantenimiento), almacenamiento y entrega a la empresa tratadora (Técnicas medioambientales WINCO), elaboración de registros, bitácoras, reportes, capacitación, monitoreo, disposición y tratamiento interno y externo. ¿Cuáles son las recomendaciones para llevar a cabo la recolección y el transporte interno de los RPBI? 1.- Recolección y Transporte Interno: Consiste en la recolección y el traslado de los desechos desde los sitios de generación hasta el almacenamiento temporal y final.



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¿Cuáles son los requisitos para el almacenamiento temporal?

Una vez realizada la recolección interna por el personal encargado, se deberán transportar los residuos al área específica denominada almacén temporal, (menos los generadores de RPBI clasificados en el nivel I de acuerdo con la NOM-087-SEMARNATSSA1-2002). Esta área sirve para el acopio y almacenamiento de los residuos, mismos que serán almacenados dentro de los carros de recolección y deberán estar rotulados con el símbolo universal de riesgo biológico, con la leyenda “RESIDUOS PELIGROSOS BIOLÓGICO-INFECCIOSOS”.

¿Cuál es el periodo de almacenamiento temporal máximo de acuerdo al nivel del establecimiento generador?



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Existen tres niveles de generación de residuos según la Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002 y los periodos de almacenamiento temporal están sujetos al nivel de generación de los R.P.B.I. como se muestra a continuación.

NIVEL I NIVEL II NIVEL III

Unidades hospitalarias de 1 a 5 camas e instituciones de investigación con excepción de los señalados en el Nivel III.

Laboratorios clínicos y bancos de sangre que realicen análisis de 1 a 50 muestras al día.

Unidades hospitalarias psiquiátricas.

Centros de toma de muestras para análisis clínicos.

Unidades hospitalarias de 6 hasta 60 camas;

Laboratorios clínicos y bancos de sangre que realicen análisis de 51 a 200 muestras al día;

Bioterios que se dediquen a la investigación con agentes biológico-infecciosos, o

Establecimientos que generen de 25 a 100 kilogramos al mes de RPBI.

Unidades hospitalarias de más de 60 camas;

Centros de producción e investigación experimental en enfermedades infecciosas;

Laboratorios clínicos y bancos de sangre que realicen análisis a más de 200 muestras al día, o

Establecimientos que generen más de 100 kilogramos al mes de RPBI.

El periodo de almacenamiento temporal estará sujeto al tipo de establecimiento generador, como sigue:

(a) Nivel I: Máximo 30 días.

(b) Nivel II: Máximo 15 días.

(c) Nivel III: Máximo 7 días.

¿Qué se debe hacer para realizar la recolección y transporte externo de los RPBI? La recolección y el transporte externo de los RPBI, deberá realizarse conforme a lo dispuesto en los ordenamientos jurídicos aplicables y además cumplir con lo siguiente: 1. Sólo podrán recolectarse los residuos que cumplan con el envasado, embalado y etiquetado o rotulado como se establece en la Norma. 2. Los residuos peligrosos biológico-infecciosos no deberán ser compactados durante su recolección y transporte.



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3. Los contenedores deben ser desinfectados y lavados después de cada ciclo de recolección. 4. Los vehículos recolectores deben ser de caja cerrada y hermética, contar con sistemas de captación de escurrimientos, y deberán contar con sistemas de refrigeración para mantener los residuos a una temperatura máxima de 4° C. 5. Además los vehículos con capacidad de carga útil de 1,000 kg o más deberán operar con sistemas mecanizados de carga y descarga. 6. Durante su transporte, los RPBI sin tratamiento no deberán mezclarse con ningún otro tipo de residuos.

¿En qué consiste el tratamiento de RPBI? Los RPBI serán tratados por métodos físicos o químicos que garanticen la eliminación de microorganismos patógenos y deben hacerse irreconocibles para su disposición final en los sitios autorizados. Cuando un objeto tiene agentes biológico-infecciosos se dice que es un objeto séptico. Cuando una cosa está libre de estos agentes se dice que es un material aséptico, es decir, que hay asepsia. Cuando se aplican medidas para eliminar a estos agentes se dice que se aplica antisepsia. Estas medidas pueden ir desde el aseo o limpieza, la higiene, la desinfección, o la esterilización. Los métodos de tratamiento que apliquen tanto a establecimientos generadores como a prestadores de servicio dentro o fuera de la instalación del generador, requieren autorización previa de la SEMARNAT, sin perjuicio de lo establecido por la Secretaría de Salud de conformidad a las disposiciones aplicables a la materia.

Norma Oficial Mexicana NOM-003-SSA2-1993, Para la disposición de sangre humana y sus componentes con fines terapéuticos.

Norma Oficial Mexicana NOM-010-SSA2-1993, Para la prevención y control de la infección por Virus de la Inmunodeficiencia Humana.

Norma Oficial Mexicana NOM-013-SSA2-1994, Para la prevención y control de las enfermedades bucales.

Norma Oficial Mexicana NOM-036-SSA2-2002, Prevención y control de enfermedades. Aplicación de vacunas, toxoides, sueros, antitoxinas e inmunoglobulinas en el humano.

5. Equipo, Instrumental, Material e insumos.

a) Recipientes y bolsas especiales para depósito de RPBI b) Jeringas, tubos, gasas, asas de inoculación, caja petri y todo el material que potencialmente pueda generarse en los diferentes laboratorios y áreas generadoras. 6. Metodología de la sesión.



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Se realizara una introducción sobre el reglamento para trabajar en los diferentes laboratorios de la FMP, posteriormente se comentara una descripción de la NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002 y se realizara un ensayo con una estación de destreza que contenga diferentes residuos producidos en el laboratorio (jeringas, tubos, gasas, asas de inoculación, caja petri y punzocortantes) para que el alumno identifique y disponga los residuos peligrosos biológico-infecciosos (RPBI) con una eficiencia del 100%. 7. Bibliografía. Ver al final del manual.



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1. Sesión 2: Uso del microscopio óptico y técnicas de microscopia.

2. Competencia a desarrollar en la sesión. Será competente en el manejo adecuado del microscopio óptico, observando laminillas e identificando diferentes tipos de células teñidas con hematoxilina e inmuno-histoquímica para que en la práctica médica pueda realizar un buen uso del microscopio óptico. 3. Mecanismos de evaluación y evidencia de desempeño. Cuestionario ¿Cuáles son las diferentes partes del microscopio? ¿Cuál es la diferencia entre las tinciones de hematoxilina e inmuno-histoquímica? Los resultados deben de ser reportados e interpretados con responsabilidad y ética. Elaboración de una conclusión sobre la competencia aprendida. 4. Fundamento teórico e información de apoyo.

El microscopio (de micro: pequeño, y scopio: observar) es un instrumento que permite observar objetos que son demasiado pequeños para ser vistos a simple vista. El tipo más común y el primero que se inventó es el microscopio óptico. Se trata de un instrumento óptico que contiene una o varios lentes que permiten obtener una imagen aumentada del objeto y que funciona por refracción. La ciencia que investiga los objetos pequeños utilizando este instrumento se llama microscopía. En general, cualquier microscopio requiere los siguientes elementos: una fuente (como un haz de fotones o de electrones), una muestra sobre la que actúa dicha fuente, un receptor de la información proporcionada por la interacción de la fuente con la muestra, y un procesador de esta información (en general, una computadora). Las partes que tiene un microscopio son las siguientes: los oculares, el cabezal, el brazo, los objetivos, un condensador, el macrómetro y micrómetro, la base, la platina y una fuente de luz.



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Figura 1: Se muestran las diferentes partes que componen el microscopio óptico. Dadas las dimensiones extremadamente pequeñas de los objetos materiales que estudia, la biología celular y molecular depende más de instrumentos y técnicas en comparación a cualquier otra rama de la biología. Por consiguiente, para estudiar estas materias es necesario conocer y manejar adecuadamente un microscopio de luz, instrumento que permitió a los biólogos descubrir la existencia física de la célula. Adicionalmente al uso del microscopio óptico tradicional, existen técnicas avanzadas de microscopía que nos permiten visualizar de una manera más precisa la estructura interna de la célula, ya sea porque permiten un grado mayor de resolución de la imagen o por resaltar ciertos componentes o compartimientos celulares. Las técnicas de microscopía óptica por contraste de fase e interferencia diferencial utilizan las diferencias en el modo de transmisión de la luz a través de regiones celulares con diferente índice de refracción. El uso de marcadores fluorescentes que se fijan a moléculas específicas, permite su visualización al absorber la luz de una cierta longitud de onda y emitirla en otra longitud de onda (más larga). Las técnicas de microscopía electrónica permitan visualizar estructuras celulares más allá de la limitación impuesta por la longitud de onda de la luz visible (∼200 nm) (microscopía electrónica de transmisión), y es posible incluso observar estructuras de manera tridimensional (microscopía electrónica de barrido). Tinción de hematoxilina La hematoxilina (C.I. 75290) es un compuesto que se obtiene de la planta leguminosa Haematoxylum campechianum L., conocida también con el nombre de palo de Campeche. Es un producto natural que al ser oxidado constituye una substancia de color morado oscuro denominada hemateína. Se utiliza en histología para teñir los componentes aniónicos (ácidos) de los tejidos, a los que da una coloración violeta. Tiñe intensamente los núcleos de las células, dado que estos contienen ácidos nucleicos ricos en radicales ácidos. Si bien la hematoxilina es una sal neutra, suele ser denominada como un colorante básico, ya que el componente cromógeno reside en el complejo catiónico (básico) de la misma. Es de notar que la tinción histológica por hematoxilina no indica la constitución química de los componentes celulares, sino la densidad de cargas eléctricas negativas de los mismos.

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Figura 2: Microscopio óptico: Se muestran tres cortes de cérvix observados con diferentes lentes (10X, 40X y 100X) teñidos con hematoxilina. Inmuno-histoquímica La inmuno-histoquímica es un estudio histopatológico que se basa en la utilización de un anticuerpo específico, previamente marcado mediante un enlace químico con una enzima que puede transformar un sustrato en visible, sin afectar la capacidad del anticuerpo para formar un complejo con el antígeno, aplicado a una muestra de tejido orgánico, correctamente fijada e incluida en parafina. El complejo antígeno - anticuerpo así formado, mediante la utilización de alguna de las técnicas específicas (peroxidasa, antiperóxidas, fluoresceína, etc.), permite ser localizado e identificado dentro de las muestras tisulares o citológicas a estudiar, logrando la identificación de marcadores antígenos característicos de distintas líneas de diferenciación y funcionalismo celular, con lo que se determina el tipo de célula involucrado en la muestra.

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Figura 3: Microscopio óptico: Se muestran tres cortes de cérvix observados con diferentes lentes (10X, 40X y 100X) teñidos por inmuno-histoquímica.

Figura 4: Imágenes de la misma célula utilizando diferentes técnicas de microscopía óptica:

• Superior: microscopía óptica convencional;

• Central: contraste de fase;

• Inferior: interferencia diferencial.



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5. Equipo, instrumental, material e insumos.

Microscopio óptico. Laminillas con diferentes tipos celulares. Papel y líquido para limpieza de lentes de microscopio. Aceite de inmersión. Imágenes representativas de los diferentes tipos de microscopía avanzada. Bata larga Guantes de látex

Figura 5: Imágenes de microscopía utilizando marcadores fluorescentes para componentes celulares específicos. Izquierda: filamentos de actina; Central: microtúbulos; y Derecha: filamentos intermedios.

Figura 6: Microscopía electrónica. Izquierda: Imagen de barrido del estereocilio de una célula del oído interno; Derecha: Imagen de transmisión de una mitocondria.



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Lentes protectores 6. Metodología de la sesión.

A. El alumno (a) deberá dominar los siguientes temas antes de iniciar la práctica:

1. Unidades y equivalencias correspondientes a micrómetros (μm) y nanómetros (nm) 2. Cuanto miden generalmente las células procariotas y las eucariotas 3. Cuál es la longitud de onda del espectro visible en humanos

B. El instructor (a) mostrará imágenes representativas de cada una de las técnicas avanzadas de microscopía. C. El instructor (a) mostrará los elementos más importantes de un microscopio óptico.

D. Se observarán diferentes laminillas bajo el microscopio con el siguiente procedimiento:

a) Coloque la laminilla sobre la platina en el centro, deslizando los clips sujetadores.

b) Verifique que el objetivo que esté colocado para la visualización sea el de menor aumento.

c) Coloque mediante el movimiento de la platina la muestra de estudio en el centro.

d) Mediante el ajuste macrométrico y bajo la visión directa de la platina, acercar la platina al objetivo hasta alcanzar una distancia de 2 mm. aproximadamente entre el cubreobjetos y el objetivo.

e) Posteriormente viendo a través del ocular y usando el ajuste micrométrico, enfocar la muestra a observar. Ajustar el diafragma para mejorar la iluminación.

f) Una vez observando las características de la muestra con el objetivo menor, cambiar el objetivo por el siguiente de mayor aumento. Enfocar la imagen con el ajuste micrométrico y observar la diferencia.

g) “Barrer” la muestra a través de movimientos de arriba hacia abajo en forma de ondas.

h) Cambie nuevamente el objetivo hacia el de mayor aumento. Ajuste nuevamente la imagen con el ajuste micrométrico y ajuste el diafragma para mejor iluminación.

ES IMPORTANTE EL SEGUIMIENTO DE ESTOS PASOS PORQUE DE ESTO DEPENDE EL ÉXITO DE LA OBSERVACIÓN AL MICROSCOPIO.

E. Los alumnos (as) observarán y realizarán un dibujo de lo observado de las laminillas de diferentes tipos celulares.

7. Bibliografía. Ver al final del manual.



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1. Sesión 3: Preparación de soluciones y manejo de báscula analítica y pHmetro.

2. Competencia a desarrollar en la sesión.

Será competente en la utilización de la balanza y del manejo y calibración del pHmetro, comprenderá los conceptos de molaridad, pH y número de Avogadro, así como la importancia de elaborar soluciones en el área de investigación, para que en la práctica médica pueda preparar soluciones con exactitud. 3. Mecanismos de evaluación y Evidencia de desempeño. Cuestionario ¿Cuáles son las diferentes partes de la balanza analítica? ¿Qué es molaridad, pH y número de Avogadro? ¿Como se puede ajustar el pH a una solución? Calidad de las notas de su cuaderno de prácticas. Los resultados deben de ser reportados e interpretados con responsabilidad y ética. Elaboración de una conclusión sobre la competencia aprendida. Y calidad del reporte. 4. Fundamento teórico e información de apoyo. Las soluciones son utilizadas ampliamente en el área de investigación dada la posibilidad de mantener las células en un medio semejante al líquido extracelular, lo que permite la viabilidad y sobrevivencia de las mismas. Estas soluciones varían en su composición dependiendo del tipo celular con el que se trabaje ya que algunas se enriquecen con aminoácidos y albúmina para mantener sus membranas. La característica de estas soluciones es la exactitud con la que se preparan tanto en su composición como en su pH y osmolaridad. El pH con el que se trabaja para cualquier tipo celular es de 7.4 y una osmolaridad de 280-290 mOsm/L. 5. Equipo, instrumental, material e insumos.

a) Balanza

b) Espátula

c) Vaso de precipitados de 500 ml

d) Agitador magnético

e) Mosca para agitación

f) Cilindro graduado de 500 mL

g) Matraz aforado de 250 mL



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h) pHmetro electrónico

i) Soluciones de calibración para pHmetro (pH 4, pH 7 y pH 10)

j) Agua desionizada

k) Solución de hidróxido de sodio 1M y 100 mM

l) HCl concentrado

m) NaCl

n) NaHCO3

o) KCl

p) CaCl2

q) MgSO4

r) KH2PO4

s) Acetato de Sodio

t) Glucosa

6. Metodología de la sesión.

1. El alumno (a) deberá dominar los siguientes conceptos antes de iniciar la práctica:

a) Moles y soluciones molares b) Número de Avogrado c) pH d) Amortiguadores (Buffers)

2. El instructor (a) realizará una demostración práctica de las siguientes destrezas:

a) Preparación de una solución b) Calibración, uso y cuidados del pHmetro c) Los alumnos (as) organizados en equipos de trabajo procederán a preparar soluciones conforme a las instrucciones del profesor (a).

Para la elaboración de las soluciones se harán los cálculos correspondientes para cada sal y así pesar la cantidad requerida. Una vez hechos los cálculos se procederá a pesar cada sal. Estas sales se colocarán en el vaso de precipitado. Se agregará agua desionizada y con un agitador magnético se agitará la solución hasta disolver las sales. Una vez disueltas las sales se procederá a la lectura de pH y se ajustará al volumen final. La solución se llevará a un pH final de 7.4 con HCl y/o hidróxido de sodio. 7. Bibliografía. Ver al final del manual.



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1. Sesión 4: Fragilidad osmótica del eritrocito.

2. Competencia a desarrollar en la sesión. Comprenderá los conceptos de fragilidad osmótica de la membrana eritrocitaria, así como la importancia de los detergentes en las membranas celulares, para que en la práctica médica pueda entender el efecto que tienen los diferentes medicamentos sobre los eritrocitos. 3. Mecanismos de evaluación y evidencia de desempeño. Cuestionario ¿Qué es una solución hipotónica? ¿Qué es una solución hipertónica? ¿Qué es una solución isotónica? Calidad de las notas de su cuaderno de prácticas. Los resultados deben de ser reportados e interpretados con responsabilidad y ética. Elaboración de una conclusión sobre la competencia aprendida. Calidad del reporte.

4. Fundamento teórico e información de apoyo. La membrana eritrocitaria es la más sencilla de las membranas celulares. Esta consta de una doble capa lapida y un esqueleto proteico en su cara citoplasmática. La morfología del eritrocito depende de la osmolaridad del medio en que se encuentra. En condiciones fisiológicas (osmolaridad de 290 mOsm/Kg), el eritrocito tiene forma de disco bicóncavo. En esta práctica se visualizarán al microscopio los cambios morfológicos del eritrocito en medios híper-, normo- e hipo-osmolares.

5. Equipo, instrumental, material e insumos. Equipo:

a) Microscopio óptico

Material:

a) Laminillas portaobjetos

b) Cubreobjetos

c) Papel y líquido para limpieza de lentes de microscopio.

d) 4 tubos de microcentrifuga de 1.6 mL

e) 1 Jeringa de 10 mL con aguja

f) Torniquete para venoclisis

g) 1 tubo recolector de sangre con EDTA o heparina

h) Recipiente hermetico rojo para productos contaminados con sangre



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Insumo:

a) Aceite de inmersión.

b) 500 ml de Solución estéril de NaCl al 1.8%

c) Agua destilada

d) 20 ml de solución de sodio-dodecil-sulfato (SDS) al 0.1%

e) Antiséptico para limpieza de piel antes de la venopunción


1. Antes de la práctica, el alumno estudiará los conceptos de ósmosis, difusión y los principales tipos de transporte de solutos a través de las membranas celulares.

2. Se obtendrá sangre fresca (aprox. 5 mL) de uno de los alumnos del subgrupo, utilizando la técnica apropiada de venopunción y se transferirá la sangre a un tubo conteniendo EDTA o heparina.

3. Preparar una solución NaCl al 1.8% en 1.5ml de agua desionizada. 4. A partir de la solución NaCl al 1.8%, realizar diluciones para obtener las soluciones

de NaCl al 0.9% y al 0.45%. 5. Agregar 1 gota de SDS al 0.1% a una de las soluciones al 0.9%. 6. Colocar 1 gota de sangre a cada una de las soluciones. Mezcle con cuidado. 7. Aplique 1 gota de cada una de las suspensiones obtenidas en una laminilla

portaobjetos y cubra cuidadosamente con un cubreobjetos. Visualice la morfología eritrocitaria al microscopio.




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1. Sesión 5: Tecnología de DNA recombinante (clase teórica).


Comprenderá las principales técnicas utilizadas en biotecnología celular y el impacto de la misma en la medicina moderna, para que en la práctica médica pueda realizar proyectos de investigación en biología celular. 3. Mecanismos de evaluación y evidencia de desempeño. Un artículo por alumno para traducción y exposición en las próximas sesiones, relacionado con la clase de biología celular y las metodologías presentadas en la sesión de Tecnología de DNA recombinante. Discutir los resultados de la práctica. Entrega del reporte de la conclusión de la práctica.

4. Fundamento teórico e información de apoyo. Las ciencias de la salud han experimentado un gran desarrollo en las dos últimas décadas; la aplicación de la biotecnología y la biología molecular ha abierto un prometedor panorama en el que las posibilidades de desarrollar nuevas estrategias diagnósticas y terapéuticas se incrementan día a día. La decodificación del genoma humano y de otros organismos, ha incrementado el entendimiento (incluso hasta el nivel molecular) de diferentes procesos fisiológicos y pato-fisiológicos. México no se puede dar el lujo de ser indiferente y pasivo en el umbral de esta revolución científica; son muy grandes las posibilidades que ofrece en cuanto al cuidado de la salud y es absolutamente indispensable aprovecharlas. Las consecuencias de invertir ahora en la formación de recursos humanos calificados no solo se reflejarán en un mejor estado de salud de la población, sino que además tendrán un impacto financiero enorme, ya que al comparar los costos de prevención de enfermedades frecuentes, frente a los costos de tratamiento crónico y de rehabilitación de sus secuelas y las bajas en la fuerza productiva del país, resulta en un balance económico muy favorable. El no apoyar adecuadamente las ciencias de la salud con un enfoque hacia la biotecnología convertiría a nuestro país en simple espectador de los descubrimientos médicos que se vislumbran, y lo que es peor, lo convertiría en un simple consumidor cautivo de los productos o estrategias desarrollados en otros países. Técnicas más importantes en biología celular.

La centrifugación es un método por el cual se pueden separar sólidos de líquidos de diferente densidad mediante una fuerza rotativa, la cual imprime a la mezcla con una fuerza mayor que la de la gravedad, provocando la sedimentación de los sólidos o de las partículas de mayor densidad. El objetivo de la centrifugación es separar sólidos insolubles (de partículas muy pequeñas difíciles de sedimentar) de un liquido. Para ello, se aplica un fuerte campo centrífugo, con lo cual las partículas tenderán a desplazarse a través del medio en el que se encuentren con la aceleración.



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La purificación de DNA es un paso clave en la experimentación en Biología Molecular. Los métodos de purificación de DNA se clasifican en dos grandes categorías, según pretendan purificar DNA cromosómico o DNA plasmídico. La purificación de DNA plasmídico es la base de cualquier experimento de clonación molecular. El problema principal que hay que resolver es la separación del DNA plasmídico y DNA cromosómico. En esta práctica hemos elegido el método de “lisis alcalina”, por su simplicidad, bajo coste y reproducibilidad. La electroforesis en agarosa permite separar moléculas de DNA, cuando éstas son sometidas a un campo eléctrico y atraídas hacia el polo opuesto a su carga neta. Hay dos fuerzas de acción opuesta que determinan la velocidad de la partícula. Primero, la fuerza eléctrica atrae en DNA hacia el electrodo y la intensidad de la atracción es directamente proporcional a la carga. Segundo, la fuerza de rozamiento se opone a la migración y su intensidad depende del tamaño y la forma de la partícula.

Una enzima de restricción (o endonucleasas de restricción) es aquella que puede reconocer una secuencia característica de nucleótidos dentro de una molécula de ADN y cortar el ADN en ese punto en concreto, llamado sitio o diana de restricción, o en un sitio no muy lejano a éste, dependiendo de la enzima. Los sitios de restricción cuentan con entre 4 y 12 pares de bases, con las que son reconocidos. El mecanismo de corte de DNA se realiza a través de la ruptura de dos enlaces fosfodiéster en la doble hebra, lo que da lugar a dos extremos de DNA. Éstos pueden ser romos (cuando los enlaces rotos coinciden) o Cohesivos/escalonados. Estos últimos tienen tendencia a volver a unirse de modo espontáneo, ya que los extremos se pueden unir a otros extremos coincidentes que pueda haber en la cercanía.

En biología molecular, transformación es la alteraciones genéticas resultantes de introducir ADN por virus (transducción) o por contactos intercelulares entre bacterias (conjugación). A la transformación de células animales se le llama transfección. El término transformación es también usado, de manera más general, para describir mecanismos de transferencia de ADN o ARN en biología molecular (es decir, teniendo en cuenta más que las consecuencias genéticas). Por ejemplo la producción de transgénicos como maíz transgénico requiere la inserción de nueva información genética en el genoma del maíz usando el mecanismo apropiado de transferencia de ADN; el proceso se le llama comúnmente transformación.

La clonación del DNA puede definirse como la recombinación in vitro de un fragmento de DNA con un DNA vector con capacidad de replicación autónoma. El fragmento de DNA se replicará junto con el DNA vector en la célula hospedadora y así será posible obtenerlo en un número elevado de copias. Las etapas básicas son:

1) Extracción y fragmentación específica del DNA del organismo que nos interesa. 2) Unión de los fragmentos de DNA: fragmento del DNA que nos interesa + vector de transformación y replicación. 3) Introducción en las células receptoras del DNA recombinante. 4) Selección de colonias aisladas que porten moléculas de DNA recombinante.



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La secuenciación de ADN es un conjunto de métodos y técnicas bioquímicas cuya finalidad es la determinación del orden de los nucleótidos (A, C, G y T) en un oligonucleótido de ADN. La secuencia de ADN constituye la información genética heredable del núcleo celular, los plásmidos, la mitocondria y cloroplastos (En plantas) que forman la base de los programas de desarrollo de los seres vivos. Así pues, determinar la secuencia de ADN es útil en el estudio de la investigación básica de los procesos biológicos fundamentales, así como en campos aplicados, como la investigación forense. El desarrollo de la secuenciación del ADN ha acelerado significativamente la investigación y los descubrimientos en biología. Las técnicas actuales permiten realizar esta secuenciación a gran velocidad, lo cual ha sido de gran importancia para proyectos de secuenciación a gran escala como el Proyecto Genoma Humano. Otros proyectos relacionados, en ocasiones fruto de la colaboración de científicos a escala mundial, han establecido la secuencia completa de ADN de muchos genomas de animales, plantas y microorganismos.

La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (Polymerase Chain Reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis, ]cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde.Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.

El Western blot, o inmunoblot, es una técnica analítica usada para detectar proteínas específicas en una muestra determinada (una mezcla compleja de proteínas, como un extracto tisular). Mediante una electroforesis en gel se separan las proteínas atendiendo al criterio que se desee: peso molecular, estructura, hidrofobicidad, etc. Hay casi tantas posibilidades como tipos de electroforesis existen. Luego son transferidas a una membrana adsorbente (típicamente de nitrocelulosa o de PVDF) para poder buscar la proteína de interés con anticuerpos específicos contra ella. []Finalmente, se detecta la unión antígeno-anticuerpo por actividad enzimática, fluorescencia... De esta forma se puede estudiar la presencia de la proteína en el extracto y analizar su cantidad relativa respecto a otras proteínas. Esta técnica es hoy en día imprescindible en varios campos de la biología, como la biología molecular, la bioquímica, la biotecnología o la inmunología. Existe toda una industria especializada en la venta de anticuerpos (monoclonales y policlonales) contra decenas de miles de proteínas diferentes.

La terapia génica consiste en la inserción de copias funcionales de genes defectuosos o ausentes en el genoma de un individuo. Se realiza en las células y tejidos con el objetivo de tratar una enfermedad. La técnica todavía está en desarrollo, motivo por el cual su aplicación se lleva principalmente a cabo dentro de ensayos clínicos controlados, y para el tratamiento de enfermedades severas, bien de tipo hereditario o adquirido.

• Terapia génica somática: se realiza sobre las células somáticas de un individuo, por lo que las modificaciones que implique la terapia sólo tienen lugar en dicho paciente.



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• Terapia in vivo: la transformación celular tiene lugar dentro del paciente al que se le administra la terapia. Consiste en administrarle al paciente un gen a través de un vehículo (por ejemplo un virus), el cual debe localizar las células a infectar. El problema que presenta esta técnica es que es muy difícil conseguir que un vector localice a un único tipo de células diana.

• Terapia ex vivo: la transformación celular se lleva a cabo a partir de una biopsia del tejido del paciente y luego se le trasplantan las células ya transformadas. Como ocurre fuera del cuerpo del paciente, este tipo de terapia es mucho más fácil de llevar a cabo y permite un control mayor de las células infectadas. Esta técnica está casi completamente reducida a células hematopoyéticas pues son células cultivables, constituyendo así un material transplantable.

• Terapia génica germinal: se realizaría sobre las células germinales del paciente, por lo que los cambios generados por los genes terapéuticos serían hereditarios. No obstante, por cuestiones éticas y jurídicas, ésta clase de terapia génica no se lleva a cabo hoy en día.

5. Equipo, instrumental, material e insumos. No aplica

6. Metodología de la sesión. El instructor (a) expondrá la clase teórica sobre las técnicas más importantes en biología celular. Centrifugación y separación de organelos. Purificación de DNA Electroforesis en agarosa Enzimas de restricción Transformación Clonación de DNA Secuenciación de ADN Reacción de polimerasa en cadena Western, Northern y Southern- Blot Análisis de huellas digitales de DNA Terapia génica 7. Bibliografía. Ver al final del manual.



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1. Sesión 6: Manejo de micropipetas.


Será competente en el manejo adecuado de las micropipetas y la importancia en experimentación de la exactitud en el volumen de los reactivos, para que en la práctica médica pueda realizar un buen uso de la nanociencia. 3. Mecanismos de evaluación y evidencia de desempeño. Cuestionario ¿Qué es nanociencia? ¿Cómo se puede descalibrar una micropipeta? ¿Cuáles son las diferentes partes de la balanza analítica? Calidad de las notas de su cuaderno de prácticas. Exposición y discusión del artículo por los alumnos. Elaboración de una conclusión sobre la competencia aprendida. 4. Fundamento teórico e información de apoyo.

El uso preciso de micropipetas es de suma trascendencia en las técnicas de biología molecular. La mayoría de las reacciones involucran volúmenes muy pequeños (en el orden de los microlitros –μL-) por lo que cualquier error en la manipulación de los mismos puede generar errores difíciles de detectar e incluso afectar el resultado final del experimento. Las micropipetas automáticas nos han aportado mayor practicidad y bioseguridad. Una mayor velocidad para dispensar muestras y reactivos con excelente precisión y sin posibilidad de contaminación entre ellos; en técnicas donde el tiempo operativo resultaba crítico, como ser en reacciones enzimáticas. Tiempo después, la gran mayoría de estas pruebas de laboratorio fueron automatizadas. Demás está decir su excelente practicidad, precisión y seguridad cuando se desarrollaron las técnicas inmunoanalíticas, mucho más aun con el desarrollo de las técnicas de PCR, donde han mejorado la calidad de los materiales utilizados en su construcción con la posibilidad de ser autoclavables En los últimos 20 años tomamos mayor conciencia de las enfermedades a la que podíamos estar expuestos en la manipulación de fluidos biológicos, la necesidad de no contaminar ensayos con residuos no deseables para los mismos, el incremento del número de muestras a procesar y por sobre todo, la tendencia de tener un mayor control sobre la calidad de los ensayos con la utilización de pequeños volúmenes de muestra en cada uno de ellos. Fue por ello que los equipos automáticos y la generalizada utilización de micropipetas provocaron un cambio fundamental en las prácticas de laboratorio.



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Fue también, con el nacimiento del inmunoanálisis en la década de los años 60, con técnicas isotópicas y posteriormente con las técnicas no isotópicas en la década de los años 80, la necesidad de dispensar los reactivos tales como soluciones radiactivas en el caso de las isotópicas (RIA e IRMA), cumpliendo con las medidas de radioprotección y las no isotópicas (EIA y ELISA) para manipular reactivos altamente cancerígenos, hicieron que su utilización se transforme en una necesidad imprescindible. Tampoco podemos dejar de lado la necesidad de una alta precisión requerida para dispensar las muestras, calibradores y controles de calidad, donde el volumen de los mismos es una consecuencia de las masas que entran en juego en una inmunoreacción primaria en el inmunoanálisis; podemos mencionar a modo de ejemplo que en un ensayo de Estradiol por alguna de las técnicas inmunoanalíticas, el cálculo de la concentración en una muestra biológica dependerá de la interpolación de una curva de calibración comprendida entre menos y más 2 veces la Kd. del anticuerpo involucrado en el ensayo. Los volúmenes utilizados de los calibradores, muestras y estándares de ese ensayo son constantes y oscilan entre 50 y 100 μL, según sea el desarrollo del sistema inmunoanalítico de una empresa productora de reactivos, el rango de masas de Estradiol en los calibradores estarán comprendidos entre 2 y 200 picogramos contenidos en dichos volúmenes. Es sabido la gran diversidad de marcas, modelos, orígenes o procedencias y precios de las micropipetas que hoy se ofrece en nuestro mercado y el mundo. También es sabido, los que hemos pasado muchos años con el uso de las mismas, de las predilecciones que cada profesional ha tenido por una marca y/o modelo determinado, probablemente se debió a las diferencias existentes que había entre ellas 2 décadas atrás. Hoy no podemos decir que hay micropipetas malas o buenas, luego que en el mundo las empresas han globalizado la producción en escala, la producción OEM, los acuerdos entre compañías, la tercerización de distintas etapas de la producción, muchas marcas históricas europeas o americanas han derivado parte o la totalidad de su fabricación a países asiáticos, como también nuevas marcas han aparecido en el mundo en la última década, todas de muy buena calidad y teniendo un mismo factor común: en muchos casos el mismo fabricante y el mismo origen o país de procedencia. Uso correcto de las micropipetas. Las micropipetas son dispositivos que permiten medir volúmenes pequeños que van desde 1 μl hasta 1 ml o más. Al igual que las pipetas éstas pueden ser para contener o para verter volúmenes. Durante el curso utilizaremos micropipetas para verter, ya sea un volumen fijo o un volumen variable. En las de volumen variable, se puede seleccionar un volumen dentro de un rango de valores determinado. La micropipeta más comúnmente usada en los laboratorios de biología celular fue introducida por la compañía Eppendorf y este nombre se adoptó de forma genérica para estos dispositivos, aunque hoy en día existen una gran cantidad de compañías y modelos similares que funcionan bajo un mismo principio de pistones para operar. Por lo tanto, es aconsejable consultar las instrucciones del fabricante sobre el empleo correcto de cada modelo. Sin embargo, todas ellas utilizan puntas descartables plásticos que se ajustan al extremo de la micropipeta. En estas puntas de plástico es donde se deposita el líquido a medir.



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Figura numeró 1. En la figura 1 se presenta el esquema general de las micropipetas a utilizar durante el curso. A1: botón pulsador, A2: tornillo del botón pulsador, B: rueda dentada de graduación del volumen, C: cono de la pipeta, D: expulsor de punta y E: punta o “tip” descartable. Para absorber el líquido, el pistón es presionado hasta una primera posición, el tip es puesto en contacto con el líquido y luego, lentamente, se permite que el pistón vuelva a su posición original. Este paso permite el llenado del tip con el volumen correspondiente. El tip de plástico generalmente no se seca por fuera ya que se considera que su superficie no absorbe líquido. A continuación se describen las instrucciones específicas para los modelos de micropipetas que se utilizarán durante el curso. 1. Selección de la micropipeta a utilizar según el volumen a dispensar. La mayoría de la micropipetas indican en el botón pulsador el rango o volumen máximo que pueden pipetear. Para prevenir un daño en el mecanismo interno de la micropipeta recuerde nunca sobrepasar los volúmenes máximos permitidos para cada micropipeta. 2. Debido a que la micropipeta tiene un rango de volumen ajustable, es necesario seleccionar el volumen a medir. Para ello se debe localizar el indicador de volumen, compuesto de tres dígitos que se deben leer de arriba hacia abajo. En la parte más baja del indicador hay una escala que permite el ajuste del volumen al último dígito o decimal



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permitido según el caso. En las micropipetas de 2 hasta 200 μl, los dígitos negros indican microlitros y los dígitos rojos representan décimas de microlitro. 3. Ajustar el volumen de la pipeta con el tornillo del botón pulsador (figura 1, A2) o la rueda de graduación del volumen (Figura 1, B), hasta llegar a 1/3 por encima del valor deseado. Luego, lentamente, girando el tornillo o la rueda, disminuir el ajuste hasta el valor deseado prestando atención para no excederlo. Si se excede, es aconsejable repetir el procedimiento de ajuste. Siempre se debe ajustar el volumen deseado desde un volumen más alto disminuyendo las indicaciones del indicador. 4. Seleccionar la punta o tip plástico apropiado para la micropipeta: la punta debe ajustarse al cono de la micropipeta (figura 1). Al insertar la punta en el cuerpo de la pipeta hay que aplicar una fuerte presión con movimiento giratorio para asegurar la hermeticidad. Nunca usar la pipeta con líquidos sin la punta colocada. Es posible que la punta plástica se encuentre en una caja también plástica que facilita su uso. Si la punta no queda bien ajustada o no está en caja, deberá ajustarse con la mano sin tocar la superficie que estará en contacto con la solución a extraer. 5. Aspiración: apretar el botón pulsador hasta el primer tope (figura 2, A) 6. Con la pipeta en posición vertical, sumergir la punta entre 1 mm y 3 mm en la muestra. 7. Lentamente se aspira el líquido al relajar la presión del dedo sobre el botón pulsador (figura 2, B). Si este paso no se realiza con atención, puede entrar aire en la punta y la cantidad de muestra aspirada no es la adecuada. 8. Esperar un segundo y retirar la punta del líquido. 9. Dosificación: colocar la parte inferior de la punta contra la pared interior del recipiente donde se depositará el líquido, con un ángulo entre 10o y 40 o. 10. Apretar el botón pulsador suavemente hasta el primer tope (figura 2, C) y esperar un segundo. 11. Apretar el botón pulsador hasta el segundo tope para vaciar el resto del líquido (figura 2, D). 12. Manteniendo apretado el botón pulsador en el segundo tope, retirar la pipeta deslizando la punta por la pared del recipiente. Soltar luego el botón pulsador (figura 2, E). 13. Expulsar la punta apretando el botón del expulsor (figura 2, F y figura 2, D).



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Figura numeró 2. Posiciones de la micropipeta a la hora de medir un volumen específico. A: Botón pulsador en el primer tope, B: la punta de la micropipeta es sumergida entre 1 mm y 3 mm en la muestra para luego liberar el botón pulsador suavemente hasta su posición original, C: Forma correcta de dispensar el líquido medido en el recipiente correspondiente, D: Posición de la micropipeta al apretar el botón pulsador hasta el segundo tope, E: Vuelta a la posición inicial, F: Expulsión de la punta, la cual debe ser descartada en un recipiente apropiado. Para no dañar el sistema interno de pistones que posee la micropipeta: -el luido nunca debe entrar en contacto con el cono de la micropipeta -nunca vuelque la micropipeta con la parte de arriba hacia abajo -nunca coloque la micropipeta en forma horizontal si la punta tiene líquido -nunca ajuste el volumen fuera del rango de la micropipeta Con respecto a la micropipeta multicanal, éstas tienen la ventaja de que se puede pipetear el mismo volumen al mismo tiempo en varios recipientes a la vez. Estas micropipetas fueron diseñadas principalmente para los ensayos en formato micro, donde se utiliza también un plato de plástico de 96 pozos para trabajar esa cantidad de ensayos de forma simultánea. Las micropipetas multicanal son dispositivos más complejos que las micropipetas unicanal ya que básicamente pueden repetir varias veces la función que realiza esta última en un solo momento. Para ello, poseen un solo mango, botón pulsador, etc pero un cono que permite la inserción de 4 hasta 12 puntas al mismo tiempo. En el curso se utilizarán micropipetas multicanales (12 canales) con un rango de volumen de 50 μl a 300 μl similares a las de la figura 3. Para su uso, se deben tener los mismos cuidados que con las micropipetas unicanal, además de cerciorarse que todas las puntas estén bien colocadas, extrayendo la misma cantidad de solución y que no se observen burbujas de aire en ninguna.



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Figura 3. Micropipeta multicanal (8 canales), modelo Biohit de rango de volumen de 50 μl a 300 μl. Este tipo de micropipeta es muy útil para microensayos semi automatizados o automatizados en platos descartables de 96 pozos.


a) Balanza

b) Micropipetas y puntillas de 100 μL y 1000 μL.

c) Vasos de precipitado 100 mL



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6. Metodología de la sesión. 1.- El alumno deberá dominar las unidades y equivalencias correspondientes a mililitros (mL) y microlitos (μL) antes de iniciar la práctica. 2.- El instructor realizará una demostración práctica del uso de micropipetas. 3.- Cada alumno (a) utilizará las pipetas para cargar diferentes volúmenes en un vaso de precipitado y pesarlo en la balanza. Se procederá a agregar la cantidad referida por el instructor (a) hasta completar el volumen establecido y posteriormente retirarlo hasta vaciar el vaso de precipitado. Se deberá consignar el peso obtenido cada vez que se agregue o retire el volumen tanto durante la carga como durante la descarga del volumen.




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1. Sesión 7: Purificación del DNA.


Será competente en la toma de sangre venosa, así como la importancia de extraer y cuantificar DNA por medio de la medición del radio de absorción 260/280 en el espectrofotómetro, para que en la práctica médica pueda realizar un buen uso de diferente instrumental de laboratorio para investigación o diagnóstico. 3. Mecanismos de evaluación y evidencia de desempeño. Cuestionario ¿Qué es DNA? ¿Cómo se cuantifica el DNA? ¿Cuáles son los diferentes equipos que se utilizan para cuantificar el DNA? Exposición y discusión del artículo por los alumnos. Elaboración de una conclusión sobre la competencia aprendida. Discutir los resultados de la práctica. Entrega del reporte de la discusión de la práctica. 4. Fundamento teórico e información de apoyo.

El kit DNeasy utiliza tecnología avanzada con membranas-geles de silicón para una purificación rápida y eficiente de DNA celular. El sistema buffer esta optimizado para permitir la lisis celular seguida de unión selectiva de DNA a la membrana DNeasy. La centrifugación remueve completamente a los contaminantes e inhibidores enzimáticos como las proteínas y cationes divalentes. El procedimiento DNeasy es sencillo. Las muestras son sometidas a lisis utilizando proteinasa K. Las condiciones de amortiguamiento son las apropiadas para la unión del DNA a la membrana. Después de una centrifugación breve los contaminantes pasan a través de la membrana y los contaminantes remanentes son removidos en 2 fases de lavado. El DNA purificado con DNeasy presenta un radio A260/A280 en el rango de 1.7 a 1.9. 5. Equipo, instrumental, material e insumos.

Equipo:

a) Micro centrífuga Material:

a) Buffers necesarios para purificación de DNA de una muestra de sangre venosa, según el kit DNeasy de Qiagen

b) Buffer PBS



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c) Mini columnas en tubos de 2mL

d) Tubos de micro centrífuga de 1.6 mL

e) 1 Jeringa de 10 mL con aguja

f) Torniquete para venoclisis

g) 1 tubo recolector de sangre con EDTA o heparina

h) Micropipeta de 10μL con pipetas desechables

i) Contenedor para productos contaminados con sangre

j) Marcador permanente de laboratorio (sharpie)

Insumo:

a) Proteinasa K b) Antiséptico para limpieza de piel antes de la venopunción

c) Baño maría a 37 C

d) CTAB (Hexadecyltrimethylamonio bromuro) 6. Metodología de la sesión.

1.-Se obtendrá sangre fresca (aprox. 5 ml) de uno de los alumnos del subgrupo, utilizando la técnica apropiada de venopunción y se transferirá la sangre a un tubo conteniendo EDTA o heparina. 2.- Agregar 20 μL de proteinasa K a un tubo de micro centrífuga de 1.5mL con CTAB 10%. 3.- Añadir 150 μL de sangre anticoagulada al tubo de 1.5mL y 50μ Lde PBS. 4.- Agregar 200 μL de buffer AL. Mezcle por medio de vórtex por pulso por 15 s. 5.- Incubar a 56 C por 10 min. 6.-Centrifugar brevemente (shortspin) para remover los residuos de la tapadera. 7.-Añadir 200 μL de etanol (96-100%) a la muestra y mezclar por vórtex de pulso por 15s. Después de mezclar, centrifugar brevemente. 8.- Agregar el contenido de la muestra a una columna con membrana (en un tubo de 2mL), cierre la tapadera y centrifugue a 8000 rpm por 1min. Coloque la columna en un tubo nuevo de 2mL y elimine el tubo con el filtrado.



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9.- Cuidadosamente abra la tapadera de la columna y añada 500μ L de buffer AW1. Cierre la tapadera y centrifugue a 8000 rpm por 1 min. Coloque la columna en un tubo nuevo y elimine el filtrado. 10.- Abra cuidadosamente la tapadera de la columna y añada 500μ l de buffer AW2. Cierre la tapadera y centrifugue a máxima velocidad por 3 min. Si no hay problemas de AW2 residual, continué con el paso 11, si hay problemas realizar el paso 10.1. 10.1) Opcional. Si hay problemas de buffer AW2 residual, colocar la columna en un tubo nuevo y eliminar el filtrado. Centrifugar a máxima velocidad por 1 min. 11.-Colocar la columna en un tubo nuevo y eliminar el filtrado. Cuidadosamente abra la tapadera de la columna y añada 200μ l de buffer AE o agua destilada. Incubar a temperatura ambiente (15-25 C) por 1 min y centrifugue a 8000 rpm por 1 min. 12.- Medir la concentración de DNA en el espectrofotómetro.

Precauciones especiales: El buffer AL y AW1 contienen una sal caotrópica (hidrocloruro de guanidina), que puede ser irritante. El buffer AW2 contiene ácido de sodio como preservativo. Este es altamente tóxico y puede reaccionar explosivamente con el plomo o cobre de las tuberías.




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1. Sesión 8: Enzimas de restricción.

2. Competencia a desarrollar en la sesión. Entender los principios fundamentales de ingeniería genética, específicamente las enzimas de restricción para su uso como herramienta de la biología molecular. Conocerá la forma de utilización de enzimas de restricción en el laboratorio de Biología Celular. 3. Mecanismos de evaluación y evidencia de desempeño. Cuestionario ¿Qué es una enzima de restricción? ¿Mencione dos experimentos en donde se pueden utilizar las enzimas de restricción? Exposición y discusión del artículo por los alumnos. Elaboración de una conclusión sobre la competencia aprendida.

4. Fundamento teórico e información de apoyo.

Las técnicas que se introducen en esta práctica son las bases de las técnicas de huellas de DNA (fingerprinting) y análisis forense de DNA. Pruebas de ADN, utilización de restos orgánicos para identificar el ácido desoxirribonucleico (ADN) de una persona. Se ha realizado un buen número de pruebas científicas que prueban que el ADN es la base de la herencia, entre las que se pueden destacar: a) en el proceso normal de reproducción celular, los cromosomas (estructuras con ADN) se duplican para proporcionar a los núcleos hijos los mismos genes que la célula madre; b) las mutaciones provocadas se producen por una alteración de la estructura del ADN que tienen como efecto una grave alteración de la descendencia de las células afectadas; c) el ADN extraído de un virus basta por sí mismo para reproducir el virus entero, por lo que parece claro que, en la esfera jurídica y a efectos legales, tiene toda la información genética para ello. Por todo ello, el ADN puede llegar a ser muy útil en Derecho, no sólo para identificar a una persona gracias a los restos orgánicos encontrados donde se haya cometido un crimen (en especial en delitos contra la libertad sexual o en los que se ha ejercido violencia), sino también para determinar la filiación biológica de una persona. Ácido desoxirribonucleico (ADN), material genético de todos los organismos celulares y casi todos los virus. El ADN lleva la información necesaria para dirigir la síntesis de proteínas y la replicación. Se llama síntesis de proteínas a la producción de las proteínas que necesita la célula o el virus para realizar sus actividades y desarrollarse. La replicación es el conjunto de reacciones por medio de las cuales el ADN se copia a sí mismo cada vez que una célula o un virus se reproducen y transmite a la descendencia la información que contiene. En casi todos los organismos celulares el ADN está organizado en forma de cromosomas, situados en el núcleo de la célula.



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ESTRUCTURA Cada molécula de ADN está constituida por dos cadenas o bandas formadas por un elevado número de compuestos químicos llamados nucleótidos. Estas cadenas forman una especie de escalera retorcida que se llama doble hélice. Cada nucleótido está formado por tres unidades: una molécula de azúcar llamada desoxirribosa, un grupo fosfato y uno de cuatro posibles compuestos nitrogenados llamados bases: adenina (abreviada como A), guanina (G), timina (T) y citosina (C). La molécula de desoxirribosa ocupa el centro del nucleótido y está flanqueada por un grupo fosfato a un lado y una base al otro. El grupo fosfato está a su vez unido a la desoxirribosa del nucleótido adyacente de la cadena. Estas subunidades enlazadas desoxirribosa-fosfato forman los lados de la escalera; las bases están enfrentadas por parejas, mirando hacia el interior, y forman los travesaños. Los nucleótidos de cada una de las dos cadenas que forman el ADN establecen una asociación específica con los correspondientes de la otra cadena. Debido a la afinidad química entre las bases, los nucleótidos que contienen adenina se acoplan siempre con los que contienen timina, y los que contienen citosina con los que contienen guanina. Las bases complementarias se unen entre sí por enlaces químicos débiles llamados enlaces de hidrógeno. En 1953, el bioquímico estadounidense James Watson y el biofísico británico Francis Crick publicaron la primera descripción de la estructura del ADN. Su modelo adquirió tal importancia para comprender la síntesis proteica, la replicación del ADN y las mutaciones, que los científicos obtuvieron en 1962 el Premio Nobel de Medicina por su trabajo.


Equipo:

a) Microcentrífuga

Material:

a) Buffer de restricción.

b) Tubos de micro centrífugo

c) Marcador permanente de laboratorio (sharpie)

Insumo:

a) Fago Lambda DNA

b) Enzimas de restricción (Eco RI, Pst I, Hind III, RNApolimerasa)

c) DNA Lambda

d) Baño maría a 37 º C

e) Hielo.



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El alumno (a) deberá dominar antes de la práctica los temas relacionados con enzimas de restricción, funcionamiento y aplicaciones, previamente discutidos en la práctica 6.

1) Tome los eppendorf que contienen la solución stock de enzimas, DNA lambda y buffer de restricción. Mantenga todas las enzimas de restricción en hielo.

2) Tome un eppendorf de cada color y ponga una etiqueta:

Claro= L = DNA Lambda

Violeta= P = Pst I

Verde= E = Eco RI

Naranja= H = Hind III

Coloque los reactivos en cada tubo de acuerdo a la tabla siguiente:

Tubo DNA Buffer Pst I Eco R1 Hindi

L

4 μ l 6 μ l ---- ------ ---------

P

4 μ l 5 μ l 1 μ l ------ --------

E

4 μ l 5 μ l ---- 1 μ l -------

H

4 μ l 5 μ l ---- ------ 1 μ l

3) Mezcle los componentes con golpeteo con los dedos

4) Ponga los eppendorf a incubar por 2 horas a baño María a 37 º C

5) Al terminar coloque las muestras en el refrigerador hasta la siguiente práctica de laboratorio.




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1. Sesión 9: Electroforesis de ADN en gel de agarosa.

2. Competencia a desarrollar en la sesión. Será competente para realizar, monta y correr geles de agarosa por electroforesis, para que en la práctica médica pueda realizar un buen uso de diferente instrumental de laboratorio para investigación o diagnóstico. 3. Mecanismos de evaluación y evidencia de desempeño. Cuestionario ¿Qué es la agarosa? ¿Cómo se prepara un gel de agarosa? ¿Cuáles es el instrumental que se utiliza para realizar los geles de agarosa? Calidad de las notas de su cuaderno de prácticas. Exposición y discusión del artículo por los alumnos. Elaboración de una conclusión sobre la competencia aprendida. 4. Fundamento teórico e información de apoyo.

Correr un gel de agarosa, método utilizado en los laboratorios de Biología celular y molecular para diferenciar los distintos cortes del DNA producidos por enzimas de restricción, bases de la ingeniería genética.

La concentración e integridad del ADN extraído, así como el tamaño de distintos fragmentos de ADN (por ejemplo, productos de PCR) pueden ser verificadas mediante electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida. La electroforesis consiste en la separación de moléculas (proteínas, isoenzimas, ácidos nucleicos) a través de una matriz tamponada (agarosa, acrilamida, almidón). La matriz funciona como un filtro, separando las moléculas en un campo eléctrico, de acuerdo al tamaño y la carga neta que poseen. En el caso de los ácidos nucleicos, el grupo fosfato es el responsable por la fuerte carga negativa en condiciones de pH neutro, haciendo que los fragmentos migren hacia el polo positivo (ánodo) durante la electroforesis. 5. Equipo, instrumental, material e insumos.

Equipo: a) Cámara para elaboración de geles

b) Cámara para electroforesis de gel

Material: a) 1 matraz de Erlenmeyer por equipo.

b) Agitador magnético con temperatura

c) Peine con dientes



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d) Cinta adhesiva de laboratorio

Insumo: a) Agarosa

b) TAE

c) Mosca para agitación

6. Metodología de la sesión. El alumno (a) deberá dominar antes de la práctica, el tema de electroforesis de DNA, previamente discutido en práctica 6. Se prepara un gel de agarosa al 0.8% con un grosor de 0.75 a 1.0 cm. Esto se logra agregando 0.8 g de agarosa a 100 mL de TAE 1X. La agarosa debe ser disuelta utilizando un buffer de electroforesis, no agua. Cuando el gel de agarosa ha solidificado, se inicia el cargado de la muestra de DNA para electroforesis. PREPARACIÓN DE LA CÁMARA DE ELECTROFORESIS: 1.- Cuando coloque el gel en la base de la cámara de electroforesis, asegúrese que los orificios para colocar la muestra se encuentran en el cátodo (electrodo negro) al final de la base. Las muestras de DNA migrarán hacia el ánodo (rojo), fin de la base durante la electroforesis. 2.- Prepare el volumen requerido de buffer de electroforesis 1X (el buffer utilizado para la electroforesis será idéntico al utilizado para la preparación del gel). 3.- Sumergir el gel a más o menos 2 mm de buffer de electroforesis. Con cuidado retire el peine del gel en una posición jalándolo de manera recta. 4.- Prepare las muestras para cargar el gel. 5.- Cargue las muestras en los orificios utilizando micropipetas. Coloque 10μL de cada tubo (L, P, E y H) en orificios separados de la cámara. Los geles se leen de izquierda a derecha. 6.- Coloque la tapadera de la cámara en su lugar y coloque los electrodos a la fuente de carga, el ánodo con el ánodo (rojo con rojo) y cátodo con cátodo (negro-negro). Asegúrese que ambas puntas eléctricas estén conectadas al mismo canal de la fuente de poder. 7.- Realice la electroforesis a 120 volts. Poco tiempo después de que se aplica la corriente, el colorante de cargado se ve cómo migra a través del gel hacia el lado positivo de la cámara. 8.- Cuando la electroforesis se ha completado, apague la fuente de luz, desconecte los electrodos de las entradas y remueva la tapa de la cámara. 9.- Retire la cámara de geles. 10.- Regrese el excedente de líquido del contenedor. 7. Bibliografía. Ver al final del manual.



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1. Sesión 10: Gráfica de resultados de electroforesis.


Será capaz de analizar los resultados obtenidos mediante la electroforesis de ADN para estimar el valor aproximado del peso molecular de las diferentes bandas observadas de DNA, para que en la práctica médica pueda entender los resultados de biología celular y molecular para diagnostico o investigación.

3. Mecanismos de evaluación y evidencia de desempeño. Interpretar los resultados con la orientación adecuada en el cuaderno de prácticas. Exposición y discusión del artículo por los alumnos. Elaboración de una conclusión sobre la competencia aprendida. 4. Fundamento teórico e información de apoyo. La estimación del tamaño de las bandas observadas mediante la técnica de electroforesis de ADN, es un procedimiento útil que permite identificar el tamaño aproximado de los segmentos de ADN en función de su distancia de migración en un campo eléctrico. La resolución y velocidad de separación de fragmentos de ADN por electroforesis son reguladas a través de la concentración de agarosa (o acrilamida) en el gel y el voltaje aplicado durante la electroforesis. La agarosa funciona como un filtro en el que los fragmentos de menor tamaño migran más rápidamente hacia el ánodo que aquellos de mayor tamaño. Al aumentar la concentración de agarosa se dificulta el movimiento de los fragmentos a lo largo del gel, permitiendo obtener una mayor resolución en los fragmentos de menor longitud. El incremento del voltaje aumenta proporcionalmente la velocidad de migración de los fragmentos en el gel. Los ácidos nucleídos separados en geles de agarosa pueden visualizarse mediante tinción con colorantes fluorescentes, lo cual permite evaluar su integridad y estimar su concentración mediante un análisis comparativo con patrones de concentración conocida. Los colorantes fluorescentes actúan mediante inserción entre las pares de bases que conforman el ácido nucleíco. El bromuro de etidio es ampliamente utilizado para la visualización de ADN y ARN. Sin embargo, éste es un reactivo altamente tóxico, con propiedades mutagénicas, por lo que debe ser manejado con extremo cuidado en el laboratorio. En la actualidad existen colorantes fluorescentes alternativos, como SYBR Safe, SYBR Gold, SYBR Green I, Vistra Green y Syto60, desarrollados específicamente para reducir los riesgos potenciales de mutagénesis. La técnica para la cuantificación de ADN consiste simplemente en la utilización de una secuencia de concentraciones de solución patrón de ADN con la que se comparan muestras de ADN de concentración desconocida. El cálculo de las concentraciones se hace bajo la luz ultravioleta según la fluorescencia. Debe evitarse la exposición prolongada a la luz ultravioleta, incluso con máscara de protección. La estimación de las concentraciones de ADN puede realizarse sobre una fotografía digital del gel tomada bajo luz ultravioleta si se cuenta con un analizador de imágenes.



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La concentración de agarosa y el voltaje con los que se debe trabajar depende del tamaño del segmento de ADN que se quiera visualizar. Los segmentos de gran tamaño, el del ADN total 2 (proveniente de una extracción de ADN), deben trabajarse con concentraciones del 0.8% y a voltajes de 60V para evitar la fragmentación del mismo. Los segmentos de 1500pb en adelante con geles al 1%, los segmentos de 500pb a 1500pb en geles 1,5% o 2% y los pequeños segmentos de de 100pb a 500pb (los microsatélites por ejemplo) en geles al 4% o 6%. Para estos el voltaje puede variar de 20V a 120V de pendiendo de la velocidad a la que quiera que migre el ADN, a voltajes elevados más rápido corren las muestras. 5. Equipo, Instrumental, material e insumos.

Equipo:

a) Transiluminador de BioRad.

d) El alumno (a) deberá traer una regla graduada para esta práctica.

6. Metodología de la sesión. - Los alumnos medirán la distancia de cada banda observada con respecto al borde del gel. Esto se realizará en cada banda para cada una de las enzimas de restricción utilizadas. - Utilizando la referencia conocida de los tamaños de las bandas generadas al utilizar la enzima HindIII en el ADN del lamba fago, se procederá a calcular el tamaño aproximado de las bandas obtenidas por las enzimas EcoRI y PstI. 7. Bibliografía. Ver al final del manual.



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1. Sesión 11: Bases teóricas de la electroforesis de proteínas.

2. Competencia a desarrollar en la sesión. Comprenderá los conceptos de electroforesis, así como la importancia de los diferentes niveles de estructura de las proteínas, para que en la práctica médica pueda entender el efecto que tienen las proteínas sobre los procesos biológicos en los seres vivos. 3. Mecanismos de evaluación y evidencia de desempeño. Cuestionario ¿Defina electroforesis? ¿Como se realiza un gel para proteínas? Calidad de las notas de su cuaderno de prácticas. Exposición y discusión del artículo por los alumnos. Elaboración de una conclusión sobre la competencia aprendida. 4. Fundamento teórico e información de apoyo. La electroforesis de proteínas en geles con una matriz de poliacrilamida, comúnmente denominada electroforesis en poliacrilamida (PAGE, 'poliacrilamida gel electroforesis') es sin duda alguna una de las técnicas más ampliamente usada para caracterizar mezclas complejas de proteínas. La electroforesis en poliacrilamida es un método conveniente, rápido y económico a nivel de muestra pues se requieren sólo cantidades del orden de microgramos de proteína. Las proteínas presentan una carga eléctrica neta si se encuentran en un medio que tenga un pH diferente al de su punto isoeléctrico y por eso tienen la propiedad de desplazarse cuando se someten a un campo eléctrico. La velocidad de migración es proporcional a la relación entre las cargas de la proteína y su masa. Cuanto mayor carga por unidad de masa más rápida será la migración. Empleando geles de sílice o de acetato de celulosa y aplicando las proteínas en una zona estrecha en torno a los electrodos se pueden determinar diferencias de carga neta (carga total/masa) entre proteínas. Este método se denomina electroforesis zonal. La matriz de poliacrilamida no es un buen soporte para este método pues la migración de las proteínas en su seno no sólo es proporcional a la carga neta sino también al tamaño y forma de las proteínas. Una ventaja importante de los geles de poliacrilamida es que son químicamente inertes, transparentes y estables en un amplio rango de pHs, temperatura y fuerza iónica.



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5. Equipo, instrumental, material e insumos. No aplica 6. Metodología de la sesión. El instructor (a) expondrá la clase sobre las bases teóricas de la electroforesis de proteínas Definiciones básicas Aspectos Velocidad de movimiento Movilidad electroforética Factores que afectan a la electroforesis

• Campo eléctrico • Temperatura • Características de la muestra • Propiedades del medio • Propiedades del soporte

Modalidad de electroforesis Orientación Gel de poliacrilamida Grupos de soportes Funciones Electroforesis de proteínas La carga neta de las proteínas Etapa de tinción




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1. Sesión 12: Electroforesis de proteínas.


Será competente para realizar, montar y correr el gel de las proteínas y conocer los principios básicos de la técnica de electroforesis, para que en la práctica médica pueda realizar un buen uso de diferente instrumental de laboratorio para investigación o diagnóstico. 3. Mecanismos de evaluación y evidencia de desempeño. Cuestionario ¿Defina las propiedades de las proteínas para separarse en una electroforesis? ¿Con que solución se tiñe un gel para proteínas? Calidad de las notas de su cuaderno de prácticas. Exposición y discusión del artículo por los alumnos. Elaboración de una conclusión sobre la competencia aprendida. 4. Fundamento teórico e información de apoyo.

Una técnica especialmente poderosa utilizada para fraccionar proteínas es la electroforesis. Hay gran variedad de técnicas para electroforesis, y todas dependen de la capacidad de moléculas con carga para desplazarse cuando se colocan en un campo eléctrico. La separación de proteínas se logra mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (EGPA), en la cual las proteínas se mueven por acción de una corriente eléctrica aplicada a través de un gel compuesto de una pequeña molécula orgánica (acrilamida) unida mediante enlaces transversos para formar un gel. El gel puede formarse como una delgada capa entre dos capas de vidrio o como un cilindro dentro de un tubo de cristal. Una vez polimerizado el gel, la placa (o tubo) se suspende entre dos compartimientos que contienen solución amortiguadora dentro del cual se sumergen electrodos con carga opuesta. La muestra que contiene las proteínas concentradas se extiende en una placa de gel con surcos situados a lo largo de la parte superior del gel. La muestra de proteínas se prepara en solución de sacarosa o glicerol cuya densidad evita que la muestra se mezcle con el amortiguador en el compartimiento superior. Se aplica entonces un voltaje entre los compartimientos de amortiguador y la corriente fluye a través de la placa causando que las proteínas se desplacen hacia electrodos con carga opuesta. Típicamente, la separación se efectúa utilizando amortiguadores alcalinos que confieren carga eléctrica negativa a las proteínas y las obligan a desplazarse hacia el ánodo con carga positiva en el extremo opuesto del gel. El movimiento relativo de proteínas a través de un gel de poliacrilamida depende del tamaño, forma y densidad de carga (carga por unidad de masa) de las moléculas. Cuanto mayor la densidad de carga, la proteína avanza con mayor fuerza a través del gel y por lo tanto su velocidad de migración es más rápida. Sin embargo, puesto que la poliacrilamida forma una criba molecular con enlaces transversos, cuando mayor sea la proteína más se enredará conforme avanza y por lo tanto menor será la velocidad de movimiento. La



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capacidad de una proteína de determinado tamaño para desplazarse a través del gel depende de la concentración de la poliacrilamida empleada para constituir la criba. Cuanto menor sea la concentración (hasta un mínimo cercano a 2 %) de acrilamida, menor será el número de enlaces cruzados y determinada molécula de proteína se desplazará con mayor rapidez. La forma también es un factor, puesto que proteínas globulares compactas se mueven con mayor rapidez en comparación con proteínas fibrosas, alargadas, de peso molecular comparable. El avance de la electroforesis se puede seguir si se observa el desplazamiento de la huella de un colorante con carga eléctrica que se mueve justo delante de las proteínas más rápidas. Luego de cierto tiempo se interrumpe la corriente y se elimina el gel del contenedor. El gel se puede teñir para investigar la localización de las proteínas. Si las proteínas están marcadas con isótopo radioactivo se puede determinar su sitio presionando el gel contra un fragmento de película radiográfica para producir una auto-radiografía. Alternativamente, se puede seccionar el gel en porciones y aislar las proteínas individuales, o también presionar el gel contra un pedazo de papel filtro de nitrocelulosa y someter a tratamiento adicional de electroforesis para desplazar las proteínas fuera del gel y absorberlas sobre la superficie de la nitrocelulosa. Este último procedimiento, llamado Western Blot, se puede emplear para identificar bandas individuales de proteínas por su interacción con anticuerpos específicos. EGP-DSS: De ordinario, la EGP se realiza en presencia del detergente dodecilsulfato sódico, que posee carga negativa y se enlaza en gran cantidad a todo tipo de moléculas de proteína. La repulsión electrostática entre moléculas DSS enlazadas causa que las proteínas se desdoblen en barras cilíndricas semejantes, eliminando así la diferencia de forma como factor que impida la separación. El número de moléculas DSS enlazadas a la proteína regularmente es proporcional al peso molecular de la misma. Por consiguiente, una especie de proteína cualquiera que sea su tamaño, siempre tiene la misma densidad de carga y será impulsada a través del gel con la misma fuerza. Sin embargo, puesto que la poliacrilamida presenta abundantes enlaces transversales, retiene las proteínas de mayor tamaño en mayor extensión comparadas con las proteínas más pequeñas. Como resultado, las proteínas se separan según una sola propiedad: su peso molecular. Además de separar las proteínas de una mezcla, la EGP-DSS se puede emplear para determinar el peso molecular de diferentes proteínas comparando la posición de las bandas contra las producidas por proteínas de tamaño conocido. 5. Equipo, instrumental, material e insumos. Equipo: a) Cámara de electroforesis MiniProtean 3 (BioRad).

Material: a) Buffer de carga para EGP-DSS.

b) Buffer 1.5 M Tris pH 8.8.

c) Pipetas desechables de 10 mL.

d) Pipetas de transferencia.



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e) Micropipetas de 1000, 100 y 10 μL con puntillas desechables.

f) Puntillas desechables para proteínas.

g) Buffer 1 M Tris pH 6.8.

Insumo: a) Sodio-dodecilsulfato (SDS) al 10%.

b) Agua destilada.

c) TEMED.

d) Solución de acrilamida al 30%

e) SDS-PAGE Running Buffer.


Para realizar la electroforesis utilizaremos el sistema MiniProtean 3 de la compañía BioRad.

Sistema de Electroforesis para Proteínas Mini Protean 3 de BioRad.



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Procedimiento 1) Limpie ambas caras de cada uno de los vidrios con alcohol etílico. 2) Coloque dos tiras de papel parafilm en el dispositivo de ensamblado de los vidrios teniendo cuidado de no producir arrugas ni bordes. 3) Coloque el vidrio pequeño encima del vidrio grande de tal manera que el espaciador quede en medio de los dos (4a). 4) Deslice ambos vidrios en el dispositivo de fijación (4b). 5) Deslice hacia afuera ambas palancas de fijación para asegurar los vidrios (4c). 6) Asegure la parte superior de los vidrios utilizando la manivela con resorte que está en la parte superior del dispositivo de fijación (4d).

Descripción de los componentes del Sistema de Electroforesis para Proteínas Mini Protean 3 de BioRad.



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7) Llene el espacio formado por ambos vidrios con agua y verifique que no existan fugas. Si existen fugas vuelva a ensamblar los vidrios en el dispositivo de fijación. 8) Introduzca el cepillo en la parte superior de las placas de vidrio y trace una línea horizontal a aproximadamente un centímetro por debajo de los dientes del cepillo. Este será el límite entre el gel de resolución (resolving gel) y el gel de agrupamiento (stacking gel). Retire el cepillo. 9) Tire el agua y asegure de secar la parte interna de las placas de vidrio utilizando un papel absorbente que no libere partículas (Kim-wipe o similar). 10) Prepare el gel de resolución de acuerdo a la siguiente tabla: Agua Bidestilada: 1.9 mL. Acrilamida al 30%: 1.7 mL. Buffer 1.5 M Tris pH 8.8: 1.3 mL. 10% SDS: 0.05 mL. 10% Persulfato de amonio: 0.05 mL.



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11) Antes de agregar el agente polimerizante (TEMED) asegúrese de contar con una pipeta de transferencia pues una vez agregado el TEMED la polimerización ocurre rápidamente.

12) Agregue el TEMED: 0.002 mL Cierre el tubo y mezcle con cuidado. Absorba la solución utilizando la pipeta de transferencia. Agregue el gel en medio de las placas de vidrio hasta 2 mm por arriba de la marca que realizó en el paso 8. La solución restante regrésela al tubo, pues le servirá de indicador para la polimerización. La polimerización debe ocurrir en aproximadamente 20 minutos. 13) Agregue cuidadosamente agua bidestilada por encima del gel de resolución. 14) Mientras se polimeriza el gel de resolución, proceda a preparar las muestras a analizar. 15) Marque con su plumón permanente la tapa de cada uno de los microtubos de centrifugación (1.6 mL.) con las leyendas de las proteínas correspondientes. Prepare el volumen requerido según las instrucciones del profesor (a). Mantenga las muestras originales en hielo. 16) Transfiera sus muestras a un flotador y desnaturalice las proteínas en agua hirviendo por 5 minutos. Verifique que cada uno de los tubos esté completamente cerrado, pues existe la posibilidad de que estos se abran durante el calentamiento. 17) Centrifugue por 5 segundos sus muestras. Colóquelas en hielo. Preparación del gel de agrupamiento de acuerdo a la siguiente tabla: Agua Bidestilada: 1.4 mL. Acrilamida al 30%: 0.33 mL. Buffer 1 M Tris pH 6.8: 0.25 mL. 10% SDS: 0.02 mL. 10% Persulfato de amonio: 0.02 mL. 18) Antes de agregar el agente polimerizante (TEMED) asegúrese de contar con una pipeta de transferencia, pues una vez agregado el TEMED la polimerización ocurre rápidamente. 19) Agregue el TEMED: 0.002ml. Cierre el tubo y mezcle con cuidado. Absorba la solución utilizando la pipeta de transferencia. Agregue el gel de agrupamiento hasta unos 4 mm por debajo del borde superior de los vidrios. Coloque cuidadosamente el cepillo en la parte superior de las placas de vidrio, teniendo precaución de no producir salpicaduras (el alumno que realice esta operación deberá contar con lentes protectores, guantes y



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mascarilla). La solución restante regrésela al tubo, pues le servirá de indicador para la polimerización. La polimerización debe ocurrir en aproximadamente 10 minutos. 20) Una vez polimerizado el gel de agrupamiento, proceda a remover las placas de vidrio del dispositivo de fijación (5a). 21) Ponga las placas de vidrio en el ensamblador de electrodos con el vidrio pequeño hacia adentro (5b). 22) Coloque el ensamblador de electrodos en el cuadro interno de fijación (5c). 23) Presione hacia abajo el ensamblador de electrodos mientras cierra las palancas del cuadro interno de fijación (5d). 24) Coloque el cuadro interno de fijación en el tanque acrílico (5e).

25) Llene la parte central del cuadro interno de fijación con solución SDS-Running Buffer hasta unos 3 mm por arriba del borde superior de las placas de vidrio. 26) Vierta solución SDS-Running Buffer en el tanque acrílico. 27) Retire cuidadosamente el cepillo. Limpie cuidadosamente cada una de las hendiduras producidas por el cepillo con una pipeta de vidrio. Utilice una pipeta de vidrio para retirar las burbujas de aire que se formen en la parte inferior de las placas de vidrio. 28) Aplique las muestras de proteínas utilizando la guía para cargar muestras.



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29) Retire la guía para cargar muestras. Coloque la tapa superior del sistema verificando la polaridad correcta de los electrodos. 30) Aplique 50V a la cámara de electroforesis utilizando la fuente de alimentación. Mantenga este voltaje hasta que la tinta azul alcance el límite entre el gel de resolución y el de agrupamiento, cuando esto ocurra incremente el voltaje a 100 volts. Mantenga este voltaje hasta que la tinta azul alcance el borde inferior de los vidrios.

31) Desensamble la cámara de electroforesis y coloque el gel en una tinción de azul de Comassie durante 24 horas. 32) Destiña el gel con solución de metanol y acido acético, cambiando la solución cada hora por 3 ocasiones. 33) Coloque su gel en plástico protector y obtenga una imagen digital de la misma utilizando un escáner.



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1. Sesión núm. 13: Transformación de bacterias.

2. Competencia a desarrollar en la sesión. Comprenderá los principios de la transfección de bacterias con plásmidos, la regulación genética y la expresión de la proteína verde fluorescente (GFP), para que en la práctica médica pueda realizar un buen uso de las diferentes herramientas de biología molecular en investigación o diagnóstico. 3. Mecanismos de evaluación y evidencia de desempeño. Cuestionario: *¿Qué utilidad tiene transformar una bacteria? *¿Como se puede identificar que una bacteria esta transformada? *Calidad de las notas de su cuaderno de prácticas. *Los resultados deben de ser reportados e interpretados con responsabilidad y ética. *Exposición y discusión del artículo por los alumnos. *Elaboración de una conclusión sobre la competencia aprendida. 4. Fundamento teórico e información de apoyo. Esta práctica de laboratorio está diseñada para comprender los principios de “transformación bacteriana”. Los estudiantes cultivarán una bacteria E. coli K12 transformada genéticamente con el plásmido pGLO. Las bacterias transformadas producirán proteína verde fluorescente (GFP). La propiedad única de la fluorescencia de la GFP permite que se pueda comprobar la transfección de una lámpara UV. Una de las herramientas básicas de la biotecnología moderna es el rompimiento del DNA, cortando DNA y uniéndole otras moléculas de DNA. El concepto básico detrás del rompimiento del DNA es el remover un fragmento funcional de DNA – vamos a decir un gen – de un organismo y combinarlo con el DNA de otro organismo para crear la proteína a la cual ese gen codifica. Por ejemplo, a ciertas plantas se les pueden dar los genes para resistencia a pesticidas o enfermedades, los genes funcionales se les pueden dar a personas con genes no funcionales o mutados, como en la enfermedad genética de la fibrosis cística. Los genes pueden ser adquiridos de humanos, animales, o DNA de plantas y colocados dentro de la bacteria. Por ejemplo, un gen de un humano sano para la hormona insulina puede ser colocado en una bacteria. Bajo las condiciones correctas, esta bacteria puede crear insulina humana auténtica. Cuando se les permite que se multipliquen en fermentadores esta bacteria puede ser usada para producción masiva de la proteína humana insulina. Esta insulina genéticamente creada es purificada usando cromatografía de proteínas y puede ser usada para tratar pacientes con diabetes, donde los genes de la insulina no funcionan normalmente. Un problema común en la purificación de proteínas genéticamente diseñadas de bacterias transformadoras es la contaminación de proteínas bacterianas endógenas. La cromatografía es un método poderoso usado en la biotecnología para separar y purificar proteínas de interés de las proteínas bacterianas. Las proteínas purificadas de esta manera, pueden ser usadas, por ejemplo, como medicinas



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para tratar enfermedades humanas, o agentes de casa como enzimas naturales para realizar mejores detergentes. La clonación y expresión del gen GFP es completamente análogo a los procesos usados en la industria de la biotecnología para producir proteínas con valor comercial. La fuente real de la proteína fluorescente verde es un gel de la alga bioluminiscente Aequoria Victoria. En este ejercicio se podrá sugerir un escenario hipotético a los estudiantes en el cual la GFP tenga algún valor comercial especial y su gen proviene de una fuente natural diferente, planta o animal. En cualquier caso, el principio es exactamente el mismo, el gen codifica la proteína fluorescente verde. “El DNA modificado por biotecnología, es el material más valorado en el mundo. Una bacteria microscópica, muy pequeña como para ser vista con el ojo humano, pero que contiene el gen de una enzima para tratar el ataque cardiaco, la estreptoquinasa, o que evita el daño a los cultivos, puede tener un valor de 5 billones de dólares en el mercado actual”. Medio de Cultivo: El medio líquido y sólido de agar son referidos como LB (por Luisa Bertani) y están hechos de extracto de levadura y una enzima digestiva de carne, ambos productos proporcionan una mezcla de carbohidratos, aminoácidos, nucleótidos, sales y vitaminas, los cuales son necesarios como nutrientes para el crecimiento bacteriano. El agar, que es derivado de un alga, se derrite cuando se calienta, y frío forma un gel sólido (muy parecido a la gelatina), funciona para proveer un soporte sólido en el cual cultivar bacterias. Selección del antibiótico: El plásmido pGLO el cual contiene el gen GFP también contiene el gen de la beta-lactaminasa, una proteína que provee a la bacteria con una resistencia al antibiótico ampicilina. La proteína beta-lactaminasa es producida y secretada por las bacterias, las cuales contienen el plásmido. La beta-lactaminasa secretada inactiva la ampicilina, permitiendo que solo las células transformadas crezcan en su presencia. Solo las bacterias transformadas las cuales contienen el plásmido pGLO y producen beta-lactaminasa pueden sobrevivir en la presencia de ampicilina. Regulación Genética: La bacteria transformada con el plásmido pGLO será sembrada en platos de agar LB/amp y LB/amp/ara. La expresión del gen GFP está bajo el control regulatorio del promotor arabinosa. Así, cuando la bacteria es sembrada en el agar conteniendo arabinosa (LB/amp/ara), la GFP se expresará y las colonias aparecerán en un color verde brillante. Inversamente, cuando las bacterias sean sembradas en agar LB que no contenga arabinosa (LB/amp), el gen no funcionará y las colonias aparecerán blancas.

5. Equipo, Instrumental, Material e insumos.

Equipo:

a) Estufa a 37ºC 1

Material:

a) Asas de inoculación – paquetes de 10 asas 2

b) Platos de cultivo 6

c) Marcadores 1



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Insumo:

a) Bacteria E. coli K12 transformada con el plásmido pGLO 1 cepa en tubo

a) Bacteria E. coli K12 sin transformar 1 cepa en tubo


1.- Tome la cepa en tubo cerrado (bacteria E. coli K12+pGLO y solo E. coli K12) y proceda a realizar el procedimiento para un cultivo: a) Abra el tubo que contiene la cepa de la bacteria E. coli K12+pGLO, cerca del mechero. b) Utilizando un asa estéril recolecte una colonia de bacterias y deposítela en el plato correspondiente. c) Cierre el tubo. d) Anote su nombre en el plato cerrado. e) Utilizando un asa estéril realice el mismo procedimiento en el tubo marcado como E. coli K12. 2.- Coloque los platos boca abajo en la incubadora a 37°C hasta el día siguiente.




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1. Sesión 14: Resultados de la transformación de bacterias con plásmido pGLO que contiene el gen de la proteína verde fluorescente (GFP).

2. Competencia a desarrollar en la sesión. Será capaz de analizar los resultados obtenidos mediante la transformación genética de la bacteria E. coli para la expresión de la proteína verde fluorescente, para que en la práctica médica pueda realizar un buen uso de las diferentes herramientas de biología molecular en investigación o diagnóstico. 3. Mecanismos de evaluación y evidencia de desempeño. Interpretar los resultados con calidad en el cuaderno de prácticas. Exposición y discusión del artículo por los alumnos. Elaboración de una conclusión sobre la competencia aprendida. 4. Fundamento teórico e información de apoyo. Un gen es un pedazo de ácido desoxirribonucleico (ADN) el cual provee las instrucciones para producir una proteína específica, la cual da a un organismo una característica particular. La transformación genética ocurre cuando una célula incorpora y expresa dentro de ella un nuevo pedazo de material genético (ADN). Esta nueva información genética muchas veces provee al organismo de una nueva característica que se puede identificar luego de ocurrida la transformación. Las bacterias demás de poseer un cromosoma grande, poseen pequeños pedazos circulares de ADN llamados plásmidos. Éste es un fenómeno que ocurre de forma natural en muchas bacterias, pero la eficacia del proceso varía enormemente de unas especies a otras. Para que la transformación tenga lugar, la bacteria tiene que encontrarse en el llamado estado de competencia, que ocurre en determinadas condiciones fisiológicas; en este estado, la bacteria presenta alteraciones en su pared y membrana celulares, que permiten la entrada de ácidos nucleicos en la célula. En el laboratorio se ha conseguido desarrollar técnicas que inducen el estado de competencia en bacterias que no lo presentan de forma natural, como es el caso de E. coli. Estas técnicas se basan en diversos tratamientos químicos o físicos que producen microporos en la célula, lo que permite la introducción del ADN exógeno (transformación) de modo bastante eficiente. Uno de los métodos físicos es el choque da calor, consistente en inducir cambios bruscos de temperatura para inducir la apertura de poros en la membrana de la bacteria haciéndola permeable. Dicha competencia se puede inducir con tratamientos químicos utilizando compuestos como el cloruro cálcico. Hay que tener en cuenta sin embargo que tras estos tratamientos no todas las células del cultivo se hacen competentes. La transformación en el laboratorio es una técnica rutinaria de enorme utilidad, que nos permite introducir prácticamente cualquier plásmido en su forma circular o superenrollada en casi cualquier tipo de bacteria. La investigación que se describe a



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continuación conjunta los conocimientos teóricos y prácticos de la ingeniería genética que nos permitió llevar a cabo una transformación bacteriana. El ADN del plásmido usualmente contiene genes para una o más características para la supervivencia de la bacteria. En esta investigación se introdujo el plásmido pGLO a la bacteria E. coli. El plásmido pGLO, contiene además un gen que codifica para una proteína que le confiere resistencia al antibiótico ampicilina (beta-lactamasa) y un sistema especial de regulación genética que puede ser usado para el control de la expresión de la proteína verde fluorescente (GFP) en células transformadas. El gen para la GFP puede ser activado o prendido en células transformadas al añadir el azúcar arabinosa al medio de cultivo donde crecen las células. Se trabajó la selección de clones celulares con las características esperadas de la expresión o ausencia de expresión de los genes marcadores presentes en un plásmido recombinante y se estimó la eficiencia de la transformación.


Equipo:

a) Estufa a 37ºC 1

Material:

a) Asas de inoculación – paquetes de 10 asas 2

b) Platos de transformación (LB, LB/amp y LB/amp/ara) 6

c) Lámpara UV de onda larga* 1

Insumo:

a) Ampicilina – liofilizada 1 vial

b) Tableta de LB – Broth (para hacer 50 mL) 1 tableta

c) Agua destilada

d) Cloro 10 ml

6. Metodología de la sesión. Los alumnos observaran las diferencias fenotípicas que presentan cada bacteria.




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1. Sesión15: Cultivos celulares. 2. Competencia a desarrollar en la sesión.

Comprenderá las principales técnicas utilizadas en cultivo celular y el impacto de la misma en la medicina moderna, para que en la práctica médica pueda entender el efecto que tienen los cultivos celulares sobre diferentes patologías. 3. Mecanismos de evaluación y evidencia de desempeño. Cuestionario ¿Qué es un cultivo celular? ¿Cómo se clasifican los cultivos celulares? ¿Cuáles son los diferentes equipos que se utilizan para cultivos celulares? Exposición y discusión del artículo por los alumnos. Elaboración de una conclusión sobre la competencia aprendida.

4. Fundamento teórico e información de apoyo.

El cultivo celular es el proceso mediante el que células, ya sean células procariotas, eucariotas o vegetales, pueden cultivarse en condiciones controladas. En la práctica el término "cultivo celular" se usa normalmente en referencia al cultivo de células aisladas de eucariotas pluricelulares, especialmente células animales. El desarrollo histórico y metodológico del cultivo celular está íntimamente ligado a los péptidos cultivares del cultivo de tejidos y el cultivo de órganos. El cultivo de células animales empezó a ser una técnica rutinaria de laboratorio durante los años 50,[ ]pero el concepto de mantener líneas de células vivas separadas del tejido de origen fue descubierto en el siglo XIX. Aislamiento de células Las células pueden ser aisladas de los tejidos para cultivos in vitro de muchas maneras. Las células pueden ser purificadas con facilidad de la sangre, sin embargo sólo los leucocitos son capaces de crecer en cultivo. Las células mononucleares se pueden liberar de los tejidos blandos mediante hidrólisis enzimática con enzimas como la colagenasa, tripsina o pronasa, que degradan la matriz extracelular. Como alternativa se pueden colocar trozos de tejido en medio de crecimiento, y las células que crecen son aptas para el cultivo. Este método es el conocido como cultivo de explantos. Las células que se cultivan directamente desde un sujeto se conocen como células primarias. A excepción de algunos derivados de tumores, la mayoría de los cultivos celulares primarios tienen un periodo de vida limitado. Después de un cierto número de divisiones las células entran en el proceso de senescencia y dejan de dividirse, generalmente manteniendo la viabilidad. Mantenimiento de células en cultivo Las células se cultivan y mantienen a una apropiada temperatura y mezcla de gases (habitualmente, 37ºC, 5% CO2 y 95% O2) en un incubadora de celular. Las condiciones de cultivo varían ampliamente para cada tipo celular, y la variación de las condiciones para un tipo celular concreto, puede dar lugar a la expresión de diferentes fenotipos. Además de la temperatura y la mezcla de gases, el factor más comúnmente variado en los sistemas de



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cultivo es el medio de crecimiento. Las recetas para los medios de crecimiento pueden variar en pH, concentración de glucosa, factores de crecimiento y la presencia de otros componentes nutritivos. Los factores de crecimiento usados para suplementar a los medios derivan a menudo de sangre animal, como el suero bovino. Estos ingredientes derivados de la sangre plantean una potencial contaminación con virus o priones de los productos farmacéuticos derivados. En la actualidad se tiende a minimizar o eliminar el uso de estos ingredientes cuando sea posible. Estrategias alternativas de abastecimiento involucran la sangre de los animales procedentes de países con un riesgo mínimo de encefalopatía espongiforme bovina, como Australia y Nueva Zelanda, y el uso de nutrientes concentrados derivados de suero en lugar de suero animal entero para el cultivo de células. []Las células pueden crecer en suspensión o de manera adherente. Algunas células viven de forma natural sin adherirse a una superficie, como las que existen en el torrente sanguíneo. Otras necesitan una superficie, como la mayoría de células derivadas de tejidos sólidos. A las células que crecen sin unirse a una superficie se las llama cultivos en suspensión. Algunos cultivos celulares adherentes pueden crecer en plástico para el cultivo de tejidos, que puede estar recubierto con componentes de la matriz extracelular para aumentar sus propiedades de adhesión y proporcionar otras señales necesarias para el crecimiento y diferenciación. Otro tipo de cultivo adherente es el cultivo organotípico que consiste en cultivar las células en un ambiente tridimensional a diferencia de las placas de cultivo bidimensionales. Este tipo de cultivo 3D es bioquímica y fisiológicamente similar al tejido vivo. Sin embargo presenta dificultades técnicas debido a varios factores (por ejemplo: difusión).


Equipo:

a) Estufa a 37ºC de CO2 1

b) Cabina de flujo laminar 1

c) Maño María 1

d) Refrigerador 1

Material:

a) Pipetas de plástico para cultivos de 5mL 10 b) Pipetas de plástico para cultivos de 10mL 10 c) Frasco de cultivo celular de 75 cm² 5 d) Frasco de cultivo celular de 150 cm² 5 e) Placas M6 para cultivo celula 5 f) Placas de 96 pocillos para dilución 5 g) Placas de 96 pocillos para cultivar celulas 5 h) Placas de 96 pocillos para ELISA 5



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Insumo:

a) Trypsona bovina páncreas 1 b) Tripsina-EDTA 1X 500ML GIBCO 1 c) Medio DMEN 500ML GIBCO 1 d) L-Glutamine, 200 mM 1 e) MEDIA NON-ESS AA 100X 1 f) Lysozyme from chicken egg white 1 g) Colchicina 1/g 1 h) Fitohemaglutinina/ Gibco 1 i) Suero Fetal Bovino 500mL 1 j) RPMI L-Glutamina 500ML 1 k) DMEM Glu/Glu/HEPES 500ML 1 l) Agua destilada 500mL 1 m) Cloro 10 ml 1 6. Metodología de la sesión. El instructor (a) expondrá la clase teórica/practica sobre las técnicas más importantes en cultivos celulares: 1.- Concepto de cultivo celular 2.- Aplicaciones del cultivo celular 3.- Tipos de líneas celulares establecidas, ejemplos de cultivos celulares 4.- Protocolo para cultivos celulares El laboratorio de cultivo celular 5.- Cabinas de flujo laminar 6.- Incubador de CO2 7.- Instrumentos ópticos de observación 8.- Congeladores e instalación de criogenia (N2 líquido) 9.- Equipo de esterilización 10.- Equipo de filtración 11.- Autoclave 12.- Mechero Bunsen 13.- Otros instrumentos Pipeteadores Centrífugas Equipos de purificación de agua



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Magdem (agitadores) Contador electrónico de células 14.- Áreas de investigación en las que son útiles los cultivos celulares

1.- Procedimiento para el pase de células. Preparación de los medios de cultivo. Las células eucariotas se crecerán en medio DMEM (Medio de Eagle modificado por Dulbecco) y RPMI, suplementado con 2 mM de L- glutamina, 1% de aminoácidos no esenciales, 1% de penicilina/estreptomicina, 0.02% de Lysozyma, 0.02% de Colchicina, 0.02% de Fitohemaglutinina y suero de ternera fetal (STF) al 5-10%. Para despegar las células adherentes de las superficies de cultivo se utilizó Tripsina-EDTA 1x con Trypsona bovina. Para el crecimiento de células se emplearan frascos de plástico estéril de distintos tamaños (T25, T75 y T150) y placas de 6 (M6), 24 (M24) y 96 (M96) pocillos. De la misma manera se utilizaran pipetas de plástico estéril de diferentes tamaños (5 y 10mL). Mantenimiento de líneas celulares. Las líneas celulares se cultivaran en los medios DMEM y RPMI suplementado con antibióticos, glutamina, aminoácidos no esenciales, factores de crecimiento celular y 5% STF. Para la línea celular de mamífero se utilizara 10% STF. Los cultivos se incubaran a 37ºC en un ambiente con 98% de humedad y 5% de CO2, en placas o botellas de plástico. Cuando las monocapas alcancen la confluencia, las células se despegaran por tratamiento con tripsina y se subcultivaran en nuevas placas o botellas a la densidad celular deseada. Las células se almacenaron congeladas en nitrógeno líquido en 90% STF y 10% DMSO. 7. Bibliografía. Ver al final del manual.



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1. Sesión 16: Resultados del mantenimiento de cultivos celulares.

2.- Competencia a desarrollar en la sesión. Será capaz de analizar los resultados obtenidos mediante el mantenimiento de cultivos celulares, para que en la práctica médica pueda realizar un buen uso de las diferentes herramientas de biología molecular en investigación, diagnóstico y cultivo celular. 3.- Mecanismos de evaluación y evidencia de desempeño. Interpretar los resultados con calidad en el cuaderno de prácticas. Exposición y discusión del artículo por los alumnos. Elaboración de una conclusión sobre la competencia aprendida. 4.- Fundamento teórico e información de apoyo. Los cultivos celulares se han convertido hoy día en una herramienta de amplio uso en investigación básica biomédica, para el diagnóstico en salud humana así como en sus aplicaciones para la elaboración de productos biotecnológicos y en la realización de pruebas de control de calidad, impartiendo una formación especializada en el campo de los cultivos celulares utilizando técnicas que están a la vanguardia de la investigación y los recursos materiales para optimizar el proceso de enseñanza-aprendizaje, impartiendo así una enseñanza de calidad.

5.- Equipo, instrumental, material e insumos.

Equipo:

a) Estufa a 37ºC de CO2 1

b) Cabina de flujo laminar 1

c) Maño María 1

d) Refrigerador 1

Material:

a) Pipetas de plástico para cultivos de 5mL 10 b) Pipetas de plástico para cultivos de 10mL 10 c) Frasco de cultivo celular de 75 cm² 5 d) Frasco de cultivo celular de 150 cm² 5



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e) Placas M6 para cultivo celula 5 f) Placas de 96 pocillos para dilución 5 g) Placas de 96 pocillos para cultivar celulas 5 h) Placas de 96 pocillos para ELISA 5

Insumo:

a) Trypsona bovina páncreas 1 b) Tripsina-EDTA 1X 500ML GIBCO 1 c) Medio DMEN 500ML GIBCO 1 d) L-Glutamine, 200 mM 1 e) MEDIA NON-ESS AA 100X 1 f) Lysozyme from chicken egg white 1 g) Colchicina 1/g 1 h) Fitohemaglutinina/ Gibco 1 i) Suero Fetal Bovino 500mL 1 j) RPMI L-Glutamina 500ML 1 k) DMEM Glu/Glu/HEPES 500ML 1 l) Agua destilada 500mL 1 m) Cloro 10 ml 1

6.- Metodología de la sesión. Los alumnos observaran la confluencia de los cultivos celulares y las diferencias que presentan cada línea celular. Cuando el cultivo llegue a una confluencia superior al 80% se puede repetir el procedimiento de la sesión numeró 15.




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V. ANEXOS 7. Bibliografía. 1. Exposure to Blood, What Healthcare Personnel Need to Know. Disease Control

and Prevention National Center for Infectious Diseases Divison of Healthcare Quality Promotion and Division of Viral Hepatitis. Junio del 2003. http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/bbp/Exp_to_Blood.pdf

2. NORMA Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección ambiental – Salud ambiental - Residuos peligrosos biológico-infecciosos - Clasificación y especificaciones de manejo. Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales [en línea]. [Fecha de acceso 20 de enero de 2003]. http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/087ecolssa.html

3. La guía de cumplimiento de la Norma Oficial Mexicana NOM-087. Colaboración entre la Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales, la Procuraduría Federal de Protección al Ambiente, la Secretaría de Salud, y la Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios. [Fecha de acceso martes 14 de abril del 2009]. http://www.cofepris.gob.mx/work/sites/cfp/resources/LocalContent/1909/5/GuiaNOM087.pdf

4. Norma Oficial Mexicana NOM-003-SSA2-1993, Para la disposición de sangre humana y sus componentes con fines terapéuticos. Secretaría de Salud. [Fecha de acceso 18 de julio de 1994]. http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/003ssa23.html

5. Norma Oficial Mexicana NOM-010-SSA2-1993, Para la prevención y control de la infección por Virus de la Inmunodeficiencia Humana. Secretaría de Salud. [Fecha de acceso 18 de julio de 1994]. http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/010ssa23.html

6. Norma Oficial Mexicana NOM-013-SSA2-1994, Para la prevención y control de las enfermedades bucales. Secretaría de Salud. [Fecha de acceso 11 de enero de 1999].

7. http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/m013ssa24.html 8. NORMA Oficial Mexicana NOM-036-SSA2-2002, Prevención y control de

enfermedades. Aplicación de vacunas, toxoides, sueros, antitoxinas e inmunoglobulinas en el humano. Secretaría de Salud. [Fecha de acceso 17 de julio de 2003]. http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/036ssa202.html

9. OMS. Manual de Bioseguridad en Laboratorios de Microbiología y Biomedicina. CDC. 4a. Edición. OMS-CD, 2006.

10. Alberts B, Bray D, Hopkin K, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K y Walter P (2005). Introducción a la Biología Celular. Panamericana, Madrid, España.



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VI. TABLA DE CAMBIOS

Tabla de Cambios

Revisión Fecha Descripción 1 17/01/11 Cambio de formato del manual

2 25/05/11 La sesión 16 de examen se cambio por resultados de cultivo celular

3 27/07/12 Se adecua al formato GC-FR-12 Rev. 3

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