Manual Biologia Celular - Mtro. Francisco Vazquez

UACJICBPROGRAMA DE QUMICA

BIOLOGA CELULAR

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Universidad Autnoma de Ciudad Jurez Instituto de Ciencias Biomdicas Departamento de Ciencias Qumico Biolgicas

Manual

Francisco Javier Vzquez Gonzlez

Ciudad Jurez Chihuahua Fecha:2

ContenidoIntroduccin general ---------------------------------------------------------------------------- 4 Prcticas1. 2. 3. 4. 5. 6.

Microscopio ------------------------------------------------------------------------------ 6 Preparacin de frotis bacteriano --------------------------------------------------- 11 Observacin de bacterias ------------------------------------------------------------ 14 Tincin Gram ---------------------------------------------------------------------------- 18 Observacin de protistas de vida libre -------------------------------------------- 20 Reproduccin celular. Reproduccin asexual por gemacin en levaduras ---------------------------------------------------------------------------------- 22

7. 8.

Observacin microscpica de hongos --------------------------------------------- 24 Observacin microscpica de un tejido vegetal: tejido epidrmico de cebolla ------------------------------------------------------------------------------------- 27

9.

Observacin microscpica de un tejido vegetal: tejido epidrmico del puerro ------------------------------------------------------------------------------------------------ 29

10. 11. 12. 13.

Observacin de clulas vegetales: clulas de la pulpa de tomate ---------- 31 Observacin de clulas de tejido adiposo----------------------------------------- 33 Observacin de la epidermis en hojas de Zebrina ------------------------------ 35 Observacin del citoesqueleto y fagocitosis en protistas acelulares: Tetrahymena ----------------------------------------------------------------------------- 38

14. 15.

Observacin de clulas sanguneas ------------------------------------------------ 41 Observacin de las clulas epiteliales de nuestra boca ----------------------- 44

3

16.

Observacin de los cloroplastos y pared celular en hojas de la planta acutica Elodea sp. --------------------------------------------------------------------- 46

17. 18. 19. 20.

Observacin de la fotosntesis en la planta Elodea sp. ------------------------ 49 Estudio de la mitosis en clulas de la raz de cebolla -------------------------- 55 Bibliografa --------------------------------------------------------------------------------- 58 Anexo ---------------------------------------------------------------------------------------59

AGRADECIMIENTOS A la Maestra Paula M. Velasco Tarelo por su valiosa aportacin para la elaboracin de este manual, al Biol. Jonatan I. Campaa Lozoya por sus valiosas sugerencias

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INSTRUCCIONES GENERALES

Para el desarrollo de las prcticas es conveniente tener en cuenta algunas normas elementales que deben ser observadas con toda escrupulosidad.

1. Antes de realizar una prctica, debe leerse detenidamente para adquirir una idea clara de su objetivo, fundamento y tcnica. Los resultados deben ser siempre anotados cuidadosamente apenas se conozcan. 2. El orden y la limpieza deben presidir todas las experiencias de laboratorio. En consecuencia, al terminar cada prctica se proceder a limpiar cuidadosamente el material que se ha utilizado. 3. Cada grupo de prcticas se responsabilizar de su zona de trabajo y de su material. 4. Antes de utilizar un compuesto hay que fijarse en la etiqueta para asegurarse de que es el que se necesita y de los posibles riesgos de su manipulacin. 5. No devolver nunca a los frascos de origen los sobrantes de los productos utilizados sin consultar con el profesor.

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6. No tacar con las manos y menos con la boca los productos qumicos. 7. Todo el material, especialmente los aparatos delicados, como lupas y microscopios, deben manejarse con cuidado evitando los golpes o el forzar sus mecanismos. 8. Los productos inflamables (gases, alcohol, ter, etc.) deben mantenerse alejados de las llamas de los mecheros. Si hay que calentar tubos de ensayo con estos productos, se har al bao Mara, nunca directamente a la llama. Si se manejan mecheros de gas se debe tener mucho cuidado de cerrar las llaves de paso al apagar la llama. 9. Cuando se manejan productos corrosivos (cidos, lcalis, etc.) deber hacerse con cuidado para evitar que salpiquen el cuerpo o los vestidos. Nunca se vertern bruscamente en los tubos de ensayo, sino que se dejarn resbalar suavemente por su pared. 10. Cuando se quiera diluir un cido, nunca se debe echar agua sobre ellos; siempre al contrario: cido sobre agua. 11. Cuando se vierta un producto lquido, el frasco que lo contiene se inclinar de forma que la etiqueta quede en la parte superior para evitar que si escurre lquido se deteriore dicha etiqueta y no se pueda identificar el contenido del frasco. 12. No pipetear nunca con la boca. Se debe utilizar la bomba manual, una jeringuilla o artilugio que se disponga en el Centro. 13. Las pipetas se cogern de forma que sea el dedo ndice el que tape su extremo superior para regular la cada de lquido. 14. Al enrasar un lquido con una determinada divisin de escala graduada debe evitarse el error de paralaje levantando el recipiente graduado a la altura de los ojos para que la visual al enrase sea horizontal. 15. Cuando se calientan a la llama tubos de ensayo que contienen lquidos debe evitarse la ebullicin violenta por el peligro que existe de producir salpicaduras. El tubo de ensayo se acercar a la llama inclinado y procurando que sta acte sobre la mitad superior del contenido y, cuando se observe que se6

inicia la ebullicin rpida, se retirar, acercndolo nuevamente a los pocos segundos y retirndolo otra vez al producirse una nueva ebullicin, realizando as un calentamiento intermitente. En cualquier caso, se evitar dirigir la boca del tubo hacia la cara o hacia otra persona. 16. Cualquier material de vidrio no debe enfriarse bruscamente justo despus de haberlos calentado con el fin de evitar roturas.17.

Los cubreobjetos y portaobjetos deben cogerse por los bordes para

evitar que se engrasen.(1)

PRACTICA 1 MICROSCOPIOOBJETIVO. Que el alumno se familiarice con las partes del microscopio, su uso y su cuidado.

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Partes de un microscopio ptico

PARTES DE UN MICROSCOPIO PTICO Sistema ptico OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Ampla la imagen del objetivo. OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparacin. Ampla la imagen de sta. CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparacin. DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador. FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador. Sistema mecnico SOPORTE: Mantiene la parte ptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo. PLATINA: Lugar donde se deposita la preparacin. CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular, REVLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos. TORNILLOS DE ENFOQUE: Macromtrico que aproxima el enfoque y micromtrico que consigue el enfoque correcto. MANEJO DEL MICROSCOPIO PTICO 1. Colocar el objetivo de menor aumento en posicin de empleo y bajar la platina completamente. Si el microscopio se recogi correctamente en el uso anterior, ya debera estar en esas condiciones. 2. Colocar la preparacin sobre la platina sujetndola con las pinzas metlicas. 3. Comenzar la observacin con el objetivo de 4x (ya est en posicin) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparacin es de bacterias. 4. Para realizar el enfoque: a. Acercar al mximo la lente del objetivo a la preparacin, empleando el tornillo macromtrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a8

travs del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparacin pudindose daar alguno de ellos o ambos. b. Mirando, ahora s, a travs de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparacin con el macromtrico y, cuando se observe algo ntida la muestra, girar el micromtrico hasta obtener un enfoque fino. 5. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debera estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micromtrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdi por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operacin desde el paso b. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparacin y por ello es fcil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparacin si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersin si se observa una preparacin que ya se enfoc con el objetivo de inmersin. 6. Empleo del objetivo de inmersin: a. b. aceite. c. d. luz. e. f. Terminar de girar suavemente el revlver hasta la posicin del Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta objetivo de inmersin. que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente. g. Enfocar cuidadosamente con el micromtrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersin y la preparacin es mnima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande. Girar el revlver hacia el objetivo de inmersin dejndolo a medio Colocar una gota mnima de aceite de inmersin sobre el crculo de camino entre ste y el de x40. Bajar totalmente la platina. Subir totalmente el condensador para ver claramente el crculo de luz

que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habr que echar el

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h.

Una vez se haya puesto aceite de inmersin sobre la preparacin, ya

no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se manchara de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operacin desde el paso 3. i. Una vez finalizada la observacin de la preparacin se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revlver. En este momento ya se puede retirar la preparacin de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersin en posicin de observacin. j. Limpiar el objetivo de inmersin con cuidado empleando un papel especial para ptica. Comprobar tambin que el objetivo 40x est perfectamente limpio. MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES 1. Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posicin de observacin, asegurarse de que la parte mecnica de la platina no sobresale del borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda. 2. Cuando no se est utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su funda para evitar que se ensucien y daen las lentes. Si no se va a usar de forma prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del polvo. 3. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente con un papel de filtro o, mejor, con un papel de ptica. 4. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se est utilizando el microscopio.5.

Despus de utilizar el objetivo de inmersin, hay que limpiar el

aceite que queda en el objetivo con pauelos especiales para ptica o con papel de filtro (menos recomendable). En cualquier caso se pasar el papel por la lente en un solo sentido y con suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol. No hay que abusar de este tipo de limpieza, porque si se aplican estos disolventes en exceso se pueden daar las lentes y su sujecin.10

6. No

forzar

nunca

los

tornillos

giratorios

del

microscopio

(macromtrico, micromtrico, platina, revlver y condensador). 7. El cambio de objetivo se hace girando el revlver y dirigiendo siempre la mirada a la preparacin para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrndolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se est observando a travs del ocular. 8. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algn lquido, secarlo con un pao. Si se mancha de aceite, limpiarla con un pao humedecido en xilol.9.

Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar

la sesin prctica y, al acabar el curso, encargar a un tcnico un ajuste y revisin general de los mismos.(1)

RESULTADO, DISCUSION Y CONCLUSIONES

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PRACTICA 2 PREPARACIN DE FROTIS BACTERIANOOBJETIVO. Que el alumno se familiarice con la tcnica de tincin directa de bacterias y aprenda a fijar por mtodos qumicos y fsicos. Se denomina frotis a la extensin que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo con objeto de separar lo ms posible los microorganismos, ya que si aparecen agrupados en la preparacin es muy difcil obtener una imagen clara y ntida. Este frotis debe ser posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos para poder aplicar los mtodos habituales de tincin que permiten la observacin al microscopio de las bacterias sin que la muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados. La fijacin de una extensin bacteriana hace que las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo menos posible la morfologa y bacteriana y las posibles agrupaciones de clulas que pudiera haber. REALIZACIN DEL FROTIS 1. Colocar una pequea gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Es necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de12

siembra, ya que en el extremo curvo de su filamento queda retenida una mnima gota de agua, que resulta suficiente. 2. Flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones aspticas, una pequea cantidad del cultivo bacteriano en medio slido y transferirlo a la gota de agua. Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensin homognea que quede bastante extendida para facilitar su secado. Si la muestra se toma de un cultivo en medio lquido, no es necesario realizar los dos primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la suspensin bacteriana, que se toma con el asa de siembra, directamente sobre el portaobjetos. 3. Esperar hasta que el lquido se evapore o acelerar su evaporacin acercando el porta a la llama del mechero. En este caso hay que tener mucha precaucin de no calentar demasiado el porta pues las clulas pueden deformarse o romperse. FIJACIN DE LAS BACTERIAS AL PORTAOBJETOS 4. Por calor: Pasar tres veces el portaobjetos por la llama durante unos segundos. Dejar enfriar el porta entre los pases. 5. Con metanol (para bacterias procedentes de medio lquido). Aadir unas gotas de metanol sobre la extensin completamente seca. Golpear el portaobjetos por su canto con cuidado contra la mesa de trabajo para retirar de inmediato el exceso de metanol. Esperar a que el metanol se evapore completamente. Una vez realizado el frotis y fijadas las bacterias, las preparaciones pueden ser observadas al microscopio, aunque carecen de contraste. Lo normal es continuar con el proceso de tincin. TINCIN DEL FROTIS BACTERIANO 6. Cubrir el frotis con abundante colorante y dejarlos actuar durante el tiempo que indique el protocolo de cada tincin concreta. Suele oscilar entre 1 y 5 minutos.13

En ocasiones el colorante tie slo en caliente, por lo que el tiempo que dure su actuacin se deber sostener el portaobjetos con unas pinzas sobre la llama del mechero para que humee el colorante, pero teniendo mucho cuidado de que no llegue a hervir ya que se producira la destruccin de las clulas. 7. Lavar la preparacin con agua para eliminar el colorante. Esta operacin se realiza inclinando el portaobjetos y aplicando el chorro de agua en su parte superior de manera que resbale sobre el frotis, pero sin que vaya dirigido directamente sobre l, pues podra arrastrar parte del frotis consigo. Eliminar la mxima cantidad de agua de los portaobjetos golpendolos por su canto con cuidado contra la superficie de la mesa de trabajo. 8. Secar el portaobjeto presionando entre dos papeles de filtro, pero en ningn caso se debe frotar el porta. 9. Observar la preparacin al microscopio llegando hasta el mximo aumento. Si se quiere montar de forma definitiva no se debe usar ahora el aceite de inmersin. MONTAJE DEFINITIVO DE LA PREPARACIN La tcnica siguiente es de aplicacin para cualquier preparacin microscpica que se desee montar de forma definitiva. Se anotar en un extremo del portaobjetos el contenido de la preparacin, la fecha y, en su caso, el nombre del alumno. 10. Pasar sucesivamente los portaobjetos por las siguientes soluciones mantenindolos un mnimo de 5 minutos en cada bao. La serie de alcoholes puede modificarse en funcin de la disponibilidad de los reactivos, pero el objetivo es que la preparacin quede totalmente deshidratada. Escurrir bien el reactivo antes de introducirlo en el siguiente bao. a b c d e Alcohol de 70 Alcohol de 95 Acetona pura Acetona-xilol (1:1) Xilol14

11.

Montar la preparacin. Emplear blsamo de Canad, euparal o algn medio de montaje sinttico. Utilizar preferiblemente cubreobjetos de 22x22 mm.(1)


PRACTICA 3 OBSERVACIN DE BACTERIAS

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OBJETIVOS 1. Realizar una tincin simple de bacterias procedentes de distintas muestras naturales 2. Realizar dos tipos de fijaciones bacterianas y saber en qu casos se recomienda una u otra. 3. Observar la morfologa bacteriana y aprender a distinguir los distintos tipos de agrupaciones que existen. 4. Practicar con el microscopio al mximo aumento y con el correcto empleo del aceite de inmersin. MATERIAL - Mechero Bunsen o de alcohol - Asa de siembra o aguja enmangada - Pinzas - Portaobjetos - Muestras bacterianas de origen natural: yogur, vinagre, sarro dental, suelo, etc. - Colorantes para tincin: a) Solucin de cristal violeta al 1% b) Solucin de safranina al 0,5% c) Azul de metileno al 1% - Microscopio y aceite de inmersin BACTERIAS DEL YOGUR El yogur es un producto lcteo producido por la fermentacin natural de la leche. A escala industrial se realiza la fermentacin aadiendo a la leche dosis del 3-4% de una asociacin de dos cepas bacterianas: el Streptococcus termophilus, poco productor de cido, pero muy aromtico, y el Lactobacillus bulgaricus, muy acidificante. En esta preparacin se podrn, por tanto, observar dos morfologas bacterianas distintas (cocos y bacilos) y un tipo de agrupacin (estreptococos, cocos en cadenas arrosariadas). Adems, el tamao del lactobacilo (unos 30m de longitud) facilita la observacin aunque no se tenga mucha prctica con el enfoque del microscopio. 1. Realizar el frotis disolviendo una mnima porcin de yogur en una pequea gota de agua. 2. Fijar con metanol para eliminar parte de la grasa.

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3. Teir

con un colorante cualquiera de los arriba indicados durante 1-2

minutos. 4. Observar al mximo aumento del microscopio. Bacterias del vinagre El vinagre es una solucin acuosa rica en cido actico resultante de la fermentacin espontnea del vino o de bebidas alcohlicas de baja graduacin. La acetificacin del vino es producida por bacterias aerbicas del cido actico, principalmente Acetobacter aceti, aunque tambin Gluconobacter. Se trata de bacilos rectos con flagelos polares. 1. Tomar con una aguja enmangada una pequea porcin de madre de vinagre natural o de la telilla que se forma sobre la superficie de los vinos agriado. 2. Extender la muestra en el portaobjetos con una gota de agua y hacer el frotis. 3. Dejar secar y fijar con calor. 4. Teir 2-3 minutos, lavar el exceso de colorante y secar. Bacterias del sarro dental El sarro dental es un depsito consistente y adherente localizado sobre el esmalte de los dientes. Est constituido principalmente por restos proteicos, sales minerales y bacterias junto con sus productos metablicos. La flora bacteriana de la cavidad bucal es muy variable dependiendo de las condiciones que se den en el momento de hacer la preparacin, pero suelen abundar bacterias saprfitas, pudindose observar gran variedad de morfologas: espiroquetas, cocobacilos, diplococos y bacilos. 1. Con una aguja enmangada tomar una pequea porcin de sarro dental y disolverla en una gota de agua sobre el portaobjetos. 2. Dejar secar y fijar con calor. 3. Teir 2-3 minutos, lavar el exceso de colorante y secar. Bacterias del suelo La variedad de bacterias que pueden aparecer en una muestra de suelo es prcticamente infinita, muchas de ellas no cultivables en los laboratorios y17

algunas, incluso, desconocidas para los microbilogos. Para recoger la muestra y hacer el frotis basta con dejar parcialmente enterrado en vertical un portaobjetos en la tierra de una maceta o de un jardn. Despus de varios das, las bacterias se habrn adherido al vidrio y slo habr que fijarlas por calor y teirlas con un colorante cualquiera. Previamente hay que limpiar los bordes del portaobjetos, as como la parte que no se va a teir.(1) PREGUNTAS 1.- Qu tipos de morfologa y agrupacin aparecen en los frotis de los cultivos? 2.- Qu fin tiene la fijacin de muestras al realizar un frotis bacteriano? 3.- Seale las ventajas y desventajas de la tincin simple respecto del examen en fresco. DIBUJOS


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PRACTICA 4 TINCION GRAMOBJETIVO. Que el alumno aprenda a clasificar las bacterias aplicando una tcnica diferencial como es la tincin de Gram. MATERIAL

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Microscopio Portaobjetos Cubreobjetos Asa de siembra Cubeta de tincin Cultivo bacteriano Pinzas

Frasco lavador Mechero de alcohol Papel de filtro Cristal violeta Lugol Alcohol-acetona Safranina

TCNICA 1. Preparar los frotis bacterianos. 2. Teir con cristal violeta 1min. 3. Lavar con abundante agua el exceso de colorante. 4. Cubrir con Lugol 1min. 5. Lavar con agua el exceso de Lugol. 6. Decolorar con alcohol-acetona o simplemente con alcohol hasta que la preparacin deje de perder color (30seg) 7. Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente. 8. Teir con safranina 1min. 9. Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste. 10. Secar la preparacin. 11. Examinar al microscopio fijndose sobre todo en el color de cada preparacin. Los tiempos de exposicin a los colorantes son orientativos. Cada vez que se prepara la batera de colorantes para realizar la tincin Gram presentan algunas diferencias respecto a los preparados en otro momento, por lo que puede ser necesario ajustar los tiempos. En un laboratorio de Microbiologa, cada vez que se preparan los colorantes, se suelen hacer pruebas con cultivos patrn de los dos tipos (Gram+ y Gram-) para ajustar as los tiempos y tener la certeza de que el resultado de todas las tinciones que se hagan mientras duren esos colorantes son fiables.

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Otra posibilidad es adquirir el equipo completo de colorantes ya preparados, pero es mucho ms caro.(1) Dibujos


PRACTICA 5 OBSERVACIN DE PROTISTAS DE VIDA LIBREOBJETIVO. El alumno reconozca diferentes protistas de vida libre que se desarrollan en nuestro medio ambiente los cuales varan de acuerdo a las estaciones del ao.

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Los estanques en tu escuela o colonia contienen muchos protistas e invertebrados. La composicin de estas comunidades varia a travs de los estanques y conforme avanza el ao. MATERIAL Gota de agua estancada Porta y cubreobjetos Pipeta Pasteur Microscopio

TCNICA1.

Toma una gota de agua estancada y colcala en un portaobjetos. Cbrela con un cubreobjetos. Observa al microscopio. Componentes celulares: flagelos, cilios y diferentes medios de locomocin.

OBSERVACIONES

Aumento Total ____________ Sin/Con tincin ____________


PREGUNTAS. 1. Describe con palabras y dibujos los organismos de tu gota de agua. RESULTADO, DISCUSION Y CONCLUSIONES22

PRACTICA 6 REPRODUCCIN CELULAR: REPRODUCCIN ASEXUAL POR GEMACIN EN LEVADURASOBJETIVO. El alumno reconozca la reproduccin asexual en clulas eucariontes. MATERIAL Microscopio Portaobjetos Cubreobjetos Levadura Agua azucarada Aguja enmangada Lactofenol-safranina

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TCNICA 1. Disolver con ayuda de una aguja enmangada un poco de levadura sobre un porta que contenga 2 o 3 gotas de agua ligeramente azucarada. 2. Colocar el cubreobjetos y observar al microscopio. 3. Repetir los pasos anteriores mezclando sobre el portaobjetos la suspensin acuosa de la levadura con una gota de lactofenol-safranina. Con este procedimiento se consigue una doble finalidad: a) Ver mejor las clulas de las levaduras, teidas por la safranina.b)

Retrasar un poco el desprendimiento de las clulas hijas gracias a la accin desfavorable del fenol para la vida normal de las levaduras.(1)

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REPRODUCCIN CELULAR: REPRODUCCIN ASEXUAL POR GEMACIN EN LEVADURA. OBSERVACIONES



PREGUNTAS. 1. Por qu se realiza la tincin? 2. Qu hace la safranina? 3. Cul es la funcin del lactofenol? RESULTADO, DISCUSION Y CONCLUSIONES

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PRACTICA 7 OBSERVACIN MICROSCPICA DE HONGOSOBJETIVO. Que el alumno identifique los hongos microscpicos que se encuentran en el ambiente. Los principales mtodos aplicados para la observacin microscpica de los cultivos son: la observacin en fresco, con una solucin adecuada, y las preparaciones en cinta adhesiva. 1. Realizar preparaciones en fresco y en cinta adhesiva de distintas especies de mohos. 2. Observar la morfologa de los hongos y distinguir entre hifas septadas y no septadas y entre distintos tipos de esporas y las estructuras que las originan. MATERIAL - Portaobjetos y cubreobjetos (22x22 mm) muy limpios y desengrasados con alcohol - Cubetas de Tinciones - Aguja enmangada o lanceta - Cinta adhesiva transparente - Trozo enmohecido de fruta o pan o un cultivo de hongos - Solucin de lactofenol al azul algodn - Microscopio PREPARACIONES EN FRESCO DE MOHOS 1. Colocar sobre un portaobjetos una gota de solucin de lactofenol no demasiado grande para evitar que el cubreobjetos flote y la preparacin quede demasiado gruesa. Realizar la misma operacin en otro portaobjetos que se usar para lavar la muestra.

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2. Tomar

el material a observar en una mnima cantidad con agujas

finas o lancetas procurando arrancarlo desde la base y disponerlo con cuidado sobre la gota de uno de los portaobjetos. Con esta especie de lavado se consigue desprender el exceso de conidios que casi siempre llenan estas preparaciones y que impiden ver lo que realmente interesa, los conidiforos.3. Transportar

el material con la lanceta a la gota del segundo

portaobjetos que ser ya el definitivo. Si se trata de hongos con picnidios (estructuras globosas tapizadas en su interior por los conidiforos), se aplastarn stos ligeramente sobre la gota o se seccionarn con un bistur. 4. Con agujas muy finas se distribuye el material en la gota de manera que no quede amontonado. 5. Colocar el portaobjetos poco a poco y empezando por un lado para evitar que se formen burbujas entre los dos vidrios. PREPARACIONES EN CINTA ADHESIVA 1. Colocar sobre un portaobjetos una gota de solucin de lactofenol no demasiado grande para evitar que el cubreobjetos flote y la preparacin quede demasiado gruesa. 2. Cortar un trozo de cinta adhesiva transparente de aproximadamente 2cm. 3. Tocar con el lado adhesivo de la cinta la superficie de la fruta o el pan enmohecidos o el borde de una colonia de hongo de un cultivo. En la zona central de una colonia puede haber una excesiva concentracin de esporas. 4. Pegar la cinta adhesiva sobre la gota del portaobjetos.5. Eliminar

el colorante sobrante con un papel de filtro.(1)

OBSERVACIN MICROSCPICA DE HONGOS OBSERVACIONES

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Aumento Total ____________


PREGUNTAS. 1. Determina si las hifas son septadas o no. 2. Forma, tamao y disposicin de las esporas. 3. Tipo de estructuras formadoras de esporas que se observan. RESULTADO, DISCUSION Y CONCLUSIONES

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PRACTICA 8 OBSERVACIN MICROSCPICA DE UN TEJIDO VEGETAL: TEJIDO EPIDRMICO DE CEBOLLAOBJETIVO. Que el alumno reconozca diferentes estructuras del tejido vegetal. MATERIAL 1.

Microscopio Portaobjetos Cubreobjetos Cubeta Agujas enmangadas Pinzas Escalpelo Verde de metilo actico o azul de metileno Cuentagotas Cebolla Separar una de las hojas interna de la cebolla y desprender la tenue membrana que est adherida por su cara inferior cncava.

TCNICA

2. Depositar el fragmento de membrana en un porta con unas gotas de agua. Pon el porta sobre la cubeta de tincin para que caiga en ella el agua y los colorantes. Si es preciso, estirar el trozo de epidermis con ayuda de dos agujas enmangadas. 3. Escurrir el agua, aadir una gotas de verde de metilo actico (o azul de metileno) sobre la membrana y dejar actuar durante 5 minutos aproximadamente. No debe secarse la epidermis por falta de colorante o por evaporacin del mismo!29

Citoplasma

Membrana Ncleo

4. Con el cuentagotas baar la epidermis con agua abundante hasta que no suelte colorante.5.

Colocar sobre la preparacin un cubreobjetos evitando que se formen burbujas y llevarlas al microscopio.

6. Observa la preparacin a distintos aumentos empezando por el ms bajo7.

Observa la preparacin a distintos aumentos, empezando por el ms bajo. Identifica las distintas clulas del tejido epidrmico y las de las hojas del bulbo de cebolla.(1)

OBSERVACIN MICROSCPICA EPIDRMICO DE CEBOLLA OBSERVACIONES

DE

UN

TEJIDO

VEGETAL:

TEJIDO




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PRACTICA 9 OBSERVACIN MICROSCPICA DE UN TEJIDO VEGETAL: TEJIDO EPIDRMICO DEL PUERROOBJETIVO. Que el alumno reconozca estructuras del tejido vegetal. MATERIAL Microscopio Portaobjetos Cubreobjetos Cuentagotas con agua Agujas enmangadas Pinzas Escalpelo Un puerro 1. Retira una parte pequea de la epidermis de la hoja de puerro y llvala sobre un porta en el que habrs colocado dos o tres gotas de agua. Ten la precaucin de que sea una capa incolora y de que est perfectamente extendida. 2. Pon el cubre y examina la preparacin al microscopio.3.

TCNICA

Identifica en tu preparacin la estructura de las clulas que aparecen en el esquema.(1)

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OBSERVACIN

MICROSCPICA

DE

UN

TEJIDO

VEGETAL:

TEJIDO

EPIDRMICO DEL PUERRO

OBSERVACIONES



PREGUNTAS. 1. Qu son los estomas? 2. Cul es su funcin? 3. Poseen cloroplastos alguna de las clulas epidrmicas? RESULTADO, DISCUSION Y CONCLUSIONES

PRACTICA 1032

OBSERVACIN DE CLULAS VEGETALES: CLULAS DE LA PULPA DE TOMATEOBJETIVO. Que el alumno reconozca los organelos membranosos en tejido vegetal. MATERIAL TCNICA 1. Utilizando un escalpelo, corta en dos mitades el tomate. 2. Obtn, ayudndote de unas pinzas, un trozo de pulpa de tomate de la zona indicada en la figura de unos 2mm de grosor. 3. Depostalo en el centro de un portaobjetos sin poner agua. 4. Coloca encima un cubreobjetos y comprime suavemente del con los de dedos hasta obtener un completo aplastamiento fragmento pulpa de tomate. 5. Lleva la preparacin a la platina del microscopio y realiza una observacin con pequeos aumentos. Selecciona el mejor grupo de clulas y pasa a mayores aumentos. 6. Identifica los distintos orgnulosVacuola

Microscopio Portaobjetos Cubreobjetos Escalpelo Pinzas Tomate

celulares visibles y dibuja lo que.(1)

Nucleo Cromoplasto 33

OBSERVACIN DE CLULAS VEGETALES: CLULAS DE LA PULPA DE TOMATE OBSERVACIONES




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PRACTICA 11 OBSERVACIN DE CLULAS DEL TEJIDO ADIPOSOOBJETIVO. Que el alumno reconozca las estructuras en tejido animal graso. MATERIAL Tocino u otra grasa animal Bistur o escalpelo Porta y cubreobjetos Formol Sudn III Frasco lavador Cubeta de tincin Microscopio 1. Con ayuda de un bistur, cortar una finsima capa de grasa, colocarla en un porta y cubrirla con unas gotas de formol. Dejar actuar 4 minutos. 2. Lavar la muestra con agua y cubrirla con unas gotas de Sudn III. Dejar actuar unos 5 minutos.3.

TCNICA

Volver a lavar la preparacin con agua, cubrirla con un cubreobjetos

y observar al microscopio.(1) OBSERVACIN DE CLULAS DEL TEJIDO ADIPOSO. OBSERVACIONES


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PREGUNTAS. 1. Por qu hay que teir con Sudn III? 2. Para qu sirve el formol? RESULTADO, DISCUSION Y CONCLUSIONES

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PRACTICA 12 OBSERVACIN DE LA EPIDERMIS EN HOJAS DE ZEBRINAOBJETIVO. El alumno reconozca la epidermis en las plantas. Ahora se observar la superficie de la epidermis: la capa ms externa de una clula vegetal. En ella podrs ver clulas guarda que controlan el intercambio de gas y vapor en la planta a travs de un poro, o estoma. Sers capaz de ver el estoma abierto o cerrado en un periodo de varios minutos. MATERIAL-

hojas de Zebrina (o especies alternativas). pinzas Porta y cubreobjetos Agua Solucin salina Microscopio Utilizars un portaobjetos, cubreobjetos, pinzas y hojas de Zebrina (o especies alternativas).

1.

TCNICA

2. Coloca una gota de agua en el centro del portaobjetos.3.

Rompe un pedazo de la hoja de Zebrina de manera que un borde irregular de la epidermis aparezca en el lado de debajo de la hoja.

4. Utilizando pinzas cuidadosamente toma el borde de la hoja de la epidermis expuesta y desprende una pieza muy pequea; coloca esta pequea pieza de epidermis en la gota de agua de tu porta objetos. Algunas veces el tejido se enrosca y se pega a las pinzas si esto sucede, algunas veces se desenrollan cuando colocas el tejido en el agua. Si no pasa esto, aydate de las pinzas. . 5. Coloca un cubre objetos sobre la muestra y observa al microscopio.6.

Busca clulas en pares con forma de labios. Estas son las clulas guarda. En la Zebrina no existen pigmentos rojos presentes en el resto de los tejidos epidrmicos.

37

7. Localiza pares de clulas guarda con el estoma abierto las clulas en forma de labio estarn arqueadas ligeramente, dejando un espacio blanco entre ellas. 8. Dibuja el tejido epidrmico incluyendo las clulas guarda y los cloroplastos. Seala las clulas epidrmicas, clulas guarda, estomas, y cloroplastos. 9. coloca una gota de solucin salina en el portaobjetos adyacente al borde de cubre objetos. 10. coloca un pequea pieza de papel secante en el lado opuesto del cubre objetos. Esto baara de solucin salina la muestra de epidermis y las clulas guarda. La solucin salina sacara agua de las clulas.11.

despus de 30 minutos observa los efectos de la solucin salina en las clulas guarda y escribe una descripcin de los cambios en la epidermis.(2)

COMPONENTES CELULARES: LA EPIDERMIS VEGETAL. OBSERVACIONES



PREGUNTAS. 1. Cmo puede una clula regular el movimiento de dixido de carbono, oxigeno, y vapor de agua hacia fuera y dentro de la hoja?38

2. Cmo beneficiara influenciar en el movimiento de estas molculas? RESULTADO, DISCUSION Y CONCLUSIONES

PRACTICA 13

39

OBSERVACIN DEL CITOESQUELETO Y FAGOCITOSIS EN PROTISTAS ACELULARES: TETRAHYMENAOBJETIVO. El alumno reconozca las estructuras externas en clulas eucariotas: los cilios, citoesqueleto y fagocitosis En esta seccin, trabajars con organismos vivos del reino protista. Protistas contienen organismos eucariotas acelulares y otras grupos cercanos. El organismo con que trabajaras es un protozoario ciliado del genero Tetrahymena. Los cilios son proyecciones de la clula que contienen filamentos del citoesqueleto que se mueven en forma de ola para mantener al organismo en su ambiente lquido. En esta actividad colocars a Tetrahymena en una solucin con partculas de tinta. Esto te ayudar a observar la locomocin y hbitos alimenticios de este protozoario. A travs del microscopio, observaras la accin de los cilios. rganos en forma de pelo en la superficie de Tetrahymena. Los cilios tambin se encuentra en las superficie de las clulas epiteliales en tus vas respiratorias, desde la traquea en tu garganta hasta los bronquiolos de tus pulmones. Mientras investigas la funcin de los cilios en Tetrahymena trata de imaginar como estos mismos organelos pueden funcionar en tus vas respiratorias. Tambin podrs observar la fagocitosis, tipo de alimentacin utilizado por Tetrahymena, las clulas especializadas en nuestro sistema inmune utilizan este mismo proceso de fagocitosis para eliminar material infeccioso, adems de observar a Tetrahymena capturando las partculas de tinta ,observaras a estas partculas moverse a travs de las fibras del citoesqueleto. Aunque no podrs ver el citoesqueleto, podrs ver el camino por el que se mueven las vesculas que contiene la tinta hacia las reas de digestin.

MATERIAL-

Suspensiones de clulas de Tetrahymena Pipeta pasteur40

-

-

Porta y cubreobjetos Tinta al 1% Microscopio

TCNICA 1. Habr suspensiones de clulas de Tetrahymena en soluciones de proteoseptona al 2% en un matraz de 125ml. Sin mezclar el fluido, inserta la punta de una pipeta al fondo de la suspensin de clulas y toma 2mm en un tubo. 2. Pipetea 2mm de tinta al 1% en el mismo tubo y mezcla subvente las dos soluciones. Toma el tiempo. 3. Coloca dos gotas de la mezcla de Tetrahymena y la tinta en un portaobjetos, coloca un cubreobjetos y observa al menos 5 clulas.4.

Despus de 10min, repite el paso 3 y observa las clulas en microscopio. Repite el paso 3 de nuevo despus de 20 min. y despus de 30 min.(2)

COMPONENTES CELULARES: CILIOS Y CITOESQUELETO. OBSERVACIONES

Aumento Total ____________ Sin/Con tincin ____________ 41


PREGUNTAS.1.

Describir alimento.

como

influencia

el

citoesqueleto

en

el

movimiento

de

Tetrahymena en su ambiente, adems de la captura y procesamiento del RESULTADO, DISCUSION Y CONCLUSIONES

PRACTICA 14 OBSERVACIN DE CLULAS SANGUNEASOBJETIVO. Que el alumno conozca las diferencias estructurales entre clulas animales y vegetales. MATERIALES Microscopio Portaobjetos Mechero de alcohol Lanceta estril

42

-

Cubeta de tincin Frasco lavador Alcohol absoluto Hematoxilina Eosina 1. Con la lanceta estril realizar una puncin en un pulgar. 2. Depositar una gota de sangre en la parte central de un portaobjetos. 3. Colocar un portaobjetos como indica el dibujo y deslizarlo sobre toda la superficie del porta de manera que se pueda obtener una fina pelcula de sangre. El porta absorbe la gota y la arrastra, pero sin pasar nunca por encima de ella para no daar los hemates. 4. Colocar el frotis de sangre sobre la cubeta de tincin y aadir unas gotas de alcohol absoluto y dejar que el alcohol se evapore para fijar la preparacin. 5. Cubrir con unas gotas de hematoxilina y dejar actuar durante 15 minutos. Evitar la desecacin del colorante agregando ms lquido. 6. Lavar la preparacin y aadir unas gotas de eosina dejndola actuar 1 minuto. 7. Volver a lavar hasta que no queden restos de colorante.

TCNICA

gota de sangre

8. Dejar secar aireando el porta o bien al calor muy lento de la llama del mechero. 9. Observar al microscopio.

43

OBSERVACIN MICROSCPICA Al microscopio se vern con un dominio predominante los glbulos rojos, hemates o eritrocitos teidos de color rojo por la eosina. No tienen ncleo y son ms delgados por el centro que por los bordes. Los glbulos blancos o leucocitos se identifican fcilmente por la presencia de ncleo, teido de morado por la hematoxilina. Hay varias clases de leucocitos: 1. Linfocitos: de tamao aproximado al de los glbulos rojos, tienen un solo ncleo que ocupa casi todo el glbulo. 2. Monolitos: son los leucocitos mayores, poco frecuentes normalmente, ncleo grande, redondo, son los ms mviles y su funcin principal es la fagocitosis. 3. Polimorfonucleares: ncleo fragmentado o arrosariado. Pueden ser eosinfilos, con abundantes granulaciones teidas de rojo por la eosina, neutrfilos y basfilos. Las plaquetas no son visibles ya que precisan una tcnica especial de tincin.(1)

OBSERVACIN DE CLULAS SANGUNEAS OBSERVACIONES



44

PREGUNTAS. 1. Identifica en los dibujos los distintos tipos de clulas sanguneas. 2. De qu color aparece teido el ncleo de los leucocitos? 3. Qu forma tienen los glbulos rojos? Tienen ncleo? RESULTADO, DISCUSION Y CONCLUSIONES

PRACTICA 15 OBSERVACIN DE LAS CLULAS EPITELIALES DE NUESTRA BOCAOBJETIVO. El alumno reconozca diferentes componentes de las clulas eucariotas humanas. En esta seccin, preparars una muestra de tus clulas epiteliales. Adicionars azul de metileno a tu muestra de clulas, esto volver visible el material nuclear a travs del microscopio.

45

Nota-Estars observando clulas epiteliales de tu propia boca. Debido a cuestiones de salud, es importante que sigas las instrucciones de acuerdo a las normas de seguridad de los picadientes que usars para colectar tus clulas epiteliales. MATERIAL Picadiente Porta y cubreobjetos Azul de metileno Papel secante Pipetas pasteur Cubeta de tincin Microscopio

TCNICA 1. Utilizars un microscopio, un cubreobjetos, portaobjetos, y papel secante. 2. Cuidadosamente coloca una pequea gota de azul de metileno en el centro del portaobjetos. Si usas demasiado se escurrir del cubreobjetos ocasionndote problemas. Recuerda que es un colorante que penetrar todo lo que toca, as que evita el contacto con tu ropa. Adiciona una gota de agua a la laminilla. 3. Cuidadosamente usa la punta de un picadiente para frotar el tejido epitelial de la mejilla dentro de tu boca, debajo de tu labio superior. 4. Gira esa parte del picadiente en el centro de tu laminilla. Antes de continuar coloca ese picadiente en un bote de desechos con cloro al 10%. 5. Utiliza pinzas para colocar un cubreobjetos sobre tu muestra y obsrvala al microscopio. Antes de continuar coloca tu portaobjetos, sin lavarlo, en el bote de residuos punzo cortantes. Componentes celulares: membrana plasmtica, envoltura nuclear y cromatina.(2) OBSERVACIONES46



PREGUNTAS. 2. Dibuja tu clula y seala la membrana plasmtica, la envoltura nuclear, y la cromatina. La cromatina est compuesta, en parte, de ADN, la molcula que contiene toda la informacin hereditaria en cada una de tus clulas. RESULTADO, DISCUSION Y CONCLUSIONES

PRACTICA 16 OBSERVACIN DE LOS CLOROPLASTOS Y PARED CELULAR EN HOJAS DE LA PLANTA ACUTICA ELODEAOBJETIVO. El alumno reconozca la pared celular y los cloroplastos en las plantas. Las hojas de la planta acutica Elodea sp. Son muy delgadas que pueden observarse sus clulas con un microscopio sin necesidad de cortarlas en secciones delgadas. La mayora de las estructuras en las clulas de las plantas no son visibles a travs de la luz del microscopio. Sin embargo, cuando ajustas propiamente el microscopio podrs ver la pared celular y los cloroplastos. El centro47

de la clula aparecer vaco ya que est ocupado por una gran vacuola que no es visible a travs de la luz del microscopio. Los organelos que son de inters particular en este ejercicio son los cloroplastos; son de color verde, estructura membranosa en el citoplasma entre la membrana plasmtica y la vacuola. Como estars observando clulas vivas, los cloroplastos se mostrarn en su color y comportamiento natural bajo el microscopio. MATERIAL Hoja de Elodea Bistur o escalpelo Porta y cubreobjetos agua Microscopio

TCNICA1.

Utiliza pinzas para tomar una hoja joven de Elodea. Las hojas jvenes estn al extremo distal de la punta del tallo.

2. Coloca la hoja extendida en una laminilla. Adhiere una gota o dos de agua y coloca un cubreobjetos. 3. Observa al objetivo 10x y despus al de 40x. 4. Usa el micrmetro para moverte a travs de los planos de la clula. b) El centro de la clula est ocupado por una gran vacuola que no es visible. La vacuola empuja el citoplasma y los cloroplastos hacia abajo, arriba y a la pared de la clula. c) Si ests enfocando arriba de la clula vers cloroplastos esparcidos a travs de la clula. d) Mientras vayas enfocando hacia debajo de la clula, los cloroplastos ocuparn el permetro de la clula, hacia la pared. Hacia abajo de la clula, los cloroplastos estarn otra vez esparcidos en la clula.5.

Haz un bosquejo de una clula de Elodea. Anota la pared celular, y los cloroplastos. Aunque parezca que las clulas ests vacas, realmente estn llenas de estructuras no visibles con el microscopio de luz.48

6.

Si hay movimientos citoplasmticos, vers los cloroplastos circulando alrededor de la clula. Los movimientos del citoplasma son controlados por microfilamentos en el citoesqueleto de la clula. Estos filamentos de actina y miosina mueven el contenido celular a un proceso activo que usa la energa liberada por el rompimiento de ATP hacia ADP.(2)

COMPONENTES CELULARES: CLOROPLASTOS Y PARED CELULAR

OBSERVACIONES



PREGUNTAS.1.

Cmo puede beneficiarse una clula al gastar energa en circular su citoplasma?


49

PRACTICA 17 OBSERVACIN DE LA FOTOSNTESIS EN LA PLANTA ELODEA SP.OBJETIVO. El alumno reconozca el proceso de la fotosntesis determinando la produccin de oxigeno. La vida por si misma no puede ser mantenida sin energa. Tal vez la diferencia fundamental entre organismos vivos y substancias no vivas es el nivel tan impresionante de complejidad y la organizacin entre organismos vivos, una cantidad de energa tremenda es requerida para llevar a cabo las complejas funciones de los organismos. Las funciones ms bsicas de los organismos-sentir y responder condiciones externas, crecer, desarrollarse, y reproducirse-claramente requieren de energa. Si los organismos vivos son privados de un recurso externo de energa, no son capaces de continuar elaborando estos procesos esenciales y se vuelven inactivos o mueren. Como toda vida requiere una fuente de energa, la vida por s misma necesita una fuente externa de energa, esta fuente externa viene del sol. La fotosntesis es el proceso que convierte la energa del sol en energa qumica, en los enlaces que mantienen juntas las molculas orgnicas de los organismos vivos. La energa que se requiere para construir protenas, lpidos, cidos

50

nucleicos, y carbohidratos proviene del sol. Aunque todas las formas de vida estn compuestas de molculas orgnicas, solamente unas cuantas- plantas, algas, y algunas bacterias- son capaces de fotosintetizar. El resto debemos robar la energa de estos organismos fotosintetizadores (cuando comemos plantas), o de otros ladrones (cuando comemos animales). La fotosntesis es un proceso que incluye muchas reacciones, las cuales se agrupan en dos reacciones mayores. Tal vez las ms impresionantes de estas reacciones en un organismo vivo son las reacciones de transduccin de la fotosntesis. Las reacciones de transduccin capturan las longitudes de onda de la luz roja y azul. La luz verde no se utiliza en la fotosntesis, por lo cual la mayora de los organismos fotosintticos reflejan la luz verde. La luz verde y roja es utilizada pata excitar los electrones de las molculas de agua ocasionando que el agua se rompa formando oxgeno. La energa de estos electrones excitados es usada en las reacciones de transduccin para adicionar un tercer fosfato al ADP para formar ATP y es usado para adherir electrones al hidrgeno del NADP + para formar NADPH. Las reacciones de fijacin de carbono oxidan el ATP y el NADPH que fueron reducidos en la anterior reaccin de luz. Esto libera energa la cual es utilizada para elaborar molculas de glucosa (C6H12O6) del hidrgeno y el dixido de carbono (CO2). Tomando todo en cuenta, estas dos reacciones convierten la energa solar en energa qumica, utilizan el agua y el dixido de carbono para producir azcares, y ellos producen oxgeno. Las carreras de electrones (ADP, ATP, NADP+, NADPH) son recicladas de las reacciones de transduccin hacia las reacciones de fijacin de carbono y de vuelta a las reacciones de transduccin. Como simplemente circulan entre las reacciones, no son incluidas en toda la red de reacciones que describen los reactivos que entran a la fotosntesis y los productos que salen de la fotosntesis. En esta actividad trabajars en grupo para disear y conducir un experimento que pruebe el efecto de un factor, una variable independiente que hayas diseado, en la velocidad de la fotosntesis, la variable dependiente.51

Usaras un respirometro para medir la produccin de oxigeno de una planta acutica, Elodea. Como el oxigeno molecular es producido solamente en la fotosntesis, puedes usar la produccin de oxigeno como un indicador de la velocidad de la fotosntesis. Como Elodea produce oxigeno a travs de la fotosntesis, el oxigeno subir del agua hacia el espacio areo al inicio del tubo. La adicin de oxigeno al espacio areo empujara el fluido marcador hacia la punta de la pipeta. Midiendo el movimiento del fluido marcador a travs de la pipeta, estars midiendo tu variable dependiente, la velocidad de la fotosntesis. Mientras conduces este experimento cuida de evitar y controlar otros factores que puedan cambiar la presin del aire en tu respirometro e interferir con la medicin de la fotosntesis. Figura 4-2.

52

TCNICA 1. Llena el frasco del respirmetro con agua a temperatura del cuarto (Si cambias la temperatura del agua cuida de no quebrar el frasco cambiando repentinamente la temperatura). 2. Coloca la lmpara a 70cm del bao de agua. 3. Atornilla la tapa al respirometro. Rota el respirometro para que los dos agujeros queden equidistantes a la luz. 4. Llena los tubos con agua o con una solucin tratadora aproximadamente 3 cm debajo de la tapadera. 5. Los tubos de vidrio salientes de la tapadera necesitan estar en un espacio con aire, no debajo del agua. Usa un termmetro para asegurarte que la temperatura del agua en los tubos este alrededor de 2 grados de temperatura del agua del frasco del respirometro. Baja los tubos hacia los agujeros en la tapa frente a la luz.6.

Recorta dos ramas de Elodea de 12cm cada una y coloca una en cada tubo.

7. Adhiere dos tapones a los tubos. Si los tapones estn secos, coloca un poco de grasa en la tapadera y luego scala con papel. 8. Adhiere fluido marcador a cada pipeta e inclina la pipeta boca abajo para colocarla entre 0.0 y 0.15mm. Coloca las pipetas en una superficie nivelada como en un estante de tubos. Tips para fluidos marcadores #1 Si el fluido marcador no se mueve, probablemente la pipeta este sucia con otro fluido marcador. Lvalo con agua jabonosa y despus con agua. Si el fluido marcador se quiebra dentro de la pipeta, probablemente el interior de la pipeta este muy jabonoso, lvalo con agua. 1. Anota la posicin del fluido marcador de cada pipeta. Anota la posicin de los marcadores de cada pipeta cada cuatro minutos durante los siguientes 20 minutos. Tips para fluidos marcadores #253

Si el fluido marcador se mueve ms all de la parte graduada de la pipeta antes de tu ltima lectura, anota esta locacin y vuelve a comenzar o pide ayuda. Si el fluido marcador no se mueve en 10 minutos pide ayuda. Tal vez haya un agujero. Estn los tornillos cerrados? Estn las mangueras ajustadas? La tapadera tal vez necesita estar cerrada con un poco de grasa.2. 3.

Remueve las ramas de la Elodea; pesa cada rama y anota el peso. Si tus plantas han fotosintetizado a diferentes velocidades con solo un intento, no puedes decir si esto fue por tu variable independiente o por otro factor. Por ejemplo una rama de Elodea no es mas sana que la otra. Para obtener una conclusin convincente necesitas repetir tu experimento si hay tiempo.

4. Tus fluidos marcadores tal vez no empezaron exactamente en cero sino en diferentes locaciones. Ajusta esto y anota el resultado acumulativo de la produccin de oxigeno.5.

Tus dos plantas tal vez no eran del mismo tamao exactamente. Ajusta esto dividiendo cada valor por el peso y anota el resultado acumulativo de la produccin de oxgeno por gramo de tejido. Tabla 4-1. Tabla 4-2. Tabla 4-3.(2)

PREGUNTAS. 1. Antes de refinar los detalles de tus mtodos y preparar t experimento, debes hacer una lluvia de ideas con tu grupo para designar e identificar tu variable independiente, la variable que podrs manipular para ver si la velocidad de la fotosntesis cambia. Mientras desarrollas una lista de posibles variables independientes considera y discute las siguientes preguntas. 2. Cules son los requerimientos de la fotosntesis? 3. Qu condiciones podrn influir en la disponibilidad de estos requerimientos en un sistema acutico? 4. La fotosntesis utiliza enzimas, si lo hace, que factores pueden influir en las reacciones enzimticas dentro de una planta acutica?54

5. Mientras discutes estas preguntas, escribe una lista de posibles variables independientes de tu experimento. Una vez que hayas identificado estas variables discute tus favoritas con tu instructor. 6. Ahora que has escrito t variable independiente estas listo para escribir una hiptesis formal sugiriendo de manera general como este factor influye en la fotosntesis. 7. El siguiente paso en disear tu experimento es determinar como planearas manipular tu variable independiente. En otras palabras, ahora podrs disear los detalles de tus mtodos experimentales. Lee los siguientes mtodos y discute con tu grupo como podras modificarlos para adaptarlos a las necesidades de tu experimento. RESULTADO, DISCUSION Y CONCLUSIONES

55

PRACTICA 18 ESTUDIO DE LA MITOSIS EN CLULAS DE LA RAZ DE CEBOLLAOBJETIVO. Que el alumno se familiarice con las diferentes fases de la mitosis. MATERIALES Microscopio Portaobjetos Cubreobjetos Lanceta estril Cubeta de tincin Aguja enmangada Pinzas Palillos Frasco lavador Tijeras Papel de filtro Vaso de precipitados Vidrio de reloj56

Mechero de alcohol

TCNICA .

Orcena A Orcena B

Llenar un vaso de precipitados con agua y colocar un bulbo de cebolla sujeto con dos o tres palillos de manera que la parte inferior quede inmersa en el agua. Al cabo de 3-4 das aparecern numerosas raicillas en crecimiento de unos 3 o 4 cm de longitud.

.

Cortar con las tijeras unos 2-3 mm del extremo de las raicillas y depositarlo en un vidrio de reloj en el que se han vertido 2-3 ml de orcena A.

. .

Calentar suavemente el vidrio de reloj a la llama del mechero durante unos 8 minutos, evitando la ebullicin, hasta la emisin de vapores tenues. Con las pinzas tomar uno de los pices o extremos de las raicillas y colocarla sobre un portaobjetos, aadir una gota de orcena B y dejar actuar durante 1 minuto.

.

Colocar el cubreobjetos con mucho cuidado sobre la raz. Con el mango de una aguja enmangada dar unos golpecitos sobre el cubre sin romperlo de modo que la raz quede extendida.

.

Sobre la preparacin colocar unas tiras de papel de filtro, 5 o 6. Poner el dedo pulgar sobre el papel de filtro en la zona del cubreobjetos y hacer una suave presin, evitando que el cubre resbale. Si la preparacin est bien asentada no hay peligro de rotura por mucha presin que se realice.

.

Observar al microscopio. OBSERVACIN MICROSCPICA Se realizar a fuertes aumentos. La orcena A reblandece las membranas celulares y la B completa el proceso de tincin. Con la presin sobre el porta de la preparacin se logra una extensin y difusin de las clulas del meristemo de la cebolla.

57

La preparacin presenta el aspecto de una dispersin de clulas por todo el campo que abarca el microscopio. Se observan clulas en diversas fases o estados de divisin celular. Se ven los cromosomas teidos de morado por la orcena. El aspecto reticulado as como el mayor tamao de algunos ncleos corresponde a las clulas que se encontraban en los procesos iniciales de la divisin mittica.(1) ESTUDIO DE LA MITOSIS EN CLULAS DE LA RAZ DE CEBOLLA

OBSERVACIONES



PREGUNTAS. 1. Describe las fases de la mitosis que has observado y su significado. 2. Por qu los cromosomas se tien de morado? 3. Has observado el proceso de citocinesis? En caso afirmativo, descrbelo. RESULTADO, DISCUSION Y CONCLUSIONES

58

Bibliografa utilizada para la elaboracin de las prcticas del manual de Biologa Celular. 1. Manual de Biologa General; Jos A. Cortes. 2005 http://www.joseacortes.com/practicas/index.htm2.

Manual CELLULAR AND ORGANISMAL Biology. Ralph W. Preeszler, Laura Lowell Haas, Amy L. Marion. 2003. Outernet Publishing, LLC.

Bibliografa de consulta para el alumno. 1. Biologa. Solomon, Berg, Martin. 8. ED. Mc. Graw Hill. 20082.

Introduccin a la Biologa Celular. Alberts, Bray, Hopkin, 2. Panamericana. 2006. Biologa Molecular de LA CELULA, Bruce Alberts, Bray, Lewis 3. Omega.

3.

4. Microbiologa. Cuarta Edicin.; Lansing Prescott; John P. Harley; Donald A. Klein.; Ed. Mcgraw-Hill-Interamericana.; 2003 5.6.

Introduccin a la Microbiologa. , 9 Edicin. Tortora, Funke, Case. Ed. Panmericana. 2007 Biologa De Los Microorganismos. Octava Edicin.; Michael T. Madigan; John M. Martinko; Jack Parker Printice Hall.; 2000.

59

ANEXO Preparacin de colorantes1.

2.

3.

4.5.

Acido-Alcohol: (decolorante para tincin Ziehl-Neelsen) o cido clorhdrico concentrado ..........................................................3 ml o Etanol 95% ....................................................................................97 ml Azul de metileno: Colorante de contraste para tincin de flagelos. o Azul de metileno................................................................................1 g o Agua destilada...............................................................................100 ml Azul de metileno de Loeffler: Tinciones simples. o Solucin de hidrxido potsico al 1%.................................................1 ml o Azul de metileno, sol. saturada en etanol al 95%...............................30 ml o Agua destilada...............................................................................100 ml Colorante para esporas: o Solucin acuosa saturada de verde malaquita Colorante para flagelos de Leifson: o Solucin A Fucsina bsica .........................................................................1,2 g Etanol 95%.............................................................................100 ml o Solucin B cido tnico................................................................................3 g60

6.

7.

8.

9.

10.

11.

Agua destilada.........................................................................100 ml o Solucin C Cloruro sdico..........................................................................1,5 g Agua destilada.........................................................................100 ml Para preparar la solucin de uso, se mezclan cantidades iguales de las soluciones A, B y C y se guarda en frasco cerrado hermticamente en la nevera donde es estable durante varias semanas. Cristal violeta: Para tincin Gram y tincin simple. o Cristal violeta (violeta de genciana)....................................................0,5 g o Agua destilada.................................................................................100 ml Eosina: Para observacin de clulas sanguneas. o Eosina...............................................................................................0,3 g o cido actico glacial......................................................................0,025 ml o Agua destilada...................................................................................100 ml Fucsina diluida: Para tincin Gram y tincin simple. o Fucsina fenicada de ZiehlNeelsen......................................................10 ml o Agua destilada.................................................................................100 ml Fucsina fenicada de Ziehl-Neelsen: Para tincin cido-alcohol resistente. o Fucsina bsica......................................................................................1 g o Etanol 95%........................................................................................10 ml o Fenol 5% en solucin acuosa............................................................100 ml Hematoxilina: Para observacin de clulas sanguneas. o Hematoxilina.........................................................................................2 g o Agua destilada......................................................................................1 l Lactofenol: Para preparaciones microscpicas en fresco de mohos. o cido lctico.....................................................................................100 ml o Fenol................................................................................................100 g o Glicerol.............................................................................................200 61

12.

13.

14.

15.

16.

17.

ml o Agua.................................................................................................100 ml Lactofenol al Azul Algodn: Para preparaciones en fresco y tinciones de mohos. o Solucin de azul algodn Sol. saturada de azul algodn (azul anilina soluble)......................10 ml Glicerol.....................................................................................1 0 ml Agua.........................................................................................8 0 ml Mezclar esta solucin con lactofenol a partes iguales Lugol: Solucin de yodo para tincin Gram. o Yodo...................................................................................................1 g o Yoduro potsico..................................................................................2 g o Agua destilada.................................................................................300 ml Orcena A: Tincin de cromosomas. o Orcena................................................................................................2 g o cido actico.....................................................................................45,8 ml o cido clorhdrico 1 mol/l......................................................................8,3 ml o Agua..................................................................................................45, 8 ml Orcena B: Tincin de cromosomas. o Orcena................................................................................................2 g o cido actico.....................................................................................55 ml o Agua..................................................................................................55 ml Safranina: Colorante de contraste para tincin Gram (preferible a la fucsina) y esporas. o Safranina.........................................................................................0,25 g o Agua destilada..................................................................................100 m Sudn III: Tincin especfica de grasas. o Alcohol etlico...................................................................................100 ml o Sudn III...................................................................................hasta62

saturacin18.

Verde de metilo actico: Igual composicin que la eosina (num. 7)

63

Manual Biologia Celular - Mtro. Francisco Vazquez

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