Levaduras en La Industria Tequilera

7/26/2019 Levaduras en La Industria Tequilera

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Fermentis tiene la satisfaccin de presentar la guaprctica de levaduras y fermentacin especial-mente ideada para produccin de tequila. Elobjetivo de este proyecto es proporcionarconsejos tcnicos tiles para poder lle-var adelante un manejo correcto de lafermentacin alcohlica a partir delevadura en formato seco, priori-zando rendimientos y calidad orga-nolptica.

El contenido de nuestra guatambin puede ser bajado desdela seccin tequila en el sitio www.fermentis.com.Visite nuestro sitio web!


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Levadura y tequilaTipos de levaduras en la industria tequilera

Qu es la levadura activa seca?Levaduras Fermentis para produccin del tequila

El crecimiento de las levaduras y cintica de fermentacinEl crecimiento de las levaduras

Velocidad de produccin de alcohol durante la fermentacin

Factores que afectan el desempeo de las levadurasen la fermentacin alcohlica

Factores fsicosFactores qumicos

Factores biolgicos

Manejo de levaduras en la industria tequileraRehidratacinInoculacin

Fermentacin

Influenca de las levaduras en la produccin de los principalescompuestos voltiles y otras sustancias relevantes

AcetaldehdoAlcoholes superiores

steresMetanol

NutricinNitrgenoVitaminasMinerales

Factores de supervivenciaAdicin de derivados de levaduras como activadores de fermentacin

Tecnologa VHGCaracterizacin de Safteq silver y Safteq blue

Bibliografa

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El tequila tiene establecido un territorio de denominacin de origen (TDO) que incluy181 municipios en Mxico. Entre ellos se encuentran :

Todos los municipios del Estado de Jalisco,30 municipios de Michoacn,11 municipios de Tamaulipas,8 municipios de Nayarit y7 municipios de Guanajuato.

Las etapas en la produccin de tequila involucran la cosecha del agave y preparacin de lacabezas. Estas son trasladadas a la fbrica donde son sometidas a un proceso de cocimientpara hidrolizar los fructanos, el principal polisacrido del agave. Una vez cocidas, las cabezse muelen y se extrae un jugo rico en azcares, que es fermentado. El vino generado e

posteriormente destilado (doble destilacin) para producir el tequila conocido como blancoLas versiones reposado, aejo y extra aejo requieren un cierto tiempo de aejamienen barricas de roble, que es establecido por la norma que regula la produccin de tequila

La seccin 4.34 de la norma mexicana NOM-006-SCFI-2005 dene al tequila de la siguiente maBebida alcohlica regional obtenida por destilacin de mostos, preparados directa y originalmentedel material extrado en las instalaciones de la fbrica de un productor autorizado, la cual debe estarubicada en el territor io comprendido en la Declaracin, derivados de las cabezas de Agave tequilanaweber variedad azul, previa o posteriormente hidrolizadas o cocidas, y sometidos a fermentacinalcohlica con levaduras, cultivadas o no, siendo susceptibles los mostos de ser enriquecidos y mezclados conjuntamente en la formulacin con otros azcares hasta en una proporcin nomayor de 49% de azcares reductores totales expresados en unidades de masa, en los trminosestablecidos por esta NOM y en la inteligencia que no estn permitidas las mezclas en fro. El tequilaes un lquido que, de acuerdo a su clase, es incoloro o coloreado cuando es madurado o cuando esabocado sin madurarlo:

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Tipos de levaduras en la industria tequilera

Las levaduras son hongos predominantemente unicelulares que incluyen varios taxones. Existems de 700 especies de levadura, algunas de ellas muy conocidas debido a sus aplicacioneindustriales, principalmente las correspondientes al gnero Saccharomyces, de amplia utilidaden la produccin de pan y bebidas alcohlicas, as como alcohol industrial.

La industria tequilera, as como en toda actividad que involucra una fermentacin alcohlicnecesita de la accin de las levaduras, justamente para transformar los azcares en alcoholPero no slo es importante este producto mayoritario de la fermentacin. Las levaduras tambicontribuyen en forma notoria a la produccin de compuestos voltiles, inuenciando el persensorial de manera signicativa.

Contrariamente a lo que ocurre en otras industrias de la fermentacin alcohlica (por ejemplo: enolgica, cervecera, otras espirituosas), en muchas tequileras, la fermentacin es an conduciden forma espontnea. En este tipo de fermentaciones, los mostos suelen ser colonizados en formprogresiva por diferentes tipos de microorganismos. Algunos estudios han establecido patronede colonizacin de microorganismos en fermentaciones espontneas de mostos de agave, comotrabajo de Lachance (1995), que describi, en una primera instancia, la presencia deTorulasporadelbrueckii, Hanseniaspora spp. yKluyveromyces marxianus, para dar luego, progresivamente,lugar a otras especies, como Saccharomyces cerevisiae, Zygosaccharomyces bailii, Candida milleri yBrettanomyces spp. En trminos generales, las especies ms resistentes al alcohol son las quedominan la segunda parte de la fermentacin y entre ellas siempre se encuentra Saccharomycescerevisiae.

Debido a que el proceso incluye la exposicin del agave a elevadas temperaturas antes de fermentacin alcohlica, con la consecuente eliminacin de la ora microbiana provenient junto a la materia prima, las especies indgenas que colonizan los mostos estaran, ms bien

instaladas en las plantas (pudiendo provenir originalmente del agave) y es muy factible que hayuna secuencia de sucesos con patrones colonizacin del mosto bien denidos, que se repitafermentacin tras fermentacin. Si bien hay consenso general que involucrar muchas especie

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de levaduras en la fermentacin alcohlica puede ser enriquecedor respecto a la produccide compuestos voltiles y bouquet de una bebida, an con patrones de comportamiento quesuelen repetirse, es extremadamente difcil lograr consistencia en el proceso. La composicidel mosto depende bsicamente de la materia prima, que vara, a su vez, con las condicioneagronmicas. El pH, la temperatura, perl de azcares y su concentracin, nutricin, compuesttxicos, estrs osmtico, etc., son algunos de los parmetros que pueden variar e inuenciar lfermentacin alcohlica y, principalmente, afectar los patrones de colonizacin de los mostosEn procesos que se apoyan en fermentaciones espontneas, estas variables son las encargadade generar inconsistencias y, muchas veces, alteraciones en los perles sensoriales de unabebida, as como rendimientos pobres, que causan prdidas econmicas muy importantes. Potal motivo, gran parte de la industria se ha volcado al empleo de levaduras seleccionadas, qual inocularse en altas concentraciones, pueden implantarse exitosamente y predominar en elproceso, logrando, como consecuencia, repetitividad y consistencia. Inclusive, a travs del usde cepas especcas, se pueden lograr mejoras sustanciales en los rendimientos y, por supuestoen las caractersticas sensoriales.

Algunas plantas han logrado caracterizar cepas de levadura a partir de sus procesos y aislaraEstas pueden ser propagadas en planta hasta los niveles de biomasa necesarios, para luegoutilizarse en la fermentacin. Sin embargo, la propagacin desde laboratorio suele demoravarios das y, en la mayora de los casos, la obtencin de una biomasa saludable para lograconsistencia en el proceso se torna muy complicada. Esto puede ser fcilmente solucionadopartir del empleo de levadura activa seca (LAS), directamente en fermentacin o realizando unfase previa de propagacin corta. Muchas plantas tequileras han optado por LAS, ya que a travde su empleo logran mejorar la consistencia y rendimientos, uniformizar patrones organolptico y disminuir costos operativos asociados al mantenimiento y propagacin de las cepas desdcero (costo de personal muy calicado y de laboratorios equipados para tal propsito).

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Qu es la levadura activa seca (LAS)?

Las LAS son producidas a partir de cultivos puros de levaduras, obtenidos por LesaffInternational R&D, ubicado en la Ciudad de Marcq en Baroeul, norte de Francia, que cuenta laboratorios equipados con tecnologa de punta, especializados en el desarrollo de levadurapara las distintas industrias de la fermentacin, y con uno de los bancos de microorganismoms importantes del mundo.

Las cepas puras de levadura son custodiadas por Lesaffre International R&D y enviadas, luegoanlisis muy exhaustivos, a las plantas del grupo para su posterior propagacin.

En las plantas industriales, las levaduras son crecidas inicialmente en laboratorios especializado y luego en fermentadores industriales. Una vez alcanzada la biomasa necesaria, sta se concentpor centrifugacin y ltros rotatorios de vaco hasta formar una pasta, que luego es extruida

secada con tecnologa especca que permite llevar la materia seca a 94 - 96,5 %, manteniendaltas viabilidades en el producto terminado.

El producto es empacado al vaco en un envase trilaminado que no permite el intercambigaseoso, as como el pasaje de luz. Este tipo de acondicionamiento permite que el producttenga una vida til mnima de 2 aos.

Los productos Fermentis slo son liberados al mercado luego de pasar un control de calidmuy estricto, que verica el cumplimiento de especicaciones muy rigurosas, implicand

anlisis microbiolgicos, siolgicos, tests de viabilidad y vitalidad, as como otros especcdesarrollados por Lesaffre.

Figura 2. Esquema simplicado de produccin de LAS

Aumento de 1600 veces. Se empiezana diferenciar las clulas

Aumento de 25 veces. Se diferencianlos pellets obtenidos luego del secado

Aumento de 6400 veces. Se visualizanclulas con detalles

Figura 1. Fotos obtenidas por microscopa de levadura activa seca.

Secado instantneode levadura

Filtro rotatoriode vaco

Almacenamiento decrema de levaduraLaboratorio Fermentacin Centrifugacin

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Ingredientes : Levadura ( Saccharomyces cerevisiae), agente emulsionante (E491)

Propiedades: Levadura clsica tequilera, utilizada desde hace varios aos por la industria, conun perl organolptico muy clsico. Fue seleccionada gracias a su buen desempeo en jugode agave destinados a la produccin tequila y mezcales. Fermenta muy bien jugos de agavsuplementados con azcares que no provienen del agave, como por ejemplo melazas de caasacarosa.

Temperatura ptima de fermentacin: 32 C

Packaging disponible en dos presentaciones: Caja conteniendo 20 sachets x 500 g Caja conteniendo 1 sachet x 10 kg

Nota: todos los sachtes estn cerrados al vaco en un envase trilaminado, que impide el intercambio gaseoso y pasaje de luz.

Almacenaje: Es preferible almacenar la levadura en sitios frescos, con temperaturas menoresa los 10 C, para conservar su vida til. Se recomienda no utilizar sachets que se encuentreblandos (prdida de vaco).

Los sachets abiertos y utilizados parcialmente pierden el vaco y, por lo tanto, deben ser guardadbien sellados a 4 C. En estas condiciones, la levadura puede utilizarse en los siguientes 7 da

Pasado dicho perodo, se recomienda el descarte. Vencimiento: Fermentis recomienda el uso de la levadura dentro de los 24 meses de su fechde produccin, siempre y tanto hayan sido almacenadas bajo condiciones recomendadas en lseccin Almacenaje.

Anlisis tpico:

Nota importante: Se informa que cualquier cambio en el proceso fermentativo puede alterar la calidad del producto. Por lotanto, siempre se recomienda la implementacin de ensayos antes de de utilizar la levadura en forma comercial

S a

f T e q Le

va

dura

seca

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Tequ

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Ingredientes : Levadura ( Saccharomyces cerevisiae), agente emulsionante (E491)

Propiedades: Levadura seleccionada por Fermentis y evaluada por el CIATEJ para fermen jugos de Agave tequilana weber variedad azul, destinados a la produccin de tequila,

suplementados o no con otros tipos de azcares. Su excelente performance en este medio sdebe a la capacidad de tolerar sustancias txicas como furfurales, normalmente presentes enlos jugos de agave. Posee tambin elevada tolerancia a la presin osmtica y al alcohol, qupermite trabajar en condiciones de VHG (ver seccin Tecnologa VHG para ms informa y temperaturas ms altas. Presenta una velocidad de fermentacin muy superior a cepas clsictequileras, acortando los tiempos del proceso.

Packaging disponible en dos presentaciones: Caja conteniendo 20 sachets x 500 g Caja conteniendo 1 sachet x 10 kg

Nota: todos los sachtes estn cerrados al vaco en un envase trilaminado, que impide el intercambio gaseoso y pasaje de l

Almacenaje: Es preferible almacenar la levadura en sitios frescos, con temperaturas menoresa los 10 C, para conservar su vida til. Se recomienda no utilizar sachets que se encuentreblandos (prdida de vaco).

Los sachets abiertos y utilizados parcialmente pierden el vaco y, por lo tanto, deben ser guardad

bien sellados a 4 C. En estas condiciones, la levadura puede utilizarse en los siguientes 7 daPasado dicho perodo, se recomienda el descarte.

Vencimiento: Fermentis recomienda el uso de la levadura dentro de los 24 meses de su fechde produccin, siempre y tanto hayan sido almacenadas bajo condiciones recomendadas en lseccin Almacenaje.

Anlisis tpico:

Nota importante: Se informa que cualquier cambio en el proceso fermentativo puede alterar la calidad del producto. Por lotanto, siempre se recomienda la implementacin de ensayos antes de de utilizar la levadura en forma comercial

eva

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Levaduras Fermentis para produccin tequila


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El crecimiento de las levadurasLas levaduras, como todo microorganismo, pasan por diferentes etapas de crecimiento cuandson inoculadas en un medio conteniendo azcares (mosto).

Figura 3. Las distintas fases de una tpica curva de crecimiento de levaduras. El grco represeel logaritmo en base 10 de la concentracin de clulas/ml en funcin del tiempo de fermentacin

1. Fase de latencia o perodo lag: En esta etapa la poblacin de levaduras es inoculada enel mosto y debe adaptarse o aclimatarse al nuevo medio. Se registra una intensa actividadmetablica, pero sin crecimiento, ya que las levaduras estn avocadas a la readecuacin de smaquinaria biolgica al nuevo ambiente.

2. Fase de aceleracin de crecimiento: En esta etapa la poblacin de lavaduras comienza adividirse asexualmente por gemacin o sin. Cada clula que entra en divisin genera doclulas. Inicialmente, en la fase de aceleracin, el tiempo generacional (tiempo que una clula


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demora entre dos divisiones celulares sucesivas o tiempo de duplicacin de la poblacin) emuy largo y ste va disminuyendo conforme avanza el tiempo, hasta alcanzar el mnimo valregistrado durante toda la curva de crecimiento, que coincide con el comienzo de la etapsiguiente (fase exponencial).

3. Fase exponencial de crecimiento: En esta etapa se registra un crecimiento mximo, debidoa que tanto el medio como el estado siolgico de las clulas es el ideal para expandir lpoblacin. El tiempo generacional se mantiene constante y es el mnimo alcanzado durante lcurva de crecimiento. La poblacin se duplica cada vez que transcurre un tiempo equivalentetiempo generacional. El crecimiento de la poblacin en esta fase se puede predecir fcilmentcon la ecuacin a continuacin:

n = n02G

donde: n = nmero de clulas a un tiempo dado n0 = nmero de clulas al inicio de la fase exponencial G = tiempo generacional = t/z (t = tiempo; z = nmero de generaciones)

4. Fase de desaceleracin de crecimiento: En esta etapa los nutrientes empiezan a escasear ose incrementa la toxicidad de algunos metabolitos (por ejemplo: etanol) y las condiciones dejade ser ideales para sostener un crecimiento mximo como en la etapa anterior. Paulatinamenteel tiempo generacional se incrementa, produciendo una desaceleracin del crecimiento. Laclulas se adaptan al nuevo medio y se preparan para resistir una etapa de escasez.

5. Fase estacionaria: En esta etapa el crecimiento celular iguala la muerte celular. Por lotanto, no se registra variacin en el nmero neto de clulas vivas. Las clulas pueden sobrevivperodos prolongados en esta condicin. Sin embargo, comienzan a exponerse cada vez ms a toxicidad del alcohol y potencialmente otras sustancias, como pueden ser los cidos orgnicodisminuyendo la productividad.

6. Fase de muerte celular : La tasa de mortandad supera la tasa de crecimiento y la poblacin declulas vivas comienza a declinar.

Velocidad de produccin de alcohol durante la fermentacinLa velocidad de produccin de alcohol (etanol) o productividad de alcohol no es constantdurante la fermentacin. Esta es funcin del nmero de clulas y su estado siolgico.

En la gura 4 se muestra una curva de crecimiento y cmo vara la productividad de alcohen las distintas etapas. La mxima productividad es alcanzada durante la fase de crecimientexponencial, cuando las clulas se dividen rpidamente con tiempos generacionales muy corto

Sin embargo, en la etapa estacionaria, aunque no hay crecimiento neto de la poblacin delevadura, tambin se produce alcohol. En esta etapa puede producirse a una velocidad hasta 3veces menor que la mxima alcanzada en la fase exponencial.


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La velocidad de produccin de alcohol determina el patrn de acumulacin de este metabolittal cual se muestra en la gura 4.

El conocimiento de las curvas de produccin de alcohol es vital para los diseos de loequipamientos y los sistemas de control de temperatura. La velocidad de produccin de alcohest asociada a la liberacin de energa. Por lo tanto, la mxima demanda de energa paraenfriar las cubas de fermentacin coincide con la velocidad mxima de produccin de alcohComo consecuencia, los sistemas de enfriamiento deben dimensionarse para que puedan actuacorrectamente en la etapa de mayor liberacin de calor y no en funcin del valor promedio dciclo fermentativo.

Figura 4. Curva de crecimiento (nmero de clulas por ml vs. tiempo de fermentacin - curvaazul -)superpuesta a la curva de productividad de alcohol(curva roja) y acumulacin de alco-hol (curva verde). La velocidad de produccin de alcohol y acumulacin de alcohol se expresancomo % de la mxima velocidad alcanzada en el ciclo y como % de la mxima cantidad de alcacumulado, respectivamente.


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En una fermentacin alcohlica es muy importante mantener la viabilidad y vitalidad de lpoblacin de levaduras en valores altos. Existen varios factores de estrs ambiental que afectan siologa y desempeo de las levaduras disminuyendo su crecimiento y rendimiento fermentativWalker (1999) describi los factores de estrs de relevancia para las fermentaciones industrialeque pueden ser qumicos, fsicos o biolgicos. Los principales se detallan a continuacin:

Factores fsicosTemperatura

Las levaduras poseen temperaturas mnimas, ptimas y mximas de crecimiento. Normalmen

las levaduras del gnero Saccharomycestoleran temperaturas mximas que oscilan entre 35 y 43C. Sin embargo, a temperaturas mayores de 35 C, el desempeo fermentativo es cada vez mpobre, ya que el estrs se incrementa en forma considerable. Los efectos son desvos metablicque alteran el perl sensorial y una clara disminucin del rendimiento. Es normal que las fermetaciones a temperaturas elevadas terminen paralizadas, con una gran cantidad de azcaresresiduales y disminucin considerable del rendimiento con las prdidas econmicas que ello signi

El control inadecuado de la temperatura es uno de los problemas ms grandes que sufren laplantas tequileras, causando prdidas econmicas de importancia. La utilizacin deSafteq bluepuede ser una alternativa, ya que est caracterizada como una cepa termotolerante (ver Manejde levaduras en la industria tequilera, seccin fermentacin).

Estrs osmtico

En general, los mostos utilizados para la produccin de bebidas alcohlicas suelen tener altaconcentraciones de solutos, principalmente azcares, ocasionando elevada presin osmticafactor de importancia para las levaduras. El efecto que produce la elevada presin osmtices la prdida de la turgencia celular por disminucin del agua contenida en el citoplasma y lconsecuente disminucin de actividad enzimtica y desestabilizacin de algunas protenas, entr

otras consecuencias. La especie S. cerevisiae es moderadamente resistente al estrs osmtico e,inclusive, tiene un mecanismo de respuesta, como la produccin de osmolitos, que permiterestablecer el volumen citoplasmtico. Es osmolito ms importante es el glicerol, que aument


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su concentracin ante situaciones de estrs. Sin embargo, para su produccin se desvanazcares, generando cada en los rendimientos.Actualmente, las industrias de la fermentacin alcohlica buscan cada vez ms trabajar coelevadas concentraciones iniciales de azcares, tecnologa denominada VHG (del ingls: VeHigh Gravity). La tecnologa VHG produce innumerables benecios, mencionados en la secTecnologa VHG. Para poder trabajar con tecnologa VHG se requieren cepas de levadosmotolerantes y que resistan altas concentraciones de alcohol. Esas dos condiciones las cumpSafteq blue.

Otros factores fsicos

Otros factores fsicos de estrs son la deshidratacin, presin hidrosttica, mecnicos yradiaciones.

La LAS es sometida a una deshidratacin durante su proceso de produccin, como fue descrianteriormente. La concentracin de materia seca se lleva al 94 96,5% y consecuentemente s

produce una desestabilizacin de las membranas y paredes celulares. En este caso particularexisten procedimientos adecuados que devuelven a las clulas su estado ideal para poder llevaradelante la fermentacin alcohlica y que se describen en secciones posteriores (ver Protocode Rehidratacin)

La presin hidrosttica y la generada por el CO2 producido endgenamente en la fermentacinsuelen ser causales de estrs, en especial en fermentadores de gran altura. La toxicidad dealcohol se incrementa en estos casos y tambin suelen producirse desvos organolpticos.

El estrs mecnico es producido por agitacin y centrifugacin de alta velocidad. S. cerevisiaeresiste en forma moderada al estrs mecnico debido a la naturaleza de su pared celular ygeneralmente no se registran inconvenientes en las plantas.

Factores qumicos

pH

La mayora de las cepas de levadura son medianamente acidlas, desarrollndose a valores dpH que oscilan entre 4,0 y 6,5.

En algunos casos suelen conducirse fermentaciones alcohlicas por debajo de los valoremencionados para controlar infecciones bacterianas. Sin embargo, tambin se produce unacada en el rendimiento fermentativo ocasionando prdidas econmicas importantes. El gradde impacto tambin depende de la cepa y otros metabolitos, que pueden incrementar su efectotxico a pH muy bajo.

Limitacin nutricional

La disponibilidad de algunos nutrientes durante la fermentacin alcohlica puede ser limitantecausando un efecto negativo. La consecuencia ms comn es la inhibicin del crecimient


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y paralizacin de la fermentacin. El nitrgeno, normalmente presente en concentracionesubptimas en mostos de agave, suele ser un limitante frecuente. En la seccin Nutricin sdiscute sobre los principales nutrientes y cmo se realiza el ajuste.

Alcohol (etanol)

La acumulacin del etanol durante la fermentacin alcohlica constituye un factor de estrde importancia. Cuando est presente en bajas concentraciones puede ocasionar inhibicin decrecimiento, pero cuando son elevadas, los efectos son letales.

El alcohol ejerce su toxicidad en varios aspectos de la siologa, pero es la membrana plasmtla estructura ms daada, ya que se incrementa la uidez y se ve afectada su integridad.

Si bien S. cerevisiae suele ser resistente a altas concentraciones de alcohol en fermentacin,

existe una gran diferencia intraespecie respecto al lmite mximo de tolerancia. Algunas cepano resisten ms all de 5% de alcohol v/v. Sin embargo, algunas industrias de la fermentacinalcohlica que utilizan cepas con alta tolerancia a ste metabolito, suelen trabajar con concentraciones de hasta 18 % v/v y se ha registrado hasta 21% v/v en determinadas condiciones.

Sustancias y metabolitos txicos

Algunos metabolitos producidos por las levaduras y otros microorganismos (contaminantes, pejemplo) durante la fermentacin alcohlica son txicos. El CO2 y etanol, como se mencionanteriormente, acetaldehdo y cidos orgnicos, pueden afectar la fermentacin alcohlica.Los cidos orgnicos de mayor importancia son el lctico y el actico. El primero es producpor bacterias contaminantes, mientras que el segundo tanto por bacterias como por la propialevadura. El cido lctico es inhibitorio cuando est presente en concentraciones que supera0,8 % p/v y el cido actico por encima de 0,05 % p/v.

Como algo particular de la industria tequilera, en el jugo de agave se encuentran altasconcentraciones de furfurales generados por las reacciones de Maillard ocurridas durante eproceso de cocimiento. Estas sustancias ejercen un efecto inhibitorio sobre las levaduras.Safteq

blue se caracteriza por poseer una alta resistencia a estos compuestos. De ah surge uno de loargumentos que explica su gran adaptacin a los medios utilizados para la produccin de tequil

Factores biolgicosCompetencia con otros microorganismos

La proliferacin de otros microorganismos (contaminacin), ya sean levaduras o bacterias, sueser un factor de estrs importante, dado a que compiten por los mismos nutrientes y pueden, su vez, generar metabolitos txicos, como se describi anteriormente (bacterias productoras dcido lctico y actico).


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La presencia de levaduras salvajes en plantas tequileras suele ser comn. Las poblaciones que pertenecen al gnero Saccharomyces (llamadas no Saccharomyces) pueden, en algunos casos,llegar a nmeros importantes durante la primera fase de la fermentacin. Estas levaduras sonluego suplantadas por las del gnero Saccharomyces, ms resistente al alcohol. Esta sucesinde microorganismos puede ser positiva desde el punto de vista sensorial de la bebida, cuandocurre en forma correcta. Sin embargo, es difcil lograr consistencia y repetitividad. En muchcasos, las fermentaciones se desvan hacia lugares no deseados, lo que puede causar estrs pola produccin de metabolitos txicos y muy probablemente deciencias sensoriales.

Otros factores biolgicos

El envejecimiento celular y cambios a nivel gentico tambin son factores de estrs. Lalevaduras tienen un nmero limitado de divisiones celulares y su vitalidad decrece en funcidel envejecimiento. Por otro lado, los cambios a nivel genoma producidos por mutaciones suel

generar alteraciones en las poblaciones. Normalmente, estos problemas ocurren luego de variageneraciones y afectan, principalmente, las industrias que reciclan levadura, como la cervecerLas alteraciones a nivel gentico se establecen en las poblaciones, ocasionando anomalas en eproceso fermentativo.

Los cambios a nivel gentico tambin ocurren en cepas almacenadas en el laboratorio y luegpueden trasladarse a las fermentaciones industriales. Para evitar inconvenientes, los cambiosdeben ser monitoreados frecuentemente a nivel molecular. Una de las ventajas de la LAproducida por Fermentis es que su integridad y pureza est custodiada en nuestros laboratorioequipados para aplicar tcnicas de biologa molecular que permiten analizar minuciosamentel ADN y asegurar que las cepas propagadas en plantas industriales no tengan ningn tipo dalteracin.


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RehidratacinAntes de poder dar inicio a la fermentacin, las levaduras secas deben recuperar el agua quhan perdido en el secado. Este proceso se denomina rehidratacin y es vital para que las cluladquieran nuevamente su funcionalidad biolgica.

Figura 5. (a) Recuperacin de la turgencia luego del proceso de rehidratacin.(b) Esquema simplicado del proceso de rehidratacin de levadura.

(a) (b)

Los sachets de levadura deben ser almacenados en un lugar fresco y seco luego de su recepcin. Ltemperatura ideal de almacenaje es alrededor de 10C. Sin embargo, a temperaturas de 15 25C se puedalmacenar en planta por algunos meses.

Rehidrate la LAS hasta la formacin de una crema. Este proceso se debe realizar esparciendo la levadura envolumen de agua equivalente a 10 veces su propio peso. La mezcla debe homogeneizarse a travs de agitacimanual o mecnica. El proceso debe durar no ms de 30 minutos (ver texto para ms informacin)

Incorporacin de agua

Esparcir la levaduraen un volumen

de aguaequivalente

a 10 veces su peso

Mezclar consuavidad hastahomogenizar

completamente(no ms de 30 minutos)

Cremade levadurahomognea

Inocularla crema

resultante enel tanque

de fermentacin


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En la gura 5 (b) se muestra un esquema simplicado del proceso de rehidratacin, que se realien un tanque acondicionado para tal propsito. Este tanque debe ser sometido a limpiezasexhaustivas (se recomienda una limpieza CIP) y desinfeccin cada vez que es utilizado para evcontaminacin bacteriana o de otro tipo de levaduras. Cuando el proceso de rehidratacin ellevado en forma adecuada, se logra una alta viabilidad celular y reducir la fase lag o de latenciperodo donde no se registra produccin de alcohol, ya que las levaduras se ambientan al nuevmedio. Las variables ms importantes a controlar en la rehidratacin son: calidad microbiolgidel agua, temperatura y agitacin (ver Protocolo de Rehidratacin para ms detalles).

Las levaduras son organismos vivos y la temperatura de rehidratacin es crtica para lograr ubuen desempeo fermentativo. Fermentis recomienda que las levaduras de fermentacin Sateq sean rehidratadas entre 35 y 38 C.

Descartar los sachets que se encuentren blandos (es sntoma de prdida de vaco) o que seencuentren vencidos.

Dejar aclimatar la levadura por lo menos 4 horas antes de su uso, a temperatura ambiente.

Limpiar y desinfectar el tanque y piping empleados para la rehidratacin de la levadura, ya sen forma manual o a travs de un proceso de limpieza CIP.

Agregar en el tanque de rehidratacin un volumen de agua (debe poseer calidad microbiolgica adecuada al proceso) que equivalga a 10 veces el peso de LAS a utilizar. La temperatudel agua debe permanecer a 35 C - 38 C durante todo el proceso de rehidratacin. Cuandlas cantidades de levadura involucradas sean grandes, se recomienda emplear un tanque conagitacin incorporada para facilitar la homogenizacin. Cuando las cantidades son menoresla agitacin se puede realizar en forma manual.

Rociar los sachets con un spray conteniendo alcohol al 70% y cortarlos en uno de los extremcon una tijera, tambin previamente rociada con la solucin desinfectante.

Agregar la levadura esparcindola lo ms homogneamente posible sobre la supercie deagua, evitando la formacin de grumos.

Comenzar a mezclar suavemente con un utensilio previamente esterilizado o medianteagitacin mecnica. Agitar durante 10 minutos a baja velocidad.

Dejar 15 minutos de reposo, con agitaciones intermitentes a mayor velocidad.

Luego del perodo de reposo, agitar a mayor velocidad otros 5 minutos hasta formar una crembien homognea (nunca llegar a una agitacin muy vigorosa).

Agregar la levadura en forma de crema al fermentador o al propagador (el mosto debe estar 32C).

Notas importantes:Mantener siempre la temperatura de hidratacin en los rangos mencionados arriba.Agregar siempre la levadura sobre el agua y no lo opuesto.Agitacin adicional puede ser requerida durante la rehidratacin para romper la espuma o grumos de levadura.


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La inoculacin de la levaduraUna vez nalizado el proceso de rehidratacin, las levaduras pueden ser utilizadas de dos formdiferentes:

Inoculadas en forma directa Propagada para amplicar la biomasa en una etapa anterior a la fermentacin

Figura 6. La curva de nmero de clulas en propagacin vs el tiempo se muestra en la parinferior del grco. Se asume que la fase exponencial comienza a las 2,5 horas y que el tiemgeneracional en esa etapa es de 2,65 horas.

Inoculacin en forma directa

Es la forma ms sencilla de trabajar. Gracias a que el nmero de clulas por gramo de LASun valor conocido, es posible ajustar la concentracin inicial en funcin de un simple pesaj(Ver tabla 1). Normalmente, la concentracin de levaduras inoculada en fermentacin est enel rango de 0,25 0,5 g/l de mosto. Por lo tanto, slo se requiere pasar por una fase previa drehidratacin.

Hidratacin

200 l

Volumen depropagacin: 5 m3

8 X 106cel/ml

Volumen defermentacin

50 m3

10 X 106cel/ml

80 X 106cel/ml

20 kg

~ 30 min

2,5 kg

30 min

25 l

~ 10 horas


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Tabla 1. Nmero de clulas por gramo de LAS, tasas de inoculacin recomendadas y nmeroclulas nales que se alcanza en el mosto inoculado, para las cepasSafteq silver y blue.

En la gura 6 se muestra un esquema clsico de inoculacin directa (lnea roja). Para un fermen-tador de 50 m3, asumiendo una tasa de inoculacin de 0,4 g/l, se requiere rehidratar 20 kg deLAS. Si el producto empleado esSafteq blue, el nmero de clulas iniciales alcanzado es de 8 x106 clulas/ml.

Propagacin

En este caso, la levadura no es utilizada en forma directa, sino que es previamente propagadpara alcanzar la biomasa requerida, mientras se mantiene un estricto control de las condicionenutricionales y ambientales. Esta alternativa tiene como benecio un menor consumo delevadura. Sin embargo, la propagacin requiere equipamiento complementario (tanques depropagacin), personal dedicado al proceso y supone mayor riesgo de contaminacin.

La propagacin se realiza en tanques con un volumen de 10 a 20 veces inferior que los fermetadores. La tasa de inoculacin es exactamente la misma que en el mtodo directo. Siempre s

realiza con inyeccin de oxgeno, ya que se favorece la produccin de biomasa.En la gura 6 tambin se muestra un ejemplo de propagacin (lnea azul). Partiendo de 2,5 kde levadura rehidratada, se inicia la propagacin en un tanque de 5 m3. Si el producto utilizadoesSafteq blue, el nmero mnimo de clulas vivas al inicio alcanza 10 x 106 por ml de mosto, queequivale a 0,5 g/l de LAS. Asumiendo que la propagacin entra en fase exponencial a 2,5 horas la inoculacin y un tiempo generacional en la misma fase de 2,65 horas, la biomasa puede llegaproximadamente a 80 x 106 clulas/ml al cabo de 10 horas, tiempo en el que se transere en sutotalidad al fermentador. Teniendo en cuenta que le fermentador es de 50 m3, el nmero de clulasiniciales alcanzado en fermentacin es de aproximadamente 8 x 106 clulas/ml.

Cuando se realiza la propagacin, es muy importante transferir la biomasa al fermentador aen fase exponencial de crecimiento.


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Las condiciones ptimas de propagacin se describen a continuacin:

FermentacinEl objetivo de la fermentacin alcohlica es convertir la mayor cantidad de carbohidratodisponibles en alcohol de la forma ms eciente y rpida posible, manteniendo la calidadsensorial de la bebida.

Para lograr una fermentacin consistente es necesario poder controlar las siguientes variable y procesos:

Limpieza y desinfeccin

Se recomienda seguir procesos de limpieza CIP (del ingls: cleaning in place) para mantenuna higiene correcta y evitar infecciones bacterianas. Para poder tener un proceso eciente, sdebe tener en cuenta el diseo del piping y tanques, de forma tal que todos los circuitos puedalimpiarse sin tener que parar la planta y evitar, a la vez, zonas muertas donde potencialmentepuedan acumularse microorganismos. La supercie de los tanques debe ser lisa y de materialde fcil limpieza (idealmente el acero inoxidable).

Temperatura

La temperatura de fermentacin recomendada para las cepas de la lnea Safteq es de 32 C. S

embargo, tantoSafteq silver comoSafteq blue pueden trabajar a temperaturas menores (dehasta 20 C, aproximadamente), aunque con una actividad metablica menor, lo que incrementel tiempo de fermentacin. Tambin se genera mayor consumo energtico, debido a que las cubde fermentacin deben ser mantenidas a temperaturas menores. Por lo tanto, en plantas dondeexiste capacidad ociosa de fermentacin y de enfriamiento suciente, se puede utilizar comopcin la fermentacin a bajas temperaturas. Los benecios estn relacionados con el cambien la calidad y cantidad de compuestos voltiles, que genera perles sensoriales diferenciales una mejor retencin de aromas.

Safteq blue es una cepa termotolerante y, por lo tanto, soporta mucho mejor temperaturas entre35 y 40 C que las cepas clsicas. Esta cepa es altamente recomendable en plantas que operan pencima de los 35 C o que tienen dicultades para controlar la temperatura durante la fermentaci


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pH

Se recomienda trabajar con un pH entre 4,0 y 5,5Timing de inoculacin

Lo ideal es adicionar el inculo de levadura una vez que se ha completado con mosto el 10del volumen de fermentacin. De esta forma, las levaduras pueden empezar a trabajar mrpidamente, disminuyendo tiempos de fermentacin y, por otro lado, se evita que la ora nativpueda proliferar.

Control de azcares

En los medios tequileros se encuentra mayoritariamente la fructosa, ya que es el monosacridpredominante en fructanos. En los jugos de agave puro hay cantidades menores de glucosaque generalmente no sobrepasan el 10% del total de los azcares y que tambin provienenmayoritariamente de la hidrlisis de fructanos. En los mostos destinados a la produccin dtequila, existe la adicin de otros azcares, como pueden ser jarabes especcos, melazas dcaa, sacarosa, etc. En estos casos, tambin es posible encontrar sacarosa y mayor proporcide glucosa.

La forma ms sencilla de monitorear el progreso de la fermentacin alcohlica es a travs dla medicin del grado Brix. Si bien es posible hacer un seguimiento preciso con esta tcnices siempre importante realizar chequeos ms especcos, que brinden ms informacin, sobrtodo al nal de la fermentacin. Para poder determinar con exactitud la cantidad de azcareresiduales, la tcnica de Fehling es utilizada por la industria tequilera. En general se determinaazcares reductores totales (con un paso previo de hidrlisis cida) y directos (sin hidrlisis). Sembargo, el alcance de esta tcnica es limitado y muchas veces no brinda informacin correctUna alternativa es la utilizacin de la cromatografa lquida de alta eciencia (HPLC). La g7 muestra un perl clsico de una corrida de HPLC, utilizado por la industria de la fermentacalcohlica para monitorear los procesos. Se pueden detectar los azcares y otros metabolitocomo alcohol, glicerol y cidos orgnicos en una simple corrida.

Figura 7. Cromatograma tpico obtenido por HPLC. Una simple corrida puede utilizarse pmedir varios metabolitos.


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Medicin de alcohol (etanol)

Tambin es un parmetro que suele medirse al nal de la fermentacin. Existen varios mtodcomo el del dicromato de potasio, enzimtico, hidrometra, densitometra y picnometra, todo

ellos utilizados por la industria. Sin embargo, el etanol puede tambin ser determinado por HPLde forma ms precisa, en la misma corrida que la utilizada para medir azcares (ver gura 7).

Control del glicerol

El glicerol es un metabolito de importancia, ya que gran cantidad de azcar es desaviado para produccin. Las levaduras lo utilizan para restablecer el equilibrio redox de las clulas. Tambisu produccin se incrementa notoriamente en condiciones de estrs. Sin embargo, rramentees medido y tomado en consideracin para controlar la fermentacin. La forma ms eciente medirlo es tambin a travs de HPLC. Tambin puede ser detectado en la misma corrida utilizpara determinar azcares (ver gura 7).

Control de produccin de cidos orgnicos

Los cidos orgnicos ms importantes son el lctico y el actico. Bsicamente, su determinacies una medida indirecta de la contaminacin bacteriana. Ante infecciones severas, los niveles destos cidos orgnicos, en forma individual o conjunta, se disparan y ocasionan prdidas econmicas importantes debido al desvo de azcares.

La tabla 2 muestra la prdida de rendimiento (produccin de etanol) en funcin de la magnitude la infeccin. En general, los cidos orgnicos no son tenidos en cuenta como parmetrode control por las plantas tequileres. La forma ms eciente de medirlos es a travs de HPLTambin pueden ser detectados en la misma corrida utilizada para determinar azcares.

Tabla 2. Prdidas de rendimiento ocasionadas por la infeccin de bacterias lcticas en fermentaciones industriales


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Control de biomasa

Se reere a la concentracin de levaduras. En este caso, si bien hay mtodos muy sosticadcomo la citometra de ujo, puede ser fcilmente estimada a travs de microscopa.

La viabilidad celular (% de clulas vivas), tambin puede ser determinada por microscopatravs de la utilizacin de algunas sustancias colorantes, como el azul de metileno.

Rendimiento, eciencia y balance de masas

A travs de la medicin de los principales metabolitos de la fermentacin, conociendo la concetracin de azcares al inicio y al nal del proceso, as como la produccin de biomasa, es posirealizar un balance de masas y determinar cmo fueron utilizados los azcares durante el procefermentativo. Por otro lado, es posible obtener la eciencia (% de alcohol obtenido respecto

al mximo valor terico) y rendimientos de fermentacin (cantidad de alcohol producido pogramo de azcar).

Tabla 3. Valores de azcares iniciales, etanol al nal de la fermentacin, rendimiento de alcoh y eciencia registrados por 5 cepas evaluadas en la produccin de tequilas

* El mximo terico de alcohol se obtiene multiplicando la concentracin inicial de azcar por el factor estequio-mtrcio de conversin del azcar a etanol: 0,511


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Los compuestos aromticos pueden ser pre-fermentativos o fermentativos. Los primeroprovienen de la materia prima y son de naturaleza variada: steres, aldehdos, cidos, alcoholesterpenos, cidos grasos y compuestos ms especcos como la vainillina. Tambin son prfermentativos los furfurales, producidos durante el cocimiento de las cabezas del agave. Se hadescripto gran variedad de estos compuestos producidos a travs de las reacciones de Maillarque ocurren a altas temperaturas durante el cocimiento de la materia prima. Los furfuraleimpactan notoriamente el perl sensorial de los tequilas y constituyen una caractersticafundamental de la bebida. El nivel de estos compuestos est regulado por la norma mexicanNOM-006-SCFI-2005, no pudiendo exceder los 4 mg en 100 ml de alcohol anhidro.

Las levaduras tambin inuyen en forma notoria en el perl sensorial del tequila a travs dla produccin de compuestos voltiles. Estos son los denominados aromas fermentativos y so

consecuencia del metabolismo de las levaduras. Los distintos grupos se describen brevemena continuacin:Acetaldehdo

Tambin llamado etanal, es un intermediario de la fermentacin alcohlica. Es el aldehdoms importante, caracterizado por producir aromas frutales en bajas concentraciones, que setransforman en picantes o pungentes cuando est en exceso. Los niveles generados dependenmucho de la cepa de levadura involucrada. El acetaldehdo est regulado en el tequila a travde la norma mexicana NOM-006-SCFI-2005 y los niveles no pueden exceder 40 mg cada 10de alcohol anhidro.

Alcoholes superioresTambin son llamados alcoholes fusel. Son aquellos que contienen dos o ms tomos de carboen su estructura, con puntos de ebullicin ms elevados que el etanol. Estos compuestos aportaaromas intensos en todas las bebidas alcohlicas.

A bajas concentraciones suelen aportar complejidad en tequilas. En altas concentracionesu impacto suele ser negativo. La norma mexicana NOM-006-SCFI-2005 regula los nivelesn-propanol, isobutanol, n-butanol, alcohol amlico e isoamlico, que en su conjunto no pueden

exceder 500 mg en 100 ml de alcohol anhidro.La generacin de alcoholes superiores es muy dependiente de la cepa de levadura y est asociaa la fase de crecimiento. Tambin, su produccin se incrementa a altas temperaturas y est

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asociada a condiciones de estrs. Estos compuestos son sintetizados a travs de la reaccide Ehrlich, a partir de aminocidos de cadena ramicada como valina, leucina e isoleucinaminocidos aromticos como el triptfano, fenilalanina y tirosina; y el aminocido azufradmetionina. Por tal motivo, la utilizacin de nutrientes que tienen aminocidos en su formulacipuede estimular la produccin de estos compuestos. Sin embargo, los alcoholes superioretambin pueden sintetizarse a travs del metabolismo de los carbohidratos (sntesis de novo).

Los alcoholes superiores son tambin precursores de otros compuestos voltiles muy importantecomo son los steres.

steres

Los steres son compuestos voltiles con un alto impacto sensorial en tequilas y otras bebidaalcohlicas. Existen dos grandes grupos: los steres de acetato y los steres etlicos.

Esteres de acetato: Son producidos por la unin de alcoholes superiores y el acetyl-CoA, queun intermediario metablico. Los ms importantes son el acetato de etilo (el ms abundante entequilas), acetato de isoamilo, acetato de isobutilo, acetato de feniletilo, acetato de hexilo y

acetato de bencilo.Esteres etlicos: son producidos por la unin de etanol y acyl-CoA. Entre los ms importanestn el propanoato de etilo, butanoato de etilo, hexanoato de etilo, octanoato de etilo,decanoato de etilo y lactato de etilo.

La norma mexicana NOM-006-SCFI-2005 regula la presencia de steres en tequilas. La noestablece la medicin del acetato de etilo y lactato de etilo (los dos steres mayoritarios), queno pueden exceder en su conjunto los 200 mg cada 100 ml de alcohol anhidro. Si bien la normregula la produccin de steres a travs de los dos compuestos mayoritarios, la mayora de ellotiene un umbral de deteccin muy bajo y pueden, potencialmente, inuir en el perl sensoriaa muy bajas concentraciones. Considerando que la mayora de los steres generan aromapositivos y que estos dependen en gran parte, en forma cualitativa y cuantitativa, de la cepainvolucrada, es probablemente uno de los campos ms importantes a desarrollar en el futuro, travs de la incorporacin de nuevas levaduras para la industria.

Metanol

El metanol se forma a partir de las pectinas presentes en el agave, por intermedio de una reaccide demetilacin. Se ha establecido que en algunos casos las concentraciones de metanol puede

variar en mostos de agave fermentados (Daz Montao, 2008). Se estima que algunas cepade levadura podran inuenciar en su produccin a travs de la presencia de metil esterasaespeccas de pectinas.


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Los azcares son los principales nutrientes en mostos tequileros, ya que proporcionan l

fuente de carbono, que es el elemento mayoritario en la biomasa de levadura, representando,aproximadamente, un 47% de la materia seca. En fermentaciones industriales para producibebidas alcohlicas, siempre se parte de un mosto con altas concentraciones de azcares. Salvalgunas excepciones, el objetivo es fermentar la totalidad de los azcares. Por lo tanto, el restode los nutrientes se ajustan en funcin de este objetivo.

A continuacin se mencionan algunos nutrientes fundamentales para llevar adelante un procesfermentativo eciente.

Nitrgeno

El nitrgeno representa aproximadamente el 8% de la biomasa de levadura, siendo constituyentesencial de protenas y cidos nucleicos, as como de otras sustancias. Muchos mostos sometida la fermentacin alcohlica son, a priori, ricos en nitrgeno, sin que esto signique quesea asimilable por las levaduras. Por lo tanto, se requieren ajustar las concentraciones paraque el mismo no se encuentre en forma limitante, hecho que llevara a paralizaciones de lfermentacin.

El YAN (del ings: yeast assimilable nitrogen) se dene como el nitrgeno asimilable pla levadura y est compuesto por la suma de los iones amonio y alfa amino cidos (menos prolina, porque no es asimilable en anaerobiosis). Para saber el valor del YAN se determina FAN (del ings: free amino nitrogen), que corresponde al nitrgeno de los grupos alfa amino dlos aminocidos y luego se suma la concentracin de iones amonio.

Las levaduras transportan iones amonio y aminocidos del mosto dentro de la clula. Loiones amonio son muy fcilmente asimilables y son preferidos por las levaduras. Por lo tantconstituyen la fuente principal de nitrgeno en fermentaciones alcohlicas. Los aminocidoscuando incorporados por la clula en la primera parte de la fermentacin, son almacenados se utilizan en etapas posteriores para la sntesis proteica, cuando hay escasez de iones amonioEste mecanismo tambin asegura la provisin de una fuente de nitrgeno en etapas tardas d

la fermentacin, cuando los sistemas de transporte se encuentran inhibidos y la disponibilidaenergtica de las clulas es escasa (la sntesis de protenas requiere menos energa cuando lafuente de nitrgeno la constituyen los mismos aminocidos).


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El nitrgeno es suplementado normalmente en forma de sales de amonio (como sulfato fosfato) y urea. El caso de la urea es bastante particular, ya que su uso incrementa los niveles dcarbamato de etilo, un potencial carcingeno, y est generalmente prohibido para la produccide bebidas alcohlicas. Los aminocidos tambin se adicionan como fuente de nitrgeno, cuandse utilizan extractos de levadura como nutrientes.

Ante un exceso de iones amonio, la levadura preere estos como fuente de nitrgeno casen forma exclusiva. Sin embargo, el exceso de iones amonio genera aumento de la biomasque incrementa a su vez la demanda de nitrgeno. Los aminocidos son asimilados tambien la primera fase de la fermentacin. Pero ante la presencia de alcohol, su incorporacin erpidamente inhibida. Por lo tanto, siempre es recomendable agregarlos antes de promediarla mitad de la fermentacin. Se estima que los iones amonio pueden ser asimilados por mtiempo, pero igualmente siempre se recomienda agregarlos no ms all de la primera mitad de fermentacin, ya que su transporte al interior de la clula tambin es afectado por la produccide etanol.

Se asume que una fermentacin alcohlica de un mosto de agave debe transcurrir con un mnimde 150 ppm de nitrgeno. Considerando que el fosfato diamnico (DAP; del ingls diammoniphosphate) y el sulfato de amonio proporcionan aproximadamente el 21 % de su peso comnitrgeno, una adicin de 0.3 g/l de cualquiera de estas sales, aporta 63 ppm de este elemento.No obstante, para lograr buena seguridad fermentativa, se sugiere trabajar con un mnimo d150 - 200 ppm de nitrgeno. Es importante determinada aclarar que la demanda de nitrgenoest tambin determinada por la cepa de levadura. Algunas cepas requieren ms nitrgeno quotras.

En la gura 8 se comparan dos fermentaciones industriales de un mismo mosto de agave, unsin adicin de nitrgeno y otra suplementado con 150 ppm. Claramente, la adicin de nitrgenactiva la fermentacin y logra nalizar antes. La curva correspondiente al fermentador sisuplemento de nitrgeno muestra un perl tpico de limitacin de nutrientes, con un descensodel brix casi lineal durante toda la fermentacin.

Figura 8. Fermentaciones industriales de mostos de agave, suplementadas com 150 ppm dnitrgeno y sin adicin.


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En otras industrias, como la enolgica, es comn seguir ciertas prcticas para la adicin dnitrgeno, completamente aplicables a la industria tequilera. Tales prcticas se resumen acontinuacin:

1. Siempre es recomendable adicionar el nitrgeno faltante y no un exceso. Pero para podelograrlo hace falta medir el YAN de un mosto. Como esto no es siempre posible, se recomieagregar como mnimo 150 ppm de nitrgeno (esto asegurara un mnimo de 200 ppmconsiderando lo que trae la materia prima) y ajustar en funcin de los resultados.

2. Se recomienda adicionar las sales de amonio luego de transcurrido un perodo de lafermentacin (transcurridos de la fermentacin, por ejemplo). De esta forma se favorece lincorporacin de aminocidos del mosto en la fase inicial.

3. Cuando se requiera agregar ms de 30 g/hl de nitrgeno en forma de sales de amonio, serecomienda realizar adiciones parciales para evitar un crecimiento desmedido de la biomas

Tpicamente, se adiciona antes de transcurrido el de la fermentacin y antes de pasar la dla fermentacin.

4. Se recomienda no realizar adiciones de DAP o sulfato de amonio en la ltima parte de fermentacin, ya que, como se mencion anteriormente, el alcohol inhibe su incorporacin.

5. Se recomienda agregar los nutrientes que contienen aminocidos no ms all de transcurridel de la fermentacin. Esto se debe a la rpida inhibicin de su asimilacin en presencia dalcohol.

Vitaminas y factores de crecimiento

Las vitaminas son cofactores de reacciones enzimticas y pueden ser utilizadas varias veces. Lvitaminas ms importantes en la fermentacin alcohlica son la biotina, tiamina y pantotenatoParte de las vitaminas se pueden obtener del medio, mientras que las levaduras puedensintetizar otras. Muchos nutrientes complejos tienen agregado de estas vitaminas. Por otro ladolas levaduras autolisadas o extractos de levadura, no slo aportan aminocidos, sino que sontambin fuente de vitaminas, pudiendo aportar las necesidades.

Fsforo

El fsforo es componente estructural de molculas importantes, como cidos nucleicos, y varimetabolitos, incluso el ATP, la moneda energtica de las clulas. Representa aproximadamente 1,2% de la materia seca de levadura y debe estar presente en los mostos en valores que soporteel crecimiento de la biomasa.

El DAP contiene 23% de fsforo y es la fuente de este elemento ms comnmente utilizada fermentaciones alcohlicas. Por lo tanto, si se agrega DAP para llegar a 150 ppm de nitrgen(como se ha planteado anteriormente), se est adicionando a la vez, 164 ppm de fsforo. Estcantidad soportara un crecimiento de hasta 13 g/l de biomasa seca de levadura, lo que constituyun exceso importante, ya que se estima que sta llega a un lmite en torno a los 6 g/l. Esto es sitener en cuenta la cantidad de fsforo que ingresa en la materia prima. Por lo tanto, raramente estelemento se encuentra en deciencia mientras se utilice DAP como fuente de nitrgeno.


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Minerales

Tambin son cofactores de reacciones enzimticas, siendo, por lo tanto, importantes en todafermentacin alcohlica. Muchos nutrientes complejos poseen sales de magnesio, potasiomanganeso y zinc, que son los minerales de mayor importancia. Las levaduras autolisadasextractos de levadura tambin aportan estos elementos.

Factores de supervivencia

Corresponden a los esteroles (ergosterol) y cidos grasos de cadena larga, que son constituyenteesenciales de las membranas celulares. La escasez de estas sustancias puede afectar notoriamentla resistencia al alcohol en la fermentacin y ocasionar paralizaciones.

La produccin de estos factores de supervivencia es dependiente del oxgeno. Por lo tanto, emostos oxigenados al inicio de la fermentacin, no suele haber escasez de estos compuestos.

La LAS cuando es inoculada en forma directa, no requiere oxigenacin, ya que es rica ergosterol y cidos grasos insaturados. Esto se debe a que en las plantas industriales es creciden forma aerbica. Por otro lado, cuando son propagadas en presencia de oxgeno, las levaduratampoco requieren adicin de oxgeno en fermentacin.

Una forma de compensar la falta de factores de supervivencia, es adicionando preparacionesbase de paredes celulares de levaduras. Las levaduras autolisadas, tambin contienen paredecelulares que sirven a este propsito.

Adicin de derivados de levaduras como activadores de fermentacin

Existen varios productos derivados de levaduras que sirven como activadores de fermentaciLos productos ms completos son las levaduras autolisadas, que, como fue mencionado arribson ricos en aminocidos, factores de supervivencia, minerales y vitaminas. Este tipo de activdores, normalmente se usa en forma complementaria a una fuente de amonio, generalmente endosis de 0,3 g/l. El contenido de nitrgeno que aporta al medio nunca ser comparable con el d

las sales de amonio. Sin embargo, el tipo de nitrgeno (amino nitrgeno) y dems nutrienteses muy importante en fermentaciones alcohlicas. La gura 9 muestra la composicin tpica dBioferm, una levadura autolisada comercializada por Fermentis.

El aporte de aminocidos, por otro lado, genera una mejora en la calidad sensorial, ya sea poun aumento en la concentracin de compuestos voltiles en forma directa (reaccin de Ehrlicho indirecta (mejora de la sntesis proteica).


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Figura 9. Composicin del Bioferm, una levadura autolisada comercializada por Fermentis

Existen tambin formulaciones especcas de nutrientes que contienen nitrgeno mineral (salede amonio), nitrgeno orgnico (levaduras autolisadas) y mezclas de vitaminas y factores dsupervivencia. Fermentis comercializa el Bioferm Equilibre, una mezcla balanceada contiene todos los nutrientes necesarios para la fermentacin alcohlica.


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Gracias a la seleccin de nuevas cepas capaces de tolerar altas concentraciones de alcohol presin osmtica, muchas industrias estn volcndose cada vez ms a la tecnologa VHG (dingls: Very High Gravity). Bsicamente, esta tecnologa consiste en fermentar mostos coaltas concentraciones iniciales de azcar. Un ejemplo muy importante ocurre en la industria detanol a partir de maz, que ha llegado, en algunos casos, hasta 21% de alcohol v/v, cuando hac10 aos esos valores eran aproximadamente del 12% v/v, como mximo.

Si bien cuando se trata de mostos de agave existe un limitante proveniente de la materia prima ya que el proceso de extraccin limita la concentracin de azcares que pueden obtenerse eel jugo de agave, la disponibilidad de cepas de levadura osmotolerantes, comoSafteq blue,permite, potencialmente, incrementar los valores de alcohol en fermentacin. Los benecios dtrabajar en estas condiciones se enumeran a continuacin:

Aumento de la productividad. Debido a que se trabaja con mostos ms concentrados,es posible incrementar la cantidad de materia prima procesada.

Disminucin del consumo de agua: Al obtenerse mostos ms concentrados,disminuye el consumo de agua.

Disminucin del gasto energtico: Esto ocurre debido a que se destilan vinos msricos en alcohol.

Reduccin del volumen de euentes.

En general, las condiciones de VHG pueden ser alcanzados con sistemas sosticados de extraccde azcares y, sobre todo, cuando se suplementan los jugos de agave con otras fuentes de azcar


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Aparte de las diferencias entreSafteq silver ySafteq blue mencionadas anteriormente en eltexto, que bsicamente se centran en la osmotolerancia, tolerancia al etanol y a las altastemperaturas, ambas cepas fueron caracterizadas en estudios tanto a nivel industrial como anivel planta piloto.

Safteq blue suele fermentar con mayor rapidez debido a su alta vigorosidad en medios de agaveLa gura 10 (a) corresponde a cinticas de fermentacin de mostos 100% agave de 18Bridonde claramente se observa queSafteq blue naliza casi 20 horas antes queSafteq silver.

Por otro lado, en la gura 10 (b) se muestra una clara diferencia en la produccin de biomasMientras queSafteq blue se desarrolla rpidamente y llega a ms de 5 g de biomasa (materiaseca) por litro de mosto al nal de la fermentacin,Safteq blue crece ms lentamente y apenassobrepasa los 3 g/l. La mayor velocidad de fermentacin deSafteq blue puede explicarse, enparte, a la gran produccin de biomasa inicial.Los niveles de glicerol tambin se diferencian, como muestra la figura 10 (c).Safteq blue produce niveles signicativamente mayores, seal de que probablemente sufra ms estrs en e

medio. Esta gura tambin muestra que el rendimiento de ambas cepas es similar.


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Figura 10.

A: Azcares totales (sumatoria de glucosa + fructosa).

B: produccin de biomasa, expresada como materia seca de levadura por gramo de mosto, enfermentaciones conducidas conSafteq silver y Safteq blue.

C: Produccin de glicerol (g/l) y rendimiento alcohlico (gramos de etanol por gramo de azcar)


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La tabla 4 muestra los niveles de compuestos regulados por la NOM-006-SCFI-2005 en destdos. Ambas cepas, segn muestra la tabla, cumplen con la norma.

Por ltimo, el anlisis sensorial de destilados producidos conSafteq silver ySafteq blue arrojque para la primera predominan el caramelo y aromas ctricos, mientras que en la segunda lhacen el agave cocido, sabor dulce y aromas a almendra.

Tabla 4. Compuestos de norma y cido actico (expresados en mg cada 100 ml de alcohoanhidro) analizados en destilados provenientes de fermentaciones de mostos de agave 100%conSafteq silver y Safteq blue.

* Valores mximos establecidos por la NOM-006-SCFI-2005 expresados en mg cada 100 ml de alcohol anhidro.** Compuesto no regulado por la NOM-006-SCFI-2005.

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Levaduras en La Industria Tequilera

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