ANÁLISIS INSTRUMENTAL II

INTRODUCCION A LOS MÉTODOS COROMATOGRÁFICOS CLÁSICOS

SEPARACIÓN ANALÍTICA

MEZCLAS HETEROGÉNEAS SEPARACIONES MECÁNICAS

MEZCLAS HOMOGÉNEAS SEPARACIONES FISICAS

SEPARACIONES QUÍMICAS

SEPARACIÓN DE ANALITOS

Alternativas:Métodos específicos

Aplicabilidad limitada (selectividad, límites de detección, no simultaneidad)

Métodos “tradicionales” o clásicos de separaciónDestilaciónExtracciónPrecipitación

Técnicas instrumentales

TÉCNICAS INSTRUMENTALES

Cromatografía

Electroforesis

Otras

CROMATOGRAFÍA

Invención de principios del siglo XXHerramienta poderosa por su versatilidadVentajas

Mezclas complejasVariedad de matrices y analitosAlto porcentaje de recuperaciónFácil cuantificaciónAcoplamiento de la separación con la caracterización

Invención de la cromatografía: Mikhail Tswett (1906)

“If a petroleum ether solution of chlorophyll filters through a column of an adsorption material (I use chiefly calcium carbonate which is firmly pressed into a narrow glass tube), the pigments will separate according to the adsorption series from above downward in differently colored zones, and the more strongly adsorbed pigments will displace the more weakly held ones which will move downward. This separation will be practically complete if, after one passage of the pigment solution it is followed, by a stream of pure solvent through the adsorbing column. Like the light rays of the spectrum, the different components of a pigment mixture in the calcium carbonate column will be separated regularly from each other, and can be determined qualitatively and also quantitatively. I call such a preparation a chromatogram and the corresponding method the chromatographic method.”

Berichte der Deutschen botanischen Gesellschaft 24, 316-23 (1906) [traducido en: Henry M. Leicester,Source Book in chemistry 1900-1950 (Cambridge, MA: Harvard, 1968)]

Descripción general de la cromatografía

Cromatografía es un método de separación que permite separar componentes de mezclas complejas. La muestra se desplaza con una fase móvil (gas, líquido, fluido supercrítico) que se hace pasar sobre una fase estacionaria con la que es inmiscible y que se fija a una columna o superficie sólida.

Las dos fases se elijen de tal modo que los componentes se distribuyen de modo distinto entre la fase móvil y la fase estacionaria. Aquellos componentes que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase móvil. Por el contrario, los componentes que se unen débilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas que pueden analizarse cualitativa y cuantitativamente.

Método físico de separación en el cual los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una de la cual es estacionaria (fase estacionaria) mientras que la otra (fase móvil) se mueve en una dirección definida. IUPAC

Cromatografía en Plano Cromatografía en Columna

La fase estacionaria se fija sobre una placa plana y la fase móvil se desplaza a través de la fase estacionaria por capilaridad.

Un tubo estrecho contiene la fase estacionaria a través de la cual se hace pasar la fase móvil por presión.

Clasificación de la Cromatografía

CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

La clasificación más fundamental de los métodos cromatográficos se basa en el tipo de fase móvil y estacionaria, y en la clase de equilibrios implicados en la transferencia de los solutos entre las fases, en el cuadro adjunto se resumen los métodos cromatográficos

Tipos de cromatografía en columnaOtra clasificación se basa en el tipo de fase móvil, tres clases generales de cromatografía donde la fase móvil son líquidos, gases o fluidos supercríticos.

Elución en columna

Cromatograma: La posición de los picos en el eje del tiempo puede servir para identificar los componentes de la muestra y el área bajo la curva proporcionan una medida cuantitativa de la cantidad de cada componente.

Dilución del analito: el tamaño de la banda original que contiene los analitos es más pequeña que las zonas que llegan al detector. Por lo tanto los detectores deben ser más sensibles que los que serían necesarios si no fuera imprescindible la separación.

A medida que aumenta la migración, aumenta la distancia entre las bandas, pero estas se ensanchan, disminuyendo la eficacia de la columna.

Las formas de los picos cromatográficos

La teoría cinética de la cromatografía explica las formas de los picos y los efectos de distintas variables sobre el ancho de los mismos.

Las bandas cromatográficas ideales tienen forma gaussiana y se puede atribuir a la combinación aditiva de los movimientos aleatorios de las numerosas moléculas de soluto en la banda cromatográfica.

Una molécula de soluto experimenta miles de transferencias entre la fase estacionaria y la fase móvil durante la migración. El tiempo que pasa en cada una es muy irregular y depende que gane accidentalmente suficiente energía térmica del medio para que se produzca la transferencia. Dado que la molécula se eluye solamente cuando reside en la fase móvil, su migración a través de la columna es muy irregular. Ciertas moléculas se desplazan con rapidez, otras se retrasan debido a que han sido retenidas mayor tiempo que el promedio en la fase estacionaria. La consecuencia de estos procesos individuales aleatorios es una dispersión simétrica de las velocidades alrededor del valor medio.

El ancho de la banda aumenta a medida que se mueve a través de la columna, debido a que se dispone de más tiempo para que la dispersión tenga lugar. El ancho de la banda está relacionado directamente con el tiempo de residencia en la columna e inversamente con la velocidad con la que fluye la fase móvil.

Efectos de las velocidades de migración y del ensanchamiento de banda sobre la resolución

El primer componente avanza en la columna a mayor velocidad

Disminución del ensanchamiento de bandas

Optimizar la separación implica: (i) modificar la velocidad relativa de migración de los componentes y (ii) reducir el ensanchamiento de banda. Qué factores determinan (i) y (ii)?

Velocidades de migración de los solutos

cMK cSAmóvil ←→

Aestacionaria

constante de distribución: cromatografía lineal

Tener en cuenta que NO hay un equilibrio ya que no se puede alcanzar con la fase móvil moviéndose continuamente

tRv L

1 k ´

1

1 KVS /VM

1

AcMVM cSVS

cMVM

R

u u v L u t

tM

Lu

Velocidad lineal promedio de migración

Fase móvil

Soluto

M M K AVS tR tMA V tk ´

Factor de retención Factor de selectividad (definido mayor que 1)

K A kA (tR ) A tM kB (tR )B tM K B ´

´

Efecto de la isoterma

Se asume que la constante de distribución es constante y por lo tanto un gráfico de C(S) vs C(M) es lineal.

Isotermas no lineales (C(S) vs C(M) a T cte) se observan en ciertos casos y resultan en picos asimétricos y tiempos de retención que dependen en la concentración del analito en la fase movil y por lo tanto en el tamaño de las muestras inyectadas.

C(S)

C(M)

Eficacia de la columna

HN LLa eficacia de la columna aumenta cuanto mayor es el número de platos(N) y cuanto menor es la altura del plato (H). (L es la longitud del relleno de la columna). Tanto N como H se toman como medidas de la eficacia de la columna.

El ancho de la curva gaussiana está relacionado con la varianza o la desviación estándar. Y definimos la eficacia en los términos de la varianza por unidad de longitud.

Por lo tanto, H y N se pueden determinar a partir de un cromatograma:

N 16( tR )216t 2

2

WH LWR

Modelo de platos de Martin y Synge no representa la realidad (aunque predice forma Gaussiana no justifica el ensanchamiento del pico): modelo de la velocidad

Teoría de van Deemter

Tomamos a H como una medida inversa de la eficacia de la columna

H A B CuuCaminos múltiples de flujo

Difusión longitudinal

Transferencia de masa entre las fases

Cu (CS CM )u

p )uDS DM

f (k ´ )d 2 f (k ´ )d 2

B 2DM

u u

A 2d

S f M

p

(

Coeficientes A, B y C

Término del camino múltiple (A): El ensanchamiento de banda surge en parte debido a la multitud de caminos por los cuales las moléculas pueden caminar a través de la columna rellena. La longitud de estos caminos puede diferir significativamente y por lo tanto el pico se ensancha.

Término de la difusión longitudinal (B/u): Los solutos difunden desde la zona central donde es mayor la concentración hacia las regiones más diluidas situadas por delante y por detrás de la banda, es decir en el mismo sentido y en el sentido opuesto del flujo de la fase móvil. Cuanto mayor es el flujo, menos sucede la difusión del centro de la banda a los costados y menor es el ensanchamiento.

Término de transferencia de masa (C u): Las columnas cromatográficas siempre trabajan en condiciones alejadas del equilibrio entre la fase móvil y la fase estacionaria. Se requiere un tiempo para que el analito difunda desde una fase hacia la interfase para que se produzca la transferencia y esto ensancha el pico. El ensanchamiento por transferencia de masa se debe a la difusión que tiende a ocurrir perpendicularmente a la dirección de flujo y por lo tanto cuanto mayor es la velocidad de flujo, menos tiempo hay para que se produzca la transferencia y menor es el ancho del pico.

Efecto del tamaño de partícula en la eficacia de la columna

El diámetro de las partículas que constituyen el relleno de la columna afectan la eficacia de la columna.

2(t t)

R R,B R, A

k ' 1 k '

N ( 1)

4

wB wA

B

B

Resolución

Para una fase estacionaria determinada, la resolución puede aumentarse alargando la columna (y así aumentando el número de platos). La consecuencia negativa es el incremento del tiempo requerido para la separación.

A,B4 B

Eficiencia de la separaciónN = L/H columna, efectos cinéticos, ensanchamiento de banda

k '

A,B

1 k '

1 BR

Partición f.móvil/f.estacionaria, efectos termodinámicos

Si bien se busca la mejor resolución en el menor tiempo posible, pero las dos propiedades no se pueden llevar a su máximo para las mismas condiciones

´2

´ 2 ´ 3

L NH (1 kB ) 16RS H (

)2 (1 kB )R,B u u 1 kbvB

t

N

Influencia del factor de retención

k’ óptimo entre 2 y 5 aproximadamente

Variables que afectan la eficacia de la columna

Al buscar las condiciones óptimas debe tenerse en cuenta que los parámetros fundamentales , k´y N (o H) pueden ajustar más o menos independientemente.

La manera más fácil de modificar y k´es variando la temperatura o la composición de la fase móvil o el relleno de la columna. Es posible cambiar N modificando la longitud de la columna y H por alteración del caudal de fase móvil, el tamaño de la partícula de relleno y la viscosidad de la fase móvil.

Se puede aumentar la resolución aumentando el número de platos teóricos de la columna, pero esto es costoso en términos del tiempo necesario para completar la separación, a no ser que el aumento de N se lleve a cabo mediante una reducción de H.

Efecto del solvente

Ejemplo: variación del factor de selectividad variando el solvente

El problema de la elución

Solución: cambiar las condiciones que determinan k´mientras tiene lugar la separación (por etapas o de forma continua), por ejemplo: variar la composición de la fase móvil (CL) o variar T (CG).

Efecto de la temperatura