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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA INFORME FINAL DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN: APLICACIÓN DE LA INMOVILIZACIÓN CELULAR COMO VECTOR DE BACTERIAS LÁCTICAS PROBIÓTICAS PARA LA PRODUCCIÓN DE ALIMENTOS FUNCIONALES. CLAVE: 20060651 DEL PROGRAMA DE INVESTIGACIÓN: BIOTECNOLOGÍA ALIMENTARIA PARA EL DESARROLLO DE PROBIÓTICOS Y BIOMOLÉCULAS ACTIVAS PERÍODO: DE ENERO A DICIEMBRE DE 2006 DR. ENRIQUE DURÁN PÁRAMO DIRECTOR DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN DIRECTOR DEL PROGRAMA DE INVESTIGACIÓN UPIBI – IPN ENERO DE 2007 1
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
INFORME FINAL DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN: APLICACIÓN DE LA INMOVILIZACIÓN CELULAR COMO VECTOR DE BACTERIAS LÁCTICAS PROBIÓTICAS PARA LA PRODUCCIÓN DE ALIMENTOS FUNCIONALES. CLAVE: 20060651 DEL PROGRAMA DE INVESTIGACIÓN: BIOTECNOLOGÍA ALIMENTARIA PARA EL DESARROLLO DE PROBIÓTICOS Y BIOMOLÉCULAS ACTIVAS PERÍODO: DE ENERO A DICIEMBRE DE 2006 DR. ENRIQUE DURÁN PÁRAMO DIRECTOR DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN DIRECTOR DEL PROGRAMA DE INVESTIGACIÓN UPIBI – IPN
ENERO DE 2007
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1.- RESUMEN.
El presente proyecto de investigación tuvo como objetivo principal la evaluación
del potencial de la técnica de inmovilización celular por atrapamiento de bacterias
lácticas probióticas como vehículo o vector para la producción de alimentos
lácteos funcionales. Para ello, se seleccionó a Lactobacillus delbrueckii subs.
bulgaricus como bacteria láctica prebiótica para la evaluación de la técnica de
inmovilización celular por atrapamiento como vector probiótico para el ser humano.
El trabajo consistió en la evaluación, in vitro, del efecto de la inmovilización celular
de Lactobacillus delbrueckii por atropamiento sobre la viabilidad celular bajo
condiciones similares de acidez similares a aquellas encontradas en el organismo
humano; todo ello con la finalidad de contar con una técnica que permita servir de
vehículo de grandes cantidades de bacterias prebióticas con altos niveles de
viabilidad al aparato digestivo del ser humano.
Los resultados del proyecto demostraron que el uso de soportes orgánicos para la
inmovilización por atrapamiento de Lactobacillus delbrueckii permite disminuir, de
manera considerable, los efectos del pH ácido similar al encontrado en el
estómago humano, mediante pruebas de simulación in vitro de las condiciones
fisicoquímicas típicas del sistema digestivo del humano. De esta forma, la
inmovilización celular de bacterias lácticas por atropamiento puede ser utilizada
como vector de probióticos para el desarrollo de alimentos lácteos funcionales de
consumo humano. El producto final del proyecto está relacionado con el desarrollo
de una tecnología para la producción de alimentos lácteos funcionales por medio
de la inmovilización de bacterias lácticas probióticas.
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2.- INTRODUCCIÓN.
La inmovilización celular representa un conjunto de técnicas que permiten localizar
en un espacio definido a un conjunto de células para la realización de un gran
número de bioconversiones. En proyectos anteriores, nuestro grupo de trabajo ha
demostrado que la inmovilización de bacterias lácticas permite mantener los
niveles de viabilidad de bacterias cuando son sometidas a procesos de
conservación o de preservación de la actividad biológica, como la liofilización. Así
también, se ha demostrado que la inmovilización de bacterias lácticas por la
técnica de atrapamiento ha permitido el uso de reactores empacados para la
inoculación continua de leche para la producción de cualquier producto lácteo.
En esta ocasión, el presente proyecto contempla la aplicación de las técnicas de
inmovilización celular, en específico, el atrapamiento celular, de bacterias lácticas
probióticas para la producción de alimentos funcionales.
En efecto, los alimentos funcionales definidos como aquellos alimentos o
componentes de éstos, que aportan un beneficio a la salud del consumidor,
además de sus características básicas nutritivas. Por otra parte, en los últimos
años se han constatado los efectos benéficos de las bacterias lácticas en el
organismo humano, lográndose evidenciar su efecto probiótico, es decir que estos
microorganismos tienen efectos benéficos en la salud humana.
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Dada la importancia de estos microorganismos, se han introducido en una gran
variedad de productos comerciales, llamados “alimentos probióticos”, debido a la
inclusión de los microorganismos vivos. Uno de los principales alimentos
probióticos es el yogurt en sus diferentes presentaciones.
Los productos lácteos con características probióticas están cada vez más
presentes en la dieta humana. Es importante mencionar que las bacterias lácticas
son microorganismos que pierden muy fácilmente su viabilidad, ya que son muy
sensibles a los cambios bruscos del medio ambiente.
En este contexto, en el presente proyecto de investigación se estudiará la
aplicación de la técnica de atrapamiento celular para preservar la viabilidad de las
bacterias lácticas; con el objetivo de que las partículas de inmovilización sirvan
como vehículo o vector para que estos microorganismos lleguen viables hasta su
destino, el colon humano, y puedan entonces realizar su labor probiótica.
Para tales fines, es necesario determinar los principales factores que afectan la
viabilidad de estas bacterias dentro del organismo humano, de tal forma que se
pueda simular in vitro las condiciones fisicoquímicas del aparato de digestivo
humano y determinar la efectividad de la técnica de inmovilización como vector de
bacterias probióticas por medio de la determinación de los niveles de
sobreviviencia.
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3.- MATERIALES Y MÉTODOS.
En esta sección se explica de forma resumida la estrategia de trabajo y las
técnicas utilizadas para el desarrollo del proyecto.
Se utilizó una bacteria láctica muy utilizada para la producción de yogurt:
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Se realizaron diversas cinéticas de
pérdida de viabilidad de células de Lactobacillus libres, bajo condiciones ácidas,
simuladas in vitro. Los niveles de sobrevivencia fueron registrados y
posteriormente fueron comparados con aquellos obtenidos de cinéticas de pérdida
de viabilidad de lactobacillus inmovilizado por atropamiento celular en un soporte
de inmovilización compuesto de alginato de sodio.
Los métodos generalmente empleados fuero la determinación de los niveles de
viabilidad por cuantificación en placa de petri y el método de inmovilización por
atropamiento celular.
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3.1.- Microorganismo.
La cepa de estudio en el proyecto fue: Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
NRRL-734.
Se trata de una cepa de colección obtenida por parte del Departamento de
Agricultura de los Estados Unidos.
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus es una bacteria láctica considerada
como probiótico, esto es que proporcionan efectos benéficos en el huésped
mejorando su equilibrio microbiano intestinal, además de mejorar el sistema
inmunológico del mamífero que lo consuma y lo adopte dentro de su flora
intestinal. Así mismo, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus es ampliamente
usado, en conjunto con Streptococcus thermophilus, para la producción industrial
de yogurt. Por todo ello, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus representa una
bacteria láctica de amplio interés económico-industrial.
3.2.- Estrategia de trabajo.
Se inició con la siembra de dos colonias de Lactobacillus delbrueckii en medio
líquido MRS contenido en un matraz (matraz semilla), el cual se incubó a 38 ºC y
180 rpm durante 24 horas. Después de la incubación, se inoculó un segundo
matraz y se incubó a las mismas condiciones que el matraz semilla. Posterior a la
incubación, se recuperó la biomasa por medio de centrifugación (5000 rpm, 5 min).
La biomasa se inmovilizó utilizando la técnica de atrapamiento celular en alginato
de sodio al 1% y 2%. Al término de la inmovilización se tomó una muestra de
células inmovilizadas (equivalente a 1 mL), mismas que fueron tratadas con
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solución de Citrato de sodio 0.1 M, a 40 ºC y agitación con vortéx para disolver la
matriz de inmovilización y liberar las células. Posterior a esto, se realizan
diluciones y se determina la viabilidad bacteriana por medio de la técnica la
técnica de conteo en placa en medio MRS.
Las pruebas que se realizaron fueron: selección del soporte de inmovilización y
concentración a emplear, así como la evaluación de la estabilidad de dicho
soporte en condiciones gastrointestinales simuladas in vitro, evaluación de la
viabilidad de células libres e inmovilizadas en presencia de ácido clorhídrico, con
la finalidad de simular el paso de las células por el estómago del ser humano.
3.2.1.- Evaluación del soporte en condiciones gastrointestinales in vitro.
Se evaluaron la κ-carragenina, el alginato de sodio y la gelatina como soporte de
inmovilización a diferentes concentraciones (1%, 2%, 2.5%), además de las
anteriores se evaluó una concentración de 20% para gelatina, para formar
partículas esféricas de 3 mm de diámetro aproximadamente. Una vez formadas
las partículas se evalúo la estabilidad de los soportes en medio ácido y en
presencia de bilis hepática, ambas condiciones seleccionadas debido a su efecto
agresivo sobre la viabilidad de bacterias lácticas. Se empleó una solución de ácido
clorhídrico 150 mM para ajustar el medio a pH de 2.4 y 4.2, manteniendo
temperatura constante a 37 ºC y agitación de 50 rpm, durante 60 min.
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3.2.2.- Determinación de viabilidad de Lactobacillus delbrueckii libre (sin
inmovilizar, muestra testigo) e inmovilizado por atrapamiento, en medio
ácido simulando in vitro la estancia de las bacterias en el estómago humano.
Se realizaron cinéticas de pérdida de viabilidad en medio ácido a pH 2.4 y 4.2,
ambos ajustados con solución de ácido clorhídrico 150 mM (concentración
presente en el estómago), con y sin presencia de alimento tipo (simulación de un
desayuno ligero típico de un ser humano, que consiste de leche y fruta), la
temperatura y agitación orbital se mantuvieron constantes 37 ºC y 50 rpm
respectivamente. Se tomaron muestras de células libres e inmovilizadas
(equivalente a 1 mL) cada 15 minutos, para determinar la viabilidad bacteriana a
dichas condiciones, mediante la técnica de conteo en placa en medio MRS
sólido. En esta etapa se trata de simular el efecto de la acidez que presenta el
estómago, sobre la viabilidad de Lactobacillus delbrueckii cuando el ser humano
se encuentra en ayunas (estómago vacío, pH 2.4) y cuando se encuentra con un
desayuno tipo en el estómago (Figura 1). Con base en esta determinación se
podrá conocer si la presencia de alimento tipo puede disminuir los efectos del pH
ácido sobre la perdida de viabilidad de las células de Lactobacillus delbrueckii,
tanto libres como inmovilizadas.
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Células (libres o inmovilizadas) + alimento muestra (fruta con leche),
ajustando pH con solución de HCl 150
Células (libres o inmovilizadas) +solución de HCl 150 mM sin
alimento muestra.
37 º C, 50 rpm
37 º C, 50 rpm
Figura 1.- Evaluación de la viabilidad de células libres e inmovilizadas de Lactobacillus delbrueckii
en medio ácido.
3.3.- Medio de cultivo MRS líquido y sólido.
La composición del medio de cultivo MRS es descrita en el Cuadro 1.
Cuadro 1. Formulación del medio MRS líquido.
REACTIVOS
CANTIDAD
Glucosa 20 g
Peptona de caseína 10 g
Extracto de carne 10 g
Extracto de levadura 10 g
Acetato de sodio 5 g
Citrato de amonio 2 g
Fosfato ácido de potasio 2 g
Twen 80 1 mL
Sulfato de magnesio
heptahidratado 200 mg
Sulfato de manganeso 50 mg
Agua destilada cbp. 1 L
Nota: para preparar medio sólido se agregan 12 g de agar bacteriológico.
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3.4.- Determinación de viabilidad por conteo en placa.
En la Figura 2, se presenta el esquema del desarrollo de la técnica de conteo en
placa, el procedimiento es el siguiente: de una concentración de células conocida
se toma 1 mL de la suspensión, y se realizan diluciones de 10-1 a 10-6. De las
diluciones 10-3 a 10-6, se toman alícuotas de 0.1 mL para sembrar por extensión en
placa en medio sólido MRS. Posteriormente, las cajas de Petri se incuban a 37 ºC
durante 48 h, al término de incubación se cuentan las colonias y se reportan como
UFC/mL.
1 mL
10 - 2 10 - 3
10 - 6 10 - 1 10 - 4 10 - 5
0.1 mL0.1 mL
0.1 mL 0.1 mL
0.1 mL
Placas con medio sólido MRS sólido
Figura 2. Esquema d
Incubar a T (38 ºC) óptima durante 24
horas.
e la técnica de determinación de viabilidad por conteo en placa de Petri.
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3.5.- Inmovilización celular por la técnica de atrapamiento.
En la Figura 3 se muestra el esquema de la técnica de inmovilización por
atrapamiento celular que fue utilizada en el proyecto.
La biomasa recuperada por centrifugación, se adiciona a la solución de soporte
(alginato de sodio ó κ-carragenina) contenida en un recipiente enchaquetado,
manteniendo constante la temperatura (38 ºC a 40 ºC) para evitar que el
polisacárido gelifique y agitación de 120 rpm para homogenizar la suspensión.
La suspensión se hace pasar a través de una aguja por medio de una bomba
peristáltica (12 rpm), se forman gotas que al ponerse en contacto con la solución
gelificante (KCl ó CaCl2 0.3 M), gelifican formándose partículas esféricas de
aproximadamente 3 mm de diámetro.
La solución gelificante se encuentra con agitación mínima, para evitar que las
esferas se peguen entre ellas al momento de caer.
Suspensión de soporte con biomasa
Bomba peristáltica
12 rpm 38 – 40 ºC, 120 rpm Solución de KCl ó CaCl2 0.3 M, 120 rpm
Figura 3. Esquema de la técnica de inmovilización celular por atrapamiento.
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4.- RESULTADOS.
4.1 Tratamientos en medio ácido a pH 2.4 (simulando in vitro la etapa de
estancia de las bacterias en el estómago humano).
El Cuadro 2 y la Figura 4 presentan los resultados de viabilidad (expresados en
porcentaje) de células de Lactobacillus delbrueckii libres (sin inmovilizar) e
inmovilizadas en alginato de sodio al 1% y 2% (p/v), tratadas a pH 2.4 y en
ausencia de “alimento muestra” o “desayuno tipo”, con la finalidad de simular in
vitro la estancia de las bacterias en el estómago humano a pH muy ácido y cuando
el estómago humano se encuentra vacío.
En la figura 4 puede observarse que se iniciaron las cinéticas de pérdida de
viabilidad con un 100% de células de Lactobacillus delbrueckii libres viables
(2.43x108 UFC/mL). Al término de las cinéticas de pérdida de viabilidad, el 14%
(3.47x107 UFC/mL) de las bacterias lácticas libres se mantuvieron viables,
mientras que las bacterias inmovilizadas en alginato de sodio al 1% y 2%,
mantuvieron porcentajes de viabilidad del 62% (7.73x108 UFC/mL) y del 70%
(5.10x108 UFC/mL), respectivamente; siendo el 100% igual a 1.25x109 UFC/mL
para la muestra de células inmovilizadas en alginato al 1% y de 7.30x108 UFC/mL
para la muestra de bacterias inmovilizadas en alginato de sodio al 2%.
Los resultados indican que la viabilidad de las células de Lactobacillus delbrueckii
se mantiene de 4 a 5 veces mayor cuando las células están inmovilizadas, en
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alginato al 1% o al 2%, con respecto a cuando se encuentran libres, en
condiciones de pH de 2.4 y en ausencia de alimento tipo.
Analizando los resultados presentados en el Cuadro 2 y la Figura 4 para el minuto
30, que es el tiempo de referencia de vaciado del estómago para este estudio,
podemos observar que las velocidades de pérdida de viabilidad de las bacterias
fueron en el caso de las células de Lactobacillus delbrueckii inmovilizadas en
alginato al 1% de 0.47% de pérdida de viabilidad/min y para alginato al 2% de
0.50%/min. En el caso de las células de Lactobacillus delbrueckii libres, la
velocidad de pérdida de viabilidad fue 2.03%/min (Cuadro 3).
Los valores estimados de las velocidades de pérdida de viabilidad celular indican
que la velocidad de pérdida de viabilidad resulta ser 4 veces mayor para las
células de Lactobacillus delbrueckii libres con respecto a las velocidades
calculadas para las células que han sido previamente inmovilizadas por
atrapamiento, ya sea en alginato al 1% o al 2%, bajo condiciones de pH de 2.4 y
en ausencia de alimento tipo.
Los resultados estadísticos demostraron que existieron diferencias significativas
entre la viabilidad de células libres de Lactobacillus delbrueckii con respecto a la
de células de Lactobacillus delbrueckii inmovilizadas, ya que la viabilidad
bacteriana resultó significativamente mayor cuando las bacterias lácticas se
encontraron inmovilizadas en alginato de sodio. Por otra parte, se observó que no
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existieron diferencias significativas entre la utilización de alginato a
concentraciones de 1% y de 2% (Duncan, α= 0.05).
Cuadro 2. Resultados de viabilidad de células libres e inmovilizadas de Lactobacillus delbrueckii
subsp. bulgaricus en alginato de sodio, a pH 2.4 en ausencia de “desayuno tipo”.
Tiempo Células libres Células Inmovilizadas Células Inmovilizadas en alginato 1% en alginato 2%
(min) (%) Desv. Std. + (%) Desv. Std. + (%) Desv. Std. +
0 100 0 100 0 100.0 0.0 15 63 16.6 96 8.2 91 8.8 30 39 9.0 86 6.5 85 6.2 45 28 5.6 72 7.0 74 2.3 60 14 10.0 62 2.1 70 1.2
100
63
3928
14
100100.0
6272
86
96
7074
85
91
0
20
40
60
80
100
0 15 30 45 60
tiempo (h)
Via
bilid
ad (%
)
Cél. libres Inmovilizadas en alginato 1%
Inmovilizadas en alginato 2%
Figura 4. Cinética de pérdida de viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus, libres e inmovilizadas en alginato de sodio al 1% y al 2% a pH 2.4 en ausencia de
“desayuno tipo”.
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Cuadro 3. Velocidades de pérdida de viabilidad de células libres e inmovilizadas de Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus en alginato de sodio, a pH 2.4 en ausencia de “desayuno tipo”.
Muestra Velocidad de pérdida de viabilidad bacteriana
(%pérdida de viabilidad/min)
Tiempo (min)
Células libres 2.03 30 Células Inmovilizadas en alginato al 1% 0.47 30 Células Inmovilizadas en alginato al 2% 0.50 30
El Cuadro 4 y la Figura 5 presentan los resultados de viabilidad (expresados en
porcentaje) de células de Lactobacillus delbrueckii libres (sin inmovilizar) e
inmovilizadas en alginato de sodio al 1% y al 2% (p/v), tratadas a pH 2.4 en
presencia de “desayuno tipo” (leche y fruta). En este tratamiento se trató de
simular in vitro la estancia de las bacterias lácticas en el estómago humano a pH
muy ácido en presencia de alimento.
Se iniciaron las cinéticas de pérdida de viabilidad con un 100% de viabilidad para
células libres de Lactobacillus delbrueckii (3.27x108 UFC/mL) e inmovilizadas en
alginato de sodio al 1% (1.24x109 UFC/mL) y al 2% (9.80x108 UFC/mL). Al término
de las cinéticas de pérdida de viabilidad, se observó que el 16% (4.67x 107
UFC/mL) de las células libres de Lactobacillus delbrueckii mantuvieron su
viabilidad al término del tratamiento en medio ácido. Por el contrario, las células de
Lactobacillus delbrueckii inmovilizadas en alginato de sodio al 1% y 2%,
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mantuvieron porcentajes de viabilidad del 72% (8.93x108 UFC/mL) y del 78%
(7.80x108 UFC/mL), respectivamente.
Los resultados indican que la viabilidad de las células de Lactobacillus delbrueckii
se mantiene casi 5 veces mayor cuando las células están inmovilizadas, ya sea en
alginato al 1% o al 2%, con respecto a cuando se encuentran libres, en
condiciones de pH de 2.4 y en presencia de alimento tipo.
Analizando los resultados presentados en el Cuadro 4 y la Figura 5 para el minuto
30, podemos observar que las células de Lactobacillus delbrueckii inmovilizadas
en alginato de sodio al 1% presentaron una velocidad de pérdida de viabilidad de
0.48%/min; mientras que para alginato de sodio al 2% de 0.46%/min. En el caso
de las células libres de Lactobacillus delbrueckii, la velocidad de pérdida de
viabilidad fue 100% más alto (1%/min) con respecto a las células inmovilizadas.
En el período de cinética de pérdida de viabilidad comprendido entre el minuto 30
y el minuto 60, las velocidades de pérdida fueron de 1.82% de pérdida de
viabilidad/min, 0.45%/min y 0.26%/min para células libres, células inmovilizadas en
alginato al 1% y al 2%, respectivamente (Cuadro 5).
Los valores estimados de las velocidades de pérdida de viabilidad celular indican
que la velocidad de pérdida de viabilidad resulta ser de 2 a 7 veces mayor para las
células de Lactobacillus delbrueckii libres con respecto a las velocidades
calculadas para las células que han sido previamente inmovilizadas por
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atrapamiento, en alginato al 1% o al 2%, bajo condiciones de pH de 2.4 y en
presencia de alimento tipo.
Los resultados estadísticos demostraron que la viabilidad de las células de
Lactobacillus delbrueckii inmovilizadas en alginato de sodio fue significativamente
mayor, con respecto a la viabilidad de las células de Lactobacillus delbrueckii
libres. Así también, se observó que no existieron diferencias significativas entre la
viabilidad celular de Lactobacillus delbrueckii con relación a la utilización de
alginato al 1% ó al 2% (Duncan, α= 0.05).
Cuadro 4. Resultados de viabilidad de células libres e inmovilizadas Lactobacillus delbrueckii
subsp. bulgaricus en alginato de sodio, a pH 2.4 en presencia de “desayuno tipo”.
Tiempo Células libres Células Inmovilizadas
Células Inmovilizadas
en alginato 1% en alginato 2%
(min) (%) Desv. Std.
+ (%) Desv. Std. + (%) Desv. Std. + 0 100 0.0 100 0.00 100 0
15 76 7.05 94 4.51 90 7 30 70 5.76 86 9.20 86 9 45 40 4.13 78 14.47 81 13 60 16 9.76 72 19.99 78 14
Los resultados estadísticos también demostraron que no se encontraron
diferencias significativas en el efecto de la presencia o la ausencia de alimento tipo
sobre la viabilidad celular de Lactobacillus delbrueckii sin importar que las células
estuvieran libre o inmovilizadas sometidas a un pH de 2.4 (Duncan, α= 0.05).
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100
7670
40
16
100.0100
78
9486
72
868190 78
0
20
40
60
80
100
0 15 30 45 60tiempo (min)
Viab
ilidad
(%)
Células libres Cél. Inmov. en alginato 1%Cél. Inmov. en alginato 2%
Figura 5. Cinética de pérdida de viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus, libres e inmovilizadas en alginato de sodio al 1% y al 2% a pH 2.4 en presencia de
“desayuno tipo”.
Cuadro 5. Velocidades de pérdida de viabilidad de células libres e inmovilizadas de Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus en alginato de sodio, a pH 2.4 en ausencia de “desayuno tipo”.
Muestra Velocidad de pérdida de viabilidad bacteriana
(%pérdida de viabilidad/min)
Tiempo (min)
Células libres 1 1.82
30 60
Células Inmovilizadas en alginato al 1% 0.48 0.45
30 60
Células Inmovilizadas en alginato al 2% 0.46 0.26
30 60
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4.2.- Tratamientos en medio ácido a pH 4.2 (simulando in vitro la etapa de
estancia de las bacterias en el estómago humano).
El Cuadro 6 y la Figura 6 presentan los resultados de viabilidad (expresados en
porcentaje) de células de Lactobacillus delbrueckii libres (sin inmovilizar) e
inmovilizadas en alginato de sodio al 1% y al 2% (p/v), tratadas a pH 4.2 en
ausencia de “alimento muestra”. En este tratamiento se trató de simular la estancia
de las bacterias en el estómago humano cuando éste se encuentra vacío.
Las cinéticas de pérdida de viabilidad de Lactobacillus delbrueckii iniciaron con un
100% de células libres viables (1.20x108 UFC/mL) e inmovilizadas en alginato de
sodio al 1% (1.24x109 UFC/mL) y al 2% (1.19x109 UFC/mL). Al término de las
cinéticas de pérdida de viabilidad se observó que el 8% (9.5x106 UFC/mL) de las
células libres mantuvieron su viabilidad, mientras que las células inmovilizadas en
alginato de sodio al 1% y 2% mantuvieron porcentajes de viabilidad del 61%
(7.6x108 UFC/mL) y de 73% (8.73x108 UFC/mL), respectivamente.
Los resultados indican que la viabilidad de las células de Lactobacillus delbrueckii
se mantiene de 7 a 9 veces mayor cuando las células están inmovilizadas, en
alginato al 1% o al 2%, con respecto a cuando se encuentran libres, en
condiciones de pH de 4.2 y en ausencia de alimento tipo.
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Las velocidades de pérdida de viabilidad para las células de Lactobacillus
delbrueckii inmovilizadas en alginato de sodio al 1% y al 2% en el minuto 30,
tiempo de referencia de vaciado del estómago, fueron de 0.69%/min y de
0.53%/min, respectivamente; mientras que para las células libres de Lactobacillus
delbrueckii fue de 2.57% de pérdida de viabilidad/min.
En el período de cinética de pérdida de viabilidad comprendido entre el minuto 30
y el minuto 60, las velocidades de pérdida fueron de 0.60%/min y de 0.36%/min
para células de Lactobacillus delbrueckii inmovilizadas en alginato de sodio al 1%
y al 2%.
Para el caso de células libres de Lactobacillus delbrueckii, la velocidad de pérdida
de viabilidad al inicio de la cinética (del minuto cero al minuto 15) fue de
4.73%/min. Ello quiere decir que cada minuto que pasa durante la cinética, 4.73%
de las células de Lactobacillus delbrueckii originales pierden su viabilidad. La
velocidad de pérdida de viabilidad para las células libres de Lactobacillus
delbrueckii disminuyó después del minuto 30 de cinética, presentando un valor de
0.50% /min. entre los tiempos 30 y 60 minutos (Cuadro 7).
Los valores estimados de las velocidades de pérdida de viabilidad celular indican
que la velocidad de pérdida de viabilidad resulta ser de 4 y hasta 13 veces mayor
para las células de Lactobacillus delbrueckii libres con respecto a las velocidades
calculadas para las células que han sido previamente inmovilizadas por
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atrapamiento, en alginato al 1% o al 2%, bajo condiciones de pH de 4.2 y en
ausencia de alimento tipo.
El análisis estadístico de los resultados demostró que existieron diferencias
significativas entre la viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii
inmovilizadas en alginato de sodio con respecto a la viabilidad de células de
Lactobacillus delbrueckii libres. La viabilidad de las células de Lactobacillus
delbrueckii fue mayor cuando éstas se encontraban inmovilizadas en alginato de
sodio con respecto a cuando se encontraban en forma libre. Además, se observó
que no existieron diferencias significativas entre la utilización de alginato de sodio
a concentraciones de 1% ó de 2% (Duncan, α= 0.05).
Cuadro 6. Resultados de viabilidad de células libres e inmovilizadas Lactobacillus delbrueckii
subsp. bulgaricus en alginato de sodio, a pH 4.2 en ausencia de “desayuno tipo”.
Tiempo Células libres Células Inmovilizadas
Células Inmovilizadas
en alginato 1% en alginato 2% (min) (%) Desv. Std. + (%) Desv. Std. + (%) Desv. Std. +
0 100 0 100 0 100 0.0 15 29 14.91 90 3.49 91 7.52 30 23 13.10 79 5.39 84 4.21 45 19 11.37 68 3.39 80 4.63 60 8 1.50 61 6.60 73 2.15
21
100
2923 19
8
100
6861
100
7379
90 8491
80
0
20
40
60
80
100
0 15 30 45 60
tiempo (min)
Via
bilid
ad (%
)
Células libres Cél. Inmov. en alginato 1% Cél. Inmov. en alginato 2%
Figura 6. Cinética de pérdida de viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus, libres e inmovilizadas en alginato de sodio al 1% y al 2% a pH 4.2 en ausencia de
“desayuno tipo”.
Cuadro 7. Velocidades de pérdida de viabilidad de células libres e inmovilizadas de Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus en alginato de sodio, a pH 4.2 en ausencia de “desayuno tipo”.
Muestra Velocidad de pérdida de viabilidad bacteriana
(%pérdida de viabilidad/min)
Tiempo (min)
Células libres 4.73 2.57 0.50
15 30 60
Células Inmovilizadas en alginato al 1% 0.69 0.60
30 60
Células Inmovilizadas en alginato al 2% 0.53 0.36
30 60
22
El Cuadro 8 y la Figura 7 presentan los resultados de viabilidad (expresados en
porcentaje) de células de Lactobacillus delbrueckii libres (sin inmovilizar) y células
inmovilizadas en alginato de sodio al 1% y 2% (p/v), tratadas a pH 4.2 en
presencia de “desayuno tipo” (leche y fruta).
Las cinéticas de pérdida de viabilidad iniciaron con un 100% de células libres
viables (2.20x108 UFC/mL) e inmovilizadas en alginato de sodio al 1% (1.09x109
UFC/mL) y al 2% (9x108 UFC/mL). Al término de las cinéticas, el 18% (3.98x107
UFC/mL) de las células libres de Lactobacillus delbrueckii mantuvieron su
viabilidad, mientras que las células de Lactobacillus delbrueckii inmovilizadas en
alginato de sodio al 1% y al 2% conservaron porcentajes de viabilidad de 74%
(8.03x108 UFC/mL) y de 83% (7.23x108 UFC/mL), respectivamente.
Los resultados indican que la viabilidad de las células de Lactobacillus delbrueckii
se mantiene 4 veces mayor cuando las células están inmovilizadas, ya sea en
alginato al 1% o al 2%, con respecto a cuando se encuentran libres, en
condiciones de pH de 4.2 y en presencia de alimento tipo.
La velocidad de pérdida de viabilidad para las células de Lactobacillus delbrueckii
inmovilizadas en alginato de sodio al 1% estimada hasta el minuto 30 de la
cinética fue de 0.39% de pérdida de viabilidad/min, mientras que para alginato de
sodio al 2% fue de 0.33%/min. Para el caso de las células libres de Lactobacillus
delbrueckii se observó una velocidad de pérdida de viabilidad de 2.27%/min. Sin
embargo, si observamos los primeros 15 minutos de la cinética de pérdida de
23
viabilidad para la muestra de células libres de Lactobacillus delbrueckii, la
velocidad de pérdida de viabilidad fue de 4 %/min. Esto quiere decir que cada
minuto, el 4% de las células de Lactobacillus delbrueckii originales pierde su
viabilidad cuando están sometidas a un pH de 4.2. Sin embargo, la velocidad de
pérdida de viabilidad presenta una disminución entre los minutos 30 y 60 de la
cinética, presentándose únicamente una velocidad de pérdida de viabilidad de
0.46%/min (Cuadro 9).
Los valores estimados de las velocidades de pérdida de viabilidad celular indican
que la velocidad de pérdida de viabilidad resulta ser de 5 a 7 veces mayor para las
células de Lactobacillus delbrueckii libres con respecto a las velocidades
calculadas para las células que han sido previamente inmovilizadas por
atrapamiento, en alginato al 1% o al 2%, bajo condiciones de pH de 4.2 y en
presencia de alimento tipo.
Por otra parte, se observó que existieron diferencias significativas entre la
viabilidad de células Lactobacillus delbrueckii inmovilizadas en alginato de sodio
(1% y 2%) con respecto a la viabilidad de células libres de Lactobacillus
delbrueckii. Además, se observó que no existieron diferencias significativas entre
la utilización del alginato de sodio, como soporte de inmovilización, a
concentraciones de 1% y de 2% (Duncan, α= 0.05).
24
Cuadro 8. Resultados de viabilidad de células libres e inmovilizadas Lactobacillus delbrueckii
subsp. bulgaricus en alginato de sodio, a pH 4.2 en presencia de “desayuno tipo”.
Tiempo Células libres Células
Inmovilizadas Células
Inmovilizadas alginato 1% con inulina 2%
(min) (%) Desv. Std. + (%) Desv. Std. + (%) Desv. Std. + 0 100 0 100 0 100 0.0 15 40 1.61 94 5.78 94 1.81 30 32 3.84 88 6.04 90 3.41 45 21 1.09 82 5.75 87 4.91 60 18 0.97 74 1.49 83 7.14
100
40
18
100
74
100
87 83
2132
8288
9490
94
0
20
40
60
80
100
0 15 30 45 60
tiempo (min)
Via
bilid
ad (%
)
Células libres Cél. Inmov. en alginato 1% Cél. Inmov. en alginato 2%
Figura 7. Cinética de pérdida de viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus, libres e inmovilizadas en alginato de sodio al 1% y al 2% a pH 4.2 en presencia de
“desayuno tipo”.
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Cuadro 9. Velocidades de pérdida de viabilidad de células libres e inmovilizadas de Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus en alginato de sodio, a pH 4.2 en presencia de “desayuno tipo”.
Muestra Velocidad de pérdida de viabilidad bacteriana
(%pérdida de viabilidad/min)
Tiempo (min)
Células libres 4.00 2.27 0.46
15 30 60
Células Inmovilizadas en alginato al 1% 0.39 0.48
30 60
Células Inmovilizadas en alginato al 2% 0.33 0.23
30 60
Los resultados estadísticos también demostraron que sí se encontraron
diferencias significativas en el efecto de la presencia o la ausencia de alimento tipo
sobre la viabilidad celular de Lactobacillus delbrueckii libre o inmovilizado
sometido a un pH de 4.2 (Duncan, α= 0.05). Las células libres de Lactobacillus
delbrueckii presentaron porcentajes de viabilidad significativamente menores
cuando la cinética de pérdida de vibilidad se llevó a cabo en ausencia de alimento
que cuando ésta se llevó en presencia del desayuno tipo a un pH de 4.2.
26
5.- CONCLUSIONES.
Con base en las simulaciones in vitro de las condiciones gastrointestinales del ser
humano, así como de cinéticas de pérdida de viabilidad realizadas, los resultados
obtenidos en el proyecto reflejaron que Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
NRRL-734 inmovilizado en soportes de alginato de sodio, mantiene mayores
niveles de viabilidad con respecto a las células libres de Lactobacillus delbrueckii
subsp. bulgaricus tratadas bajo las mismas condiciones fisicoquímicas.
También, se puede concluir que la presencia de una muestra de desayuno tipo
mezclado a las células de Lactobacillus delbrueckii a un pH de 4.2 disminuyó
significativamente los porcentajes de pérdida de viabilidad de las células libres, así
como la velocidad de pérdida de viabilidad durante las cinéticas realizadas. Dicho
efecto no fue significativo para el caso de las cinéticas realizadas a un pH de 2.4.
Estos resultados quieren decir que en el caso de que un ser humano consuma
células de Lactobacillus delbrueckii, existirán mayores posibilidades de dichas
células libres de Lactobacillus delbrueckii sobrevivan a las condiciones
gastrointestinales del ser humano, cuando las bacterias se consuman
acompañadas de algún alimento tipo como el que aquí se utilizó, que cuando la
persona se encuentre en ayunas.
Por último, podemos concluir que la técnica de inmovilización celular por
atrapamiento resultó adecuada para su aplicación como vector de bacterias
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probióticas hacia el ser humano, ya que su utilización permitió de manera
significativa y por medio de simulaciones in vitro, la disminución de los niveles de
pérdida de viabilidad de las células de Lactobacillus delbrueckii inmovilizadas.
6.- IMPACTO.
El impacto del presente proyecto en el sector productivo puede llegar a ser
importante en un futuro cercano, una vez que la tecnología aquí presentada,
basada en la inmovilización celular de bacterias lácticas probióticas, pueda ser
realizada de manera automatizada y además validada por medio de la
experimentación con animales o con seres humanos; todo ello con la finalidad de
desarrollar nuevos alimentos lácteos funcionales que contenga grandes
cantidades de bacterias probióticas y con altos niveles de viabilidad celular, lo que
resultaría en múltiples beneficios para la salud del ser humano.
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