INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS -...

INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS

Prof. J.M.Sánchez-MonteroGrupo de Biotransformaciones

Departamento de Química Orgánica y Farmacéutica. Fac. Farmacia

INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS

Prof. J.M.Sánchez Montero, Facultad de Farmacia, UCM, Madrid, España

DEFINICIÓN:•CONFINAMIENTO FÍSICO DE UNA ENZIMA O CÉLULA EN UNA DETERMINADA REGIÓN DEL ESPACIO, DE MANERA QUE SU ACTIVIDAD CATALITICA SE RETENGA, Y PUEDA SER REUTILIZADA. •1971, 1er Enzyme Engineering Conference, Henniker, NewHampshire, USA.

POSTERIOR SIMPLIFICACIÓN DEL TÉRMINO: BIOCATALIZADORES INMOVILIZADOS•ENZIMAS, CÉLULAS ENTERAS U ORGÁNULOS CELULARES (O BIEN COMBINACIONES DE ELLOS) QUE SE ENCUENTRAN EN UN ESTADO TAL QUE SE PERMITE SU REUTILIZACIÓN


PARA UNIFICAR CRITERIOS A LA HORA DE CARACTERIZAR UN CATALIZADOR INMOVILIZADO, EL WORKING PARTY ON APPLIED BIOCATALYSIS, ENCUADRADO DENTRO DE LA FEDERACIÓN EUROPEA DE BIOTECNOLOGÍA DEFINIÓ UNAS LÍNEAS MAESTRAS (GUIDELINES) CON OBJETO DE RESPONDER A PREGUNTAS TIPO:

•¿ QUE RENDIMIENTO COMPARADO PRESENTA UNA REACCION BIOCATALIZADA POR ENZIMAS O CÉLULAS LIBRES FRENTE A SISTEMAS INMOVILIZADOS?

•¿ QUÉ PARÁMETROS GOBIERNAN UNA REACCIÓN BIOCATA LIZA DA ?

•¿ QUÉ CANTIDAD DE ENZIMA LIBRE SE NECESITA PARA PREPARAR UN BIOCATALIZADOR INMOVILIZADO ACTIVO?


REQUISITOS MÍNIMOS PARA PODER CARACTERIZAR UN BIOCATALIZADOR INMOVILIZADO

0.- DESCRIPCIÓN GENERAL.

0.1.- ESQUEMA DE REACCIÓN0.2.- ENZIMA Y MICROORGANISMO0.3.- TIPO DE SOPORTE0.4.- MÉTODO EMPLEADO PARA LA INMOVILIZACIÓN

1.- PREPARACIÓN DEL CATALIZADOR INMOVILIZADO.

1.1.- MÉTODO DE INMOVILIZACIÓN, CONDICIONES DE REACCIÓN.

1.2.- RENDIMIENTO POR PESO SECO, ACTIVIDAD DEL SOBRENADANTE.


2.- CARACTERIZACION FISICO- QUIMICA.

2.1.-FORMA DEL BIOCATALIZADOR2.2.-DIÁMETRO MEDIO DE PARTÍCULA HÚMEDA2.3.-CAPACIDAD DE HINCHAMIENTO2.4.-COMPORTAMIENTO EN COLUMNAS

(COMPRESIBILIDAD)2.5.-ABRASIÓN EN REACTORES AGITADOS2.5.-ABRASIÓN EN REACTORES DE LECHO

FLUIDIZADO.


3.-CINETICA DEL BIOCATALIZADOR INMOVILIZADO.

3. 1.-ESTUDIO DE LA VARIACIÓN DE LA VELOCIDAD INICIAL DE REACCIÓN FRENTE A LA VARIACIÓN DE LAS CONCENTRACIONES DE ENZIMA Y DE SUSTRATO.

3.2.- EFECTO DEL TIPO DE BUFFER Y DEL pH.3.3.- LIMITACIONES DIFUSIONALES EN EL SISTEMA (EFECTO

DEL TAMAÑO DE PARTÍCULA Y LA CARGA ENZIMÁTICA)3.4.- GRADO DE CONVERSIÓN FRENTE A TIEMPO DE

RESIDENCIA.3.5.- ESTABILIDAD DEL BIOCATALIZADOR EN EL

ALMACENAMIENTO (VELOCIDAD INICIAL RESIDUAL TRAS EL ALMACENAMIENTO A DIFERENTES TIEMPOS EN DIFERENTES CONDICIONES.)

3.6.- ESTABILIDAD OPERACIONAL (VELOCIDAD INICIAL RESIDUAL DESPUÉS DE DIFERENTES CICLOS CATALÍTICOS)..

OBJETIVO: MAYOR REPRODUCIBILIDAD


PUNTO DE VISTA BIOQUÍMICO

VENTAJAS:

1.- Disminución de problemas de autolisis (proteasas) o de agregación, al estar limitados los movimientos rotacionales y translacionales.

2.- Se ralentizan los cambios conformacionales, por lo que se pueden estudiar las relaciones estructura-función.

3.- Se pueden simular reacciones in vivo.4.- Se pueden simular sistemas estructuralmente asimétricos (ej.

estudios de membranas).5.- En sistemas entrecruzados, se pueden fijar interacciones con

fosfolípidos, polisacáridos... para simular orgánulos celulares.6.- La unión multipuntual a soportes deformables permite

estudiar la deformación de proteínas globulares.

VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA INMOVILIZACIÓN


PUNTO DE VISTA BIOQUÍMICO

DESVENTAJAS:

1.- Generalmente, se disminuye la actividad enzimática al inmovilizar.

2.- Si la preparación enzimática no es homogénea, se dificulta la interpretación de los datos.

3.- A veces, se pueden originar contactos proteína-proteína indeseados.



PUNTO DE VISTA APLICADO

VENTAJAS:

1.- Se produce un gran aumento de la estabilidad de la enzima o célula inmovilizada.

2.- Se aumenta de gran manera la productividad enzimática por la capacidad de reutilización.

3.- Se aumenta la facilidad de recuperación y purificación de los productos.

4.- Se puede elegir entre una gran variedad de diseños ingenieriles

5.- Se aumenta la facilidad de operación y control del proceso, al trabajar en condiciones más suaves.



PUNTO DE VISTA APLICADO

DESVENTAJAS:

1.- Generalmente, se disminuye la actividad enzimática.2.- Se aumentan los problemas difusionales.3.- Se aumenta el costo del proceso.4.- El intervalo de pH de trabajo puede ser distinto al del

biocatalizador nativo.



MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN:

Existen varias metodologías.

1.- RETENCIÓN QUÍMICA1.1.- Enlaces covalentes1.2.- Enlaces no covalentes. Adsorción.1.3.- Reticulado (cross-linking)

2.- RETENCIÓN FÍSICA = ATRAPAMIENTO2.1.- Atrapamiento en matrices.

2.1.1.- En geles o polímeros.2.1.2.- Micelas reversas.

2.2.- Atrapamiento en membranas.2.2.1.- En fibras huecas.2.2.2.- En reactores de membrana.


1.- RETENCIÓN QUÍMICA1.1.- Enlaces covalentes1.2.- Enlaces no covalentes. Adsorción.1.3.- Reticulado (cross-linking)


2.- RETENCIÓN FÍSICA = ATRAPAMIENTO2.1.- Atrapamiento en matrices.

2.1.1.- En geles o polímeros.2.1.2.- Micelas reversas.

2.2.- Atrapamiento en membranas.2.2.1.- En fibras huecas.2.2.2.- En reactores de membrana.

E EE

E

EE

E

E

E

E

E

EE

E

E EE

E E

E

E

E

E E E

E+ E+

----

E

E

E

Métodos químicos Métodos físicos

Enlace covalenteEntrecruzamientoIntramolecular

EntrecruzamientoIntramolecular

Copolimerización de la enzima modificada con un monómero insaturado en un gel 3D

Atrapamiento en gel polimérico

Adsorción(no covalente) Atrapamiento en

fibras

Microencapsulación

Atrapamiento en láminas de un polímerosemipermeable

Adsorcióniónica

Atrapamiento en liposomas

Atrapamiento en fibras huecas



ELECCIÓN DEL MÉTODO DE INMOVILIZACIÓN:COMPARACIÓN DE LOS MÉTODOS

MÉTODO INCLUSIÓN MEMBRANAS ATRAPAM IENTO RETICULADO ADSORCIÓN UNIÓN

COVALENTE

PREPARACIÓN INTERMEDIA DIFÍCIL INTERMEDIA SENCILLA DIFÍCIL

FUERZA DE LA UNIÓN DÉBIL MEDIA DEBIL-MEDIA MEDIA FUERTE

ACTIVIDADENZIMÁTICA MEDIA-ALTA BAJA BAJA MEDIA-ALTA ALTA

REGENERACIÓNDEL SOPORTE POSIBLE IMPOSIBLE IMPOSIBLE POSIBLE DIFÍCIL

COSTE MEDIO-ALTO MEDIO MEDIO BAJO ALTO

ESTABIL IDAD MEDIA ALTA ALTA BAJA ALTA

VALIDEZ GENERAL GENERAL LIMITADA GENERAL LIMITADA

RESISTENCIA A CONTAMINACIÓN SI SI SI NO NO


REQUISITOS LÓGICOS MÍNIMOSLa enzima o célula debe ser estable en las condiciones experimentales empleadas.Si se emplean agentes entrecruzantes, éstos no deben afectar al centro activo. Si pudieran interferir

con éste, se debe utilizar un agente entrecruzante lo más grande posible.Si es posible, se debería proteger el centro activo:

si existen grupos -SH, éstos deben hacerse reaccionar con cisteína o glutation, para reactivarse posteriormente tras la inmovilización.

se puede realizar la inmovilización en presencia de concentraciones saturantes de sustrato.El proceso de lavado no debe afectar negativamente a la enzima.Coherencia con la posterior biotransformación.

si soporte = polianión, la conversión de un sustrato aniónico será muy difícil (repulsión)enzima atrapada en un gel: si el sustrato presenta un alto peso molecular, el resultado será

malo.Gran importancia de las propiedades mecánicas (estabilidad del soporte, forma física del mismo)El soporte debe presentar una alta superficie específica, para minimizar los problemas de

transferencia de materia.El soporte debe conferir al derivado inmovilizado una buena resistencia a la contaminación

microbiana.El soporte debe permitir que se inmovilice una alta cantidad de biocatalizador (alto "loading").El soporte debe ser comercialmente accesible:

bajo preciobuena disponibilidad

INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS -...

Documents

Transcript of INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS -...