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II CURSO: INMUNIDAD INNATA EN SALUD Y ENFERMEDADES INFECCIOSAS

MODULO PRÁCTICO 1

“ANÁLISIS DE CÉLULAS Y MOLÉCULAS INVOLUCRADAS EN EL PROCESO INFLAMATORIO AGUDO EN EL SITIO

DE LA INFECCIÓN”

PROGRAMA DE ACTIVIDADES

24-28 Septiembre de 2018

ACTIVIDAD

FECHA: Lunes 24 Septiembre

9 – 9:15 Bienvenida e inauguración

9:15 – 10 Introducción. Amibiasis; Moléculas reguladoras del proceso inflamatorio en

amibiasis.

10 – 10:30 Modelo de absceso hepático amibiano en hámster

10:30 –11:30 Observación de trofozoítos amibianos in vitro

11:30 – 14:00 Método de inoculación intra-hepática de trofozoítos de E. histolytica (72 h) en

hámster.

14:00 – 15:00 COMIDA

15:00 – 16:00 Introducción. Técnica histológica

Introducción: Técnica de inmunofluorescencia e inmunohistoquímica

16:00 –17:00 Tinción del AHA con hematoxilina - Eosina

Martes 25 Septiembre

9 – 10 Observar microscópicamente la histología del AHA.

10 – 11:00 Localización de E. histolytica en hígado mediante la técnica de inmunohistoquímica

(Parte I)

Identificación de neutrófilos (CD15+) y macrófagos (CD68+) en el AHA a través de la

técnica de inmunofluorescencia (Parte I)

11:00 –12:00

12:00 – 13:00

13:00 – 14:00

14:00 – 15:00 COMIDA

15:00 – 16:00

Localización de E. histolytica en el AHA mediante la técnica de inmunohistoquímica

(Parte I).

Identificación de neutrófilos (CD15+) y macrófagos (CD68+) en el AHA a través de la

técnica de inmunofluorescencia (Parte I).

16:00 –17:30

Discusión de artículo

Amibiasis aspectos relevantes,

Citocinas en AMIBIASIS (TNF,

IL-8, INF)

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Miércoles 26 Septiembre

9 – 10 Localización de E. histolytica en el AHA mediante la técnica de inmunohistoquímica

(Parte II)

Identificación de neutrófilos (CD15+) y macrófagos (CD68+) en el AHA a través de la

técnica de inmunofluorescencia (Parte II).

10 – 11

11 – 12:00

Discusión de artículo

Caracterización de FAC

12:00 – 13:00 Amibiasis cerebral

13:00 – 14:00 NETs generalidades, NETs y E.

histolytica, AHA,

14:00 – 15:00 COMIDA

15:00 – 16:00 Revisión de laminillas marcadas con inmunohistoquímica e inmunofluorescencia

16:00 – 17:00

Jueves 27 Septiembre

9 – 10

Detección de trampas extracelulares de neutrófilos interactuados con trofozoítos de

E. histolytica

10 – 11

11 – 12:00

12:00 – 13:00

13:00 – 14:00 Análisis de resultados de la interacción de neutrófilos con los trofozoítos de

E. histolytica

14:00 – 15:00 COMIDA

15:00 – 16:00 Análisis de resultados de la interacción de neutrófilos con los trofozoítos de

E. histolytica

16:00 – 17:00 Obtención del AHA

Viernes 28 Septiembre

9 – 12:00 Evaluación del curso.

a) Examen teórico.

b) Reporte de la práctica.

Entrega de constancias.

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MÓDULO PRÁCTICO I

“ANÁLISIS DE CÉLULAS Y MOLÉCULAS INVOLUCRADAS EN EL PROCESO INFLAMATORIO AGUDO EN EL SITIO

DE LA INFECCIÓN IN VITRO”

La amibiasis es una infección intestinal humana que afecta a 50 millones de personas cada año y es

causada por el parásito protozoario Entamoeba histolytica (E. histolytica). Este parásito causa amibiasis

intestinal, la cual cursa con diarrea y ocasionalmente, disentería. También puede migrar a sitios

extraintestinales, como el hígado, los pulmones y el Sistema Nervioso Central, desarrollando un absceso

amebiano. Las estimaciones mundiales indican que aproximadamente 500 millones de personas están

infectados por el parásito de E. histolytica y el 10% de estos individuos sufren de amibiasis invasiva, así mismo

a causa de esta enfermedad, mueren al año 100,000 pacientes debido a complicaciones clínicas.

La inmunidad es el estado de protección contra una enfermedad infecciosa. El primer obstáculo para

un patógeno son las barreras que protegen al hospedero (piel y membranas de la mucosa, acidez del

contenido estomacal, lágrimas, sudor etc.) después de las barreras mecánicas, la inmunidad innata incluye

diversas células, como los neutrófilos y macrófagos que liberan IL-8 e IFN-γ entre otras citocinas, además de

compuestos antimicrobianos sintetizados por el hospedero que son capaces de reconocer y neutralizar a los

patógenos invasores mediante marcadores de superficie comunes. Durante la invasión de E. histolytica las

primeras células de defensa para su control son los neutrófilos y posteriormente los macrófagos. Ambos tipos

celulares son reclutados en la zona de lesión, aunque por lo general son destruidos (neutrófilos) o inactivados

(macrófagos) localmente promoviendo el daño tisular asociado a la formación de abscesos.

En este contexto nosotros estudiamos algunos de los mecanismos moleculares y celulares a través de

los cuales E. histolytica logra evadir la respuesta inmune e invadir órganos extra-intestinales como el hígado.

OBJETIVOS:

Analizar algunos de los mecanismos celulares y moleculares, que participan en el proceso inflamatorio agudo

en el modelo de absceso hepático.

a) Realizar el modelo de absceso hepático amibiano en hámster.

b) Desarrollar la técnica histológica.

c) Analizar la histopatología de las lesiones amebianas.

d) Identificar NETs en contacto con E. histolytica in vitro.

e)

PROTOCOLO EXPERIMENTAL

Se inocularán hámsteres macho con 500,000 trofozoítos de E. histolytica por vía intra-hepática (modelo AHA).

Los animales se sacrificarán a las 72 h post-inoculación.

Se extraerán los hígados; y el absceso amebiano se fijará por inmersión en paraformaldehído al 4%. Los tejidos

se incluirán en parafina y posteriormente se cortarán en micrótomo.

Se caracterizara la lesión amebiana; se identificará a E. histolytica y células de la respuesta inmune innata

(neutrófilos) participantes en el proceso inflamatorio agudo.

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Para cumplir con los objetivos del curso se realizaran las siguientes metodologías:

Modelo de absceso hepático amibiano (72 h) in vivo.

Técnicas de histoquímica para describir el absceso hepático amibiano.

Técnica de inmunohistoquímica para localizar a E. histolytica en las lesiones amibianas.

Técnica de inmunofluorescencia para identificar neutrófilos (CD15+) y macrófagos (CD68+) en el

absceso hepático amibiano.

Interacción in vitro de E. histolytica y neutrófilos, detección de NETs mediante anti-histona,

antimieloperoxidasa, anti (CD15), y antiamiba 140 kDa.

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DOCUMENTO A

OBTENCIÓN DE AMIBAS

MATERIAL

Puntas para micropipetas estériles

Frasco de vidrio con cloro para residuos

biológicos

Frasco de vidrio para material sucio

Tubo de vidrio con rosca de 11 ml

Gradilla

Campana de flujo laminar

REACTIVOS

Cultivo axénico de trofozoítos de Entamoeba histolytica

cepa HM-1:IMSS

Suero Bovino Adulto grado C.T. inactivado por calor a 56 °C

Lab. Microlab

Vitaminas comerciales NCTC-107 grado C.T. Lab. Microlab

Antibiotico 100X (10000 U de Penicilina y 10 mg de

Estreptomicina por cada 100 ml) Lab. Microlab

Medio de cultivo Diamond (*)

Alcohol al 70 %

1. Esterilizar la campana de flujo laminar.

Encender la lámpara de luz UV durante 20 minutos y posteriormente el flujo durante 10 minutos.

2. Limpiar nuestra manos con alcohol al 70 %, e introducir el material y reactivos para trabajar.

3. Tomar el tubo que contienen el cultivo axénico de trofozoítos de Entamoeba histolytica cepa HM-

1:IMSS, agitar suavemente para remover los detritus y enseguida decantar el medio de cultivo, en el

frasco con cloro para residuos biológicos y agregar al tubo 7 ml del medio Diamond.

4. Colocar el tubo con amibas en la centrifuga a 4°C durante 20 minutos. Trascurrido este tiempo, se

activa la centrifuga a 3000 rpm durante 20 minutos a 4 °C.

5. Mientras se centrifugan las amibas preparar los tubos necesarios para la resiembra con medio

Diamond suplementado adicionando los siguientes reactivos:

7 ml de medio Diamond

1000 µl del Suero Bovino Adulto

70 µl de Vitaminas

70 µl de Antibiótico 100X

6. Una vez terminada la centrifugación observar en el fondo de los tubos un sedimento en el fondo del

tubo llamado pellet celular (aquí es donde encuentran las amibas).

7. Inmediatamente dentro de la campana y sin manipular demasiado el tubo de cultivo de amibas, retirar

cuidadosamente el medio de cultivo con ayuda de una pipeta Pasteur (desechar en el frasco con cloro

6

para residuos biológicos) y resuspender el pellet amibiano en un volumen conocido de medio Diamond

y mantenerlo a 4°C.

8. Contar las amibas.

En un tubo ependorff colocar:

10 µl del resuspendido amibiano

10 µl del azul trypan 2x

Mezclar suavemente y colocar 10 μl en una cámara de Neubauer y contar las amibas en los 4

cuadrantes de las esquinas.

Cels/µl = (No. de células en los cuatro cuadrantes/4)(10)(2)

9. Colocar 5 x 105 - 1 x 106 trofozoítos de Entamoeba histolytica cepa HM-1:IMSS en 100 µl de medio

Diamond en una jeringa para insulina y mantenerla a 4°C hasta su uso.

Cuadrante

1

Cuadrante

3

Cuadrante

2

Cuadrante

4

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DOCUMENTO B

METODO DE INOCULACIÓN INTRAHEPÁTICA DE TROFOZOÍTOS DE Entamoeba histolytica EN HÁMSTER

1. Tener preparada una jeringa para insulina con 5 x 105 - 1 x 106 trofozoítos de Entamoeba histolytica

cepa HM-1:IMSS en 100 µl de medio Diamond a 4°C.

2. Preparar el material de cirugía.

Una lámpara de escritorio, mesa de cirugía para roedores, campos estériles, y el material de disección

a utilizar sumergido en isodine.

3. Anestesiar los animales con pentobarbital via intra-peritoneal.

µl de pentobarbital utilizados/animal = (15 µl pentobarbital 1:10) (peso del animal en gramos)

4. Colocar los animales anestesiados en la mesa para cirugía, atar sus extremidades con hilos y rasurar el

abdomen.

8

5. Realizar asepsia de la cavidad abdominal con isodine.

6. Colocar el campo estéril dejando la cavidad abdominal descubierta.

7. Realizar en la línea media del abdomen, una incisión en la piel de aproximadamente 2 cm con el bisturí,

bajo el apéndice xifoides.

8. Cortar el músculo con las tijeras, del mismo tamaño aproximadamente que la piel.

9. Exponer perfectamente el hígado e inocular las amibas en el lóbulo derecho, a través de la punción

(introducir la ahuja con el bicel hacia arriba y notar que conforme se realiza la inoculación se va

formando un área circular de color blanco en el hígado.

10. Proceder a suturar la incisión, tomando en cuenta el músculo y la piel.

11. Dejar en recuperación al animal por 3 días.

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DOCUMENTO C

OBTENCIÓN Y FIJACIÓN POR INMERSIÓN DEL TEJIDO

1. Anestesiar los animales con una sobredosis (del 50%) de pentobarbital 1:10.

2. Colocar los animales anestesiados sobre una mesa de cirugía, sujetando las extremidades con hilo.

3. Realizar una incisión bilateral en el abdomen, con la tijera, bajo el apéndice xifoides y una pinza de

disección sin dientes, sujetar la porción del diafragma que sujeta al hígado y cortarlo, para extraer el hígado

completamente.

4. Lavar el tejido con solución salina y cortar el tejido de interés con una navaja.

5. Sumergir en paraformaldehído al 4% en buffer salino de fosfatos (PBS) durante 24 horas a temperatura

ambiente, posteriormente mantener los tejidos en PBS 1X, hasta que se realice la técnica histológica.

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DOCUMENTO D

TÉCNICA HISTOLÓGICA

6. Realizar la técnica histológica en el HISTOQUINET (THERMO SCIENTIFIC).

7. Oprimir la tecla ↑↓ para subir y bajar la porta-cesta del histoquinet.

8. Verificar la posición de la porta-cesta, en el vaso 1.

Si está en el último vaso de parafina oprimir la tecla ← para cambiar de lugar el porta-cesta al vaso 1 que

contiene agua destilada.

9. Colocar la canastilla con las cápsulas que contienen los tejidos previamente fijados (documento C) y las

etiquetas correspondientes escritas con lápiz.

10. Volver a oprimir la tecla ↑↓ para bajar la porta-cesta.

11. Elegir el programa (ver página 12) que se quiere llevar a cabo y oprimir la tecla START para comenzar el

proceso.

12. Luego oprimir la tecla TIMER para programar el tiempo del FIN DEL PROGRAMA, con las teclas UP y

DOWN para incrementar o disminuir el valor visualizado y con la tecla ENTER validar la opción o ajustes

establecidos.

13. Al finalizar la programación del tiempo de FIN DE PROGRAMA oprimir la tecla START, para que inicie el

procesamiento de la muestra.

14. Cuando termina el programa suena la alarma para sacar los tejidos ya procesados.

15. Oprimir la tecla STOP y luego ↑↓ para subir la porta-cesta y sacar la canastilla con las cápsulas.

16. Retirar los tejidos procesados y llevarlos a la placa caliente de la Módulo de Inclusión para proceder a

incluirlos en bloques de parafina.

El histoquinet se encarga de deshidratar, aclarar e infiltrar parafina a los tejidos mediante el uso de 12

soluciones localizadas en los contenedores.

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PROGRAMA DEL HISTOQUINET UTILIZADO

Vaso N° Reactivo Tiempo de Inmersión (hrs)

1 Agua Destilada 1:00

2 Alcohol 70% 1:00

3 Alcohol 80% 1:00

4 Alcohol 96% 1:00

5 Alcohol 96% 1:00

6 Alcohol 100% 1:00

7 Alcohol 100% 1:00

8 Alcohol 100%-Xilol 1:00

9 Xilol 1:00

10 Xilol 1:00

11 Parafina 1:00

12 Parafina 1:00

17. Encender la Módulo de Inclusión en la parte posterior, luego oprimir el botón de Manual Mode (ON/OFF).

Verificar que el foco en verde esté encendido en la placa fría (COOL) y caliente (HEAT)

18. Verificar que el contenedor contenga parafina a una temperatura de 63°C para poder usarla.

19. Tomar el tejido de la placa caliente (paso 16) con una pinza y colocarlo en una base metálica de acuerdo

al corte anatómico de intereses (sagital, transversal, coronal), posteriormente a los costados del tejido y de

acuerdo al tamaño del tejido colocar 2 escuadras metálicas.

20. Vaciar la parafina caliente sobre el tejido y finalmente colocar una base de la cápsula de plástico sobre las

escuadras.

21. Pasar la base metálica a la placa fría para que solidifique la parafina y esperar a que el bloque se enfríe

para retirar las escuadras y la base metálica.

22. Sobre un pedazo de papel, anotar con lápiz la identificación del tejido y pegar al bloque.

23. Guardarlo a temperatura ambiente hasta su uso.

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DOCUMENTO E

CORTES HISTOLÓGICOS EN MICROTOMO

1. Colocar el bloque de parafina (documento D; paso 23) en el microtomo, aparato con el que se puede

controlar el ángulo y grosor del corte.

2. Rebanar el exceso de parafina para descubrir el tejido en el bloque.

3. Una vez que el tejido es visible, proceder a hacer cortes, comúnmente a 5 µm.

4. Los cortes salen como pequeñas rebanadas, pegadas en sus bordes lo que constituye una película de

parafina. Hasta 5-8 cortes consecutivos son adecuados, es importante que los cortes no se doble sobre sí o se

arruguen. Para evitar esto se recomienda transportar la película de parafina sobre un portaobjetos y colocar

entre ellos alcohol al 70%.

5. Enseguida la película de parafina-tejido extendida sobre el portaobjeto es transferida a un baño maría a

42°C en donde se deja sobre la superficie del agua para la parafina se expanda.

6. Con ayuda de un portaobjetos se “pesca” las rebanadas, y se elimina el exceso de agua.

Para verificar que el corte es correcto, realizar una prueba rápida. Colocando el portaobjetos con el tejido,

sobre una superficie caliente para que se evapore el agua y el tejido se pegue al portaobjetos por acción de

calor.

Revisar al microscopio óptico que el corte del tejido obtenido tenga todas sus capas histológicas, si es así, se

procede a realizar los cortes definitivos que se colocaran sobre portaobjetos esmerilados tratados con 3-

aminopropyl-triethoxysilane al 2% en acetona y de forma seriada (marcar los porta-objetos con el nombre del

experimento y numero de corte que corresponda).

7. Posteriormente los portaobjetos se transfieren a una estufa a 60°C para desparafinizar durante 6 horas. El

objetivo de desparafinizar es para que el tejido quede bien fijado al portaobjetos y quitar el exceso de

parafina, para poder proceder a hidratar y teñir el tejido.

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DOCUMENTO F

TINCIÓN CON HEMATOXILINA- EOSINA

Desparafinizar e hidratar los cortes

Xilol (2 veces/10 min)

Alcohol 100% (2 veces/10 min)

Alcohol 96% (2 vez/10 min)

Alcohol 80° (1 vez/5 min)

Agua destilada (1 vez/10 min)

Tinción de hematoxilina - Eosina

1. Sumergir las laminillas en Hematoxilina (1 vez/1-3 min)

2. Lavar las laminillas con agua corriente (1 vez/15 min).

3. Lavar las laminillas con agua destilada (2 veces/10 min).

4. Teñir las laminillas con Eosina (1 vez/30 segundos).

Deshidratar los cortes

Alcohol 80% (1 vez/5 min).

Alcohol 96% (1 vez/5 min)

Alcohol 100% (2 veces/5 min)

Xilol (2 veces/10 min)

Montaje de la preparación histológica

Cubrir el tejido con Entellan (1.07961.0500; Merck) evitando dejar burbujas.

Dejar secar las laminillas durante 24 h a temperatura ambiente.

Almacenar las laminillas a temperatura ambiente.

Revisar los cortes con microscopía de luz visible antes de iniciar cualquier técnica.

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DOCUMENTO G

TÉCNICA DE INMUNOHISTOQUIMICA E INMUNOFLUORESCENCIA EN CORTES INCLUÍDOS EN PARAFINA

1. Preparación de cortes histológicos

Utilizar cortes histológicos de 5 µm de grosor sobre laminillas recubiertas con 3-Aminopropyl

triethoxysilane al 2%.

2. Desparafinización

Las laminillas con los cortes histológicos se incuban a 56°C durante 7 hrs, posteriormente se procede a

la desparafinización de la manera siguiente:

Xileno (2 veces/7 min.)

Etanol 100% (2 veces /7 min.)

Etanol 96% (1 vez /15 min.)

Etanol 70% (1 vez /5 min.)

Enjuagar con agua corriente durante 5 min

3. Desenmascaramiento de epítopos

Colocar dentro de la olla 1.5 lt de buffer de citrato de sodio 1X y encender la olla. Dejar que la presión

de la olla suba a lo máximo, en seguida apagar la olla y permitir que se enfríe para poder abrir la tapa.

Posteriormente introducir las laminillas (en un porta-laminillas de metal) dentro de la olla, procurar

que queden completamente cubiertas por el buffer. Nuevamente se enciende la olla y una vez que

salga el vapor por la válvula se deja 2 minutos, después apagar y reposar las laminillas dentro del buffer

por 15 minutos.

A continuación se pasan las laminillas a PBS 1X.

4. Lavar las laminillas con PBS (3 veces/5 min).

A partir de este paso se selecciona una laminilla para la técnica de inmunohistoquímica y dos

laminillas para la técnica de inmunofluorescencia.

Una vez seleccionadas las laminillas se continúa con su respectivo procedimiento

INMUNOHISTOQUÍMICA INMUNOFLUORESCENCIA

Inactivar las peroxidasas endógenas

Colocar las laminillas en una solución de

metanol-H2O2 10% a temperatura ambiente

15

durante 30 minutos.

Lavar las laminillas con PBS (3 veces/5 min)

Permeabilizar la membrana celular

Lavar las laminillas con PBS–Tritón X-100 0.2% durante 30 min.

Lavar las laminillas con PBS 1X (1 vez/5 min).

Delimitar el tejido de interés con el PAP pen (Z377821-1EA; Sigma)

Bloquear las uniones inespecíficas

Colocar sobre el tejido 50 µl de Suero Fetal de Bovino al 20% en PBS–Tritón X-100 0.2%

durante 1 hora en cámara húmeda

INMUNOHISTOQUÍMICA INMUNOFLUORESCENCIA

Incubar con el primer anticuerpo

Anti-Lectina 140 kDa (ratón 1:200) Anti-CD68 (ratón 1:200)

Anti – CD15 (conejo-monoclonal 1:100)

Diluir los anticuerpos primarios en PBS–Tritón X-100 0.2%-albumina sérica bovina

3%.

Colocar sobre el tejido 50 µl del anticuerpo primario diluído.

Incubar durante toda la noche en cámara húmeda a 4°C.

Lavar las laminillas con PBS–Tritón X-100 0.2% (3 veces/5 min) y posteriormente con

PBS 1X durante 5 min.

Incubar con el segundo anticuerpo

Anti-ratón IgG-HRP (1:200)

Chivo-ratón IgG (H+L) (Alexa fluor 594

(rojo fluorescente; A11005; Invitrogen) 1:500 en PBS-Suero Fetal Bovino 1 %

Chivo-conejo IgG (H+L) Alexa fluor 488

(verde fluorescente; A11008; invitrogen) ) 1:500 en PBS-Suero Fetal Bovino 1 %

Colocar sobre el tejido 50 µl del anticuerpo

secundario diluido

Incubar durante 1 h en cámara húmeda a temperatura ambiente.

Lavar con PBS 1X (3 veces/5 min)

Revelar con 3 3’diaminobenzidina (DAB)

Preparar en un tubo Eppendorf:

16

1 mg de DAB (D-8001; Sigma)

1 ml PBS

5µl H2O2

Colocar sobre el tejido 50 µl de DAB diluida

durante 5 minutos.

Lavar con PBS (3 veces/5 min)

Los restos de solución de DAB inactivarlos

con cloro. LA DAB ES CANCERÍGENA FAVOR

DE USAR GUANTES

Teñir núcleos.

Colocar al tejido 100 µl de hematoxilina

diluida 1:1 durante 1 minuto

Teñir núcleos.

Colocar al tejido 50 µl de Hoechst 1X e

incubar en oscuridad durante 10 minutos.

Lavar con PBS (3 veces/5 min)

Deshidratar el tejido

Etanol 100% (1 vez/10 min)

Xileno (2 veces/15 min)

Montar la INMUNOHISTOQUÍMICA

Cubrir el tejido con Entellan (1.07961.0500;

Merck)evitando dejar burbujas

Dejar las laminillas secar durante 24 hrs a

temperatura ambiente.

Montar la INMUNOFLUORESCENCIA

Cubrir el tejido con 100 µl de Glicergel

(C0563; Dako) procurando no dejar

burbujas

Dejar las laminillas secar durante 24 hrs a

4°C

Rotular las laminillas con los siguientes datos:

Nombre del paciente

Tipo de tejido

Nombre del anticuerpo primario y dilución

Almacenar las laminillas a temperatura

ambiente.

Almacenar las laminillas en oscuridad a 4°C

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Análisis de imagen

Observar los tejidos marcados con inmunohistoquímica usando un microscopio de luz visible y los tejidos

marcados con inmunofluorescencia con un microscopio Axio Visión Release 4.6.3 SP1 usando los filtros

específicos para la absorción de luz UV.

Capturar las imágenes con el programa Image – Pro Plus procurando no saturar de luz las imágenes y editar

con Adobe Photoshop CS2.

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DOCUMENTO H

DETECCIÓN DE TRAMPAS EXTRACELULARES DE NEUTRÓFILOS INTERACCIONADOS CON

TROFOZOÍTOS DE E. histolytica. 1. Aislamiento de neutrófilos

Tomar sangre periférica de donantes sanos y depositar la sangre en tubos heparinizados

Colocar la sangre en un tubo con Histopaque-Gradiente 1119 (Sigma-Aldrich).

Centrifugar a 700 g durante 45 minutos

Recolectar el anillo de células, depositarlas en un tubo limpio y adicionar buffer de lisis para eliminar los

eritrocitos de la muestra.

Diluir los neutrófilos en medio RPMI-1640 suplementado con 10% suero fetal bovino (FCS) y L-cisteína 5.7

mM.

2. Interacción de neutrófilos humanos con E. histolytica.

Incubar trofozoítos y neutrófilos de E. histolytica en RPMI-1640 (proporción neutrófilos/trofozoítos 6:1)

suplementado con 10% de FCS y L-cisteína 5.7 mM durante 30 min. E incubar a 37 ºC.

Adicionar 200 µl de paraformaldehído al 4% para fijar las células en la placa de cultivo durante 30 min.

Realizar lavados con PBS-1X (3 veces/5 min).

Permeabilizar la membrana con PBS–Tritón X-100 0.2% durante 30 min

Realizar lavados con PBS-1X (3 veces/5 min).

Incubar las células con el anticuerpo primario diluido en PBS–Tritón X-100 0.2%-albumina sérica

bovina3%.

Anticuerpo primario

E. histolytica Neutrófilos

Anti-Lectina 140 kDa hecho en ratón

1:200

Anti-CD15 (conejo 1.200) o MPO

Anti-histona H2A (Conejo; 1:100)

Incubar durante 30 minutos a 37 ºC y 30 minutos a temperatura ambiente

Realizar lavados con PBS-1X (3 veces/5 min).

19

Anticuerpo Secundario

E. histolytica Neutrófilos

Chivo-ratón IgG (H+L) (Alexa fluor 594

(rojo fluorescente; A11005; Invitrogen) 1:500 en PBS-Suero Fetal Bovino 1 %

Chivo-ratón IgG (H+L) (Alexa fluor 594

(rojo fluorescente; A11005; Invitrogen) 1:500 en PBS-Suero Fetal Bovino 1 %

Chivo-conejo IgG (H+L) Alexa fluor 488

(verde fluorescente; A11008; invitrogen) ) 1:500 en PBS-Suero Fetal Bovino 1 %

Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente

Realizar lavados con PBS-1X (3 veces/5 min).

Teñir núcleos.

Colocar al tejido 200 µl de Hoechst 1X e incubar en oscuridad durante 10 minutos

Realizar lavados con PBS-1X (3 veces/5 min).

Cubrir las células con Glycergel (Dako)

20

ANTICUERPOS UTILIZADOS EN LA DETECCIÓN DE ANTÍGENOS

Anticuerpos

Primarios Huésped Clona

Isotipo

Dilución Catálogo

Casa

comerc

ial

Anti-Mieloperoxidasa Ratón 2C7 IgG1 1/200 ab25989 Abcam

CD15 Conejo FUT4/

1478R

IgG 0.5-1.0ug/ml

FUT4/147

8R

Novus

Anti-histona Conejo IgG

1:500 ab12478

1

Abcam

Anti-CD68 Ratón IgG1 1/200

Antiamiba policlonal o

el anti 140 de raton

Anticuerpo

secundarios

Huésped Isotipo Fluorocromo

Excitación/Emisión

(nm)

Dilución Catálogo Casa

comercial

Alexa Flúor

594 Anti-

ratón

Goat IgG

(H+L)

Rojo fluorescente

590⁄617

1/500 A-11005 Invitrogen

Alexa Flúor

488 Anti-

conejo

Goat IgG

(H+L)

Verde fluorescente

488⁄519

1/500 A-11008 invitrogen

21

APENDICE

METODO PARA RECUBRIR LAMINILLAS CON (3-AMINOPROPYL) TRIETHOXYSILANE)

1. Usar laminillas nuevas, en caso de que sea necesario limpiarlas con una gasa impregnada de alcohol al

96% (preparar suficientes laminillas para que el proceso sea costeable)

2. Colocar las laminillas limpias en un porta-laminillas (preferentemente de metal).

3. Preparar una solución de silane al 2% en acetona.

(3-Aminopropyl)triethoxysilane (Silane; A3648, Sigma) 2 ml.

Acetona 98 ml.

4. Depositar la solución de silane al 2% en acetona en un recipiente adecuado para que quepa el porta-

laminillas.

5. Sumergir el porta-laminillas en la solución de silane al 2% durante 5 minutos a temperatura ambiente,

cuidando que todas las laminillas se encuentren completamente sumergidas dentro de la solución.

6. A continuación el porta-laminillas se retira y se procede a lavar las laminillas. Para realizar el lavado, el

porta-laminillas se coloca dentro de un recipiente que contiene suficiente agua destilada durante dos

minutos, en seguida se retira el agua destilada y nuevamente se llena el recipiente de agua destilada

para lavar nuevamente las laminillas durante 2 minutos.

7. A continuación el porta-laminillas se retira del agua (quitar el exceso de agua con una sanita y cuidar

que las laminillas no queden pegadas) y se coloca en la estufa a 50°C durante 12 horas para que las

laminillas se sequen.

8. Finalmente las laminillas se retiran del porta-laminillas y se guardan en sus respectivas cajas

(previamente rotuladas) a temperatura ambiente.

BUFFER DE CITRATOS 10X

Acido cítrico monohidratado 0.1 M (24752-9; Aldrich) 1.9gr/90 ml de agua

Citrato de sodio tribásico dihidratado 0.1 M (364601;

Baker)

12.05 gr/410 ml

agua

Disolver por separado cada solución y entonces agregar el ácido cítrico al citrato de sodio hasta ajustar el

pH = 6. Almacenar la solución en una botella oscura. No usar después de un mes de preparada. Ajustar el

pH con acido cítrico 1% (0.4 gr/40 ml) o NaOH 10 M

BUFFER DE CITRATOS 1X

100 ml de buffer de citratos 10X

900 ml de agua

pH = 6

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BUFFER DE FOSFATOS SALINO (PBS) 10X

KH2PO4 0.02M 2.72 gr

Na2HPO4 0.08 M 11.3 gr

NaCl 1.5M 90 gr

Agua destilada 1 lt

Ajustar el pH = 7.2 y almacenar a temperatura ambiente.

BUFFER DE FOSFATOS SALINO (PBS) 1X (solución de trabajo)

PBS 10X 100 ml

Agua destilada 900 ml

Almacenar a temperatura ambiente.

PBS + TRITON X-100 AL 0.2%

Triton X-100 (028K0011, Sigma) 100 µl

PBS 1X 50 ml

SUERO FETAL DE BOVINO (SFA; SU420; LUMO).

Descongelar el suero stock a 4°C y descomplementarlo a 56°C durante 30 min.

Hacer alícuotas de 1ml/tubo eppendorf y almacenarlas a -20°C hasta su uso. Una vez que se descongele la

alícuota guardarla a 4°C.

HOECHST 33258 1000X

Hoechst 33258 (33258; Invitrogen) 5 mg

PBS 1X 1 ml

HOECHST 33258 (5µg/ml) 1X (solución de trabajo)

Hoechst 33258 100X 1 µl

PBS 1X 1 ml

PARAFORMALDEHÍDO AL 4%.

Para 100 ml de solución:

Pesar 4 gr de paraformaldehído y disolverlos en 60 ml de PBS 1X a temperatura de 60 °C hasta

que el fijador se disuelva y aquiera un aspecto turbio.

Agregar lentejas de NaOH para terminar de disolver el fijador, dejar enfriar y ajustar el pH = 7.4

Aforar a 100 ml con PBS 1X

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ALCOHOL ACIDO

1 ml Ácido clorhidrico

100 ml Etanol 70%

AGUA ACIDIFICADA

1 ml Ácido acético glacial

200 ml Agua destilada

AGUA AMONIACAL

25 gotas Hidróxido de amonio

concentrado

500 ml Agua destilada

BIBLIOGRAFIA GENERAL

1. Ventura-Juarez J, Campos-Esparza M, Pacheco-Yepez J, López-Blanco JA, Adabache-Ortíz A, Silva-Briano M, Campos-Rodríguez R. (2016). Entamoeba histolytica induces human neutrophils to form NETs. Parasite Immunol. 38(8):503-9. doi: 10.1111/pim.12332. Epub 2016 Jun 14. 2. Maldonado-Barrera CA, Campos-Esparza Mdel R, Muñoz-Fernández L, Victoria-Hernández JA, Campos-Rodríguez R, Talamás-Rohana P, Ventura-Juárez J. (2012) Clinical case of cerebral amebiasis caused by E. histolytica. Parasitol Res. 110(3):1291-6. doi: 10.1007/s00436-011-2617-8. 3. Sierra-Puente RE, Campos-Rodríguez R, Jarillo-Luna RA, Muñoz-Fernández L, Rodríguez MG, Muñoz-Ortega MH, Ventura-Juárez J. (2009) Expression of immune modulator cytokines in human fulminant amoebic colitis. Parasite Immunol. 31(7):384-91. doi: 10.1111/j.1365-3024.2009.01118.x. 4. Ventura-Juárez J, Barba-Gallardo LF, Muñoz-Fernández L, Martínez-Medina L, Márquez-Díaz F, Sosa-Díaz SJ, Gerardo-Rodríguez M, González-Romo R, Campos-Rodríguez R. (2007) Immunohistochemical characterization of human fulminant amoebic colitis. Parasite Immunol. 29(4):201-9. 5. Ventura-Juárez J, Jarillo-Luna RA, Fuentes-Aguilar E, Pineda-Vázquez A, Muñoz-Fernández L, Madrid-Reyes JI, Campos-Rodríguez R. (2003) Human amoebic hepatic abscess: in situ interactions between trophozoites, macrophages, neutrophils and T cells. Parasite Immunol. 25(10):503-11.