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Universidad Autónoma de Sinaloa Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia

Módulo de Producción de Leche

Identificación de agentes patógenos que producen mastitis subclínica y

resistencia a antimicrobianos.

Autores:

Gamboa González Mauricio Alfonso

González Navarrete Cecilia de Jesús

Millán Sarabia Martha Daniela

Vivanco Osuna Verónica Berenice

Asesores:

MVZ EPAB. Carlos Osuna Ezquer

Dr. Miguel Alberto Luque Agundez

Culiacán Sinaloa, 09 de Diciembre de 2011

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Agradecimientos

Al MC Martin López Valenzuela, por el apoyo para la realización de este trabajo,

por su tiempo y esfuerzo.

A la QFB Beatriz y a la MVZ Fabiola por su apoyo y tiempo y por compartir sus

conocimientos.

A nuestros compañeros: Daniela Itzel Franco Salinas, Luis Miguel González

Luquín y Francisco Javier Mendivil García, por su apoyo incondicional y sobre todo

por su colaboración para la toma de muestras.

A los médicos responsables de cada uno de los establos lecheros, por sus

atenciones, ayuda y el permiso para realizar la investigación en sus respectivos

lugares de trabajo.

A nuestros docentes por su apoyo y por sus concejos para hacernos más fácil la

investigación.

A nuestros padres, por el apoyo, tanto moral como económico, por alentarnos

cuando nos sentíamos cansados.

Gracias a todos ellos, ya que sin su apoyo y colaboración no hubiese sido posible

realizar esta investigación.

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Índice

I. Introducción…………………………………………………………….…..4

II. Antecedentes………………………………………………………….…..5

III. Objetivo………………………………………………………….……….10

IV. Materiales y métodos……….………………..…..…..….….....………11

V. Resultados y discusión…………………………………………….……12

VI. Conclusiones…………………………………………………………….15

VII. Bibliografía………………………………………………….…………..16

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Introducción

La mastitis es una inflamación de la glándula mamaria y sus tejidos secretores, que

reduce la producción del volumen de leche, alterando su composición, incluso su sabor,

además de elevar su carga bacteriana normal es un problema poblacional multifactorial

imposible de erradicar; por consiguiente, su control depende de la aplicación de un

sistema integral de medidas cuyos objetivos son: reducir la tasa de nuevas infecciones y

reducir el tiempo de infección de cada caso de mastitis. En general, las mastitis causan

entre un 40 a 50% de disminución en los márgenes económicos netos por vaca, con la

mayor parte de estas pérdidas debidas entre 5 a 7% por disminución en la cantidad de

leche por lactancia. Las estimaciones de las pérdidas causadas por un menor rendimiento

fluctúan entre 100 a 500 kg/vaca por lactancia. Cuando las mastitis clínicas ocurren, los

gastos adicionales se presentan por: eliminación de leche anormal, las compras de

medicinas y los honorarios por la atención veterinaria. Cada caso de mastitis clínica ha

sido estimado como produciendo gastos comprendidos entre 100 a 200 USD por vaca en

una lactancia. El objetivo del presente trabajo fue identificar los agentes patógenos que

producen mastitis subclínica en diferentes establos lecheros de Culiacán, Sinaloa, México,

determinar su prevalencia y su resistencia a antimicrobianos.

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Antecedentes

Es una requisitoria de las poblaciones de distintos países, que los alimentos, incluidos la

leche y los productos lácteos, sean seguros para la salud, nutritivos y de sabor fresco y

agradable. Por este motivo, los programas preventivos de mastitis y de calidad de leche

que se llevan a cabo en las lecherías deben tener como objetivo la producción de leche

de óptima calidad en su composición, provenir de vacas sanas y bien alimentadas, con la

máxima calidad higiénica posible, y sin la presencia de sustancias adulterantes de ningún

tipo. La calidad de leche que llega a la planta de industrialización no puede ser mejorada

en la misma, aun considerando el proceso de pasteurización, por lo tanto, es

determinante para el futuro proceso de la leche en la industria, la calidad con la que se

produce en las lecherías (Chaves, 2010).

La mastitis es una inflamación de la glándula mamaria y sus tejidos secretores, que

reduce la producción del volumen de leche, alterando su composición, incluso su sabor,

además de elevar su carga bacteriana normal (Gasque, 2008).

Se caracteriza por la entrada de células somáticas, principalmente neutrófilos

polimorfonucleares (PMN), en la glándula mamaria y por un aumento en el contenido de

proteasa en la leche (Kerr y Wellnitz, 2003). (Métodos de detección)**

La mastitis bovina continua siendo una de las enfermedades que causa mayor impacto

económico en las ganaderías orientadas a la producción de leche por ser una de las

enfermedades más significativas desde el punto de vista de la producción de leche y

salud pública (Rodríguez, 2006).

La mastitis es un problema poblacional multifactorial imposible de erradicar; por

consiguiente, su control depende de la aplicación de un sistema integral de medidas

cuyos objetivos son: reducir la tasa de nuevas infecciones y reducir el tiempo de infección

de cada caso de mastitis (Andresen, 2001).

En general, las mastitis causan entre un 40 a 50% de disminución en los márgenes

económicos netos por vaca, con la mayor parte de estas pérdidas debidas entre 5 a 7%

por disminución en la cantidad de leche por lactancia. Las estimaciones de las pérdidas

causadas por un menor rendimiento fluctúan entre 100 a 500 kg/vaca por lactancia.

Cuando las mastitis clínicas ocurren, los gastos adicionales se presentan por: eliminación

de leche anormal, las compras de medicinas y los honorarios por la atención veterinaria.

Cada caso de mastitis clínica ha sido estimado como produciendo gastos comprendidos

entre 100 a 200 USD por vaca en una lactancia (Concha, 2008).

La Mastitis bovina es un complejo singular de enfermedades, que causa una gran

cantidad de perdidas a nivel mundial y en especial en las regiones con una producción

lechera intensiva. La causa más común para un sacrificio temprano de las vacas lecheras

son los problemas de salud de la glándula mamaria, además de problemas de Fertilidad.

El 26.5% de las vacas lecheras sacrificadas en el continente americano es debido a

trastornos ocasionados por la mastitis (Wolter y col., 2000).

La mastitis bovina es muy persistente en el ganado lechero (Wellenberg y col., 2002),

usualmente es tratada o prevenida con antibióticos intramamarios; representando una

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carga económica muy alta a los productores de leche en todo el mundo. Las pérdidas

mundiales, anuales debido a la mastitis, se han estimado en 35 billones de dólares

americanos (Wellenberg y col., 2002; O´Flaherty y col., 2005). Revision bibliografica***

Esta enfermedad, económicamente, es la más importante en la industria lechera de los

Estados Unidos, ya que afecta a la mitad de las vacas infectadas con algún tipo de

mastitis. Se considera que esta enfermedad representa el 70% de los gastos totales para

los ganaderos lecheros, resultando en una pérdida de billones de dólares cada año

(Bradley y Green, 2001; dos Santos et al., 2002).***

La constitución anatómica de la ubre, la expone constantemente a lesiones y agentes

patológicos de diversos orígenes (Báez, 2002). El propósito de la respuesta inflamatoria

es destruir o neutralizar al agente causal y preparar la forma de sanar y retornar a su

función normal (Philpot y Nickerson, 2000; Báez, 2002).*** La Federación Internacional de

Lechería (1999), define a la mastitis bovina como una enfermedad inflamatoria de la

glándula mamaria, que tiene por objetivo la eliminación del agente patógeno y la

restauración de la funcionalidad del órgano.

Todos los métodos comerciales para producir leche tienden a proveer condiciones

favorables para la diseminación de microorganismos contagiosos de vaca a vaca en el

momento del ordeño; y la diseminación de organismos ambientales durante el intervalo

entre ordeños. La mayoría de los factores involucrados en la diseminación de

microorganismos causantes de mastitis están bajo el control directo de los dueños del

hato y sus empleados (Philpot, 2001).

Los patógenos contagiosos viven y se multiplican en la glándula mamaria y la piel del

pezón, se transmiten de animal a animal principalmente durante el ordeño e incluyen a

Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Corynebacterium bovis y a especies de

Mycoplasma. Los patógenos ambientales son aquellos cuyo reservorio primario es el

lugar donde viven las vacas. Estos organismos constituyen un grupo heterogéneo de

géneros y especies bacterianas, siendo los más frecuentemente aislados los

estreptococos y las bacterias coliformes. Los estreptococos ambientales (EA) causantes

de mastitis bovina incluyen Streptococcus uberis, Streptococcus dysgalactiae,

Streptococcus equinus (anteriormente caracterizado como Streptococcus bovis),

Streptococcus equi, Streptococcus parauberis y Streptococcus canis. Dentro de estos, S.

uberis y S. dysgalactiae son los más prevalentes, causando infección intramamaria (IIM)

cuando se dan condiciones favorables. Streptococcus dysgalactiae puede comportarse

tanto como un patógeno ambiental como contagioso (Rodríguez,. 2000).

Se han identificado más de 130 especies, subespecies y serovares de bacterias

causantes de la enfermedad; sin embargo, más del 75% de los casos se deben a

microorganismos GRAM Positivos, particularmente especies de los géneros

Staphylococcus y Streptococcus. La enfermedad tiene dos formas básicas de

presentación: clínica y subclínica que, por lo general, no son más que fases del proceso

inflamatorio. En la forma clínica se presentan evidentes signos de inflamación como

tumefacción, rubor, dolor, cambios notables en la secreción y eventualmente, signos

sistémicos como fiebre, pérdida del apetito y depresión. La forma subclínica se caracteriza

por la existencia de inflamación sin los signos macroscópicos que permiten reconocerla,

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por lo que generalmente pasa desapercibida, a pesar de ser 20 a 50 veces más frecuente

que la forma clínica (Scaramelli, 2003).

Osteras et al. (2006), afirman que la distribución de los patógenos que producen mastitis

pueden ser diferentes entre los dos tipos arriba descritos, puesto que en los casos clínicos

la etiología puede ser por bacterias que están presentes solamente por un corto periodo

de tiempo, naturalmente desencadenando claros signos clínicos, ej. Eschericha coli. Por

el contrario, las mastitis subclínicas pueden ser causadas por patógenos que pueden

estar presentes por largos periodos de tiempo y solamente produciendo leves signos en la

ubre, ej. Staphylococcus aureus. Pero considerando básicamente la etiología, las mastitis

contagiosas son producidas por microorganismos cuyo habitat principal es el canal del

pezón o la piel externa del mismo, de forma que los contagios se producen

fundamentalmente durante el ordeño, así en este caso destacando bacterias como

Staphylococus aureus , Streptococcus agalactiae.

Numerosos estudios a nivel mundial colocan a Staphylococcus aureus como el principal

agente causal de mastitis bovina, por ejemplo en chile fue el agente bacteriano aislado

con mayor frecuencia (Montes y col., 1989; Reyes y col., 2002). En colombia se determino

al mismo agente como el principal agente involucrado en este problema con una

prevalencia del 37.45% (Londoño, 2006). En México se ha encontro como principal

causante al mismo agente con un 78.57% en un estudio realizado por Luque y Gaxiola

(1993), mientras que en 2006 un estudia realizado por Bedolla y col (2006) se encontró

una prevalencia del 73%. En 2010 un estudio realizado por Olivas en diferentes establos

lechero del municipio de Culiacan, se determino una prevalencia del 33.33% para

Staphylococcus aureus, un 24.07% para Candida albicans, un 22.22% para Streptococcus

spp, un 12.96% para Staphylococcus spp., y un 1.85% para Corynebacterium spp.,

Klebsiella spp., Escherichia coli y Pseuomona aeruginosa.

Staphylococcus aureus constituye la principal causa de mastitis infecciosa en vacas,

borregas y cabras, causando fuertes perdidas económicas a nivel mundial. Las

infecciones tienen a ser subclinicas y crónicas con episodios periódicos de mastitis clínica,

pudiendo causar también mastitis gangrenosa (Philpot y Nikerson, 1993).

Se utiliza una gran variedad de pruebas que ayudan al diagnostico de la mastitis

subclínica mismas que han quedado restringidas casi enteramente a la determinación de

la cantidad de DNA, y por lo tanto del número aproximado de leucocitos en la muestra

(Blanco, 2001).

Prueba de California para mastitis.

La prueba de California para mastitis es la utilizada con más frecuencia habiendo probado

su eficacia sobre todo en manos de operadores hábiles. Refleja la cantidad de células

somáticas (leucocitos y células epiteliales) de la leche. La combinación del DNA nuclear

de las células en la leche con un detergente (Alquil-Aril-Sulfonato más Púrpura de

Bromocresol) en un recipiente de la paleta especial produce un gel, los resultados se leen

como Negativos, Traza, 1+, 2+ y 3+ según la cantidad de gel.

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Prueba de Wisconsin para mastitis

La prueba de Wisconsin para mastitis es la segunda técnica más utilizada para el

diagnóstico de la mastitis subclínica; requiere de una gradilla con 12 tubos de plástico fijos

con capacidad de 15 ml y graduación de 1 a 6 ml; presentan un orificio aereador colocado

lateralmente con un diámetro de 3.15 mm. Los tapones de hule llevan un orificio central

de 1.10 mm. El reactivo utilizado es el mismo que el de la prueba de California para

mastitis diluido en proporción de 1:1 usando agua destilada. En esta prueba se mezclan

en cada tubo 3 ml de leche con 3 ml de reactivo, posteriormente se agitan durante 10

segundos y se deja reposar la mezcla por 15 segundos, luego se vierte 15 segundos y se

procede a realizar la lectura.

Cuenta directa de las células somáticas en la leche

Uno de los procedimientos mas empleados por su utilidad y sencillez para el estudio de la

leche, es la determinación directa o indirecta del número de células somáticas.

Conductividad eléctrica en leche

La evaluación de la conductividad eléctrica como un método para la detección de mastitis

se basa en el aumento en la cantidad de sodio y cloro presentes en la leche cuando existe

una alteración de la glándula mamaria, provocándose entonces un aumento en la

conductividad de la misma.

Cloro en leche.

En la leche la relación lactosa: cloro, es influenciada por: a) estado lactacional y b)

presentación de mastitis.

En casos de mastitis el contenido de cloro en la leche tiende a incrementarse en

proporción a la lactosa, lo que ocasiona en la leche un sabor ligeramente salado.

Determinación de pH en leche.

El pH identificado en el calostro es de 6.4, en tanto que en la leche es de 6.5-6.8, cantidad

que a media lactación es de 6.6-6.7, y al final de 6.8 o mayor.

Se ha considerado que en la leche proveniente de glándulas mamaria afectada por

mastitis, el pH es alcalino, lo que se atribuye a la disminución de la lactosa e incremento

de sales que pasan de la sangre a la leche.

N-acetyl-beta-d-glucosaminidasa (nagasa).

Recientemente se ha empezado a popularizar una prueba en la leche de vacas con

mastitis llamada NAGASA, esta es una enzima que ha demostrado altas correlaciones

entre su presencia y el numero de células somáticas en la leche. Esta correlación no vario

entre los diferentes agentes etiológicos, tampoco tuvo influencia el numero de recaídas de

mastitis de las vacas.

Análisis bacteriológico de la leche.

La colección de muestras de leche en forma aséptica para los exámenes bacteriológicos

puede proveer un diagnóstico válido y correcto para el tratamiento y pronóstico de la

mastitis bovina.

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Un diagnóstico bacteriológico deberá realizarse en un laboratorio especializado. Las

muestras de leche deberán ser recolectadas en tubos estériles y dentro de las primeras

24 horas, cultivarse en un caldo nutritivo de bacterias asociadas a mastitis o agar nutritivo

en cajas conteniendo el medio de cultivo.

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Objetivo

El objetivo del presente trabajo fue identificar los agentes patógenos que producen

mastitis subclínica en diferentes establos lecheros de Culiacán, Sinaloa, México,

determinar su prevalencia y su resistencia a antimicrobianos.

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Material y Métodos

El presente trabajo se realizo en el rancho El Torito ubicado en el poblado los

becos, rancho La Herradura ubicado en el poblado la laguna colorada, rancho RS

ubicado en el limón de los ramos y rancho Los Peñascos ubicado en el Salado.

Se realizaron visitas los días lunes y martes para hacer la toma de muestras.

Para la muestra de leche se uso gel desinfectante, torundas y vasos estériles,

para tomar la muestra primero se desinfectaron las manos con el gel y un poco de

algodón, se limpio y desinfecto el pezón de la vaca con la torunda, se tiraron los

primeros chorros de leche y se colecto la leche en los vasos estériles, cuidando de

no contaminar la muestra.

Las muestras fueron puestas en refrigeración y posteriormente se trasladaron al

laboratorio de microbiología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia,

donde inmediatamente se realizaron los cultivos en los diferentes medios; agar

sangre, EMB, saborou y sal y manitol. Se encendió el mechero, se esterilizo el asa

bacteriológica, se tomo una muestra de leche y se colocaron de una a dos gotas

de leche en cada uno de los medios, se extendió la muestra haciendo estrias en el

agar y terminado el procedimiento se esterilizo el asa y los cultivos fueron puestos

en la incubadora a 37.5°C por 24 horas.

Pasadas las 24 horas se realizó la lectura de los cultivos, los positivos fueron

observados al microscopio para identificar el microorganismo, los que dieron

positivos a Staphilococcus se les realizo la prueba de la coagulasa para identificar

si eran Staphilcoccus aureus o staphilococcus spp.

Posteriormente se realizo el antibiograma a todos los cultivos positivos, utilizando

una muestra del cultivo y realizando otro cultivo en un medio liquido, que fue soya,

se puso en la incubadora durante 1 hora y posteriormente se realizo un cultivo y

se coloco el disco con 12 antibióticos, se colocaron nuevamente en la incubadora

a 37.5°C durante 24 horas y se realizo la lectura de los mismos.

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Resultados y Discusión

Los resultados fueron los siguientes:

De 20 muestras recolectadas para cultivo, solo 9 (45%) presentaron crecimiento

(Cuadro 1). De las muestras observadas al microscopio todas fueron positivas a

Staphylococcus, se realizo la prueba de la coagulasa a las 9 muestras positivas,

de las cuales 6 (66.66%) fueron coagulasa positiva, determinando asi que son

Staphylococcus aureus y 3 (33.33%) son Staphylococcus spp. (Cuadro 2 y 3). En

el antibiograma realizado a las 9 muestras positivas se determino la resistencia o

sensibilidad a 12 diferentes antibióticos, encontrando solo resistencia en 3

(33.33%) de las muestras (Cuadro 3).

Cuadro 1. Cultivos

Positivo45%

Negativo55%

Cultivos bacterianos

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Cuadro 2. Prueba de cuagulasa

No. Coagulasa (+) Coagulasa (-)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Cuadro 3. Resultados de la prueba de la cuagulasa

Staphylococcus aureus

Staphylococcus spp.

0.00%

10.00%

20.00%

30.00%

40.00%

50.00%

60.00%

70.00%

Staphylococcus aureus, 66.66%

Staphylococcus spp., 33.33%

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Cuadro 4. Resistencia a antibióticos

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Amikacina (AK) S S S S S S S S S

Ampicilina (AM) R S S S S S S S R

Cefalotina (CF) S S S S S S S S S

Ceftriaxona (CRO) R S S S S S S S S

Cloranfenicol (CL) R S S S S S S S S

Dicloxacilina (DC) R R S S S S S S R

Enoxacina (ENX) S S S S S S S S S

Eritromicina (E) R S S S S S S S S

Gentamicina (GE) R S S S S S S S S

Netilmicina (NET) S S S S S S S S S

Penicilina(PE) R S S S S S S S R

Trimetroprim-sulfatometoxasol(SXT)

R S S S S S S S S

Los resultados encontrados respecto a la prevalencia del agente coinciden con lo dicho por Mones y col., en 1989, Reyes y col., en 2002, Luque y Gaxiola en 1993, Bedolla y col., en 2006, ellos encontraron como agente principal a Staphylococcus aureus,

al igual que en el presente trabajo.

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Conclusiones

Con la realización de este trabajo se llega a la conclusión de que la principal causa

de mastitis en México y en el mundo es la falta de higiene y el mal manejo al

momento de la ordeña, lo que ocasiona grandes pérdidas económicas en la

industria lechera debido a que esta enfermedad provoca una notable disminución

en la producción de leche, y en casos mas graves el cuarto afectado llega a

perderse por completo. También se concluye que el principal agente causante de

mastitis subclínica es el microorganismo gram positivo: Staphylococcus aureus;

género del cual existe muy poca resistencia a los antibióticos, teniendo un gran

porcentaje de sensibilidad a ellos.

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Bibliografía

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