UERGS – Bento GonçalvesGenética de microorganismosProf. Dra. Adriana Dantas

Dificuldade de cruzamentos intergenéricos ou interespecificos

Incompatibilidade que ocorre entre duas linhagens por impedimento de anastomose das hifas

Possibilidade de produzir células sem parede celular (protoplasto) e a fusão destas celulas antes incompativeis

Cruzamentos entre especies ou generos distintos de fungos

ProtoplastosProtoplastos

•células células livres de parede celularlivres de parede celular

A ausência da parede: A ausência da parede: sistema útilsistema útil

•extração de organelas celularesextração de organelas celulares

•transferência gênica através da técnica de transferência gênica através da técnica de transformação genética – eletroporaçãotransformação genética – eletroporação

•produção de novos genótiposprodução de novos genótipos por por hibridação hibridação somáticasomática

Protoplastos:Protoplastos:

Em 1957 isolado de leveduras Células esféricas em ambientes osmóticos Totalmente desprovidas de parede celular Enzimas de isolamento: driselase,

helicase, zimolase e Novozyn 234 Constituídos por celulases e quitinases

Utiliza-se micélio de fungos filamentosos, células de leveduras, conídios germinando ou conídios intactos

Não deve causar rompimento do protoplasto

Estabilizadores osmóticos em meio liquido

Sal (KCl, NaCl, MgSO4) Açucar – sacarose Valores de 0,5M a 1M

Dois processos Substância fusogênicia polietilenoglicol

(PEG) Induz formação de agregados de células e

formação de pontes citoplasmática entre elas Eletrofusão

Células expostas a uma fonte de corrente alternada e ficam em linha como um colar de pérolas, em seguida um pulso de corrente continua é dado e há uma quebra reversível da membrana, permitindo a fusão.

Desenvolvimento de produtos de fusão em meio contendo Aneurina (esquerda) ou inositol (direita), utilizando as técnicas de seleção. Protoplastos fundidos foram semeadas em discos de celofane contendo os suplementos apropriados e incubados a 25°C por 4 dias.

Duas formas: Duas linhagens auxotróficas distintas

Em média 105 celulas parentais Produtos da fusão recuperados em MM

Seleção de produtos de fusão com mutantes a agentes inibidores Cloranfenicol e eritromicina

Linhagem AAuxotrofica a-b-

Linhagem BAuxotrofica c-d-

Fusão (PEG ou eletrofusão)

Obtenção do protoplasto

Recuperação em MM

heterocário

diploide

Seleção para obter diploides (MM)

Anaçlise genetica igual ao ciclo parassexual

Quebras das barreiras de incompatibilidade

Interespecíficas: Aspergillus nidulans x Aspergillus rugulosus Obtenção de segregantes com cromossomos

dos dois fungos Intergenéricas:

Aspergillus x Penicillum; Candida tropicalis x Saccharomyces fibugera; S. cerevisiae x Schizossacharomyces pombe; S lipolytica x Pichia guillemondii

Hibridação somáticaHibridação somáticaHíbridos Híbridos nuclearesnucleares ou ou citoplasmáticoscitoplasmáticos (cíbridos) (cíbridos)

•fusões fusões interespecíficasinterespecíficas, ,

•intergenéricas intergenéricas entre entre parentais parentais sexualmente sexualmente compatíveiscompatíveis;;

•intergenéricos entre intergenéricos entre parentais parentais sexualmente sexualmente incompatíveis.incompatíveis.

Perda de um núcleo

Fusão nuclear

Cíbridos(Híbridos

citoplasmáticos)

Synkarions

Organelas celulares são transferidas para estudos de herança citoplasmatica

Obtenção de protoplastos anucleados e sua fusão com células nucleadas

Restauração da capacidade respiratória por ação de mitocôndrias

Biossíntese de produtos do metabolismo secundário

Obtenção de cariótipos moleculares Transformação genética Utilizados na separação e análise de cromossomos

1973 – Neurospora crassa – DNA isolado de linhagens selvagens transferidos para linhagensm deficiente para inositol

1978 – S. cerevisae, protoplastos de mutantes deficientes para leucina (leu-) receberam DNA de celulas de leu+

1979 – Plasmidio de E. coli carregando genes de levedura

Células providas de espessa parede celular Fungos filamentosos – micélio – nitrogênio liquido Utiliza-se vetores com plasmidios bacterianos que

carregam genes de fungos Para tanto, o DNA é tratado com enzimas de

restrição que quebram em pontos específicos e colocam o plasmidio da bacteria E. coli

São selecionados e multiplicados na E. coli Plasmidio E.coli com fragmento contendo gene ga-2

de N. crassa; sintese de triptofano (trpC); arginina (argB); piridoxina (pyr-4); uracila (ura-5) de N.crassa, A. nidulans

Em estado de competência Conídios intactos ou germinados são tratado com acetato

de íitio (0,1M) Excelente estado de competência:

protoplastos na presença de PEG e CaCl2, ou por eletroporação, são altamente receptivos ao DNA exógeno

Absorção do DNA Colocação do DNA junto com os protoplastos é feita com

PEG e CaCl2. PEG causa fusão celular com auxilio do CaCl2.

DNA total – ação das nucleases é intensa e parte é degradada; proteção usando lipossomos

Inibiçãod as nucleases: espermidina, heparina

Realizar tanto a mutagênese insercional aleatória, como também a mutagênese dirigida.

Mutagênese dirigida permite a realização da superexpressão de um ou mais genes, ou também o silenciamento gênico, seja ele parcial ou completo.

Técnicas utilizando protoplastos, Agrobacterium tumefaciens e biobalística permitem a superexpressão de um gene tanto por integração heteróloga ou por recombinação homóloga.

Técnicas baseadas no RNA são capazes de realizar o silenciamento gênico por meio de regulação pós-transcricional do mRNA.

Silenciamento gênico parcial pode ser conseguido com a utilização do RNA antisense e RNA de interferência; já o silenciamento completo é possível utilizando a interrupção do gene em vetores que permitam a recombinação homóloga, via ribozimas e transposons.

Usado plasmidios de E. coli que contem um ou mais genes empregados no processo de transformação

Três destinos: Uma permuta entre o plasmidio carregando o gene, e o gene no

cromossomo do fungo provoca a integração no sitio homologo, ficando então o cromossomo do fungo com o gene mutante e o plasmidio carregando o gene selvagem

O plasmidio é incorporado em um outro local não homologo do cromossomo. O fungo fica com dois genes, um original mutante e outro selvagem

Por uma permuta dupla ou mesmo conversão gênica, o gene do fungo no plasmidio bacteriano substitui o gene mutante no cromossomo do hospedeiro

Tipo padrão é o pan7-1 Se duplicam independentemente dos

cromossomos São instáveis, podendo dar

pseudotransformação ou transformação abortiva

Seleção é feita na regeneração dos protoplastos que receberam o DNA exógeno

(A) Atividades biológicas do GFP-tagged variantes de proteína NUDE. Uma cepa (SF2-9) e thenudF7 ts mutante foram transformadas com genes indicados no vetor.

Transformantes foram cultivadas por 3 d em meio completo (YAG) sem ou com 0,6 M KCl a 43 ° C, que é uma temperatura restritiva para o mutante nudF7.

A cor de conídios na cepa ΔnudE é semelhante ao de cor acastanhada do micélio. A cor de conídios na cepa nudF7 é amarelo. (B) GFP:: NUDE variantes são expressos em níveis semelhantes. Extratos de proteína total foram feitas a

partir de uma cepa ΔnudE transformado com genes indicados no vetor . Dois transformantes diferentes foram usados para cada GFP:: variante NUDE. Proteínas (12 mg / pista) foram

separados em 10% SDS-PAGE e immunoblotted com um anticorpo anti-GFP.