Paredes celulares procariotas (3)

Biosíntesis del PG. Protoplastos y esferoplastos.

Formas L

Cómo sintetizar un sáculo cerrado fuera del

protoplasto El PG es una estructura “cerrada” Pero debe de “crecer”

Debe de “abrirse” de algún modo controlado para incorporar nuevo material

Debe facilitar el proceso de división en dos células hijas, a partir de un septo

¿Cómo transportar una macromolécula tan grande al exterior?

¿Cómo se resuelve el aporte de energía para la biosíntesis en el exterior del protoplasto?

Biosíntesis del PG: visión de conjunto

1. Síntesis de precursores solubles en el citoplasma

2. Los precursores son recogidos por un transportador de membrana y se forman las uu. disacarídicas con el pentapéptido

3. Las uu. disacarídicas-(pentapéptido), expuestas al exterior, son polimerizadas cadenas lineales de PG

4. La cadena lineal de PG recién formado se une al PG preexistente por transpeptidación

Fase 1 (en el citoplasma)

Activación de los monosacáridos: UDP-NAG UDP-NAG + PEP UDP-NAM

Unión secuencial aa. al NAM (con ATP y Mn): NAM-L-ala NAM-L-ala-D-glu NAM-L-ala-D-glu –di aa (m-DAP, L-Lys) NAM-L-ala-D-glu –di aa-D-ala-D-ala

Al final de esta fase tenemos en citoplasma: UDP-NAG UDP-NAM-(pentapéptido)

Fase 2: formación unidad disacarídica-pentapéptido

(a) El NAM-(pentapétido) se transfiere desde el

UDP hasta el bactoprenol-P bactoprenol-P-P-

NAM-(pentapéptido)

Fase 2: formación unidad disacarídica-pentapéptido

(b) El NAM-(pentapétido) se transfiere desde el

UDP hasta el bactoprenol-P bactoprenol-P-P-NAM-(pentapéptido)

Ahora se transfiere la NAG desde el UDP para unirse por transglucosidación con el NAM.

Tenemos, pues: bactoprenol-P-P-NAM(pentapéptido)-NAG

Bactoprenol está en membrana citoplásmica. NAM(pentapéptido)-NAG está en principio colgando hacia el citoplasma, pero ahora...

Fase 3: transglucosidación y producción de PG lineal

... El bactoprenol cargado con la unidad NAM(pentapéptido)-NAG se va al otro lado de la membrana (flip-flop), con lo que la unidad queda expuesta hacia el exterior

Transglucosidación: dos unidades de bactoprenol-P-P-NAM(pentapéptido)-NAG reaccionan Queda libre un bactoprenol-P-P ( bactoprenol-P, por

fosfatasa específica) Queda un bactoprenol-P-P unido a dos unidades de

NAM(pentapéptido)-NAG La reiteración de transglucosidación va generando

cadenas largas de PG naciente unido por un extremo a bactoprenol

Fase 4: transpeptidación: creación de PG entrecruzado

El PG naciente (con sus pentapétidos) unido al bactoprenol reacciona por transpeptidación con un PG aceptor preexistente: El –CO de la D-ala(4) reacciona con el

NH2 libre del di-aa(3) Entrecruzamiento entre dos cadenas de

PG Se libera la D-ala(5)

Detalle de la reacción de transpeptidación

Antibióticos que actúan sobre la biosíntesis del PG

Fosfomicina: inhibe la formación de NAM a partir de NAG

Cicloserina: inhibe la racemización de la Ala, así como la formación del dipéptido D-ala-D-ala

Tunicamicina: inhibe la traslocasa (2ª fase) Vancomicina: inhibe transglucosidación (3ª

fase) Bacitracina: impide la regeneración del

bactoprenol ß-lactámicos: inhiben transpeptidación (fase

4ª: entrecruzamiento de cadenas de PG

Crecimiento de pared celular: papel de las

autolisinas Para que el PG crezca coordinadamente y se

pueda formar el septo transversal, hay una serie de enzimas: “autolisinas”

Muchas autolisinas son sitios de acción de penicilinas BPBs PBP1: síntesis de PG durante elongación PBP2: crecimiento forma bacilar PBP3: síntesis de PG en el tabique transv. PBP4: hidrólisis entrecruzamientos en elongación PBP5: destrucción pentapéptido no entrecruzado

Crecimiento pared en Gram-negativa (E. coli) Crecimiento en longitud

(elongación) la célula crece en tamaño

Producción del tabique transversal (septación) formación de 2 células hijas

Elongación de la pared en Escherichia coli

Las PBPs1 se encargan de la elongación del PG naciente: Transglucosidación de uu. disacarídicas Transpeptidación entre tetrapéptidos de cadenas

adyacentes Las cadenas nacientes de PG se intercalan

en el PG preexistente: PBP4 y PBP5 cortan enlaces del PG previo PBP2 interviene en la transpeptidación

La elongación se hace en la parte cilíndrica de la célula, en forma dispersa (˜200 puntos)

Septación de la pared en Escherichia coli

Ensamblaje del “divisoma” por debajo de la membrana, en el centro del bacilo (modelo aún hipotético): FtsZ (parecida a tubulina) se ensambla,

formando un “anillo citocinético” que “tira” de las envueltas hacia el interior

Luego se activa la PBP3(=FtsI), una transglucosidasa/transpeptidasa del septo

Otras proteínas Fts

Crecimiento y septación de PC en Enterococcus

faecalis El crecimiento de la PC es zonal: comienza

en centro y avanza hacia fuera1. Célula adulta con banda ecuatorial donde la PC

se hace más gruesa2. Debajo de este engrosamiento, se va

depositando nuevo material de PC. Aparece una muesca en banda ecuatorial

3. El tabique (doble grosor de PC normal) avanza...

4. ... hasta que se completa5. El tabique de doble grosor se escinde

simétricamente por autolisinas

Crecimiento zonal de la PC del Enterococcus faecalis

Protoplastos y esferoplastos

En laboratorio se pueden lograr células desprovistas total o parcialmente de PC Protoplastos: células procarióticas

carentes totalmente de pared celular Esferoplastos: células procarióticas

carentes parcialmente de pared celular

Métodos de obtención de protoplastos y esferoplastos

Por destrucción del PG con lisozima o peptidasas En Gram-negativas hay que

desorganizar antes la membrana externa con el agente quelante EDTA (secuestra cationes)

Por inhibición de la formación de nuevo PG en células en crecimiento Ej.: tratando las células con penicilina

Protoplastos y esferoplastos son

osmóticamente sensibles

Suspensiones estables de protoplastos y esferoplastos

Hay que obtenerlos en un medio isotónico o ligeramente hipertónico: NaCl 0.25-0.5 M Sorbitol o sacarosa 0.5-1.0 M Polietilenglicol (PEG) al 7.5%

En estos medios protoplastos y esferoplastos tienen formas esféricas, cualquiera que fuera la forma original de la bacteria

En medios adecuados, protoplastos y esferoplastos pueden regenerar la PC

¿Para qué sirven los protoplastos y esferoplastos?

Método suave de obtener extractos libres de células y fracciones subcelulares

Para hacerlas permeables a ADN, en experimentos de transformación artificial (ej.: en ingeniería genética)

Fusión de protoplastos (para obtener recombinantes somáticos)

Formas L

Formas L naturales: Carentes totalmente (o casi) de PC que algunas

bacterias generan espontáneamente en medios a base de suero (que son hipertónicos)

Ejemplo: Streptobacillus moniliformis Colonias en forma de “huevo frito”

Formas L inducidas: tratamiento con penicilina en medio hipertónico L inestables: tratamiento breve; revierten PC L estables: tratamiento prolongado; no

revierten PC