UERGS – Bento GonçalvesGenética de microorganismosProf. Dra. Adriana Dantas
Dificuldade de cruzamentos intergenéricos ou interespecificos
Incompatibilidade que ocorre entre duas linhagens por impedimento de anastomose das hifas
Possibilidade de produzir células sem parede celular (protoplasto) e a fusão destas celulas antes incompativeis
Cruzamentos entre especies ou generos distintos de fungos
ProtoplastosProtoplastos
•células células livres de parede celularlivres de parede celular
A ausência da parede: A ausência da parede: sistema útilsistema útil
•extração de organelas celularesextração de organelas celulares
•transferência gênica através da técnica de transferência gênica através da técnica de transformação genética – eletroporaçãotransformação genética – eletroporação
•produção de novos genótiposprodução de novos genótipos por por hibridação hibridação somáticasomática
Protoplastos:Protoplastos:
Em 1957 isolado de leveduras Células esféricas em ambientes osmóticos Totalmente desprovidas de parede celular Enzimas de isolamento: driselase,
helicase, zimolase e Novozyn 234 Constituídos por celulases e quitinases
Utiliza-se micélio de fungos filamentosos, células de leveduras, conídios germinando ou conídios intactos
Não deve causar rompimento do protoplasto
Estabilizadores osmóticos em meio liquido
Sal (KCl, NaCl, MgSO4) Açucar – sacarose Valores de 0,5M a 1M
Dois processos Substância fusogênicia polietilenoglicol
(PEG) Induz formação de agregados de células e
formação de pontes citoplasmática entre elas Eletrofusão
Células expostas a uma fonte de corrente alternada e ficam em linha como um colar de pérolas, em seguida um pulso de corrente continua é dado e há uma quebra reversível da membrana, permitindo a fusão.
Desenvolvimento de produtos de fusão em meio contendo Aneurina (esquerda) ou inositol (direita), utilizando as técnicas de seleção. Protoplastos fundidos foram semeadas em discos de celofane contendo os suplementos apropriados e incubados a 25°C por 4 dias.
Duas formas: Duas linhagens auxotróficas distintas
Em média 105 celulas parentais Produtos da fusão recuperados em MM
Seleção de produtos de fusão com mutantes a agentes inibidores Cloranfenicol e eritromicina
Linhagem AAuxotrofica a-b-
Linhagem BAuxotrofica c-d-
Fusão (PEG ou eletrofusão)
Obtenção do protoplasto
Recuperação em MM
heterocário
diploide
Seleção para obter diploides (MM)
Anaçlise genetica igual ao ciclo parassexual
Quebras das barreiras de incompatibilidade
Interespecíficas: Aspergillus nidulans x Aspergillus rugulosus Obtenção de segregantes com cromossomos
dos dois fungos Intergenéricas:
Aspergillus x Penicillum; Candida tropicalis x Saccharomyces fibugera; S. cerevisiae x Schizossacharomyces pombe; S lipolytica x Pichia guillemondii
Hibridação somáticaHibridação somáticaHíbridos Híbridos nuclearesnucleares ou ou citoplasmáticoscitoplasmáticos (cíbridos) (cíbridos)
•fusões fusões interespecíficasinterespecíficas, ,
•intergenéricas intergenéricas entre entre parentais parentais sexualmente sexualmente compatíveiscompatíveis;;
•intergenéricos entre intergenéricos entre parentais parentais sexualmente sexualmente incompatíveis.incompatíveis.
Perda de um núcleo
Fusão nuclear
Cíbridos(Híbridos
citoplasmáticos)
Synkarions
Organelas celulares são transferidas para estudos de herança citoplasmatica
Obtenção de protoplastos anucleados e sua fusão com células nucleadas
Restauração da capacidade respiratória por ação de mitocôndrias
Biossíntese de produtos do metabolismo secundário
Obtenção de cariótipos moleculares Transformação genética Utilizados na separação e análise de cromossomos
1973 – Neurospora crassa – DNA isolado de linhagens selvagens transferidos para linhagensm deficiente para inositol
1978 – S. cerevisae, protoplastos de mutantes deficientes para leucina (leu-) receberam DNA de celulas de leu+
1979 – Plasmidio de E. coli carregando genes de levedura
Células providas de espessa parede celular Fungos filamentosos – micélio – nitrogênio liquido Utiliza-se vetores com plasmidios bacterianos que
carregam genes de fungos Para tanto, o DNA é tratado com enzimas de
restrição que quebram em pontos específicos e colocam o plasmidio da bacteria E. coli
São selecionados e multiplicados na E. coli Plasmidio E.coli com fragmento contendo gene ga-2
de N. crassa; sintese de triptofano (trpC); arginina (argB); piridoxina (pyr-4); uracila (ura-5) de N.crassa, A. nidulans
Em estado de competência Conídios intactos ou germinados são tratado com acetato
de íitio (0,1M) Excelente estado de competência:
protoplastos na presença de PEG e CaCl2, ou por eletroporação, são altamente receptivos ao DNA exógeno
Absorção do DNA Colocação do DNA junto com os protoplastos é feita com
PEG e CaCl2. PEG causa fusão celular com auxilio do CaCl2.
DNA total – ação das nucleases é intensa e parte é degradada; proteção usando lipossomos
Inibiçãod as nucleases: espermidina, heparina
Realizar tanto a mutagênese insercional aleatória, como também a mutagênese dirigida.
Mutagênese dirigida permite a realização da superexpressão de um ou mais genes, ou também o silenciamento gênico, seja ele parcial ou completo.
Técnicas utilizando protoplastos, Agrobacterium tumefaciens e biobalística permitem a superexpressão de um gene tanto por integração heteróloga ou por recombinação homóloga.
Técnicas baseadas no RNA são capazes de realizar o silenciamento gênico por meio de regulação pós-transcricional do mRNA.
Silenciamento gênico parcial pode ser conseguido com a utilização do RNA antisense e RNA de interferência; já o silenciamento completo é possível utilizando a interrupção do gene em vetores que permitam a recombinação homóloga, via ribozimas e transposons.
Usado plasmidios de E. coli que contem um ou mais genes empregados no processo de transformação
Três destinos: Uma permuta entre o plasmidio carregando o gene, e o gene no
cromossomo do fungo provoca a integração no sitio homologo, ficando então o cromossomo do fungo com o gene mutante e o plasmidio carregando o gene selvagem
O plasmidio é incorporado em um outro local não homologo do cromossomo. O fungo fica com dois genes, um original mutante e outro selvagem
Por uma permuta dupla ou mesmo conversão gênica, o gene do fungo no plasmidio bacteriano substitui o gene mutante no cromossomo do hospedeiro
Tipo padrão é o pan7-1 Se duplicam independentemente dos
cromossomos São instáveis, podendo dar
pseudotransformação ou transformação abortiva
Seleção é feita na regeneração dos protoplastos que receberam o DNA exógeno
(A) Atividades biológicas do GFP-tagged variantes de proteína NUDE. Uma cepa (SF2-9) e thenudF7 ts mutante foram transformadas com genes indicados no vetor.
Transformantes foram cultivadas por 3 d em meio completo (YAG) sem ou com 0,6 M KCl a 43 ° C, que é uma temperatura restritiva para o mutante nudF7.
A cor de conídios na cepa ΔnudE é semelhante ao de cor acastanhada do micélio. A cor de conídios na cepa nudF7 é amarelo. (B) GFP:: NUDE variantes são expressos em níveis semelhantes. Extratos de proteína total foram feitas a
partir de uma cepa ΔnudE transformado com genes indicados no vetor . Dois transformantes diferentes foram usados para cada GFP:: variante NUDE. Proteínas (12 mg / pista) foram
separados em 10% SDS-PAGE e immunoblotted com um anticorpo anti-GFP.
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