Cultivo de Protoplastos

Dpto. Biología Vegetal FACULTAD DE AGRONOMÍA

Micropropagación y proyectos de producción

Protoplastos:

Cultivo y aplicaciones



Protoplasto :

Célula vegetal desprovista de pared celular, por proceso mecánico o enzimático.

Membrana plasmática completamente expuesta.

Estado transitorio, permite manipulación de esas células.

Mantiene potencialidades de células vegetales completas.



1892 Primer aislamiento de protoplastos vivos de

cebolla por métodos mecánicos.

1919 Primer aislamiento enzimático, células de

levadura.

1960 Aislamiento de protoplastos de plantas superiores

con degradantes de pared celular.

1971 Regeneración de plantas a partir de protoplastos

de Nicotiana tabacum.



Aplicaciones

�Producción de híbridos por fusión de protoplastos.

�Manipulaciones genéticas.

�Estudio de procesos fisiológicos y bioquímicos.



Metodología

1. Aislamiento y factores que lo afectan

2. Purificación

3. Determinación de viabilidad

4. Cultivo

5. Regeneración



1) Factores que afectan la producción y viabilidad de los protoplastos

�Fuente de material

�Tratamientos pre-enzimáticos

�Tratamientos enzimáticos

�Osmolaridad



2) Purificación

3) Viabilidad

Toma de oxígeno

Actividad fotosintética

Tinciones



4) Cultivo

Medio de cultivo: MS, B5 (líquido o sólido)

Osmolaridad

Densidad de plaqueo

Condiciones de almacenamiento

Material vegetal

5) Regeneración

Organogénesis/Embriogénesis somática

Eficiencia generalmente baja



Protoplastosaislados de hipocótilo de arroz.

Regeneración de plantas de arroz por cultivo de protoplastos.

Primer división de un protoplasto, a los 4 días de cultivo.

Grupos de protoplastoscreciendo en agarosa.

Bloques de agarosa flotando sobre medio de cultivo.

Plántula derivada de protoplasto, en tubo de ensayo.

Debergh et al.



Hibridación somática

Aislamiento de protoplastos

Fusión de protoplastos (fases)

Selección células híbridas

Cultivo de células híbridas

Regeneración de plantas

Caracterización de las planas híbridas


Hibridación somática



Mecanismo de fusión

Tres fases: Aglutinación

Fusión de membranas

Redondeamiento de protoplastos fusionados

Tratamienos: PEG

alto pH

Ca+2



PROTOPLASTO A PROTOPLASTO B

AGREGACIÓN

FUSIÓN

DIVISIÓN CELULAR

CÉLULAS HÍBRIDAS

HIBRIDACIÓN SOMÁTICA



Hibridación somática en Dianthus.

D. chinensis D. barbatus

Masahiro, 2004.



Hibridación somática en Dianthus.

Masahiro, 2004.



Hibridación somática entre D.chinensis y D. caryophyllus.

Masahiro, 2004.



Problemas de la hibridación somática

�La regeneración de plantas a partir de protoplastos es difícil, y a partir de productos de fusión aún más.

�Ploidía de los híbridos es impredecible.

�Dificultades para recobrar la ploidía normal.

�Híbridos con frecuencia presentan problemas de esterilidad.



Logros de la hibridación somática

�Transferencia de esterilidad masculina de coliflor (Brassica oleracea) a rábano (B. rapa) y a colza (B. napus). Earle y Dicson, 1994).

�Transferencia de resistencia a atrazina en Brassicas(Christey et al. 1991).

�Transferencia de esterilidad masculina en Nicotiana(Zelcer et al. 1978).

�Diversos híbridos somáticos en especies ornamentales y flores de corte.


FIG. 2. Soybean protoplast cultures. A, Freshly isolated protoplasts; B, first cell divisions in protoplast culture 4 d after isolation; C, microcalliformation in 10 d old culture; D, microcalli in 15 d old culture; E, 25 d old culture; and F, 1 month old culture.

Lin et al, 1987

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