Fusión de Protoplastos

8/11/2019 Fusin de Protoplastos

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L/O/G/O

Biotecnologa de cultivos celulares

INSTITUTO POLITCNICO NACIONALUNIDAD PROFESIONAL

INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA

Integrantes:

Hernndez Huerta Sarah

Islas Castaeda N. Andrea

Jara Aguilar David

Jimnez Hernndez Oscar

Equipo: 3 Grupo: 4FV1 20-Septiembre-2013


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Hibridacin somtica


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Hibridacin somtica


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Aislamiento de protoplastos

1.Seleccin del material de partida.

2. Tratamiento enzimtico Temperatura 25 - 30C, pH 4,7 6.

Medio con:

a) Enzimas que degradan la pared celular: Celulasas, pectinasas y

hemicelulasas.

b) Inhibidores de proteasas (PVP).

c) Estabilizador osmtico (Sorbitol o manitol).d) Estabilizacin de membranas (CaCl2).

3. Limpieza y purificacin de los protoplastos.


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Mtodos de fusin

QumicosLos protoplastos de dos tipos parentales se mezclan en una solucin

conteniendo 15 a 45 % de fusgeno PEG (peso molecular de 1500 a 6000),

durante 15 a 30 minutos. La temperatura de incubacin ptima para inducir la

fusin es de 35 a 37 C pero, en la prctica, suele ajustarse a 24 C.

La remocin del PEG se lleva a cabo en forma gradual, siendo esto

fundamental para asegurar una elevada frecuencia de heterocariones. Para

ello, la suspensin se somete a sucesivos lavados con una solucin alcalina(pH 9-11) de CaCl2 10-50 mM, disminuyendo progresivamente la

concentracin de PEG con cada lavado.


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ElectrofusinAplicacin de corriente alterna de alta frecuencia (0,5 a 1,5 MHz). Las

cargas se separan dentro de las clulas formando un dipolo y generando,

por lo tanto, un potencial de membrana. Los

protoplastos se aproximan unos a otros y forman cadenas paralelas a laslneas de campo aplicadas.

Mtodos de fusin

El segundo paso consiste en la aplicacin de uno o ms pulsos cortos de

corriente directa de 15 a 100 seg., con una intensidad de campo elevada (1

a 3 Kv/cm), suficiente para causar la ruptura reversible de la membrana. Paraque esto ocurra es necesario que el voltaje crtico de membrana sea

alcanzado en cuestin de nanosegundos a microsegundos. Ocurre entonces

la fusin de las dos clulas cuyas membranas estn en estrecho contacto (1 a

2 nanmetros de distancia).


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Esquema general


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Ejemplo: Dianthus


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Resumen


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Resumen

La fusin de protoplastos es una tcnica de biotecnologa en la cual se

produce la fusin de las membranas de dos o ms clulas dando lugar

a un hbrido somtico. La tcnica es ampliamente empleada para

introducir variabilidad en las cepas de inters biotecnolgico.

Esta tcnica, pese a mezclar el contenido gentico de dos lneas

distintas, no est considerada ingeniera gentica, pues en su ejecucinno se emplea la tecnologa del ADN recombinante


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Gracias

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