Diferenciacin histoqumica, inmunohistoqumica y electrofortica de diferentes tipos de fibrasmusculares

Introduccin y objetivos:

En esta prctica intentaremos diferenciar entre los distintos tipos de fibras que componen el msculoesqueltico. Este tipo de tejido est altamente organizado, especializado en la ejecucin de la actividadcontractil, implicada en multitud de eventos corporales de cualquier sistema vivo.

El msculo esqueltico, junto al cardiaco, forma parte del msculo estriado. Se denomina as, por el aspectoque presentan los cortes de tejido al microscopio ptico. Esto se debe a la organizacin sarcomrica quepresenta, con las caractersticas bandas Z, I, A, H y la lnea M. A diferencia que el msculo liso, que carece deesta disposicin ordenada de las fibras, adems de poseer otras caractersticas metablicas y de inervacindiferentes.

Esta alta organizacin del msculo esqueltico hace pensar que todo es homogneo, y nada ms lejos de larealidad. An en un mismo msculo puede haber fibras con diferentes propiedades metablicas y diferentecapacidad contractil, lo que las har responder ante un estmulo de diferente manera.

El hecho de ser estructuras extraordinariamente plsticas, hace que se pueda adaptar a sobretrabajosdesarrollando estructuras para soportarlo, y a la vez, que exista atrofiamiento en caso de no utilizarlo.

El objetivo de esta prctica es poner de manifiesto esta heterogeneidad celular del msculo esqueltico y ladiversidad de propiedades metablicas y contrctiles de las fibras constituyentes; analizar la presencia deprotenas marcadoras que puedan servir para identificar las fibras y comparar mediante electroforesis lacomposicin molecular de diferentes tipos de msculo.

Fundamento terico

Como sabemos el msculo esqueltico se compone de fibras (denominadas as por su elevada relacinlongitud/seccin). En los mamferos, la inervacin del msculo esqueltico es mononeural, o lo que es lomismo, una fibra es inervada por una neurona, pero una neurona puede inervar a varias fibras. Es ciertotambin, que una neurona est en contacto siempre con el mismo tipo de fibra, y por eso, podemos definir larelacin neurona"fibras como unidad motora. Las diferentes unidades motoras que pueden componer unmsculo pueden activarse de forma independiente, consiguiendo as una regulacin de la intensidad de lacontraccin.

Estas fibras son el resultado de la fusin de clulas, llamadas miocitos, durante el desarrollo. Los sincitiospresentan en su interior las miofibrillas, que estn envainadas por el retculo citoplasmtico, al quedenominamos retculo sarcoplsmico. Las miofibrillas constan de sucesiones de sarcmeros unidos por eldisco o banda Z, que se ve rodeado por el tbulo T. Este tbulo es una invaginacin de la membrana quepermite poner en contacto la membrana plasmtica con el retculo sarcoplsmico. El tbulo T est en contacto,a todo lo largo de la circunferencia del sarcmero, con las cisternas terminales. stas son el resultado de unensanchamiento del retculo sarcoplsmico. Esta relacin entre membranas (plasmtica, tbulo T y cisternasterminales) es esencial para la regulacin de la contraccin muscular.

El sarcmero

La organizacin sarcomrica es tal, que no se aleja mucho de una disposicin totalmente cristalina, sobre todoen msculos que requieren una gran potencia, como los de vuelo de la mosca. La visin de bandas es el

1

resultado de la colocacin de dos tipos de protenas esenciales:

Actina, que forma parte esencial de los filamentos delgados. Miosina, que forma parte integral de los filamentos gruesos.

En un corte transversal de un sarcmero, se observa que un filamento delgado se rodea de tres gruesos, ycomo se muestra en la figura, uno grueso se rodea de seis delgados. La contraccin se produce gracias a laconversin que realiza la cabeza globular de la miosina, de la energa de hidrlisis del ATP a energamecnica. La contraccin se debe al acortamiento de las zonas I y H, por el desplazamiento de los filamentosdelgados sobre los gruesos. Es importante la polaridad de los filamentos de actina, ya que si no eldesplazamiento se realizara en sentido contrario, desplazndose la estructura sarcomrica en lo que seraelongacin, no contraccin.

La actividad ATPasa se localiza en la cabeza globular de la miosina, y es el motor molecular ms antiguo quese conoce. El estudio de su estructura y su actividad ha permitido caracterizar otro tipo de protenas quepermiten el movimiento, no solo sobre actina, sino sobre microtbulos, no habindose caracterizado ningunaque deslice filamentos intermedios.

En el sarcmero no slo hay actina y miosina, sino que existen toda una serie de protenas que hacen posiblesu funcionamiento:

Protena Estructura y Componentes Localizacin Funcin

Miosina

Formacin deestructurasuperenrolladacada dosmolculas yposteriorasociacin conpolaridadenfrentada. El ejede simetra seencuentra en lalnea M

2 cadenaspesadas Componente

principal delos filamentosgruesos

Con un sitio deinteraccin con laactina y otro confuncin ATPasaque es la quedesarrolla elesfuerzomecnico

Se asocian a lascabezas de lascadenaspesadas, dos porcabeza.

4 cadenasligeras(LC1,LC2 yLC3)

Actina

Asociacin de monmerosque da lugar a un filamentocon estructura similar a unadoble hlice

Componenteprincipal delos filamentosdelgados

Permiten eldeslizamientosobre losfilamentos demiosina

Tropomiosina Protena con cremallera deleucina que se asocia enforma cabeza"cola

Asociada a losfilamentos deactinaenrollndoseen los surcosque deja.

Implicada en laestabilizacin delos filamentos deactina y en laregulacin de lacontraccin altapar el sitio de

2

unin a miosinaen ausencia deCa++

Troponina

Forman uncomplejo detresprotenas

Tn"T

En la unincabeza cola delatropomiosina

Tn"T y Tn"I unenTN a TMmientras queTn"C es la unidadreguladora concapacidad para4iones Ca++. Lastres estnimplicadas en elcambio de lugarde TM cuando seune calcio,dejando activo elsitio de unin a lamiosina

Tn"I

Tn"C

Protena Estructura y Componentes Localizacin Funcin

Titina oConectina Protena muy larga y flexible

Entre la lnea M yel disco Z

Permite unir la miosina alos discos Z (a pesar de lacontraccin, pues esflexible). Adems demantenerla paralela a losfilamentos de actina

Nebulina Protena flexible pero inextensible Unida al disco Z

Orienta la polaridad de losfilamentos de actinaadems de unirlos al discoZ y mantenerlos paralelos

"actinina Formada por dos cadenas En el disco Z

Unin de la actina en lazona del disco Z. Enmsculo liso hace lasfunciones del disco Z juntoa la vinculina

Miomesina En la lnea MMantiene el eje de simetrade la asociacin de lamiosina en la lnea M

Protena C A ambos lados dela lnea M Unida a la miosina

Cap"Z En el disco Z

Unin de l polo + de laactina al disco Z y evita quepolimericen msmonmeros de actina

TropomodulinaEn el extremo " delos filamentos deactina

Evita la despolimerizacinde los filamentos de actina

Regulacin de la contraccin en el msculo esqueltico

3

El movimiento de contraccin del sarcmero se explica gracias a modelos de interaccin entre la miosina y laactina. Todo comienza cuando la miosina, unida a la actina, une ATP. En ese momento se despega de la actinacambiando su conformacin durante la hidrlisis del ATP. Al finalizar el proceso de hidrlisis, la miosina(con ADP + Pi en el sitio de unin a ATP), ha estirado el cuello, fijndose a otra subunidad de actina, de lacual no se despegar. Al salir del ADP + Pi, la conformacin de la cabeza de miosina cambia de nuevo alestado original. Como no se ha soltado de la actina, hace que el filamento se desplace.

El mtodo de movimiento es esencialmente igual para toda la familia de las miosinas, lo nico que cambia esla cola que bien puede ser larga y estar unida a otra en un sarcmero, o corta asociada a otra corta o corta ysuelta.

Este movimiento se puede producir in vitro, nicamente hace falta la actina, la miosina el calcio y el ATP. Sinembargo, in vivo, las cosas necesitan regularse, y en este caso muy finamente. Es el calcio el principalregulador de la actividad muscular, algo lgico, ya que manejar la otra variable, el ATP no es lgica,recordemos que tenemos que hacer caso a estmulos rpidos. La regulacin se resume en esta figura.

Etapa de despolarizacin. Se manda un mensaje va neuronal, como onda de despolarizacin. Laonda pasa por el tbulo T al ser este un continuo de la membrana. A ese estmulo responde un canalsensible a despolarizacin, ubicado en la membrana del tbulo, pero orientado hacia la cisternaterminal, iniciando la segunda etapa. En cuanto al sarcmero hay que destacar que la miosina no estunida a la actina ya que la TM se dice que est en off porque obstruye el sitio de unin de la miosina.

Etapa de salida de Calcio. La despolarizacin ha llegado al canal que libera al sarcoplasma laconcentracin de 10 mM que tiene este ion en la cisterna terminal (no en forma libre, sino unido a unaprotena llamada calsecuestrina). El calcio llega a la Tn"C, capaz de unir 4 iones, y hace cambiar ladisposicin de las dobles hlices de TM sobre la actina, dejando libres los sitios de unin de lamiosina.

Etapa de captura de calcio. Una vez recuperada la polaridad, se cierra el canal y comienza afuncionar una bomba Ca++"ATPasa, la cual introduce dos cationes por molcula de ATP gastada. Aldisminuir la concentracin de calcio en el sarcmero, se vuelve a la configuracin inicial, nopudiendo la miosina unirse a la actina.

Este tipo de regulacin no es vlida para msculo liso, con una contraccin ms lenta, ya que en este no hayTN, sustituyndolo por calmodulina, las bombas de calcio son isoformas ms lentas y, adems, no presentaestructuras de membrana tan especializadas.

Fibras rpidas y lentas

En la actualidad, la puesta a punto de nuevas tcnicas histoqumicas e inmunohistoqumicas, han permitidocorroborar lo que se haba observado por tcnicas de microscopa o electroforticas. Esto es: las fibras de losmsculos esquelticos de vertebrados son heterogneas en su velocidad de contraccin.

El desarrollo de variedad de fibrillas de msculo esqueltico responde a una tendencia evolutiva que se hatratado de resolver de diferentes formas segn avanzaba el tiempo. Se trata, por tanto, de poder responder ados exigencias bsicas:

Estmulos potentes de forma rpida. Estmulos menos potentes pero que se alargan en el tiempo.

En definitiva, la velocidad de reaccin frente a la resistencia ante un ejercicio fsico. Ambas son necesariaspara la supervivencia de un individuo. En el hombre, como buen generalista no posee ningn msculo queest mayoritariamente formado por un solo tipo de fibras. El resultado en un corte transversal de un msculo,es un mosaico de fibras rpidas y lentas. Sin embargo, si hay mamferos que poseen msculos compuestos

4

casi en su totalidad de fibras de un solo tipo.

Nosotros, en estas prcticas vamos a utilizar como modelo de msculo preferentemente lento el msculosoleo. Procede grupo extensor del tobillo de la extremidad posterior, y se asocia con dos msculos ms. Elsoleo tiene actividad en el mantenimiento de la postura sufriendo un ligero aumento durante la locomocin.Como modelo de msculo rpido utilizaremos el msculo extensor de los dedos largos (EDL), de roedor. Elmsculo debe responder a estmulos rpidos en un tiempo mnimo, aunque se agote enseguida la energa.

Las diferencias entre los distintos tipos de fibras son, tanto metablicas, como fisiolgicas. Ambas, en suconjunto proporcionan a cada una las caractersticas necesarias para realizar bien su funcin.

Las fibras rpidas necesitarn una inervacin rpida y un mtodo de obtencin de energa igualmente rpido.Para conseguirlo, se fabrican isoformas de las protenas descritas anteriormente o protenas nuevas (como lacadena ligera de miosina LC3, slo presente en este tipo de fibras). Adems, se ve potenciada la va deobtencin de energa ms rpida que poseemos, la glucolisis. Con esto se consigue un menor rendimiento dela glucosa y un rpido agotamiento de los recursos, lo que conlleva inexorablemente a la fatiga de la fibra enun corto periodo de tiempo. La glucolisis no requiere oxgeno, de modo que, porque gastar energa enfabricar mioglobina y capilarizar en exceso la fibra?. Ya que no se van poder alargar las contracciones con eltiempo, habr que agrandar la seccin de la fibra para que la contraccin sea ms eficaz y violenta.

Las fibras lentas necesitarn de isoformas ms lentas, ya que una contraccin demasiado rpida llevara aagotar las energas, al igual que suceda en las fibras rpidas. El poder alargar los periodos de contraccin dacomo posibilidad la utilizacin de una va de obtencin de energa mucho ms lenta pero mucho ms eficaz, elciclo de los cidos tricarboxlicos. Esta ruta metablica requiere oxgeno y no mucha glucosa, de modo, queno hace falta mucho almidn (al contrario que en las fibras rpidas), pero si que hay que fabricar mioglobina yhacer que llegue suficiente oxgeno capilarizando la zona. Evidentemente, si necesitamos el ciclo derespiratorio, tendremos muchas mitocondrias. Los citocromos respiratorios junto a una mayor irrigacin de lasfibras, hacen que a simple vista podamos diferenciar los dos tipos de fibras, ya que las oxidativas tendrn untono ms rojizo que las rpidas, carentes de componentes de color rojo.

Los diferentes rendimientos de las rutas glucoltica y oxidativa se pone de manifiesto en esta tabla.

Tasa relativa Glucosa utilizada Lactato producido O2 necesario?MetabolismoOxidativo 36"38 ATP 1 0 Si

MetabolismoGlucoltico 64 ATP 32 64 No

Las vas glucolticas producen menos ATP por glucosa que las oxidativas, pero pueden estar activas con unatasa de produccin de ATP ms elevada.

Estos seran los dos extremos, ya que entre medias existen una gran variedad de fibras ms o menos rpidas,ms o menos oxidativas. Para repasar todo esto realizamos la siguiente tabla.

Propiedades fisiolgicas y bioqumicas de los tipos de fibras de los msculos de mamferos

Clasificacin BioqumicaRG

Rpidas glucolticas

ROG

Rpidas oxidativas"glucolticas

LO

Lentas oxidativas

Clasificacin fisiolgicaRF

Fatigables rpida

RR

Rpidas resistentes a fatiga

L

LentasVelocidad de contraccin Rpida Rpida Lenta

5

Actividad ATPasa de la miosina Alta Alta BajaFuente de produccin de ATP Glucolisis Oxidativa o mezcla OxidativaContenido de mioglobina Bajo " AltoMitocondrias Pocas Muchas MuchasCapilares Pocos " MuchosContenido de glucgeno Alto Intermedio BajoTasa de fatiga Rpida Intermedia LentaDimetro de la fibra + cantidadde tensin Grande Intermedio Pequeo

Al principio del apartado, comentamos que la evolucin haba desarrollado, a lo largo del tiempo, solucionesalternativas ms o menos similares, pero siempre orientadas a poder responder a los dos tipos de estmulos.

En peces, los msculos del miotomo (tronco corporal) estn divididos en regiones separadas de msculosrojos lentos y blancos rpidos. Las fibras musculares de estas regiones tienen muchas semejanzas histolgicas,bioqumica y fisiolgicas con las fibras de mamfero LO y RG respectivamente. El msculo lento nuncaexcede del 25% de todo el miotomo. Esto es debido a que solamente se usa el msculo lento en la natacinlenta o moderada. El msculo rpido se utiliza en periodos cortos de tiempo ya que se fatiga muyrpidamente. Adems de las diferencias que comparten con los mamferos, ancho de fibra y capilarizacin,presentan una diferencia ms, y es el tipo de inervacin, que se efecta por una neurona en un extremo de lafibra rpida, mientras que una neurona de unidad motora lenta inerva en varios puntos a una misma fibra.

En artrpodos, se manifiesta una distribucin similar entre fibras rpidas y lentas. Aunque las basesmetablicas de esta distincin an no estn claras. Si que parece existir una correlacin con el tamao delsarcmero y la cantidad relativa entre filamentos gruesos y delgados. De esta forma, las fibras de contraccinrpida presentan sarcmeros ms cortos (1,5"3 m) y una proporcin relativamente baja de filamentosdelgados. Sin embargo, las fibras de contraccin rpida presentan sarcmeros ms largos (6"15 m) y unaproporcin elevada de filamentos gruesos.

Las fibras suelen estar en forma de mosaico en los msculos del animal, pero si hay msculos preferentementeespecializados, como los que se hallan en la cola del cangrejo de ro o la langosta. Estos msculos presentansarcmeros cortos, lo que implica contraccin rpida, asociada a coletazos casi espasmdicos que permiten alanimal huir rpidamente.

En otros casos estudiados, tanto en vertebrados como en invertebrados, la especializacin en msculos rpidosy lentos es menos completa que en los ejemplos descritos, teniendo la mayora distribuciones mixtas de fibrasen los msculos. Ya sea que los tipos de fibras estn dispuestos en msculos separados, o mezclados, laespecializacin de los distintos tipos de fibras es una caracterstica funcional importante del msculo.

Mtodos de obtencin de datos

Una vez conocidos los principios fisiolgicos y bioqumicos que diferencian los distintos tipos de fibras,describiremos en que se basan las pruebas histoqumicas, inmunohistoqumicas y electroforticas que vamos autilizar en estas prcticas.

Pruebas histoqumicas

Basadas en la formacin de precipitados coloreados, visibles a simple vista, y de forma ms especficamediante el microscopio ptico. En nuestro caso, el precipitado se forma a partir de un derivado insoluble delazul de paranitrotetrazolio (NBT), el azul de formazn. Este se forma debido a la reduccin sufrida por elNBT al aumentar la concentracin de NADH + H+. En ambas rutas de obtencin de ATP que tienen lugar en

6

las fibras rpidas y lentas, se forma NADH + H+ y, por tanto, es lo que acompaa al NBT lo que nosdiferenciar entre las deshidrogenasas de uno u otro ciclo metablico.

Menadiona""glicerofosfato deshidrogenasa ("GPD): Nos permitir valorar la actividaddeshidrogenasa de la GPD de la va glucoltica. Dar positivo, de forma significativa en las fibras rpidas,con una tasa metablica glucoltica muy alta.

NADH"tetrazolio reductasa (NADH"TR): Nos permite valorar la actividad deshidrogenasa de la varespiratoria de los cidos tricarboxlicos.

Pruebas inmunohistoqumicas

Con este tipo de pruebas, podemos diferenciar los diferentes tipos de fibras, ya que presentan distintospatrones de expresin de las protenas componentes de la maquinaria contractil. Estos distintos patronespueden llegar expresar una protena en un tipo de fibra y no en el otro. La base de la deteccin es la mismaque la que se utiliza en la inmunodeteccin de los Western"blot, la formacin del complejoperoxidasa"antiperoxidasa y la formacin de un precipitado visible al aadir los sustratos adecuados.

Por supuesto, utilizamos anticuerpos contra aquellas protenas que se encuentran nicamente o de formapreferente en un tipo de fibras. Mediante inmunohistoqumica cuantitativa, podemos obtener las cantidadesrelativas de cualquier protena para que tengamos un anticuerpo.

Uno de los epitopos ms utilizados es la cadena pesada de la miosina, con diferentes isoformas que seexpresan de forma diferencial en los diferentes tipos de fibras. Adems de las isoformas embrionaria yneonatal, existen cuatro isoformas que se expresan en el msculo esqueltico adulto, codificadas, codificadaspor otros tantos genes: MHC lenta y MHC rpidas de tipo 2A, 2B y 2X. Hay anticuerpos monoclonalescomerciales que reconocen especficamente la miosina lentas (tipo I) y la de fibras rpidas (IIa y IIb) sin darreaccin cruzada con las otras. La troponina T es otra protena que presenta isoformas y para la que tambintenemos un anticuerpo monoclonal para la isoforma rpida. An no perteneciendo a la maquinaria contractil,hay protenas que se expresan de forma diferencial en uno u otro tipo de fibra. Este es el caso de la protena deestrs o de choque trmico HSP72, mucho ms abundante en fibras tipo I que en las de tipo II. Estos antgenospermiten obtener una informacin preliminar rpida sobre la naturaleza de las fibras que componen elmsculo.

Fibras tipo I

Lentas

Fibras tipo II

RpidasMiosina lenta +Troponina T +Miosina rpida +HSP72 +

Actividad diferencial ATPasa de la miosina

Otro de los mtodos para diferenciar los distintos tipos de fibras es el utilizar el diferente grado de resistenciaa medios cidos o bsicos de las isoformas de miosina.

La resistencia viene condicionada por la asociacin de isoformas diferentes, tanto de las cadenas pesadascomo de las ligeras. Estas asociaciones presentan diferentes grados de resistencia a pH cidos (entre 4 y 4,5) ybsico (por enzima de 9). Esto nos permite escoger condiciones en las que se inactive/n alguna/s isoforma/ssin que la/s otra/s se vea/n afectada/s.

7

El cuadro de resistencia de los diferentes isotipos se muestra en la siguiente tabla.

pH depreincubacin Tipo I

Tipo IIIIA IIB IIC

9,3 " ++ + +4,35 + " +4,2 + " "

Como se observa en la tabla, incubando slo en medio cido y bsico podramos diferenciar perfectamente lostipos I de los tipos II, ya que a pH 9,3 se inactiva la miosina lenta, quedando activa (aunque con diferentegrado) las rpidas. A pH 4,2 quedaran activas las miosina de las fibras lentas inactivndose las de las rpidas.Pero el ensayo puede hacerse ms preciso si aadimos otro pH, tambin cido, a 4,35 unidades. A estaconcentracin de protones, se inactivan de forma diferencial las distintas asociaciones de isoformas demiosina de las fibras tipo II (mirar la tabla), pudiendo as llegar a identificarlas uniendo todos los datos.

La visualizacin de la actividad ATPasa se lleva a cabo mediante una serie de postincubaciones (despus dehaber estado expuesta al medio extremo). Se trata de activar la contraccin aadiendo ATP y Ca++ a pHalcalino. En ese momento empieza a funcionar la actividad ATPasa de la cabeza de la miosina (aquella queest activa), dejando en el medio el resultado bioqumico de la hidrlisis del ATP, ADP + Pi. El fosfatoinorgnico, en medio alcalino, se asocia espontneamente con el calcio para formar fosfato clcico, salinsoluble que precipita en el lugar donde se ha formado. Aadimos posteriormente una solucin de cobaltocon el fin de intercambiarlo por el calcio en la sal precipitada. Despus de la incubacin, se ha formado unanueva sal, tambin precipitada que podemos transformar en algo visible aadiendo sulfuro amnico. Elresultado es un precipitado negro de sulfuro de cobalto (de ah el crculo de distintos tonos de negro quehemos utilizado en la tabla).

Evidentemente la cantidad de sulfuro de cobalto debe ser la misma, o cuando menos proporcional a lacantidad de Pi existente en el medio, el cual proviene de la actividad ATPasa de la miosina. El resultado es,por tanto, un tono negro ms tupido a mayor actividad.

Electroforesis

Hemos estado hablando de diferentes patrones de expresin de protenas en los distintos tipos de fibras. Estoimplica que mediante un gel de electroforesis con SDS podramos diferenciar dos homogeneizadosprocedentes de diferentes fibras.

En efecto esto es as, como veremos en el desarrollo de las prcticas. Sin embargo, las conclusiones a sacar severan ampliadas en electroforesis en condiciones nativas, que permitira diferenciar mejor las isoformas quedifieran en carga, algo ms usual que las diferencias de peso molecular, que sera lo que vemos en un geldesnaturalizante.

Las protenas que muestran estas diferencias son, principalmente la Ca++ATPasa, algunas isoformas de lamiosina y la presencia de la cadena ligera LC3 exclusivamente en fibras rpidas.

Desarrollo de la prctica

Para poder efectuar un mayor anlisis, repartimos el trabajo entre la mesa. Cada mesa tendr una mismamuestra problema que tendremos que identificar por los mtodos sealados en el apartado anterior. Cadapareja realizar un tipo distinto de ensayo, de modo, que al final de las prcticas, la puesta en comn de losdatos nos permitir efectuar un veredicto.

8

Como patrn de fibra rpida, utilizaremos el msculo extensor de los dedos largos, y como patrn de fibraslentas, utilizaremos el msculo soleo, de los que ya hablamos en el apartado anterior.

Para una mejor distribucin, todas las mesas seguimos un mismo patrn de ensayos, cada uno de estos gruposconsta de una prueba histoqumica, otra inmunohistoqumica, otra de actividad ATPasa de la miosina y otraelectrofortica. La distribucin de los ensayos fue la siguiente:

Cdigo deensayo ATPasa miofibrilar Histoqumica Inmunohistoqumica Electroforesis

Pareja A C pH cido NADH"TR Troponina TPareja B D pH bsico M""GPD Miosina RpidaPareja C A pH cido NADH"TR HSP72Pareja D B pH bsico M""GPD Miosina Lenta

Durante el desarrollo de las prcticas, necesitaremos portas con los cortes de tejido, sobre los que realizaremoslos ensayos de la ATPasa e histoqumica. Estos portas contendrn los patrones de fibra rpida EDL y los defibra lenta, Sol, adems de un corte problema que vendr identificado con un nmero. El nmero servir parasaber al final de la prctica si hemos acertado en nuestras conclusiones. Para poder identificar los cortes, unavez colocados sobre el porta tenemos ste esmerilado por uno de los extremos, con lo que podemos disponerlos cortes con una disposicin relativa que ser idntica para todos los portas que recibiremos. Esta es lasiguiente:

Para el ensayo de inmunohistoqumica utilizaremos un porta con el corte del problema, no de los patrones

Desarrollo experimental

Desarrollaremos la metodologa a seguir slo en los ensayos que realizamos, (mostrados en la tabla), aunque,en el apartado de conclusiones mostraremos los resultados de la mesa haciendo un desarrollo de lo que nospermite afirmar cada uno de los ensayos.

En los portas que nos dieron, el problema era el nmero 10, el mismo para toda la mesa.

Actividad ATPasa miofibrilar

Material

Portaobjetos conteniendo los cortes de los msculos Soleo, EDL y problema. Cubeta de incubacin paraportas. Bao a 37 C. Tampn AmMeP"Ca (CaCl2 0,1 M; AmMeP 50 mM; NaN3 0,1%) pH 9,3. TampnAmMeP (AmMeP 50 mM; NaN3 0,1%) pH 9,3. Agua destilada. Solucin de CaCl2 1M. ATP 0,2M. Solucinde CoCl2 150 mM. Sulfuro amnico 0,5%. DPX o Aquamount. Microscopio ptico.

Protocolo

Dejar descongelar el porta 15 o 20 minutos. Incubar con 25 ml de tampn AmMeP"Ca pH 9,3. Aclarar con agua destilada. Incubar 30 minutos a 37 C con la mezcla de reaccin, (24,5 ml de tampn AmMeP; 250 l de CaCl2 y 250l de ATP).

Aclarar con agua destilada, dejndolo 3 minutos en el ltimo lavado. Incubar 10 minutos en 25 ml de CoCl2. Aclarar con agua destilada

9

Poner en contacto, el tiempo que sea necesario para visualizar color negro, con la solucin de sulfuroamnico. Esto debe realizarse en un recinto aireado, pues se trata de una sustancia txica y con un olor muydesagradable.

Aclarar con agua destilada y dejar secar. Montar el cubre aadiendo DPX o aquamount evitando laformacin de burbujas.

Visualizar al microscopio ptico, preferentemente con el objetivo 10x ya que el color negro es bastanteintenso.

Incidencias

Durante la realizacin del ensayo, hubo una equivocacin. Esta consisti en un fallo en la preparacin de lasolucin de ATP, en la que se aadi ADP en lugar del nucletido trifosfato. No hubo forma de descubrir laequivocacin, as que seguimos adelante, hasta el paso 8. En nuestro caso no realizamos este paso ya quealgunos compaeros ya lo haban intentado con un resultado negativo. Fue entonces cuando se dieron cuentadel error, con lo que decidimos que el ensayo se repetira al da siguiente.

En definitiva, lo sucedido nos sirvi como control de la contraccin muscular, la cual, como ya hemosindicado en apartados anteriores requiere de calcio (componente que s se suministr) y ATP, donde seencuentra la energa necesaria para el cambio de conformacin de la miosina. Si aadimos ADP en lugar deATP, lo que hacemos es aadir un producto de la reaccin ATPasa que realiza la miosina, no el sustrato quenecesita. El resultado es, por tanto, negativo. No hay reaccin ATPasa, con lo que el msculo no se contrae.

Decidimos utilizar el porta con resultado negativo para teir con azul de Coomassie. El resultado nos permitiobservar el espacio intercelular y clulas ms teidas que podran corresponder a clulas sanguneas. Lairrigacin es mayor en aquellas fibras que requieren oxgeno, las lentas y, por tanto, el msculo soleo presentams capilares que el EDL. En cuanto al problema, el patrn observado se asemejaba mucho al del msculosoleo.

Menadiona""GPD. Medida le la actividad glucoltica

Material

Portaobjetos conteniendo los cortes de los msculos Soleo, EDL y problema. Cubeta de incubacin paraportas. Bao a 37 C. Tampn Tris 0,2 M, pH 7,4. Menadiona 0,02 M. "glicerofosfato 0,2 M. NBT 2,5%.Agua destilada. DMX o aquamount. Microscopio ptico.

Protocolo

Dejar descongelar el porta 15 o 20 minutos. Incubar a 60 minutos a 37 C en 25 ml de una solucin compuesta por: 2ml de Tris, 1ml de Menadiona, 1mlde "glicerofosfato, 1ml de NBT y agua destilada hasta el volumen final.

Lavar con agua destilada Dejar secar u montar con DPX o aquamount.

Incidencias

Ninguna. El ensayo se desarroll sin ningn contratiempo. Durante la observacin del cubre en elmicroscopio, se podan observar zonas ms oscuras, que no eran consecuencia de la reaccin, sino depequeos pliegues que se formaron al fijar el tejido al porta. Esto ocurri en todas las muestras, en mayor omenor medida.

Inmunohistoqumica. Ab contra miosina lenta

10

Material

Porta con corte de tejido problema. Tampn TBS (Tris"Salino"HCl: Tris 0,5 M; NaCl 0,145 M), pH 7,6 M.suero bovino al 10%. Anticuerpo primario (contra las cadenas pesadas de la miosina de fibras de contraccinlenta) diluido en TBS y albmina bovina al 0,1%. Anticuerpo secundario a una dilucin 1:25 (contra elprimario). Complejo peroxidasa"antiperoxidasa diluido 1:100 en TBS. 4"Cloro, 1"Naphtol diluido en tampntris. Perxido de hidrogeno al 0,05%. Placa Petri grande. Papel de filtro, varillas cuadrangulares de cristal.Microscopio ptico.

Protocolo

Rehidratar las secciones congeladas en tampn TBS, eliminando con mucho cuidado el exceso de tampnde los bordes del tejido, sin tocarlo.

Incubar 20 minutos con TBS con albmina de suero bovino. Incubar toda la noche 4 C con el anticuerpo primario. Lavar con PBS y secar cuidadosamente. Incubar durante 30 minutos con el anticuerpo secundario. Lavar cuidadosamente con TBS. Incubar con el complejo PAP durante 30 minutos. Lavar con PBS Desarrollar la reaccin de la peroxidasa durante 5 o 10 minutos con cloronaftol y agua oxigenada. Lavar con agua destilada y dejar secar.

Incidencias

El ensayo no tuvo contratiempos. Todo se realiz en el interior de una placa Petri a la cual habamos aadidopapel de filtro recortado a medida y empapado para mantener la humedad en el interior. Para que el porta noentre en contacto con el papel de filtro, se utilizan dos varillas cuadrangulares de cristal, que dispuestasparalelamente sirven de soporte al porta.

Electroforesis (SDS"PAGE)

Material

Stock de acrilamida 30 % (29,2 g de acrilamida: 0,8 g de bisacrilamida). TrisHCl 1M pH 6,8. TrisHCl 1M.pH 8,8. SDS 10 %. Persulfato amnico (APS) 10 %. TEMED. Tampn de electroforesis (Tris 0,025 M;glicina 0,192 M; SDS 0,1%; pH 8,3). Tampn de carga 2x (TrisHCl 0,125 M (pH 6,8); SDS 4%; glicerol 20%; 2mercaptoetanol 10 %; EDTA 15 nM; azul de bromofenol 0,008 %). Marcadores preteidos de pesomolecular. Homogeneizado de msculo soleo, EDL y problema a concentraciones conocidas.

Protocolo

Hacemos un gel mediante un soporte doble. El gel ser discontinuo, para empaquetar las protenas y asasegurarnos que todas parten a la vez. En el gel se cargan los marcadores de peso molecular, el msculo soleo,el EDL y el problema; adems de componentes de la otra prctica.

Incidencias

Debido a la experiencia con el tipo de molde con el que fabricamos el gel (los utilizamos en prcticas de otrasasignaturas), pudimos evitar que los espacios creados entre los diferentes cristales hicieran (por el principio delos vasos comunicantes) que el frente del gel separador quedara demasiado bajo, lo que implicara unaseparacin escasa y una baja informacin.

11

Hay que decir que los msculos nunca estn formados por un solo tipo de fibra, por tanto, en elhomogeneizado de soleo tambin estarn presentes protenas caractersticas de fibras rpidas y viceversa. Ses cierto que la proporcin observada al microscopio es muy baja y que, al ser la deteccin por Coomassie, debaja resolucin, no creemos que esto influya sobremanera en el resultado.

Resultados

En este apartado discutiremos los resultados obtenidos, no solo por nosotros, sino por toda la mesa. El haberdividido el trabajo nos ha hecho posible el realizar un mayor nmero de pruebas para la posterioridentificacin.

Histoqumica

Se realizaron dos pruebas metablicas, una para valorar la glucolisis (M""GPD) y otra para marcar el ciclode los cidos tricarboxlicos (NADH"TR).

Menadiona""GDP

Esta prueba dio positivo (color azul"violeta intenso) para la mayora de al clulas del msculo EDL pero, sinembargo, las fibras del msculo soleo y del problema presentaban una coloracin ms dbil, que se distinguaa simple vista.

Se pone de manifiesto que no hay msculos compuestos por un solo tipo de fibras, ya que en el msculo soleoy en el problema aparecan fibras glucolticas rpidas y en el EDL fibras sin tincin correspondientes a fibraslentas.

NADH"Tetrazolio reductasa

Al contrario que la anterior, este ensayo marca la actividad respiratoria, que se lleva a cabo en la mitocondria.Ya que utilizan el mismo sistema de marcado (mismo precipitado) el positivo es igual que con la menadiona,un color azul"violeta intenso. En este caso, y como indica la lgica el resultado fue el contrario al del ensayoanterior, positivo en el corte de msculo soleo y el problema y negativo en el corte de EDL.

Seccin de msculo esqueltico: NADH"TR. El crculo de la derecha muestra partes de los dos tipos defibras con un mayor aumento. Los componentes contrctiles no se tien. Foto tomada del atlas de histologa.Ross

El resultado al microscopio se observa en la siguiente micrografa. No es un msculo especializado, sino quepresenta un mosaicismo caracterstico de la mayora de los msculos estriados.

Seccin de msculo esqueltico: Succinico Deshidrogenasa x 200. histologa funcional, Wheater.

La deteccin de actividades metablicas tienen su dificultad en las fibras ROG (rpidasoxidativas"glucolticas), ya que presentaran positivos ms o menos tenues en ambos ensayos.

Hay otros tipos de marcados metablicos, como el que se muestra en la figura. En este caso se trata del ensayohistoqumico de la succnico deshidrogenasa, enzima de la va respiratoria. A fibras aerobias (LO); An fibrasanaerobias (RG); I fibras intermedias (ROG). En esta micrografa se observa perfectamente el mosaicismoexistente en la mayora de los msculos, no solo de mamferos.

Inmunohistoqumica

12

En este caso, tenemos tres anticuerpos monoclonales que nos marcarn protenas que solo se expresan en untipo de fibra.

El positivo puede presentarse de forma muy tenue, con lo que hay que tener cuidado con el fondo. Enprincipio, si hay color, es que en la muestra se encuentra la protena contra la que se ha lanzado el anticuerpo.Todos los positivos presentarn el mismo color, aunque la intensidad ser variable, en funcin de la cantidadde la protena blanco que halla en la muestra.

HSP72

Se observa una leve coloracin, peno no parece un positivo claro. Pudiera ser, que al tratase de una protenacitoslica, nos la hubiramos llevado con los lavados. Si que aparece ms intenso en el espacio entre lasfibras.

Cadena pesada de la miosina de las fibras lentas

El resultado es positivo, como es lgico a tenor de las pruebas que ya poseemos. Se ven zonas no teidas,correspondientes a las fibras rpidas intercaladas dando lugar al mosaicismo ya descrito.

Troponina T

No se observa coloracin en la mayora del corte, slo algunas fibras, que ahora podemos calificar de rpidas,muestran un ligero color.

Cadena pesada de la miosina de las fibras rpidas

Evidentemente el resultado es negativo en la mayora del corte, si exceptuamos a las fibras rpidas que estnpresentes de forma mnima en las dems muestras n 10, pero que en esta parece haber coincidido con unazona ms heterognea.

ATPasa miofibrilar

En esta prueba slo realizamos dos ensayos a pH cido de 4,3 y otra bsico de 9,3. La irreproducibilidad delos ensayos hace poco eficiente la comparacin de tonos a pH intermedio de 4,5, lo que nos permitira laidentificacin de las fibras rpidas IIA, IIB Y IIC.

pH cido(4.3)

La isomiosina del msculo EDL, un resiste el tratamiento cido, de modo que se forma poco Pi. El resultadoes, la no coloracin del corte, si exceptuamos algunas fibras lentas que se intercalan en el msculo. En le cortede msculo soleo, la diferencia es notable. Presenta un color oscuro, resultado de la precipitacin del sulfurode cobalto, lo que significa una actividad ATPasa, a pesar del tratamiento cido, propio de fibras lentas.

En cuanto al problema, presenta una tincin oscura similar a la que presenta le msculo soleo.

pH bsico (9,3)

Dijimos que en medio bsico, eran las isomiosinas de las fibras lentas las que no resistan. Esto se pone demanifiesto en el msculo soleo, que presenta cierta actividad, mostrada por un tono oscura, tal vez resultadode un pH no muy extremo o por un defecto en la realizacin del ensayo (poco tiempo en el medio bsico,mucho tiempo en el medio de reaccin o en el sulfuro amnico) que ha podido aumentar el fondo. Como es deesperar hay zonas del corte que presentan coloracin ms intensa.

13

El msculo EDL presenta un tono muy oscuro, casi negro, lo que lo caracteriza como msculo rpido. Almicroscopio se observan fibras con una tincin de menor intensidad.

El problema tiene un tono oscuro, al igual que el msculo soleo.

Seccin de msculo esqueltico ATPasa x 600. histologa funcional, Wheater.

En la micrografa presentada a la derecha se observa un corte de msculo esqueltico. Como la mayora esheterogneo, algo que se pone de manifiesto tambin mediante esta prueba. A fibras aerobias (LO); An fibrasanaerobias (RG); I fibras intermedias (ROG).

Electroforesis

Como ya dijimos en el apartado anterior, las conclusiones que se pueden sacar de un gel SDS"PAGE sonlmitadas. Prcticamente slo te permiten diferenciar patrones de expresin.

En ese lmite, podemos afirmar que el patrn de expresin de nuestro problema se asemeja mucho al delmsculo soleo, incluso podramos decir que es el mismo. Esto se observa claramente en la fotografa del gel.

An sin identificar protenas, es evidente que las fibras rpidas presentan protenas que no estn en las lentas.En este orden, deberamos observar como, protenas como la Troponina T y la cadena ligera de la miosinaLC3, slo se expresan en fibras rpidas, mientras que HSP72 slo se expresa en fibras lentas. No podemosidentificar la mayora de los isotipos, ya que tienen el mismo peso molecular. Tampoco podemos hacer muchocaso a diferencias de tonalidad de las bandas, ya que la cantidad de protena que hemos aadido en el pocillopuede ser distinta aunque en la clula sea la misma.

Identificacin de Protenas

Mediante la construccin de una recta patrn intentaremos identificar la mayor cantidad de bandas posible.Como ya dijimos, el pequeo tamao del gel, el hecho de estar en condiciones desnaturalizantes y el utilizarun mtodo de revelado poco sensible como el Coomassie, hace extremadamente complicado llegar aidentificar las protenas de forma clara.

Pm (Da) Log Pm (cm)1 180.000 5,255 0,52 116.000 5,061 13 84.000 4,924 1,354 58.000 4,763 1,755 48.000 4,681 2,26 36.000 4,556 2,97 26.000 4,415 3,4

En la representacin marcamos ya los pesos moleculares calculados de las bandas de las que se tomo lamovilidad electrofortica. Como observacin hay que decir que todos los datos de se tomaron sobre el gelsin deshidratar.

En la representacin se observa como la desviacin de los puntos marca dos rectas con pendientes distintas.Aunque lo preceptivo es realizar una recta de regresin, y luego interpolar, el hecho de que las bandas ainterpolar caigan sobre dos rectas de ajuste perfecto a los puntos, nos ha hecho pensar que dara un resultadoms exacto de Pm que la interpolacin sobre la recta de regresin. Esto se demuestra en la primera banda, =0,5 cm, en la que interpolando sobre la recta, llammosla experimental, se obtiene un Pm de 180.000 Da, que

14

coincide exactamente con la primera banda del patrn, que presenta la misma movilidad electrofortica. Sinembargo, la interpolacin sobre la recta de regresin arroja un dato de 160.000 Da, lo que no est mal, pero esevidente que en este caso se ajustara ms a la realidad el peso obtenido sobre la recta experimental que elobtenido sobre la recta de regresin.

Para intentar minimizar el error, hemos credo conveniente obtener los Pm mediante el antilogaritmo de lamedia, del resultado obtenido de la interpolacin en las dos rectas. O lo que es lo mismo, interpolaremos sobrelas dos rectas, y haremos la media del logaritmo del Pm, con ese valor realizamos el antilogaritmo obteniendoel valor de Pm. Esto se realizar siempre y cuando, los dos puntos se encuentren cercanos. En los casos en losque los puntos resultado de una misma interpolacin se encuentren ostensiblemente separados, hemos optadopor calcular los Pm resultantes de cada punto, como se muestra en la grfica.

Los resultados se muestran en la grfica, pero ahora los volvemos a mostrar intentando identificar protenas.Para la identificacin, necesitamos los Pm de las protenas musculares, o la informacin que se nos dio enprcticas, donde se nos indic cual era la banda de la Ca++ATPasa. Los datos recopilados de Pm se muestranen esta tabla.

Protena Pm (Da)

Miosina

Cadena Pesada 220.000Cadenas Ligeras

LC1, LC2, LC322.000

Actina 43.000Tropomiosina 32.000

TroponinaTn"T 30.000

Tn"I 30.000Tn"C 18.000

El resultado de la identificacin lo mostramos mediante este cuadro.

En esta identificacin hay patrones que no parecen encajar en exceso. Esto puede ser por una error en laidentificacin o por una mala visualizacin de las bandas. Las bases de la identificacin han sido lassiguientes.

Miosina. An presentando un Pm bajo. Efectivamente, el peso de la miosina es de 220.000 Da, mientrasque la protena identificada en el gel presenta un Pm de 180.000. Esto puede ser debido al variable tamaode la miosina. En todo caso, no puede ser otra protena, ya que la gran mancha indica una gran cantidad deprotena, y la miosina, junto a la actina son las mayoritarias en el msculo.

Ca++ATPasa. Hemos podido identificar esta protena gracias a la intervencin del profesor de prcticas,ya que no hemos podido encontrar su Pm. La descripcin de isoformas rpidas es evidente al observar elresultado del gel. Las fibras rpidas presentan una bomba diferente, que debe ser capaz de trasladar losiones calcio al retculo sarcoplsmico de una forma ms rpida que la presente en las lentas. Esta diferenciaes una de las bases claves en la discriminacin de tipos de fibras.

Actina. Casi sorprendentemente, el peso molecular encaja perfectamente. Adems, como pasaba con lamiosina, la intensidad de la banda no deja otra posibilidad.

Tropomiosina. Al igual que con la actina, el Pm encaja. La expresin de esta protena es la misma en todoslos tipos de fibras. El menor grosor de la banda en el msculo EDL nos hace pensar que se introdujo menoscantidad de muestra. Esto se corrobora con bandas como la de la actina o la miosina.

Troponina T y Troponina I. El peso molecular de la banda la hace la mejor candidata para pertenecer aestas protenas. En cuanto al patrn de expresin. La mayor intensidad de la banda del msculo EDL,podra corresponder a una mayor expresin de alguna o de las dos en las fibras rpidas. Lo que s est claro

15

es que, la Tn"T presenta isoformas diferentes, como ya vimos en la prueba inmunohistoqumica.Cadenas ligeras de la miosina. La identificacin de estas bandas ha sido extremadamente complicada, y sepodra decir que es casi aleatoria. En cuanto al patrn de expresin conocido, hay que decir que LC3, slose encuentra en las fibras rpidas, pero que estas expresan tambin LC1 y LC2, aunque en proporcionesdiferentes que en las fibras lentas. Hemos optado por esa colocacin de bandas, porque s que parece existiruna leve banda a la altura de la identificada para LC1 y LC2 en msculo EDL y, sin embargo, no hayprotena a la altura de la banda identificada con LC3 para fibras lentas. Tambin es cierto que en principiono hemos encontrado diferencias de Pm entre las tres isoformas en ningn libro, pero la explicacin dadaanteriormente parece coherente.

Troponina C. La adjudicacin de esta banda se ha realizado por encajar esta con el Pm de la protena. Laprctica ausencia de banda en msculo EDL, pudiera deberse a la menor carga de muestra en el carril delmsculo rpido. Esta banda puede corresponder a la parvalbmina, protena que presentar una banda muycercana al frente.

Identificacin del problema

Mediante una tabla intentaremos unificar de forma sencilla todos lo resultado expuestos de forma amplia enlos apartados anteriores.

Prueba Ensayo Soleo EDL Problema

histoqumica

M""GPDNADH"TR

inmunohistoqumica Miosina LentaMiosina RpidaTn"T RpidaHSP72

Prueba Ensayo Soleo EDL Problema

ATPasa

pH cidopH bsico

Electroforesis Patrn RpidoPatrn Lento

A la vista de todas las pruebas reunidas durante las prcticas, englobadas en esta tabla, nuestro problemapresenta exactamente el mismo comportamiento que el msculo soleo, el cual utilizamos como modelo defibras lentas (tipo I), al tener ste un alto contenido en este tipo de fibras. Por lo tanto, podemos concluir que:

El problema N 10 se trata de un corte de msculo con un alto porcentaje de fibras tipo I (LO).

En cuanto a si se trata del propio msculo soleo, podra decirse que s. La base de este razonamiento es elexamen morfolgico del contorno del corte, que era prcticamente igual en la muestra de msculo soleo queen el problema. Esto hace pensar que se trataba de cortes seriados.

2"amino, 2"metil, 1"propanol

Paso que no se realiz por problemas de tiempo

Al igual que en el ensayo anterior, no montamos el cubre. En este porque no haca falta, la visualizacin essuficiente sin cubre.

16

Prcticas de Fisiologa Molecular

1

26

Tipos de fibras musculares

Ca++

ATP

Cabezas de Miosina

Cola de Miosina

Disco

Z

Filamentos de Actina

Lnea M

Banda A

Banda H

Banda I

Banda I

Contraccin

"

+

Polaridad de los filamentos de actina

EDL

Sol

Prob

Prob

Sol

EDL

17

Prob

Sol

EDL

Prob

Sol

EDL

Prob

Sol

EDL

4,1

3,9

4,3

1,15

1,1

1,2

2,5

2,8

3

3,2

0,5

Soleo EDL Problema (cm) Pm (Da) Protena Candidata

20.000 " 15.000

22.000 " 17.000

18.000 " 13.000

102.000

105.000

18

97.000

43.000

36.000

32.000

30.000 " 27.000

180.000 " 160.000

LC3?

LC1 y LC2?

Tn" C?

Ca++ATPasa

Ca++ATPasa

Ca++ATPasa

Isoformas rpidas

Actina

LC1 y LC2?

Tropomiosina

Tn"T y Tn"I

Miosina

19