Bioqumica

Bioqumica2013

EXTRACCIN DE ADN EN AVES GUANERAS

AO DE LA INVERSIN PARA EL DESARROLLO RURAL Y LA SEGURIDAD ALIMENTARIAUNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURAFACULTAD DE CIENCIASESCUELA PROFESIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS EXTRACCIN DE ADN EN AVES GUANERASINTEGRANTES :CAMPOVERDE JIMNEZ, Nadia de FtimaGARCA LPEZ, Kenia JesselPROFESOR:Mcblgo. Csar Torres CURSO:BIOQUMICASEMESTRE:IV 2013.18 Noviembre, 2013.

PROYECTO DE INVESTIGACIN

I.- GENERALIDADES:Titulo del proyecto:EXTRACCIN DE ADN EN AVES GUANERASPersonal investigador: Campoverde Jimnez Nadia del Ftima Garca Lpez Kenia Jessel

Tipo de investigacin:

De acuerdo con el objetivo que se persigue: BASICA. De acuerdo a la tcnica de contrastacin: DESCRIPTIVA.

Seccin a la que pertenece el proyecto: Bioqumica

Ubicacin donde se desarrollo el proyecto: Se llevara a cabo en la UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA en el departamento de biologa donde trabajaremos en el LABORATORIO DE HISTOLOGIA.Tiempo que duro la ejecucin del proyecto: Cuatro (4) semanas

Fecha de inicio y termino: Inicio: 28 DE OBTUBRE Termino: 18 DE NOVIEMBRE

Cronograma de trabajo:

SEMANASActividad

S4S1S2S3

Revisin bibliogrficax

Identificacin de la zona a muestrearx

Adquisicin de materiales y equiposXX

Recoleccin de muestrasX

Anlisis de las muestrasX

Anlisis de datosXX

Presentacin del TEAX

Sustentacin del TEAX

II.- PLAN DE INVESTIGACINANTECEDENTES:La extraccin y purificacin de cidos nucledos constituye la primara etapa de la mayora de los estudios de biologa molecular y de todas las tcnicas de recombinacin de ADN. En este caso, los mtodos de extraccin permiten obtener cidos nucledos purificados a partir de diversas fuentes para despus realizar anlisis especficos de modificaciones genticas mediante la reaccin en cadena de la polimerasa. (Hotzel, H., Mller, W. y Sachse, K. 1999).

La calidad y la pureza de los cidos nucledos son dos de los elementos ms importantes en ese tipo de anlisis. Si se desea obtener cidos nucledos muy purificados, que no contengan contaminantes inhibidores, es preciso aplicar mtodos de extraccin adecuados. (Hupfer, et al K.H. 1998).

Los contaminantes capaces de inhibir el anlisis PCR se enumeran en el cuadro 1. Con objeto de evitar los falsos negativos debidos a la presencia de inhibidores de la PCR en la muestra, se recomienda vivamente efectuar un experimento de control de la inhibicin de la PCR, que suele hacerse mediante PCR especfica de vegetales (eucariotas o cloroplastos) o de la especie. (Lipp, et al 1999).

Dada la gran variedad de mtodos de extraccin y purificacin de cidos nucledos existentes, la eleccin de la tcnica ms adecuada suele efectuarse conforme a los criterios siguientes:

cido nucledo diana organismo fuente material inicial (tejido, hoja, semilla, material transformado, etc.) resultados deseados (rendimiento, pureza, tiempo que requiere la purificacin) uso posterior (PCR, clonacin, etiquetado, transferencia, RT-PCR, sntesis de ADN, etc.)Para extraer los cidos nucledos del material biolgico es preciso provocar una lisis celular, inactivar las nucleasas celulares y separar los cidos nucledos de los restos de clulas. El procedimiento de lisis idneo suele consistir en un equilibrio de tcnicas y ha de ser suficientemente fuerte para romper el material inicial complejo (un tejido, por ejemplo), pero suficientemente suave para preservar el cido nucledo diana. Entre los procedimientos usuales de lisis figuran los siguientes: Rotura mecnica (trituracin, lisis hipotnica, etc.); Tratamiento qumico (detergentes, agentes caotrpicos, reduccin con tioles, etc.) Digestin enzimtica (Proteinasa K, etc.)

Es posible romper la membrana celular e inactivar las nucleasas intracelulares al mismo tiempo. Por ejemplo, una misma solucin puede contener detergentes que solubilicen las membranas celulares y sales caotrpicas fuertes que inactiven las enzimas intracelulares. Tras la lisis celular y la inactivacin de las nucleasas, los restos de clulas se eliminan fcilmente por filtracin o precipitacin (Murray, M.G. y Thompson, W.F.1980).

Introduccin:Los estudios genticos han revolucionado el campo de muchas disciplinas, como son la evolucin, ecologa e incluso sistemtica, muchos de estos estudios se utilizan para determinar la relacin entre individuos, el procedimiento de extraccin de DNA brinda esta importantsima informacin, con diferentes mtodos se puede obtener una muestra de DNA como lo son una muestra de sangre, tejido etc. Para estos estudios tambin pueden utilizarse mtodos menos invasivos como lo son plumas y que sin embargo se pueden utilizar para la obtencin de la muestra y a partir de esta trabajar para conseguir DNA puro para su posterior estudio.Se utilizan estos mtodos a partir de plumas cuando la extraccin de sangre se dificulta por la edad del ave, por ejemplo, con el uso de protocolos se purifica el DNA, como lo es el DNeasy Tissue Kit de la marca QIAGEN la tcnica incluye una etapa de lisis para que la pluma se deshaga esto se logra por la protenas K, as como la adicin de otros buffers que modificaran la muestra para que esta sea adecuada en la metodologa brevemente se explica cual es la funcin de cada buffer.Objetivo:El objetivo de esta investigacin, es obtener una muestra de DNA a partir de Pelecanus thagus por medio del kit de extraccin Dneasy Tissue Kit de Qiagen para que posteriormente se secuencie esa muestra.Justificacin:Esta investigacin puede tiene como fin y a beneficio de los estudiantes conocer qu tipo de tcnica es la ms conveniente para la extraccin de ADN en un ave guanera de la costa norte del pas, adems de poder reconocer e identificar el ADN que presenta la Pelecanus thagus, tanto en proceso como estructura.Hiptesis: Siguiendo cada paso detallado en mtodo, se observar la estructura de ADN purificado, pudiendo notarse la estructura bsica del ADN, la hlice enrollada y algunas estructuras anexas.Mtodo de investigacin: Para tratar la pluma se cort un pedacito de una pluma aprox. 1 cm, se transfiri a un tubo de microcentrifuga de 1.5 ml con 300l de buffer ATL que lisa las clulas del tejido, 20 l de protenas K, que acta inactivando nucleasas que podran degradar DNA durante la purificacin y 20 l de DTT, (dithiothreitol) usado como reductor. Despus se llevo a la incubadora por 56C para que la muestra se lise por completo.

Despus aprox. de 5 horas de incubacin se observo que la muestra estaba lisada casi por completo y de color oscuro y turbio, se paso al vortex 15 segundos, se agregan 300 l de buffer AL , esto para romper las clulas y su ncleo y as extraer el DNA. Despus de esto se paso al vortex por unos segundos, con ayuda de una pipeta se paso el sobrenadante a otro tubo, sin alterar el precipitado ya que la muestra est muy turbia en el fondo.

Aadir 300 l de etanol y pasar nuevamente al vortex unos segundos, se aprecia que ya no hay un color turbio en la muestra, sino color claro.

Se pasa a la columna DNeasy mini spin que viene en el kit, teniendo cuidado de no tocar el fondo de la misma ni tocar los bordes, la transferencia debe ser limpia, esto para evitar contaminar la muestra. . Centrifugar a 6.0 x g (8000 rpm) por un minuto.

Se agregan 500 l de buffer AW1 (desnaturaliza protenas) y centrifugar a 6.0 x g por 1 minuto.

Pasar el sobrenadante a una columna nueva, poner buffer AW2, para remover sales y purificar mas el DNA, y meter en la centrifuga por 13.3 g x 3 minutos.

Ya casi para terminar, se pasa a una nueva columna sin agregar nada y centrifugar a 13.3 fuerzas g x 1 minuto, por ultimo se recomend agregar 100 l de buffer AE, cabe mencionar que nuestra dilucin fue de 3x es decir lo recomendado serian 100 l pero la cantidad total obtenida en la muestra fue de 300 l, esto tal vez pueda influir en que la muestra se disolvi casi por completo por lo cual lo esperado es encontrar una muy baja o nula cantidad de DNA en la muestra.rea de estudio y materiales para la investigacin:La isla Foca: Se encuentra ubicada a 20 km al sur de la ciudad de Paita, en torno a los 05 12 de latitud S y los 81 12 de longitud O. Presenta una longitud mxima de aproximadamente 1,44kmy una anchura de unos 0,65 km. La isla tiene un relieve accidentado con hondonadas profundas yacantiladosque presentan alturas aproximadas de 40 metros, interrumpidas por cantos rodados yplayasque son el resultado de la accin delvientoy del ocano. Las playas son muy escasas en isla Foca y la mayora se encuentra en el lado este, donde se encuentra la nica playa de arena: Playa Blanca. El resto de las playas son pequeas, profundas y de pequeas piedras. Por el lado oeste destaca un grupo deislotesy rocas visibles a poca distancia de su orilla.El clima en la isla es templado y la temperatura del mar vara poco con respecto a las estaciones del ao.La aves son los habitantes ms numerosos de la isla.se pueden encontrar ms de 38 especies de aves en la ISLA FOCA, lo que convierte a este lugar en una zona privilegiada para la observacin de estos animales.

ESPECIE ESCOGIDA: Nombre Comn: Pelcano Peruano, Alcatraz, Huajache (Chile) Nombre Cientfico:Pelecanus thagusElpelcano peruano(Pelecanus thagus) es unaespeciedeavemarinade lafamiliaPelecanidaeque habita enAmrica del Sur. Actualmente es considerado como una especie propia depelcanoy no una subespecie delpelcano pardo.Es un ave grande (1.1 metros) y fcilmente reconocible por su gran pico con su caracterstica bolsa (llamada bolsa gular) y su vuelo de aleteos lentos. Es de color marrn oscuro con jaspes gris claros, frente blanca y cuello blanco en el invierno y parcialmente negro en el verano. Los juveniles tienen el vientre blanco.El Pelcano es la tercera ms importante ave guanera, con una poblacin estimada en 400,000 individuos a mediados de los 90.Se alimenta de peces que captura en forma exagerada mientras nada o zambullndose tras de ellos. Muestra preferencia por las anchovetas y las lisas. Cuando se da el fenmeno del Nio la poblacin de pelcanos se reduce considerablemente al faltarle el alimento.Anida en colonias numerosas en las islas guaneras y su pca de reproduccin es de Setiembre a Marzo. Es un ave muy social y se le suele ver volar en grupos de 3 a 10 individuos, alineados en V y en vuelo rasante sobre el mar.El pelcano es un ave endmica (propia de la zona) de la corriente de Humbolt y habita a lo largo de las costas del Pacfico en Per y Chile.

Se utilizar el siguiente protocolo:

1. Extraer la muestra de la base de las plumas de pelcano, para esto se debern escoger las plumas, que sern sacadas de la parte posterior del animal, con mucho cuidado que no tocar las base de la pluma para evitar contaminantes Las plumas en crecimiento presentan un can ms oscuro y grueso y son de un tamao ms corto. Arranque 3-4 plumones de la misma manera descrita anteriormente. Este tipo de plumas contienen pequeas cantidades de sangre de la que se puede extraer ADN. Envolver esta zona en pequeos trozos de papel secante (por ejemplo papel de cocina limpio). As se evitar que la sangre manche el papel contaminando otras muestras.2. Agregar 670l del buffer de extraccin, incubar 54 Cx 40m,invertir cada 10min.3. Agregar fenol saturado 470l, luego agregar 200l Cloroformo isoamilalcohol4. Llevar a vortex5. Centrifugar a 13000rpm a T0C ambiente por 306. Recuperar el sobrenadante y agregar a un tubo nuevo7. Agregar un volumen igual a lo recuperado de Cloroformo isoamilalcohol, girar suavemente8. Centrifugar a a 13000rpm por 5min.9. Recuperar el sobrenadante y agregar a un tubo nuevo10. Agregar 0.6 volumen de Isopropanol11. Invertir y dejar en reposo por 5 min.12. Centrifugar a 13000rpm por 20min13. Vaciar el sobrenadante14. Centrifugar por 30 seg.15. Nuevamente recuperar el sobrenadante y agregar a un tubo nuevo16. Agregar 330l de etanol al 70%, centrifugar por 1min a vaciar el sobrenadante17. Repetir 15 y 1618. Secar por 15min.19. Resuspender en 50 ul de TE.20. Agregar 1ul de ARNasa incubar por 37C por 30 minutos.21. Conservar a 4c o -20c

Reactivos:-Buffer de extraccin: TRIS 0.2M a pH 8.5, EDTA 25mM, Cloruro de sodio 0.25M, SDS 0.5% hidroximetilaminometano 2- amino 2- hidrometil-propano-1, 3- diol (HO CH2)3CNH2-RNAsa-Fenol saturado-Cloroformo isoamilalcolcohol (24:1)-Isopropanol al 100%-Etanol 70%-Buffer TE: Tris 10mM pH 7.5; EDTA 1mM3

ANEXOSISLA FOCA

Pelecanus Thagus

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS1. Fitzsimmons C J, Schmutz S M, Bergen R D and McKinnon J J 1998 A potential association between the BM1500 microsatellite and fat deposition in beef cattle. Mammalian Genome 9: 432-4342. Cornide M.T., DIVERSIDAD GENETICA Y MARCADORES MOLECULARES. CNIC, La Habana, 20003. Tautz D., HYPERVARIABILITY OF SIMPLE SEQUENCES AS A GENERAL SOURCE FOR POLYMORPHIC DNA MARKERS. Nucleic Acids Research 17, 6463-6471. 19894. Mullis K.B., THE POLYMERASE CHAIN REACTION, Birkhauser, Boston 1994 Dellaporta S.L., Wood J. And Hicks J.B., A PLANT DNA MINIPREPARATION: VERSION II. Plant Molecular Biology Reprter 1(14):19-21, 19835. Velasco Mosquera R, PRINCIPIOS DE LAS TECNICAS MOLECULARES BASADAS EN PCR, Universidad Nacional Sede Palmira. 20046. Rogers S.O., Bendish A.J., EXTRACCION OF DNA FROM PLANT TISSUES. Plant Molecular Biology Manual. A6:1-10.Kluwer Academic Publishers, Belgium, 19887. Howell S.H., THE ISOLATION AND ANALYSIS OF DNA FROM EUKARYOTIC CELLS. In Molecular Techniques and Approaches in Developmental Biology, Chrispeels M.J., Ed. Wiley-Interscience Publication, NY p 127-

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