UNIVERSIDAD NACIONAL DE LOJAAREA AGROPECUARIA Y DE RECURSOS NATURALES RENOVABLESINGENIERA EN MANEJO Y CONSERVACIN DEL MEDIO AMBIENTE

UNIVERSIDAD NACIONAL DE LOJAREA AGROPECUARIA Y DE RECURSOS RENOVABLES

CARRERA DE: INGENIERA EN MANEJO Y CONSERVACIN DEL MEDIO AMBIENTE.MDULO VIII: OBRAS DE REMEDIACIN AMBIENTALUNIDAD: Biorremediacin y tratamientos biotecnolgicos

TEMA:Determinacin de la calidad del ADN genmico de una bacteria procariota por espectrofotometra y electroforesis RESPONSABLES: Anabel Bermeo Snchez.

DOCENTE: Ing. Klever Granda Mora, Mg Sc.

LOJA -ECUADOR2015TABLA DE CONTENIDOS

TABLA DE CONTENIDOS21.TEMA: Determinacin de la calidad del ADN genmico de una bacteria procariota por espectrofotometra y electroforesis42.INTRODUCCION43.REVISIN DE LITERATURA53.1.Gentica Bacteriana53.1.1.Genoma bacteriano: estructura53.2.Extraccin de ADN53.2.1.Etapas de la tcnica53.2.2.Mtodos ms utilizados63.2.3.Mtodo de anlisis: cuantificacin y cualificacin del ADN7Cuantificacin del ADN por espectrofotometra7Cualificacin del ADN por electroforesis83.2.4.Ventajas y desventajas de los mtodos de extraccin y purificacin de ADN104.MATERIALES Y MTODOS114.1.Ubicacin poltica y geogrfica114.2.Materiales114.3.Mtodos analticos y estadsticos124.3.1.Extraccin del ADN genmico de una bacteria procariota mediante, Mini bacteria kit INVITROGEN.125.RESULTADOS Y DISCUSIN165.1.Objetivo 2: caracterizar cualitativamente el ADN genmico mediante espectrofotometra.165.2.Objetivo 3: caracterizar cuantitativamente el ADN genmico mediante la tcnica de electroforesis.166.CONCLUSIONES187.RECOMENDACIONES188.LITERATURA CITADA199.ANEXOS209.1.Anexo 1. Fotografas de la extraccin de ADN genmico.209.2.Anexo 2. Fotografas de la caracterizacin cuantitativa del ADN por espectrofotometra.229.3.Anexo 3. Fotografas de la caracterizacin cualitativa del ADN por electroforesis.23

1. TEMA: Determinacin de la calidad del ADN genmico de una bacteria procariota por espectrofotometra y electroforesis

2. INTRODUCCION La gentica como tal es la rama de la biologa que se encarga de estudiar los genes y mecanismos que regulan la transmisin de caracteres hereditarios Por otro lado en lo que respecta a gentica bacteriana, su importancia recae bsicamente en que los primeros estudios y caracterizacin del genoma se realiz en clulas bacterianas; generando como tal bases y principios para ser aplicados en organismos ms complejos (UMMC 2014). En la actualidad la gentica bacteriana abre paso a millones de investigaciones de diferente carcter, por ejemplo, en el campo agronmico y de zootecnia para conocer y mejorar las caractersticas de las diferentes especies que en estas se involucran, en el campo de la medicina, para identificar y aislar aquellos genes de inters en el desenvolvimiento de la salud y la prevencin y finalmente pero no menos importante en el campo ambiental, para la generacin de productos o mecanismos ms amigables con la naturaleza, que implican el uso directo de las caractersticas de estas clulas bacterianas y su traspaso o aislamiento de ADN a nuevos organismos, para que adquieran las mismas peculiaridades.Por lo tanto, con el fin de conocer la variacin gentica existente entre individuos, especies o poblaciones as como sus patrones y procesos ecolgicos-evolutivos, y conocer a su vez sus capacidades degradativas, acumulativas, curativas, entre otras, es necesario abordar mediante marcadores moleculares, segmentos de ADN que proporcionan informacin sobre la variacin allica la distincin entre individuos. Por lo general se involucran tcnicas de PCR (Reaccin continua en Polimerasa) y secuenciacin, sin embargo dichas tcnicas empiezan con la extraccin de ADN, la misma que consiste en el aislamiento y purificacin para conocer las caractersticas fsico qumicas de una molcula (Alejos 2014). El aislamiento a su vez se consigue por electroforesis, proceso encaminado a la separacin de fragmentos de ADN y ARN en funcin de su tamao, los mismos que mediante tincin reflejan el contenido de cidos nucleicos de una muestra, consiguiendo una estimacin de concentracin y entereza (Fierro 2014). Es por esto y dada la importancia de la prctica a desarrollarse; en el presente trabajo de laboratorio se han planteado los siguientes objetivos.Objetivo general Determinar de la calidad del ADN genmico de una bacteria procariota por espectrofotometra y electroforesis.

Objetivos especficos

Extraer el ADN de una bacteria procariota mediante, Mini bacteria kit INVITROGEN. Caracterizar cuantitativamente el ADN genmico mediante espectrofotometra. Caracterizar cualitativamente el ADN genmico mediante la tcnica de electroforesis.

3. REVISIN DE LITERATURA3.1. Gentica Bacteriana3.1.1. Genoma bacteriano: estructuraEl cido desoxirribonucleico (ADN), macromolcula encargada de codificar toda la informacin necesitada para programar las actividades de las clulas incluyendo la reproduccin, el metabolismo y otras funciones especializadas, est constituida por dos filamentos de nucletidos. Cada uno contiene un fosfato, un azcar de 5 carbones (2-desoxirribo) y una de cuatro bases nitrogenadas: adenina, citosina, timina guanina. El fosfato y el azcar componen la espina dorsal de cada filamento de ADN, mientras que las bases son responsables de sostener los dos filamentos juntos va enlaces del hidrgeno en una estructura llamada la hlice doble. El orden de las bases en un filamento de la ADN contiene la informacin gentica cifrada. Toda la ADN encontrada en un organismo se refiere colectivamente como el genoma. El genoma humano se abarca de 23 pares de cromosomas lineares, y de aproximadamente 3000 megabases (Mb) de ADN, mientras que el genoma de Escherichia coli consiste en un solo cromosoma de la circular del Mb (Rocha 2002).3.2. Extraccin de ADNPrincipio. Proceso mediante el cual hay separacin del ADN de un ser vivo de los dems elementos celulares a travs del aislamiento del mismo. Se requiere del rompimiento de la membrana celular con la finalidad de acceder al ncleo de la clula; una vez en el citoplasma se debe cribar la membrana nuclear para dejar libre al ADN, y por ltimo es necesario protegerlo de enzimas que puedan degradarlo (DNAsas) para retirarlo completamente (Rocha 2002).La extraccin bsicamente consiste en el aislamiento y purificacin de molculas de ADN, basndose en las caractersticas fisicoqumicas de la molcula. En donde los grupos fosfato al estar cargados negativamente y ser polares (ADN una carga neta negativa) permite contar con una fuerte tendencia a repelerse, lo que permite a su vez, disolver al ADN en soluciones acuosas y formar una capa hidratante alrededor de la molcula. A su vez le permite unirse a molculas y matrices inorgnicas cargadas positivamente (Alejos 2014). 3.2.1. Etapas de la tcnicaLas etapas que generalmente que se siguen en un proceso de extraccin de ADN, es el mismo, las variaciones por otro lado se denotan en el mtodo a emplearse y los kit o programas a utilizarse (figura 1). Sin embargo entre las fases necesarias para que se d una correcta extraccin y purificacin del ADN mediante un procedimiento qumico se tiene:1. Lisis de las clulas. Las sales caotr- picas ayudan a romper la estructura tridimensional de macromolculas como las protenas o los cidos nucleicos consiguiendo su desnaturalizacin. La adicin de un detergente como el SDS es necesaria a menudo para eliminar las membranas.

2. Degradacin de la fraccin proteica asociada al ADN. Se consigue mediante la adicin de una proteasa. La fraccin proteica puede precipitarse mejor con la ayuda de sales como el acetato de amonio o el acetato sdico.

3. Purificacin. El proceso consta de tres fases:a) Precipitacin del ADN. El ADN es insoluble en alcohol, por lo que se puede precipitar etanol fro o isopropanol y recuperar mediante una centrifugacin. El alcohol del sobrenadante se llevar las sales aadidas previamente.b) Lavado del pellet. Se realiza con alcohol fro volviendo a centrifugarsec) Recuperacin. El sedimento se puede resuspender en agua o tampn Tris tras ser secado completamente.

4. Determinacin de la calidad del ADN. Involucra un anlisis cuantitativo y cualitativo (Radstrom 2009).

Figura 1. Metodologa del proceso de extraccin de ADN3.2.2. Mtodos ms utilizadosSegn el INCP (2003) para extraer los cidos nucleicos del material biolgico, se requiere de forma necesaria provocar una lisis celular, inactivar las nucleasas celulares y separar los cidos nucleicos de los restos de clulas. El procedimiento de lisis idneo suele consistir en un equilibrio de tcnicas, siendo lo necesariamente fuerte como para romper el material inicial complejo, pero a su vez lo suficientemente suave para preservar el cido nucleico diana. Entre los procedimientos usuales de lisis figuran los siguientes: rotura mecnica (trituracin, lisis hipotnica, etc.); tratamiento qumico (detergentes, agentes caotrpicos, reduccin con tioles, etc.); digestin enzimtica (Proteinasa K, etc.).Por otro lado con el pasar de los aos Alejos (2014) indica que se han diseado distintos protocolos con la finalidad de obtener una cantidad y calidad de ADN adecuados, as como garantizar la eliminacin de inhibidores potenciales que dificulten el tratamiento posterior de la molcula. Entre los mtodos ms comunes se encuentran: Mtodo tradicional. Desarrollado en los aos 50, utiliza solventes orgnicos para separar a las protenas del ADN y, una vez suspendido en la fase acuosa, aislarlo por precipitacin con etanol. Estos mtodos requieren preparar soluciones y la extraccin puede tomar desde unas horas hasta varios das por los numerosos pasos que deben realizarse. En general, los protocolos tradicionales consisten de cinco etapas principales: homogeneizacin del tejido, lisis celular, separacin de protenas y lpidos, precipitacin y redisolucin del ADN. Mtodo moderno. Involucra el uso de kits y extractores automticos robotizados con la mnima intervencin de operadores, que permitan mejorar la precisin, obtener resultados reproducibles y reducir el tiempo de extraccin, en particular cuando se requiere procesar una gran cantidad de muestras. Da como resultado un ADN ntegro y sin contaminantes, esencial para tener xito en la obtencin de datos genticos.

3.2.3. Mtodo de anlisis: cuantificacin y cualificacin del ADNLos mtodos de anlisis de la obtencin y aislamiento del ADN involucra una caracterizacin cuantitativa y cualitativa del mismo, esto con la finalidad de conocer su calidad.Cuantificacin del ADN por espectrofotometraGeneralidades. La espectrofotometra UV-visible es una tcnica analtica que permite determinar la concentracin de un compuesto en solucin. Se basa en que las molculas absorben las radiaciones electromagnticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentracin. Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotmetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solucin y medir la cantidad de luz absorbida por la misma. La electroforesis a su vez se basa en la Ley Lambert Beer, la misma que consiste en un medio matemtico que expresa cmo la materia absorbe la luz. Esta ley afirma que la cantidad de luz que sale de una muestra es disminuida por tres fenmenos fsicos: La cantidad de material de absorcin en su trayectoria (concentracin) La distancia que la luz debe atravesar a travs de la muestra (distancia de la trayectoria ptica) La probabilidad de que el fotn de esa amplitud particular de onda sea absorbido por el material (absorbencia o coeficiente de extincin)

Cuantificacin. La ley de Beer-Lambert indica que la concentracin de una molcula en solucin depende de la cantidad de luz absorbida de las molculas disueltas. Una caracterstica del ADN es que absorbe la luz ultravioleta (UV) a 260 nm y permite estimar su concentracin mediante espectrofotometra. Cuando la longitud de la celda en que se disuelve el ADN, es de 1 cm, la absorbancia es igual a la densidad ptica (DO). En el caso de ADN genmico o de doble cadena, una densidad ptica equivale a 50 ug/ml (Leninger 1975). Se debe considerar el factor de dilucin para obtener la concentracin en nanogramos/microlitro (ng/ul).

En el caso de algunos equipos como el espectrofotmetro Nanodrop, no es necesario diluir la muestra y el equipo nos proporciona directamente la concentracin en ng/ul. Considerando que para una reaccin de PCR se requieren de 10 a 200 ng debemos obtener al menos, 5 ng/ul de ADN en cada muestra, si se recuperaron 50 ul, el rendimiento neto de la extraccin sera de 0.25 ug. Concentraciones menores dificultan la estandarizacin de la PCR u otras tcnicas.Para estimar la pureza del ADN se considera la proporcin de la absorbancia a 260 nm y 280 nm.

Una proporcin de 1.8 es aceptada como ADN puro, proporciones menores a este valor indican la presencia de protenas. Una segunda valoracin de la pureza de cidos nucleicos es la proporcin 260/230, los valores aceptados se encuentran en el rango de 2.0 a 2.2, si la relacin es menor indican la presencia de contaminantes como carbohidratos o fenol (Alejo 2014).

Cualificacin del ADN por electroforesis

Generalidades. La electroforesis es una tcnica para la separacin de molculas segn la movilidad de estas en un campo elctrico a travs de una matriz porosa, la cual finalmente las separa por tamaos moleculares y carga elctrica, dependiendo de la tcnica que se use (Morales 2010).

Tipos. La electroforesis abarca algunos tipos como:

Electroforesis capilar en zona o en disolucin libre (CZE). Es el procedimiento de electroforesis ms habitual, en el cual el capilar es recorrido por el electrolito a travs de un medio buffer que puede ser cido (fosfato o citrato), bsico (borato), o anftero (carcter cido y bsico). El flujo electroosmtico crece con el pH del medio electrofortico.

Electroforesis capilar electrocintica micelar (MEKC). En esta variante del procedimiento anterior se aade a la fase mvil un compuesto catinico o aninico para formar micelas cargadas. Estas pequesimas gotitas inmiscibles con la disolucin retienen a los compuestos neutros de un modo ms o menos eficaz, por afinidad hidrfilahidrfoba. Se puede utilizar este tipo de electroforesis para molculas que tienen tendencia a migrar sin separacin, como es el caso de algunos enantiomeros.

Electroforesis capilar en gel (CGE). Esta es la transposicin de la electroforesis en egel de poliacrilamida o de agarosa. El capilar est relleno con un electrolito que contiene al gel. Se produce un efecto de filtracin que ralentiza a las grandes molculas y que minimiza los fenmenos de conveccin o de difusin. Los oligonucletidos, poco frgiles, se pueden separar de este modo.

Isoelectroenfoque capilar (CIEF). Esta tcnica, tambin conocida como electroforesis en soporte, consiste en crear un gradiente de pH lineal en un capilar con pared tratada que contiene un anftero. Cada compuesto migra y se enfoca al pH que tenga igual valor que su punto isoelctrico (al pI su carga neta es nula). Seguidamente, bajo el efecto de una presin hidrosttica y manteniendo el campo elctrico, se desplazan las especies separadas hacia el detector. Las altas eficiencias obtenidas con este procedimiento permiten separar pptidos con pI que apenas difieren entre s 0.02 unidades de pH (Morales 2010).

Etapas de la tcnica. Segn Fierro (2014) la tcnica de electroforesis est dada por una serie de siete pasos los mismos que son:

Obtencin de las muestras de ADN Preparacin del gel de agarosa. Preparacin de las muestras con el buffer de carga. Carga de las muestras. Corrida del gel. Teido del gel. Visualizacin del gel con luz ultravioleta y anlisis de resultados.

ba

Figura 2. Cmaras de electroforesis: a) vertical; b) horizontal

Cualificacin. El anlisis de los geles de agarosa y poliacrilamida se realiza preferiblemente en un aparato documentador de geles (por ejemplo el Molecular Imager ChemiDoc XRS System de Biorad), los cuales tienen incorporado un software que permite guardar fotografas del gel en formatos como TIFF, JPG, etc., adems de llevar a cabo anlisis densitomtricos cuando se necesite realizar una cuantificacin precisa de la intensidad de las bandas en el gel.

Esta cuantificacin puede tener distintas aplicaciones, por ejemplo la estimacin de la concentracin de ADN en una muestra mediante comparacin con otra muestra de concentracin conocida, y la comparacin de las cantidades de ADNc en un experimento de RT-PCR semicuantitativa. Adems los programas de anlisis pueden realizar una estimacin del tamao de los fragmentos (Fierro 2014).

3.2.4. Ventajas y desventajas de los mtodos de extraccin y purificacin de ADNLas ventajas y desventajas de la tcnica de extraccin de ADN estn en funcin de los mtodos a utilizarse. Una de las ventajas de utilizar mtodos tradicionales es su bajo costo, as como un alto rendimiento. Sin embargo, en ocasiones el material obtenido est fragmentado. Estos mtodos son susceptibles de contaminacin, variacin y errores por los mltiples pasos de manipulacin.

El rendimiento de los kits depende del tipo de tejido y la cantidad de muestra inicial, as como de la capacidad de unin de la membrana. La matriz permite capturar selectivamente al ADN haciendo posible obtener un extracto de alta pureza con molculas ntegras; al tiempo que se reduce el nmero de pasos en la extraccin y se disminuye la posibilidad de contaminacin con ADN o ARN exgeno, con lo que se garantiza la obtencin de resultados confiables.

Las tcnicas actuales de biologa molecular no requieren de grandes cantidades de material gentico.

4. MATERIALES Y MTODOS4.1. Ubicacin poltica y geogrficaEl Laboratorio del Centro de Biotecnologa de la Direccin de Investigaciones de la Universidad Nacional de Loja se encuentra ubicado en la Ciudad Universitaria Guillermo Falcon Espinosa, La Argelia, Avenida Reinaldo Espinoza y Avenida Pio Jaramillo Alvarado. En cuanto a sus coordenadas geogrficasLatitud: 3 59 0 S,Longitud: 79 12 0 W

Centro de biotecnologa

4.2. MaterialesEn la presente prctica de laboratorio se emplearon los siguientes materiales.Materiales de laboratorio: los materiales a emplearse estn divididos de acuerdo al procedimiento que se realiz.Extraccin del ADN genmico (Mini bacteria kit INVITROGEN): reactivos: RNasa, buffer de resuspensin (R4), buffer de lisis (L14), buffer de unin (B8), buffer de lavado (W12), buffer de elucin (E5), lisosima, Proteinasa K; instrumentos de laboratorio: Bao Mara, incubadora, centrifugadora, micropipetas (50, 100 y 1000 l), vortex, Perlas Magneticas del Kit ChargeSwitch, gradilla magntica, tubos de 5ml, tubos eppendorf. Proceso de espectrofotometra: reactivos: ADN diluido en el buffer (ADN de ganglios); instrumentos de laboratorio: toallas clean tissue micropipeta (1000 l), Nanodrop (espectofotmetro). Proceso de electroforesis: reactivos: Syber safe, agarosa grado molecular, TBE 10X y agua destilada, azul de bromofenol; instrumentos de laboratorio: micropipetas, puntas para micropipetas, tubos tipo eppendorf, cmara de electroforesis horizontal, peines para las bandejas, bandeja para la preparacin del gel, fuente de poder, probetas de 50mL, 100mL y 1000mL, botella de vidrio con ms de dos veces el volumen de la solucin de agarosa a preparar, guantes de ltex, guantes para calor.Materiales de oficina: cuaderno de apuntes, computador, red, rotulador.4.3. Mtodos analticos y estadsticosCon el fin de cumplir los objetivos establecidos en la prctica se ha credo conveniente establecer y detallar la metodologa que se sigui en base a los objetivos ya planteados. La metodologa que se emple la explic el Ing. Klever Granda, Mg, Sc y la Dra. Loidy Zamora.4.3.1. Extraccin del ADN genmico de una bacteria procariota mediante, Mini bacteria kit INVITROGEN.Para el aislamiento del ADN genmico el procedimiento se rigi bsicamente a seis pasos, tal como se detalla a continuacin (anexo 1):1. Antes de comenzara) Adicionar el contenido RNasa A al buffer de resuspensin (R4). Mezclarlo bien. Marcar el frasco para saber que se ha adicionado la RNasa A. Almacenar el buffer con RNasa a 4C.b) Adicionar 5 l de lisosima fresca (50 mg/ml) a 100 l de buffer de resuspensin con RNasa A para cada muestra.2. Lisis de clulas bacterianas1. Disponer de Bao de Mara, estufa o bloque calentador a 37C, 55C y 80C.2. Colectar las clulas bacterianas por centrifugacion de 1 ml de cultivo crecido. 3. Pipetear 1 ml del cultivo bacteriano y depositarlo en un tubo eppendorf.4. Centrifugar a 6000 rpm por 5 minutos. 5. Desechar el sobrenadante con cuidado para no romper el pellet.6. Adicionar los 100 l de buffer de resuspensin (R4) con RNasa A y lisosima al pellet de las clulas de cada muestra. Pipetear progresivamente para asegurarse que las clulas han sido bien distribuidas.7. Incubar las muestras por 10 minutos a 37C.8. Durante la incubacin mezclar 500 l del buffer de lisis (L14) con 10 l de Proteinasa K para cada muestra.9. Adiconar 500 l del buffer de lisis (L14) con 10 l de Proteinasa K a cada muestra e invertir el tubo 6 veces para mezclar la muestra.10. Incubar las muestras: Para bacterias Gram negativas: incubar de 1-1.5 horas a 80C. Para bacterias Gram positivas: incubar de 10 minutos a 55C.3. Uniendo el ADN1. Darle vrtex a los tubos que ocntienen las Perlas Magneticas del Kit ChargeSwitch 2. Adicionar 40 l de los tubos de Perlas Magnticas a las muestras del paso 10 del protocolo anterior.3. Pipetiar progresivamente para mezclar sin formar burbujas.4. Adicionar 300 l del buffer de unin (B8) y mezclar usando 5-6 pulsos cortos en el vrtex.5. Incubar a temperatura ambiente por 1 minuto.6. Ubicar las muestras en la gradilla magntica durante 1 minuto o hasta que las perlas magnticas hayan formado un pellet.7. Sin sacar los tubos de la gradilla magntica, pipetear el sobrenadante cuidando no mover el pellet de perlas magnticas pegado a la gradilla magntica.8. Procede inmediatamente a lavar el ADN.4. Lavado del ADN1. Sacar los tubos de la gradilla magntica conteniendo el pellet.2. Adicionar 1 ml del buffer de lavado (W12) a cada muestra y pipetear gentilmente 3 veces sin formar burbujas.3. Ubicar las muestras en la gradilla magntica durante 1 minuto o hasta que las perlas magnticas hayan formado un pellet.4. Sin sacar los tubos de la gradilla magntica, pipetear el sobrenadante cuidando no mover el pellet de perlas magnticas pegado a la gradilla magntica.5. Sacar los tubos de la gradilla magntica conteniendo el pellet.6. Proceder inmediatamente a elidir el ADN. 5. Eluyendo (liberando) el ADN1. Sacar los tubos de la gradilla magntica conteniendo el pellet.2. Adicionar 200 l del buffer de elucin (E5) a cada muestra y pipetear gentilmente 5-10 veces para mezclar sin formar burbujas.3. Incubar a 55C durante 5 minutos. 4. Ubicar las muestras en la gradilla magntica durante 1 minuto o hasta que las perlas magnticas hayan formado un pellet.5. Sin sacar los tubos de la gradilla magntica, transferir cuidadosamente el sobrenadante conteniendo el ADN a un nuevo tubo eppendorf. Tener cuidado y no mover el pellet para que no se adicionen perlas magnticas al ADN. Si el sobrenadante presenta un color caf, repetir los pasos 4 y 5 de esta seccin del protocolo.6. Almacenamiento del ADNa) Para uso inmediato almacenar a 4C, de lo contrario almacenar a -20C.

4.3.2. Caracterizacin cuantitativa del ADN genmico mediante espectrofotometra.Para determinar la caracterizacin cuantitativa del ADN genmico, se utiliz una muestra de ADN de ganglios, dado que el ADN extrado no fue cuantitativamente representativo. La metodologa a desarrollarse fue (anexo 2):1. Tener listo el software en cargado de realizar la lectura cuantitativa del ADN. Preparar la ventana de cidos nucleicos y seleccionar factor DNA 50.2. Limpiar el pedestal del Nanodrop. Utilizar toallas de clean tissue para mejores resultados.3. Colocar en el pedestal 1 l de la muestra. Extraer con una pipeta 1 l de ADN de ganglios diluido en el buffer.4. Analizar los datos obtenidos. Procesar la informacin en el software y observar los datos por cada una de las muestras.

4.3.3. Caracterizacin cualitativa del ADN genmico mediante la tcnica de electroforesis.En lo que respecta a la caracterizacin cualitativa, por electroforesis, los pasos a seguirse fueron los siguientes (anexo 3):1. Preparacin de un gel de agarosa al 1%1. Prepare la bandeja sellando los bordes por presin o con cinta adhesiva (esto depende del modelo de cmara utilizado) y pngale los peines.2. Pese 2,5 gr. de agarosa.3. Coloque la agarosa dentro de un envase de vidrio que contenga 250 mL de buffer TBE 0,5X y caliente en el microondas o en el bao de Mara hasta su completa disolucin.4. Cuando la solucin de agarosa haya alcanzado una temperatura soportable por la mano, agregue 25 uL de SYBR blue *1 (dilucin final de la solucin comercial es 1 en 10.000).5. Mezcle bien, agitando el recipiente en forma circular, evitando que se formen burbujas en la solucin.6. Sirva la solucin en la bandeja de corrida vertiendo la solucin lentamente por uno de los extremos de la bandeja y retire las burbujas que queden sobre el rea de corrida de las muestras con una punta limpia.7. Deje polimerizar la agarosa y solidificar durante al menos 30 min.2. Preparacin de las muestras. Mezclar tanto las muestras de ADN como el marcador de tamao con 0.2 volmenes del buffer de carga 6x. El volumen total estar determinado por el tamao de los pocillos, habitualmente 15-30 l.3. Carga de las muestras y corrida del gel1. Una vez que el gel ha solidificado retirar el sellado de los bordes y colocar el molde con el gel en la cmara de electroforesis.2. Aadir buffer de electroforesis (TAE 1x o TBE 0.5x) hasta que cubra el gel unos 3-5 mm.3. Retirar cuidadosamente el peine para que queden libres los pocillos para las muestras.4. Cargar en los pocillos las muestras preparadas.5. Nota: Dependiendo del tipo de muestra y del marcador, frecuentemente es conveniente calentar a 65C las muestras durante 3-5 min y enfriarlas en hielo antes de cargarlas.6. Conectar los cables a la fuente alimentacin y aplicar un voltaje de 100 V por 40 minutos. El ajuste del voltaje es muy variable dependiendo de la cmara y de los tamaos que se pretenden separar, se recomienda voltajes no muy altos para tamaos muy grandes del ADN.7. Correr el gel hasta que el colorante azul de bromofenol est a una distancia del borde de aproximadamente un 25% de la longitud total del gel. En ese momento debe detenerse la electroforesis.4. Tincin del gel y visualizacin del ADN1. Si no se aade el BrEt al gel, ste debe teirse una vez finalizada la electroforesis. 2. Colocar el gel sobre un transiluminador y encender la lmpara de luz ultravioleta ( 300 nm), el ADN se visualizar como bandas de color anaranjado.3. Fotografiar el gel con el sistema fotogrfico disponible.

5. RESULTADOS Y DISCUSINLos resultados de la prctica al igual que la metodologa fueron planteados y deducidos en base a los objetivos del presente trabajo.5.1. Objetivo 2: caracterizar cuantitativamente el ADN genmico mediante espectrofotometra.

Cuadro 1. Resultados cuantitativos de la concentracin de ADN.MuestraConcentracin de ADN (ng/ul)*Relacin**

1596,31,91

21402,01,88

32660,11,90

41234,51,90

5751,51,82

6798,51,92

7336,61,89

*Concentracin ideal 250 ng; ** Relacin ideal 1,8.

En el cuadro 1 se presencia los resultados obtenidos por el software del espectofotmetro Nanodrop del laboratorio de microbiologa, por las siete muestras utilizadas. Una de las caractersticas del ADN es que absorbe la luz ultravioleta (UV) a 260 nm y permite estimar su concentracin mediante espectrofotometra. Dada su capacidad, las concentraciones de ADN que se reflejan en el cuadro se encuentran bajo concentraciones ideales, puesto que estn por encima de 250 ng, lo que facilita la utilizacin de estas en otras tcnicas como la electroforesis o el PCR.

Por otro lado en lo que respecta a la relacin, el parmetro permite identificar si existe la presencia de contaminantes (por debajo de 1,8) o protenas. Dado que los datos del cuadro, reflejan concentraciones por encima de este valor, se deduce que el ADN no presenta ningn tipo de contaminantes. Tanto la concentracin como la relacin permiten identificar la pureza del ADN a diferentes muestras.

5.2. Objetivo 3: caracterizar cualitativamente el ADN genmico mediante la tcnica de electroforesis.

Figura 3. Fotografa de ADN segn el nmero de bandas por electroforesisEn la figura 1 se puede observar la integridad y la concentracin del ADN obtenida por el proceso de electroforesis en gel de agarosa Si el ADN est integro, se debe observar una banda estrecha cercana al pozo en que se coloc la mezcla de ADN. Si est fragmentado, se observar una banda de ms de un cm de ancho o un sendero luminoso en el carril de la muestra. Dadas las consideraciones anteriores, nicamente la muestra 3 (seleccin roja), presenta un ADN ntegro (estrecho), dado que el resto de muestras poseen bandas de mayor extensin hacia la parte vertical de la pantalla. Tanto el ADN de la muestra 1, 3, 4, 5, 6,7 estn fragmentados por lo que dificultan la amplificacin de productos de PCR de alto peso molecular y afecta la reproducibilidad de las tcnicas. Por otro lado en cuanto a la estimacin de la concentracin, una banda fuerte supone una concentracin mayor de ADN, mientras que una banda dbil, una concentracin menor. En la grfica la mayora del ADN se haba degradado, nicamente el de la muestra 3 se encuentra ntegro y no degradado.

6. CONCLUSIONESEn el presente trabajo se ha llegado a las siguientes conclusiones: La extraccin de ADN genmico, permite identificar las caractersticas de un organismo, pudiendo identificar su gnero y especie.

La caracterizacin cuantitativa refleja la pureza del ADN, en cuanto a la concentracin y relacin que esta presente; en el trabajo prctico las siete muestras podan considerarse como puras.

La caracterizacin cualitativa permite estimar la integridad y la concentracin de ADN, por el despliegue de bandas como resultado; en esta ocasin nicamente una muestra se consider como ADN ntegro.

La caracterizacin cuantitativa y cualitativa tuvieron diferentes resultados pese a que las muestras eran las mismas, debido a la falta de calibracin del espectofotmetro Nanodrop 2000.

7. RECOMENDACIONESComo algunas consideraciones en cuanto al comportamiento y actividades en el laboratorio se han planteada las siguientes recomendaciones. Al momento de realizar la extraccin de ADN, se debe tener cuidado con la formacin del pellet y su posible contacto con este con instrumentos como las puntas de la micropipeta, ya que perjudicara la prctica como tal y sus resultados.

Los equipos deben estar bien calibrados, para que los procesos y resultados como tal sean confiables.

Es necesario utilizar proteccin manual al momento de realizar el proceso de electroforesis, ya que el Syber Safe exhibe tambin un efecto mutagnico, pero que es menor al de bromuro de etidio.

8. LITERATURA CITADAAlejos, P; Aragn, M; Cornejo, A. 2014. Extraccin y Purificacin del ADN. Universidad Nacional Autnoma de Mxico (en lnea) Disponible en: http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/710/extraccion.pdf (consultado julio 29, 2015).Fierro, F. 2014. Electroforesis de ADN. Departamento de biotecnologa. Divisin de ciencias Biolgicas y de la Salud. Universidad Autnoma Metropolitana. Mxico (en lnea) Disponible en: http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/710/electroforesis.pdf (consultado julio 29, 2015).Institute for Health and Consumer Protection. 2003. Anlisis de la Presencia de Organismos Genticamente Modificados en Muestras de Alimentos: Extraccin y Purificacin de ADN. Espaa (en lnea) Disponible en: http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20ES/Sesi%C3%B3n4.pdf (consultado julio 29, 2015).Morales, I. 2010. Electroforesis. Universidad Central de Quito-Ecuador (en lnea) Disponible en: http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Exposicion_electroforesis_5087.pdf (consultado julio 29, 2015).Radstrom, P. 2009. La extraccin y purificacin del ADN para el anlisis por PCR. Mitos y realidades. Newsletter Microbial (en lnea) Disponible en: http://www.microbial-systems.com/web/docs/Newsletter_Microbial_03.pdf (consultado julio 29, 2015).Rocha, P. 2002. Teora y prctica para la extraccin y purificacin del ADN de palma de aceite. Laboratorio de marcadores moleculares. Bogot-Colombia (en lnea) Disponible en: http://www.geocities.ws/pedrojrocha/pr/rocha23_3.pdfADNpdf (consultado julio 29, 2015).

9. ANEXOS9.1. Anexo 1. Fotografas de la extraccin de ADN genmico.

Figura 3. Procedimiento de la extraccin de ADN

9.2. Anexo 2. Fotografas de la caracterizacin cuantitativa del ADN por espectrofotometra.

F

FFFigura 4. Procedimiento por espectrofotometra9.3. Anexo 3. Fotografas de la caracterizacin cualitativa del ADN por electroforesis. Figura 5. Prcedimeinto de electroforesis22