EXTRACCIÓN DE ADN Y ELECTROFORÉSIS

Integrantes: Alex Bernal Cerda

Catalina Cornejo Antillanca

Dayana Marilaf Flores

Carla Yañez Castillo

Sección: Sección C1

Profesores: Jenniffer Angulo Trancoso

Gabriel Cunich Ansaldi

Fecha entrega: Jueves 08, Octubre, 2015

UNIVERSIDAD BERNARDO O'HIGGINSFACULTAD DE SALUD, DEPORTE Y RECREACIÓN ESCUELA DE TECNOLOGÍA MÉDICAGENÉTICA

Introducción

La molécula de ADN o acido desoxirribonucleico es quién guarda el código genético de

todos los organismos, ya sean eucariotas o procariotas. Para realizar un estudio adecuado de

éste, se requiere extraer y obtener un ADN puro y libre de contaminantes que interfieran

con su análisis. (1) Para realizar extracción de ADN suele utilizarse el de lisis alcalina, el

cual se basa en la desnaturalización y precipitación selectiva del ADN cromosómico

dejando el DNA plasmidial intacto debido principalmente a su pequeño tamaño y a su

naturaleza circular y generalmente superenrollada. (2)

La electroforesis en gel de agarosa, es la técnica más empleada que separa las moléculas de

ADN según su relación de carga-masa. Al ADN previamente purificado se le aplica un

campo eléctrico bajo el cual migrará siempre hacia al cátodo (por su carga negativa

atribuida a sus grupos fosfato). La migración de este puede verse afectado por diversos

factores, como el tamaño, conformación del fragmento de DNA y pureza del mismo,

concentración del gel de agarosa, tiempo de exposición a los electrodos, etc. (3)

En este laboratorio se realizará la extracción y purificación de ADN, procedimientos de

suma importancia ya que son la primera etapa de la mayoría de los estudios genéticos.

Además de realizar una electroforesis de ADN plasmidial para su posterior análisis.

Objetivos

General: Procesar mediante diversas técnicas moléculas de ADN para su

posterior análisis.

1. Purificar ADN plasmidial de Virus de Tumor Mamario Murino utilizando la técnica

de lisis alcalina.

2. Realizar una electroforesis horizontal en gel de agarosa del ADN plasmidial

previamente purificado.

3. Analizar el ADN plasmidial de Virus de Tumor Mamario Murino y determinar su

tamaño aproximado.

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Procedimiento experimental

El primer día se hizo crecer 5 mL de células transformadas con virus del tumor mamario murino (MMTV) en medio LB más ampicilina por 17 horas a 37°C en agitación constante a 200 rpm.El segundo día se centrifugó (Arquimed, PLC-05) el cultivo de bacterias a 4.000 rpm por 15 minutos a temperatura ambiente. Se eliminó el sobrenadante y se secó el pellet sobre papel absorbente por 1 minuto dando golpes suaves. A ésta se le agregó 250 μL de Solución I (Glucosa/Tris/EDTA) y se resuspendió el pellet con la misma micropipeta p1000 μL (Prime pet), luego se traspasó la solución a un tubo eppendorf de 1,5 mL con micropipeta y se agregó 250 μL de Solución II (NaOH/SDS) y se mezcló por inversión, se dejó pasar 3 minutos y el contenido se tornó transparente y viscoso. A este mismo tubo se le agregó 250 μL de Solución III (Acetato de Potasio 5m) y se mezcló hasta que se formó un precipitado blanco y se llevó a la centrifuga por 10 minutos a 6.000 rpm a temperatura ambiente.Al mismo tiempo, se agregó 700 μL de Isopropanol frío tomado con micropipeta a un nuevo tubo eppendorf de 1,5 mL y se sacó el tubo que estaba en la centrifuga, se recuperó el sobrenadante de ADN plasmidial con micropipeta y se agregó al tubo eppendorf con 700 μL de Isopropanol. Luego este último se agitó en un Vórtex (Bios Lab Chile, QL-901) por 15 segundos y se dejó en el refrigerador (LG) a -18°C por 10 minutos donde la muestra precipitó, se llevó a la centrifuga a 6.000 rpm por 7 minutos a temperatura ambiente y se elimino el sobrenadante con una micropipeta, luego se le agregó 200 μL de Etanol al 75% con la misma micropipeta y se centrifugó a 6.000 rpm por 5 minutos a temperatura ambiente. Se eliminó el sobrenadante de impurezas con una micropipeta sin tocar el pellet de ADN plasmidial y se secó en papel absorbente por 2 minutos hasta que el etanol se evaporó completamente. Luego se resuspendió el pellet en 30 μL de agua libre de nucleasas y se guardo en el refrigerador a -18°C por 7 días.

A la semana siguiente, se preparó el gel de agarosa al 1% en un matraz Erlenmayer donde se mezcló 0,31g de agarosa al 1% más 31 mL de Buffer TAE 1X, para que la solución se disolviera hubo que se aplicar calor con una placa calefactora (Lab tech). Más tarde se trasvasijó la agarosa a un tubo falcón de 50 mL y se añadió con una micropipeta 1 μL de SYBR-SAFE DNA más 2 μL de Bromuro de Etidio y se vertió el gel en una cámara de buffer TAE 1X, a la cual se le adhirió un peine para poder formar los pocillos en el cual se depositaron las muestras. Se dejó enfriar sin mover el contenido para que después de un tiempo a temperatura ambiente este se gelifique completamente y se sumerge dentro de la cámara de electroforesis con buffert TAE 1X.

Luego en un tubo eppendorf limpio con una micropipeta se añadió 2 μL de ADN plasmidial aislado anteriormente y refrigerado por una semana más 8 μL de agua libre de nucleasas y 3 μL de Buffer de carga 6X y se mezcló la solución. A continuación se centrifugó durante 5 segundos para poder recoger todo el volumen de la muestra incluyendo pequeñas gotas que habían quedado repartidas en el tubo.

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Se depositó la muestra en un pocillo de gel de agarosa correspondiente al carril N° 4 con una micropipeta muy cuidadosamente en la cama de electroforesis horizontal (C.B.S Scientific, MGU-102T). Más tarde se cerró la cubeta de electroforesis y se colocó los electrodos de tal forma que el polo negativo quedó al lado de los pocillos y el polo positivo en el extremo opuesto del gel, y se aplicó una corriente eléctrica continua de 120 voltios durante 20 minutos. Después de haber transcurrido 20 minutos se pudo visualizar el ADN con ayuda de un transluminador de luz ultravioleta de onda corta (luz UV). Finalmente se fotografió para poder observar los resultados.

Resultados

Figura 1

Figura 2

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Figura 1: Precipitado de ADN Plasmidial. Obtenido como resultado de la extracción y purificación de ADN plasmidial mediante el método de lisis alcalina. Se observa un diminuto "botón" de ADN en el fondo del tubo eppendorf de 1,5 mL.

Figura 2: Electroforesis horizontal. Migración del ADN en gel de agarosa hacia el cátodo.

Según carril se puede observar (de izquierda a derecha):

1. Carril vacío.2. Corresponde a un estándar o patrón de peso molecular.3. HCB. Presenta 2 isoformas, y un "smear o chorreo" de

ARN.4.

4. MMTV. Nuestra muestra. Se observan 2 isoformas además de un “smear” de ARN. 5. HVI-1. Se observan 2 isoformas además de un “smear” de ARN.6. HCB. Se observan 2 isoformas además de un “smear” de ARN.7. MMTV. Único donde se observan 3 isoformas además de un “smear” de ARN.8. EMCV. Se observan 2 isoformas además de un “smear” de ARN.

Todas las bandas de los carriles presentan una pigmentación similar brillante y anaranjada al ser observada mediante luz ultravioleta (UV), además de observarse aparentemente similar peso molecular. En todas las bandas de DNA hubo migración hacia al cátodo. En el carril N° 4 se puede observar 2 isoformas correspondientes a: enrollada y superenrollada.

Discusión

El arn es altamente sensible a la degradación, se degrado el arn pero de todas maneras quedaron nucleótidos que pueden emitir fluorescencia y eso queda abajo de la muestra. Si se hubiera querido eliminar la muestra, se ocupa RNasa para catalizar la hidrólisis de ARN en componentes más pequeños o se trata con fenol cloroformo. Observamos 3 bandas (3 isoformas) pero para sólo haber obtenido una banda unica para haber obtenido el tamaño por ejemplo, se hubiera tenido que cortar el plasmidio con una enzima restricción , que reconoce una secuencia específica y corta el adn por ambos lados y el plasmidio se abre, queda lineal y al resolverlo en el gel de agarosa se observaría una banda única y ahi se podria decir que en realidad el plasmidio recorrió entre 6500 y 7000 y se puede acortar el rango pero no lo hicimos por tiempo y tampoco era el objetivo del práctico.

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Conclusión

Se puede obtener baja cantidad de ADN plasmidial al ser éste de tamaño pequeño. Con la electroforesis se logra estimar la concentración de DNA mediante un análisis

comparativo con patrones de concentración previamente conocida. La electroforesis depende directamente del campo eléctrico y la masa de la muestra,

ya que este método logra separar moléculas o fragmentos de moléculas de ácidos nucleicos según su carga y su peso molecular.

La agarosa funciona como un filtro en donde los fragmentos de ADN de menor tamaño migran más rápidamente hacia el ánodo mientras que aquellos de mayor tamaño lo hacen más lento.

Las técnicas utilizadas deben realizarse siempre con la mayor precaución posible para evitar dañar o contaminar la muestra, pero además para asegurar la protección del examinador ya que varias de estas muestras resultan potencialmente dañinas para quien las emplea.

Bibliografía

1. Karp, G. Biología Celular y Molecular. (2014). Editorial Interamericana Mc Graw-

Hill. 6° Edición. Barcelona, España. Páginas 389 – 390.

2. Pierce, B. Genética. (2010). Editorial Médica Panamericana. 3° Edición. Madrid,

España. Páginas 201 – 204.

3. Lodish, H., Berk, A. et al. Biología Celular y Molecular. (2006). Editorial Médica

Panamericana. 5° Edición. Madrid, España. Páginas 86 – 88.

4. Melana, S., Picconi, M. et al. (2002). Detección de secuencias homólogas al Gen

Env del Virus del Tumor Mamario Murino (MMTV) en Cáncer de mama de

pacientes argentinas. Revista Medicina. volumen 62, número 4. Páginas 323 – 324.

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