EXPRESIÓNEN

TRIPANOSOMÁTIDOS

Verónica Fernández Mancebo

2013

vfernan@fq.edu.uy

Trypanosoma brucei Trypanosoma cruci

Leishmania major Leishmania mexicana

Trypanosoma brucei

Organización del genoma nuclear

L. major: 32.8Mb en 36 cr peq. (0.28-2.8Mb)

T. brucei: 26Mb en 11cr grandes

T. cruci: 60.3Mb en 41 cr peq

Organizado en grandes grupos de genes policistrónicos (PGCs)

(10 a cientos de genes codifican proteínas en la misma hebra)

Repetidos Repetidos

32 53

¿Promotor? ¿Otras seq?

Codif. para ARNt ó ARNr Organización policistrónica

GGGTTA

ARN polimerasas nucleares

SUBUNIDADESARNpol II 12, ARNpol I 14, ARNpol III 17

5 subun son compartidas entre las 32 subun son compartidas entre I y III con homólogas en la II

5 subun homólogas entre las 35 subun son específicas de III2 subun son específicas de I

Diferencias con eucariotas superiores:Existen varias copias para algunas de las subunidades

El CTD de la pol II no contiene los repetidos 7-pept característicos de eucariotas superiores

• 3 ARN polimerasas nucleares (I, II y III)

• Transcripción policistrónica (genes no relacionados func.)

Inicio de la transcripción

Inicio de la transcripción

Se han identificado muy pocosAlgunos muestran clara identidad de seq con los ortólogos en

levaduras y vertebradosOtros presentan muy baja identidad

Para ARN-pol II: TRF4 (ortólogo div de TFIIB); SNAPc (SNAP50+SNAP2+SNAP3); TFIIA; TFIIH (9 sub); complejo

PBP2

Para ARN-pol III: TFIIIB (2 subunidades)

Para ARN-pol I: CITFA (específico para tripanosomátidos)

Factores de transcripción

Copyright © 2004, American Society for MicrobiologyMol Cell Biol. 2004 November; 24(21): 9610–9618.

doi: 10.1128/MCB.24.21.9610-9618.2004.

Functional Characterization of a Trypanosoma brucei TATA-Binding Protein-Related Factor Points to a Universal Regulator of Transcription in Trypanosomes

Jia-peng Ruan,1 George K. Arhin,2 Elisabetta Ullu,2,3 and Christian Tschudi1,2*

Departments of Epidemiology and Public Health1 Internal Medicine2 Cell Biology, Yale University Medical School, New Haven, Connecticut3

*Corresponding author. Mailing address: Department of Epidemiology and Public Health, Yale University Medical School, 295 Congress Ave., New Haven, CT 06536-0812. Phone: (203) 785-7332. Fax: (203) 785-7329. E-mail: christian.tschudi@yale.edu.

Received 2004 May 16; Revised 2004 July 19; Accepted 2004 August 13.

TRF-4 y SNAP50Rol esencial en ARN pol I, II y III

No necesariamente se unen en la región promotora, pero son importante en la transcripción de los genes:

PARP, SL, U-snRNA

•Factor universal de transcripción relacionado con TBP (TRF4: TBP related

factor 4)

Finalización de la transcripciónPara ARN-pol II:

Tract de 6 o más “T” en 3’ del SL (similar a pol III) está involucrado en la finalización de la transcripción, pero no en la transcripción de genes de proteínas (¿diferencia en los complejos que transcriben?)

En PGCs convergentes se separan por varios ARNt ¿la transcripción termina dentro de los genes de ARNt?

¿estructura de la cromatina importa en la finalización de la transcripción?

Para la ARN-pol III:

Finaliza en varias Ts en el 3’ (nº variable en cada ARNt). No se ha identificado alguna proteína involucrada

Para la ARN-pol I:

Finaliza en el 3’, en área conteniendo secuencias cortas con potencial de formar un loop (similar a bacteria indep de rho)

En genes de PRO: 3 elementos de secuencias en el 3’ que actúan sinergisticamente en una manera dependiente de la orientación

• Es responsable de la transcripción de genes estruct (act, tubulina), de los genes del miniexon (ARN-ME o SLRNA) y otros snoARN

• No parece existir promotores clásicos de eucariotas

• Expresión constitutiva sin gran regulación en el inicio de la transcripción (similar a los TATA-less de eucariotas superiores)

• Sin intrones (excep Poli(A) polim. de T.brucei, T.cruzi)

• Transcripción policistrónica mRNA maduro monocistrónico: capping, poli(A)

ARN polimerasa II

TripartitaInr

100pb

Inr = CYAC/AYR(+1)

SL-RNA T...T

-60 -30 Pol II

PBP2PBP1

3 subunidadesuna TBP-like

InrEvidencia que reclutala pol II

Promotor para ARN-pol II

• Todos los genes de un PGC son transcriptos al mismo nivel como unidad policistrónica

• Todos los ARNm maduros comienzan con la misma secuencia de 30-40 nt -> miniexon (ME - SL)

• Esa secuencia no se encuentra en las vecindades del gen que está siendo analizado

• Existen 100-200 genes para ME por núcleo en tandem

• c/u está presente en un repetido de aprox 1,3 kb

• Su transcripto presenta Cap 4 (m7G, metilaciones 2’OH ribosas 1-4 y metilaciones en las bases 1 y 4) y es monocistrónico

Qué se sabe sobre los pre-ARNm

trans-splicing y poliadenilación están acoplados

Generan ARNm maduro para ser exportado del núcleo

ARNm de las sintetasas de

aminoacil-tRNA

Si todos los genes del una PGC se transcribe en un mismo

transcripto primario ¿por qué se tiene diferente

concentración de las proteínas codificadas por esos genes?

Incluso ¿diferente concentración de ARNm maduro?

Transcripción constitutiva de genes para proteínas

La principal regulación se da a nivelPOST-TRANSCRIPCIONAL

ElongaciónRegiones intergénicas (ME/poli(A))

Estabilidad ARNm (3’UTR)Traducción

Estabilidad de la proteína

Reg. Cod.ME AAAAA n

5’ UTR 3’ UTR

Regulación de la expresión

• Esta regulación es la clave para los cambios en la expresión génica

• Elementos en las regiones intergénicas (rol de las regiones UTR)

GP82: gp de superficie

presente en la forma infectiva y ausente en la

sanguínea

Destinos de los ARNm en

tripanosomátidos

(modelo)

ORF

3’UTR

5’UTRCAP4

RBP

•Transcribe ARN pequeños (5S, tARNs, 7SL-ARN y todos snARN) usando snARN

•Básicamente presenta los mismos promotores que eucariotas superiores: estar tanto en la región 3’ como 5’

Promotor para ARN-pol III

DSE PSE TATA Tipo III

A CTipo I

A BTipo II

Punto de inicio

ARNr 5S

ARNt

U2-U6

TSS/Inr

T. brucei

• Transcribe: ARN ribosomal (nucleolo) y genes de Ags de superficie (VSG y PRO)

• ARNr maduro: 20% 5’PO4 y 80% 5’ OH

• Promotor parecido de los eucariotas superiores

Core promoter

Punto de inicio

–170 –150 –130 –110 –60 –40 –20 –10 +10 +20Upstream control element

Pol I

Promotor para ARN-pol I

Dom III (distal) Dom II DomI

Core

Promotor para ARN Pol

I

Suficiente para transcribir VSG

Se estimula la actividad por la presencia de elementos en el 5’ (UCE)

Aparentemente están siempre activos (regulación de las unidades de VSG y de PRO?).

VSGs

T. brucei:Inmunofluorescencia de formas sanguíneas

usando Acs contra

VSG 221

VSG VO2

Variant Surface Glycoprotein

• Cada cambio se acompaña de un pico de parasitemia

1. Southern blot: ADN de distintas poblaciones del parásito, Digestión con enzimas de restricción, Electroforesis en gel de agarosa, Transferencia a membrana de nylon, Hibridización.

2. Hirbridización con un ADNc de una población (pej. b)

a b c d ...etc

Copia Básica (BC)

Copia ligada a la expresión (ECL)

Más del 50% de los genes VSGs siguen este patrón

Genes VSG: copia ligada a la expresión (ECL)

VSG

Cambio de Expresión

VSG(tel-inact)

VSG(interno)

VSG(tel-act)

VSG(tel-inact)

VSG(interno)

VSG(tel-act)

VSG(tel-inact)

VSG(interno)

VSG(tel-act)

VSG(tel-inact)

VSG(interno)

VSG(copia-act)

VSG(tel-act)

VSG(tel-inact)

VSG(interno)

VSG(tel-act)

VSG(interno)

VSG(tel-inact)

La formación del ELC ocurre por conversión génica

ARN pol mitocondrial (mitARNpol)

El ADN en el kinetoplasto está distribuído en: maxi-(30-50kb) y mini-(0.8-1.6 kb) círculos

10-30 copias 30000-50000 copias genoma mitocondrial ARNguias

No se han encontrado secuencias promotoras consenso

Transcribe ARN poli-cistrónicos que luego se procesa (corte en ARN monocistrónicos seguido/acompañado de editado (+/-U), poli-A para ARNm y poli-U para ARNg)

NOTA: en el núcleo se transcriben:.el ARN mitARNpol, que se sintetiza en el citosol (1 subunidad).los ARNt del kinetoplasto y se deben importar

RET1 (RNA editing TUTase 1).

Editado

• Modificación de información génica codificada en el ADN

• Se adicionan o se remueven bases del ARNm (en general se introducen o se sacan “U”)

• Ocurre en la mayor parte de los ARN mitocondrial.

• Se corrige el marco de lectura.

Simple: número pequeño de U en el extremo 5´ cox2 T.brucei

Extensa: 60% del ARNm maduro no codificado por el gen

> 50% de los genes de T. brucei mitocondriales, ej. Cox3

• Todos los ARNg tienen su propio gen en el minicírculos mitocondriales (salvo el 3’ de COXII)

•Son pequeños (40-70nts) y no sufren edición.

•El extremo 5’ de cada ARNg es complementario a la secuencia cercana a la región editada hacia el 3’ del mRNA.

•El extremo 3’ de los gRNAs tienen una cola de U (5-15nts), agregada por una terminal uridil transferasa (TUTasa).

•La región intermedia contiene la secuencia complementaria a la porción editada del mRNA. (AU, GC y GU)

ARNg

Editado

5’

5’ 3’3’

anclas

Seq guía de edición

pre-ARNm

ARNg

•Editosoma: corta el transcripto y agrega Us (TUTasa), mantiene los extremos abiertos, elimina las Us no apareadas (exoribonucleasa U-específica) y liga los extremos del transcripto mRNA editado.

(Blum et al. 1990

TbRGG2

Armar marcos de lectura:

- crear codón de inicio y de terminación,

- establecer marcos de lecturas funcionales

La edición es esencial para la diferenciación en T. brucei

Las cantidades relativas de ARNm editado y sin editar varía en los diferentes estadios (¿mec. de regulación?)

Algunas consideraciones

Editado

La edición alternativa del RNAm de la citocromo C oxidasa mitocondrial III (COXIII) en Trypanosoma brucei produce una nueva proteína de unión a ADN: AEP-1.

AEP-1 sería una estructura que enlaza físicamente el kADN y cuerpos basales flagelares.

La expresión en tripanosmátidos…

•Entender la regulación la expresión génica ayudaría a comprender procesos (diferenciación, virulencia, variación antigénica) y a encontrar blancos claves para controlar la infección.

•Mecanismo de expresión único (transcrip policistrónica, trans-splicing, editado de ARNm, la ARNpol I sintetiza ARNm).

•La iniciación de la transcripción de genes de proteínas parece ser comparable a los promotores sin caja TATA de humanos y otros mamíferos (cr 1 de L major).

•La transcripción no parece ser atípica ya que se han identificado factores de transcripción generales diferentes a los eucariotas superiores.

¿PREGUNTAS?