Exploración del genoma de cáncer en plasma: Detección de aberraciones del número de copias relacionadas con el tumor, variantes de nucleótido único y heterogeneidad tumoral mediante la

secuenciación masiva en paralelo

K.C.A. Chan, P. Jiang, Y.W.L. Zheng, G.J.W. Liao,

H. Sun, J. Wong, S.S.N. Siu, W.C. Chan, S.L. Chan,

A.T.C. Chan, P.B.S. Lai, R.W.K. Chiu e Y.M.D. Lo

Enero de 2013

www.clinchem.org/content/59/1/211.full

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Introducción

ADN del tumor en plasma• Presente en pacientes con cáncer• Detectado mediante mutaciones, cambios de

metilación de ADN y ácidos nucleicos virales• Estudios previos basados típicamente en 1

marcador de ácido nucleico o un número reducido de estos marcadores

Nuevo enfoque• Secuenciación shotgun de ADN• Exploración del genoma completo

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Introducción

Secuenciación shotgun de ADN en plasma

• Basado en secuenciación de ADN masiva en paralelo

• Secuenciación aleatoria de millones a miles de millones de moléculas de ADN en plasma

• Requiere amplio soporte bioinformático• Método similar usado anteriormente para

diagnóstico prenatal no invasivo

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Pregunta 1

¿Qué tipos de aberraciones moleculares relacionadas con el tumor pueden detectarse en el plasma de pacientes con cáncer?

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Materiales y métodosMuestras:

4 pacientes con carcinoma hepatocelular (HCC) 4 pacientes con infección crónica de hepatitis B sin HCC 1 paciente con cáncer sincrónico de mama y ovarios 16 sujetos de control sanos

Secuenciación de ADN masiva en paralelo Realizada en ADN de plasma, tejidos tumorales y de

capa leucocitaria

Concentraciones fraccionales de ADN de tumor en plasma

Medido al sumar los recuentos alélicos de polimorfismos de nucleótido único que presentan pérdidas alélicas en tumores

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Materiales y métodos

Aberraciones del número de copias: Genoma dividido aproximadamente en 3,000 ventanas

de 1Mb cada una Comparación de cada ventana en cada paciente con

cáncer y portador de hepatitis B crónica con la ventana correspondiente de los 16 controles

Variantes de nucleótido único (SNV) Comparación de datos de secuenciación de ADN de capa

leucocitaria y tejidos tumorales del mismo paciente Elaboración de SNV relacionadas con el tumor; es decir,

mutaciones puntuales Búsqueda de dichas SNV relacionadas con el tumor en los

datos de secuenciación del ADN en plasma del mismo paciente

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Pregunta 2

¿Qué procedimiento estadístico puede usarse para detectar aberraciones del número de copias en el plasma de pacientes con cáncer?

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Resultados principales

Figura 1. Aberraciones del número de copias en el tumor (círculo más interno), plasma anterior a la cirugía (círculo medio) y plasma posterior a la cirugía (círculo mas externo) de uno de los pacientes con HCC. Nótese que el plasma anterior a la cirugía contiene los patrones de ganancias (verde) y perdidas (rojo) del número de copias del tumor

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Resultados principales

Figura 2. Análisis del número de copias en el plasma de un portador de hepatitis B crónica sin HCC. Nótese la sorprendente diferencia entre estos resultados y aquellos del plasma anterior a la cirugía del paciente con HCC que se observa en la figura 1.

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Resultados principales

Aberraciones del número de copias relacionadas con el tumor en plasma

Se asociaron tumores más grandes con mayores concentraciones fraccionales de ADN de tumor en plasma

Se detectaron más aberraciones en pacientes con tumores más grandes

Las ganancias de 2 copias se detectaron con mayor facilidad que las ganancias de 1 copia y las pérdidas de 1 copia

Las concentraciones fraccionales de ADN tumoral en plasma disminuyeron después de la extracción quirúrgica de HCC

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Resultados principales

Aplicaciones en escenarios oncológicos complejos El plasma recibe el ADN de tumores de múltiples

sitios, que incluyen varios tipos de tumores La contribución de cada sitio y tipo de tumor puede

medirse por secuenciación shotgun de ADN en plasma

Útil para el control no invasivo de heterogeneidad tumoral (ver Editorial por Swanton. doi:10.1373/clinchem.2012.197053)

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Resultados principales

Figura 3. Análisis del número de copias en el plasma del paciente con cáncer sincrónico bilateral de ovarios y de mama. (A) muestra las ubicaciones de los tumores. (B) muestra las aberraciones del número de copias en la mama (círculo más interno), una región del cáncer de ovarios (segundo círculo desde el interior), plasma anterior a la cirugía (tercer círculo desde el interior) y plasma posterior a la cirugía (círculo más externo).Nótese que el plasma anterior a la cirugía contiene el compuesto de patrones de ganancias (verde) y pérdidas (rojo) del número de copias de tumores de mama y ovarios. Las regiones genómicas que contienen las aberraciones del número de copias específicas para el cáncer de mama (marcado por un cuadrángulo) o el cáncer de ovario (marcado por una flecha) pueden usarse para medir el ADN del tumor en plasma que aportó cada tumor.

A

B

Tumor ovárico derecho de 12 cm

Tumor ovárico derecho de 6 cm

Carcinoma ductal infiltrante de 3 cm en la mama izquierda

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Resultados principales

Figura 3. Contribución de las SNV asociadas con diferentes regiones del cancer de ovario en plasma. A, B, C y D representan las SNV presentes en solo una de las 4 regiones muestreadas. AB representa las SNV presentes en ambas regiones A y B. CD representa las SNV presentes en ambas regiones C y D. ABCD representa las SNV presentes en las 4 regiones. Los porcentajes indican la proporción del ADN en plasma que aportó cada clase de SNV.

A

Carcinoma ductal infiltrante de 3 cm en la mama izquierda

Tumor ovárico derecho de 12 cm

Clase de SNV

Tumor ovárico derecho de 6 cm

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Pregunta 3

¿Cuáles son las ventajas y las desventajas de la detección de las aberraciones del número de copias relacionadas con el tumor en comparación con las variantes de nucleótido único?

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Conclusiones

La secuenciación shotgun de ADN en plasma en pacientes con cáncer permite lograr un perfil genómico completo de las aberraciones genómicas relacionadas con el cáncer

Esta tecnología permite la detección del tumor, el control en serie, el pronóstico y el análisis de heterogeneidad tumoral

Es necesaria la validación en más casos y más tipos de tumores

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