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EVALUACIÓN DE DOS CLONES DE Escherichia coli...
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EVALUACIÓN DE DOS CLONES DE Escherichia coli TRANSFORMADOS MEDIANTE UN VECTOR PLASMÍDICO CON EL ADN COMPLEMENTARIO DE LA IDURONATO 2- SULFATO SULFATASA HUMANA ANDREA ROJAS MOLANO TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial Para optar al título de MICROBIÓLOGA INDUSTRIAL PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTÁ DC JULIO 2007
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EVALUACIÓN DE DOS CLONES DE Escherichia coli TRANSFORMADOS
MEDIANTE UN VECTOR PLASMÍDICO CON EL ADN COMPLEMENTARIO DE LA IDURONATO 2- SULFATO SULFATASA HUMANA
ANDREA ROJAS MOLANO
TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial
Para optar al título de
MICROBIÓLOGA INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BOGOTÁ DC JULIO 2007
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946 “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos
en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra
persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
EVALUACIÓN DE DOS CLONES DE Escherichia coli TRANSFORMADOS MEDIANTE UN VECTOR PLASMÍDICO CON EL ADN COMPLEMENTARIO DE LA
IDURONATO 2- SULFATO SULFATASA HUMANA
ANDREA ROJAS MOLANO
APROBADO _____________________ ________________________ Henry Córdoba Ruiz, IQ, M.Sc. Luis A. Barrera Avellaneda, PhD DIRECTOR Co-Director _____________________ ________________________
Raúl A. Poutou BQ, M.Sc., Ph.D. Edwin David Morales Álvarez, Quím. M.Sc.
Jurado Jurado
EVALUACIÓN DE DOS CLONES DE Escherichia coli TRANSFORMADOS MEDIANTE UN VECTOR PLASMÍDICO CON EL ADN COMPLEMENTARIO DE LA
IDURONATO 2- SULFATO SULFATASA HUMANA
ANDREA ROJAS MOLANO
APROBADO _______________________ __________________________ Angela Umaña Muñoz, MPill. LUIS DAVID GOMEZ. MS.c Decana Académica Director de Carrera Facultad de Ciencias. Facultad de Ciencias
A mis papas que fueron el motor de impulso De cada uno de los pasos y tropiezos de mi tesis.
i
AGRADECIMIENTOS A DIOS por permitir que este trabajo se terminara en el tiempo justo y por darme toda
la fortaleza espiritual que necesité.
A mis papás y hermano por estar en cada uno de los pasos de éste proceso.
A Catalina y Joko por ser las mentoras de todo el proceso y las que me dieron fuerzas
para continuar, por brindarme su apoyo, su tiempo.
A David Morales por su colaboración desde Armenia, por el envío de las cepas y por
todos los inconvenientes que solucionó a distancia.
A mi Quinta, a Pelkin, y la Hormi por ser los amigos de toda mi carrera por estar ahí
siempre y ayudarme a levantar.
A mi gran familia el IEIM, por ser quienes me acogieron hace más de 3 años por
brindarme todo tipo de apoyo y seguridad. A Henry por enseñarme muchas cosas y
por ayudarme a madurar intelectualmente. Al Doctor Barrera por tener siempre un as
bajo la manga y hacer todo un poco más fácil. A Jenny Granados por hacer posible
que muchas cosas de este trabajo salieran rápido. Ana Rosita quien estuvo junto a mí
en momentos importantes, consiguiendo lo que necesitaba y por estar pendiente de mí
en todo sentido. Y al resto de los integrantes del Grupo, por cada granito de arena que
pusieron para que esto fuera posible, y pues bueno porque el que vive el IEIM es el
que lo goza; le agradezco especialmente a Javier Alméciga por todo lo que aprendí de
su trabajo y el tiempo que me dedicó; a Olguita, Luisfe, Linis, Rocio, Estefi, Johanita, a
mi Lunis, a Mariandre, Ines Estella, Maria Lu, Caro y Alex.
A la persona que tuvo que soportar todas las cosas que sucedieron en el proceso,
gracias mi Joel por estar ahí, junto a mi.
ii
TABLA DE CONTENIDO Pág 1. INTRODUCCIÓN---------------------------------------------------------- 1
2. MARCO TEORICO Y REVISIÓN DE LITERATURA---------------- 3
2.1 Procesamiento de Glicosaminoglicanos-------------------------- 3
2.2 Síndrome de Hunter (Mucopolisacaridosis Tipo II) ------------ 3
2.3 Iduronato-2- Sulfato sulfatasa--------------------------------------- 9
2.4 Terapia de Reemplazo enzimático -------------------------------- 10
2.5 Sistema de Expresión de Proteínas Recombinantes-------- 11
2.5.1 Escherichia coli (E. coli) ------------------------------------------ 11
2.5.1.1 Cepa E. coli BL21---------------------------------------------------- 14
2.5.1.2 Cepa E. coli DH5α--------------------------------------------------- 15
2.5.2 Vector -------------------------------------------------------------------- 16
2.5.3 Plásmido pUC13 ---------------------------------------------------- 16
2.5.4 Plásmido pGEX-3X---------------------------------------------------- 17
2.5.5 Control de la transcripción. El operón lactosa------------------ 18
2.6. Electroforesis en gel de poliacrilamida ---------------------------- 19
2.7. Western Blot --------------------------------------------------------------- 20
2.8. PCR (Polimerase Chain Reaction) ---------------------------------- 21
2.9. Cuerpos de Incusión ---------------------------------------------------- 23
3. Planteamiento del problema y Justificación------------------------------ 25
4. Objetivo General---------------------------------------------------------- 26
4.1 Objetivos Específicos-------------------------------------------------- 26
5. Materiales y Métodos--------------------------------------------------------- 27
5.1 Microorganismos------------------------------------------------------ 27
5.2 Lisis Celular ------------------------------------------------------------ 27
5.3 Extracción de ADN plasmídico Miniprep------------------------ 27
5.4 Digestiones plásmido pGEX-3X IDS---------------------------- 28
5.5 Diseño de primers para amplificar el gen de la IDS --------- 29
5.6 Determinación de la concentración de las proteínas totales 34
5.7 Determinación de Biomasa --------------------------------------- 34
5.8 Electroforesis (SDS-PAGE)--------------------------------------- 34
5.9 Detección de la IDShr por Western blot ---------------------- 35
5.10 Determinación de la actividad biológica de la IDShr----- 35
iii
5.11 Determinación de la concentración de IDShr
por ELISA Indirecta-------------------------------------------------- 36
5.12 Solubilización cuerpos inclusión-------------------------------- 37 6. Resultados --------------------------------------------------------------------- 38
6.1 Estabilidad Genética ------------------------------------------------- 38
6.2 Ruptura celular por sonicación ------------------------------------ 41
6.3 Densidad Celular ----------------------------------------------------- 43
6.4 Determinación de la concentración de las proteínas totales 45
6.5 Western blot ----------------------------------------------------------- 47
6.6 Actividad de IDShr producida en E.coli ------------------------ 50
6.7 Proteína detectada por ELISA Indirecta ----------------------- 51
7. Discusión de Resultados --------------------------------------------------- 53
8. Conclusiones ------------------------------------------------------------------ 59
9. Recomendaciones ----------------------------------------------------------- 60
10. ANEXO ------------------------------------------------------------------------- 61
11. Bibliografía--------------------------------------------------------------------- 65
iv
INDICE DE TABLAS
1. Clasificación de Mucopolisacaridosis -------------------------------- 4 2. Criterios y claves de selección para una plataforma de expresión-12 3. Productos farmacéuticos aplicados a la salud humana que provienen de organismos genéticamente modificados ------------- 14 4. Resultados preeliminares producción a nivel de erlenmeyer de la IDShr con el constructo DH5α pGEX3X/IDS ----------------------- 15 5. Digestiones con enzimas de restricción -------------------------------- 28 6. Primers diseñados ----------------------------------------------------------- 30 7. Condiciones PCR ------------------------------------------------------------ 33 8. Crecimiento de los dos clones de E. coli ------------------------------- 44 9. Determinación de las proteínas totales método de Bradford---- 46
10. Solubilización de cuerpos de inclusión BL21 pGEX3X/IDS----- 47 11. Actividad IDShr ------------------------------------------------------------ 51 12. IDShr detectada por ELISA indirecta --------------------------------- 53
v
INDICE DE FIGURAS 1. Ruta Metabólica de los GAGs------------------------------------------ 5
2. Paciente que padece la enfermedad de Hunter ------------------ 6
3. Sitios potenciales de N-glicosilación ---------------------------------- 9
4. Plásmido pUC13- IDS ---------------------------------------------------- 16
5. Plásmidos pGEX ---------------------------------------------------------- 17
6. Operón lactosa ------------------------------------------------------------ 18
7. Estructura del IPTG ------------------------------------------------------ 18
8. Plásmido pGEX-3X sitio múltiple de clonación ------------------- 19
9. Montaje de Western Blot ----------------------------------------------- 20
10. Esquema del proceso para una reacción positiva
de un western blot ------------------------------------------------------- 21
11. Predicción de cortes con enzimas de restricción ---------------- 29
12. Constructo pGEX3X/IDS ---------------------------------------------- 30
13. Digestiones EcoR I y Sma I ----------------------------------------- 38
14. Mini prep DH5 α pGEX3X/IDS ------------------------------------- 39
15. PCR pGEX-f y pGEX-r ------------------------------------------------ 40
16. PCR IDS- f y pGEX-r -------------------------------------------------- 41
17. Ruptura celular de E.coli --------------------------------------------- 42
18. Electroforesis de muestras sonicadas con una amplitud
del 20% a diferentes tiempos -------------------------------------- 43
19. Crecimiento en placa LBAmp ------------------------------------- 44
20. Crecimiento clones BL21 pGEX3X/IDS y DH5 α pGEX3X/IDS 45
21. Variación del anticuerpo conjugado en el western blot ------ 48
22. Variación del anticuerpo primario en el western blot ------- 49
23. Ensayos con controles positivos y negativos de
rupturas celulares provenientes de los clones de E.coli ----- 50
24. Actividad Enzimàtica E.coli comparada en diferentes muestras 51
25. Comparación de la IDShr detectada por ELISA indirecta
en las muestras de E.coli ------------------------------------------------------ 52
vi
TABLA DE ANEXOS
Anexo 1. Reactivos --------------------------------------------------------- 61
Anexo 2. Curvas Calibración Albúmina ------------------------------- 62
Anexo 3. Curva Calibración IDS----------------------------------------- 63
Anexo 4. Diagrama de Flujo -------------------------------------------- 64
vii
RESUMEN La expresión de proteínas recombinantes, ha sido de gran utilidad en el empleo para
la terapia de reemplazo enzimático. El síndrome de Hunter, enfermedad metabólica en
la que la enzima Iduronato 2- sulfato sulfatasa ha perdido su funcionalidad y se
encuentra deficiente. El Instituto de Errores Innatos del Metabolismo ha diseñado un
nuevo modelo de expresión empleando procariotas para la expresión de proteínas.
Por tanto, se desea expresar la IDSh en un modelo recombinante Escherichia coli
transformado en la Universidad del Quindío, microorganismo ampliamente utilizado
para expresar proteínas menos complejas. En el presente trabajo se pretende evaluar
la transformación del plásmido pGEX3X/IDS en las cepas BL21 y DH5α, por medio de
la técnica PCR, para cual se diseñaron los primers que permitan verificar la inserción
completa del ADNc en el plásmido, y su correcta direccionalidad dentro del marco de
lectura, evidenciando la pérdida de un fragmento de 1.5 kb. Además, se establecieron
condiciones de ruptura celular, y con base en la lectura de proteínas totales de los
lisados se logró estandarizar las condiciones de detección para Western blot y ELISA
indirecta. Adicionalmente, se consideraron protocolos básicos para identificar la
presencia del producto de interés como proteína insoluble en cuerpos de inclusión. Se
propone esta metodología previa a estudios de producción y escalado de este
producto recombinante.
viii
ABSTRACT
The expression of recombinant proteins in Eukariotic and procariotic organisms has
been very useful in enzyme replacement therapies, including Hunter disease or
Mucopolysaccharidosis II (MPS II). MPS II is caused by the deficiency of Iduronate 2-
sulphate sulphatase (IDS). The Institute for the Study of Inborn Errors of Metabolism
(IEIM) has develop a new expression model utilizing Escherichia coli expression of
proteins such as IDS.The purpose of the study was to express IDS in the recombinant
model of Escherichia coli transformed at University of Quindio. The aim of this work
was to the transformation efficiency conditions for the plasmid pGEX3X/IDS in strains
BL21 and DH5 α by means of PCR technique. The primers were designed to verify the
complete insert of the cDNA in the plasmid, and their correct orientation within the
reading frame. In addition, conditions for cellular rupture were standardized. Based on
lysate total proteins it was possible to standardize the detection conditions for Western
blot and indirect ELISA. Moreover, basic protocols were used in order to identify IDS
as insoluble proteins in inclusion bodies. We propose this methodology to evaluate the
efficacy of the insertion steps, before the scaling up process for the enzyme
production.
ix
1. INTRODUCCIÓN En el síndrome de Hunter (MPSII), ó mucopolisacaridosis tipo II la enzima
Iduronato 2-Sulfato Sulfatasa (IDS) ha perdido su funcionalidad; ésta sulfatasa
lisosomal hace parte del catabolismo de dos glicosaminoglicanos (GAGs), tales
como los sulfatos de heparán y dermatán. De este síndrome se conocen dos formas
clínicas diferentes: la forma leve (MPSII B) y la severa (MPSII A). En la secuencia
de la IDS se encuentran ocho sitios potenciales de N-glicosilación. En esta
enfermedad, como en otros errores innatos del metabolismo, el defecto se halla a
nivel del gen que codifica para la enzima, lo cual, la convierte en una patología
intratable mediante la terapéutica convencional. Por ser una “enfermedad rara”
dada su incidencia, el manejo de MPS II, tradicionalmente ha estado dirigido a la
corrección de las manifestaciones clínicas de la enfermedad; en este sentido, el uso
de audífonos y la terapia ortopédica han sido de utilidad. Sin embargo, la búsqueda
de soluciones terapéuticas, ha llevado a diferentes ensayos como, proporcionar a
los pacientes la enzima IDS activa mediante Terapia de Reemplazo Enzimático
(TRE). Mediante esta técnica en la actualidad se ofrece comercialmente, elaprase®,
idursulfasa®, la primera de ellas, una enzima recombinante producida en líneas
celulares humanas, en fibroblastos. La TRE ha mostrado efectividad en otros
desordenes metabólicos como el Síndrome de Gaucher, Fabry, Hurler, Maroteaux-
Lamy y Pompe. Para TRE es necesario el desarrollo de las técnicas de expresión de
proteínas recombinantes, empleando modelos más económicos respecto a las
líneas celulares, como lo son E. coli y levaduras, y su caracterización bioquímica,
con lo cual se ha abierto una ventana de esperanza para el tratamiento del
Síndrome de Hunter.
En el Instituto de Errores Innatos del Metabolismo (IEIM) se ha logrado avanzar en
la Expresión de la IDShr tanto en Escherichia coli, Pichia pastoris y Hansenula
polymorpha como modelos expresión de proteína. También se están estudiando
otras alternativas como la Terapia Génica, o las Células Madre.
En trabajos previos realizados por la doctora Patricia Landázuri y colaboradores de
la Universidad del Quindío, se extrajo el ADNc de la IDShr del plásmido pUC13-
IDSh (plásmido donado por el Doctor Tomatsu, de la Universidad de Saint Louis) el
cual se insertó en el plásmido pGEX-3X. Este constructo, pGEX-3X/IDS se
transfectó con CaCl2, en dos cepas diferentes de E. coli, BL21 y DH5α, se
evidenció experimentalmente actividad biológica de la proteína producida en con el
clon DH5α/pGEX-3X/IDS.
En este trabajo, se presentan los pasos principales que se deben tener en cuenta
para evaluar un microorganismo transformado genéticamente, teniendo en cuenta
técnicas como PCR, digestiones enzimáticas, y otras más específicas para verificar
la expresión del gen insertado, usando Western blot y ELISA Indirecta.
Para escalar la producción de la IDShr, suficiente para estudios de TRE, será
necesario posteriormente, evaluar la producción y actividad de la proteína en los
transformados en los medios tradicionales recomendados por Invitrogen a nivel de
matraz erlenmeyer agitado.
2
2. MARCO TEORICO Y REVISIÓN DE LITERATURA 2.1 PROCESAMIENTO DE GLICOSAMINOGLICANOS (GAGs)
Los Mucopolisacáridos ó recientemente llamados GAGs, son cadenas largas de
moléculas de azúcares, los cuales constituyen el mayor componente de la matriz no
fibrosa del tejido conectivo y se encuentran en grandes cantidades en huesos,
cartílagos, piel, tendones, vasos sanguíneos, válvulas cardíacas, córnea, y en
pequeñas cantidades en otros órganos como hígado y cerebro (Brady, R.O 2006).
En la Tabla 1 se muestran los tipos diferentes de errores innatos del metabolismo
asociados a la acumulación de uno o varios mucopolisacáridos. Estos
heteropolisacáridos están compuestos por residuos de hexosaminas, ácidos
urónicos y galactosa; de los anteriores, la N-acetilglucosamina y el ácido L-idurónico
estan presentes en los sulfatos de heparán y dermatán (Neufeld et al,1995).
Existen por lo menos siete GAGs: Acido Hialurónico, heparina y sulfatos de
Condroitín, Queratán I y II, Heparán y Dermatán; su degradación incompleta causa
que se acumulen en el lisosoma intracelularmente, provocando un daño progresivo
y una sintomatología específica (Scriver et al,2001). En la figura 1, se muestra la
ruta catabólica de los GAGs.
2.2 SINDROME DE HUNTER (MPS II) El síndrome de Hunter (OMIM309900) es una enfermedad relacionada con la
acumulación de mucopolisacáridos a nivel lisosomal; ésta enfermedad fue descrita
en 1917 por el profesor de Medicina en Manitoba Canadá, Charles Hunter (Scriver
et al, 2001). Todos los individuos con MPSII presentan disminución en la actividad
biológica de la IDS.
3
TABLA 1. Clasificación de las Mucopolisacaridosis
MPS Nombre Enfermedad
Enzima deficiente GAG´s Acumulados
Manifestaciones clínicas
Tipo I Hurler α-L- Iduronidasa Dermatán y Heparán
Opacidad Corneal. Disostosis Múltiple. Organomegalia. Enfermedad Cardiaca. Muerte en infancia.
Tipo I Scheie α L- Iduronidasa Dermatán y
Heparán
Opacidad Corneal. Rigidez
articular
Inteligencia Normal
Tipo I/S Hurler/Scheie α L- Iduronidasa Dermatán y
Heparán
Fenotipo Intermedio entre IH y IS
Tipo II Hunter (leve) Iduronato 2- sulfato
(IDS)
Dermatán y
Heparán
Inteligencia normal Corta Estatura
Supervivencia 20-60 años
Tipo II Hunter
(severa)
Iduronato 2- sulfato
(IDS)
Dermatán y
Heparán
Disostosis múltiple Organomegalia
Muerte antes de 15 años.
Tipo IIIA Sanfilippo A Heparán N-Sulfatasa. (Sulfaminidasa)
Heparán Sulfato Deterioro Mental Profundo Hiperactividad. Manifestaciones somáticas medias.
Tipo IIIB Sanfilippo B α N-acetil
glucosaminidasa
Heparán Sulfato Fenotipo similar a III A
Tipo IIIC Sanfilippo C Acetil-CoA:
α−glucosamida
acetiltransferasa.
Heparán Sulfato Fenotipo similar a III A
Tipo IIID Sanfilippo D N-acetilglucosamina
6 – sulfato sulfatasa
Heparán Sulfato Fenotipo similar a III A
Tipo IVA Morquio A N-cetilgalactosamina 6-sulfatasa (GALNS)
Queratán y Condroitín sulfato
Deformidades Esqueléticas
Hipoplasia odontoide; Opacidad Corneal.
Tipo IVB Morquio B βgalactosidasa Queratán sulfato Espectro similar IVA
Tipo VI Maroteaux
Lamy
Arilsulfatasa B Dermatán sulfato Disostosis múltiple; Opacidad
Corneal; Inteligencia Normal
Tipo VII Sly β−Glucuronidasa
(GUSB)
Dermatán, Heparán y Condroitín sulfato
Disostosis múltiple; Hepatoesplenomegalia; Amplio Espectro de Severidad.
Tomado de [Scriver et al,2001]
4
Figura 1. Ruta catabólica de los GAGs
Tomado de BRENDA, The comprehensive enzime information, 2006.
5
Se han intentado diferentes tratamientos para la enfermedad como el transplante de
médula ósea, pero los resultados no han sido alentadores; a la vez, se ha propuesto
la Terapia de Reemplazo Enzimático (TRE), basada en el uso de enzimas
recombinantes (Fernández et al,2000).
La apariencia física de personas con este síndrome se caracteriza por facies toscas
(rasgos faciales bruscos), nariz pequeña, cuello corto, lengua grande, tienen los
dientes espaciados y frágilmente formados, macrocefalia (cabeza grande),
hipertricosis (aumento del cabello), rigidez de las articulaciones, agrandamiento de
los órganos internos como el hígado y el bazo, síndrome del túnel carpiano. Además
presentan dificultades respiratorias y enfermedades relacionadas con problemas
cardiacos, ya que las válvulas del corazón tienden a cerrarse por la acumulación de
glucosaminoglicanos (Scriver et al, 2001).Ver foto, paciente del IEIM, figura 2.
Figura 2. Paciente que padece la enfermedad de Hunter.
Foto archivo del IEIM
Se han establecido dos presentaciones clínicas de la enfermedad: La forma severa
(MPS IIA) la cual se presenta entre los 2 y los 4 años de edad, con retardo mental,
disturbios en el comportamiento y en la mayoría de los casos muerte antes de la
6
adolescencia. Los que padecen la enfermedad presentan hernias inguinales y
umbilicales. La disostosis y la cifoescoliosis se hacen mas obvias con la edad y son
la causa primordial de la baja estatura de los pacientes. La principal causa de la
muerte es la falla respiratoria obstructiva y falla cardiaca por disfunción vascular. La
expectativa de vida es de aproximadamente 15 años (Scriver et al, 2001).
La MPSII se hereda como una enfermedad ligada al cromosoma X. Esto significa
que las mujeres pueden portan la enfermedad y transmitirla a sus hijos sin ser ellas
afectadas. Para detectar posibles portadores se pueden realizar por análisis de
ligamiento en familias Hunter, mapeando el locus de la IDS en el cromosoma Xq27-
28 (Wilson et al,1993). Se ha aislado y secuenciado un ADNc de 2.3 kb que codifica
para la secuencia completa de la IDS humana. Los análisis del precursor de 550
aminoácidos, indican que la IDS tiene una secuencia señal de 25 aminoácidos y
ocho sitios potenciales de N-glicosilación. Se ha encontrado una fuerte homología
de las secuencias de la IDS con las arilsulfatasas humanas A,B,C y con la
glucosamina 6 sulfatasa (Froissart, et al 2002 ; Millat ,et al 1997).
En la forma Intermedia ó Leve (MPS II B), las personas afectadas no presentan
retardo mental y la estatura es cercana a lo normal. Los pacientes pueden sobrevivir
hasta la quinta o sexta década de la vida y normalmente la causa de muerte es la
insuficiencia cardiaca. En esta forma de MPS II no se han observado hidrocéfalos.
(Froissart et al,2002).
Usualmente el criterio empleado para determinar la severidad, esta dado por el
grado de retardo mental el cual es difícil de determinar en pacientes jóvenes.
Adicionalmente se han intentado crear relaciones genotipo-fenotipo para explicar no
solo la gran heterogeneidad clínica, sino también para establecer el pronóstico de la
enfermedad (Shapira, et al,1989). Sin embargo, no siempre es posible la predicción
del fenotipo de un paciente basándose en el genotipo.
Se han propuesto diferentes tratamientos opcionales para esta enfermedad, uno de
éstos es el transplante halogénico de medula ósea. Las pruebas que se realizaron
7
para el tratamiento muestran corrección metabólica en algunos tejidos, pero su
aplicación es limitada debido a la escasez de donadores histocompatibles, y algunas
complicaciones debidas al transplante (Pan et al 2000). La eficacia de terapias para
enfermedades lisosomales puede depender de la instauración de las mismas en
etapas tempranas de la enfermedad, cuando a menudo no es posible predecir la
severidad clínica. Esto tiene implicaciones en terapias para MPS II, como el
transplante de medula ósea, el cual no es exitoso en paciente con la forma severa
(Young et al 1982).
Otra alternativa planteada son ensayos con terapia génica con la cual se pueden
modificar las células involucradas en la patología por medio de la transferencia de
copias “sanas” del gen afectado, de ésta manera las células modificadas pueden
liberar el producto enzimático necesario para así corregir las células vecinas por un
proceso de endocitosis. Los estudios realizados para optimizar esta terapia se
basan en ensayos llevados a cabo en fibroblastos o líneas celulares que expresan la
IDS recombinante, y usando linfocitos o macrófagos transfectados con vectores
retrovirales. (Brady, et al 1973; Gutiérrez M 2005).
Las pruebas de diagnostico para el paciente se basan en la detección de sulfatos de
heparán y dermatán incrementados en orina; una forma mas específica de detectar
la enfermedad es haciendo un estudio enzimático IDS (en el suero, glóbulos
blancos, fibroblastos (Froisart et al, 1995; Shapira et al,1989), y ensayos
moleculares que pueden mostrar mutación en el gen de la IDS (Parkinson-Laurence
et al,2005). La caracterización de la IDS hace posible el diagnóstico definitivo del
síndrome mediante determinación enzimática.
En la actualidad, para medir la actividad biológica, se encuentran disponible dos
clases de sustratos artificiales:
• Sustrato radiométrico, acido O-(alfa –L-iduropiranosiluronico 2 sulftato)-(1-
2,5 anhidro-D-(3H-1)manitol-6-sulfato (Froisart et al,1995)
• Sustrato fluorométrico, 4-metilumbeliferil-α-iduronato-2-sulfato (Vonzyi et al,
2001). El valor de referencia en el IEIM, usando la segunda técnica, para
prueba de leucocitos de individuos normales es de 12 nmolmg-1h-1 y en
8
pacientes con el síndrome, la actividad enzimática varia entre no detectable
y algo de actividad residual.
2.3 IDURONATO 2- SULFATO SULFATASA (IDS) La IDS (EC 3.1.6.13) actúa en los lisosomas, como una exosulfatasa para
hidrolizar la unión éster sulfato del carbono 2 de los residuos terminales del ácido L-
idurónico de los sulfatos de heparán y dermatán. La enzima ha sido purificada a
partir de plasma humano, placenta e hígado (Di Natale, et al 1985)
En estudios posteriores, Flomen et al.1993, reportaron la estructura del gen de la
IDS, el cual está conformado por 9 exones y 8 intrones (Wilson, et al 1993).
La IDS es sintetizada en el retículo endoplasmático rugoso donde también se inicia
a la N-glicosilación; posteriormente, en la cara cis del complejo de Golgi adquiere un
marcador de reconocimiento manosa 6-fosfato (Man 6-P), éste marcador es de gran
importancia debido a la alta afinidad que presenta con el receptor MPRs necesario
para el transporte hasta los lisosomas. Finalmente el complejo MPR-IDS es
transportado al compartimiento prelisosomal donde el pH ácido, causa la liberación
de la enzima en el compartimiento lisosomal (Pan, et al 2000). En la figura 3 se
presentan los sitios de glicosilación encontrados de la producción de la IDSh en
células COS.
Figura 3. Sitios potenciales de N-glicosilación
Tomado de (Millat, et al 1997)
9
Las formas maduras de la IDSh presentan pesos moleculares de entre 42 y 45 kDa;
estas modificaciones incluyen glicosilaciones, fosforilaciones, deglicosilaciones. Su
precursor es de aproximadamente 76 kDa y por fosforilación y glicosilación genera
una forma de 90 kDa, la cual por proteólisis origina una de 62 kDa y otra de 18kDa
(Froisart et al ,1995).
2.4 TERAPIA DE REEMPLAZO ENZIMATICO (TRE) La TRE consiste en proporcionarle al paciente la enzima purificada de origen
exógeno, para proveerla a los tejidos en los cuales esté ausente. Hasta el momento
con ésta terapia se han tratado algunas enfermedades no lisosomales como la
deficiencia de α1-antitripsina, la inmunodeficiencia severa combinada, las hemofilias
A y B, la deficiencia de la hormona del crecimiento y la fibrosis quística (Muenzer et
al, 2002).
Además, ésta terapia es una opción para el tratamiento de la MPS II, pues ya se
han adelantado estudios para enfermedades lisosomales como Gaucher, Fabry,
Hurler o Pompe (Brady et al, 1973). Mediante esta técnica en la actualidad se ofrece
comercialmente, elaprase®, una enzima producida en fibroblastos humanos, y
idursulfasa®.
Se requieren cantidades suficientes de la enzima que no produzca antigenicidad,
con alta actividad específica y que pudiera dirigirse a las células y compartimentos
subcelulares del paciente, de esta manera seria posible contrarrestar los efectos
sistémicos que genera la acumulación de GAGs, y de comenzar el tratamiento del
paciente en enfermedades de aparición temprana se lograría prevenir la aparición
de algunos síntomas (Roscoe et al, 2006). Uno de los problemas de TRE para
MPSII es dirigir la enzima a cerebro lo cual implica traspasar la barrera
hematoencefálica.
La enzima requerida para esta terapia puede obtenerse de tejidos y/o fluidos
10
corporales humanos o puede ser sintetizada en modelos biológicos recombinantes
como bacterias, levaduras o líneas celulares de mamíferos, (Muenzer et al,2002)
pero se requiere de una producción y purificación de cantidades suficientes para
efectuar estudios de caracterización bioquímica, bioactividad, termoestabilidad,
antigenicidad y si es el caso modificarlas químicamente, antes de ser ensayadas en
modelos animales y posteriormente con el fin de recuperar cantidades clínicamente
útiles que permitan implementar los protocolos de TRE para esta enfermedad
(Roscoe et al,2006)
2.5 SISTEMAS DE EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES
La producción de proteínas recombinantes en diferentes modelos posibilitan
obtener proteínas humanas con fines terapéuticos, aditivos en alimentos, vacunas,
entre otras; tales enzimas pueden provenir de bacterias, entre ellas E. coli, algunas
levaduras, células de insecto, células vegetales, células de mamíferos, entre otros,
ver tabla 2.
Se han preferido modelos con levaduras y bacterias ya que son cultivos rápidos y
económicos, los cuales se pueden escalar con relativa facilidad aún a altas
densidades celulares, lo cual permite la obtención de la proteína de interés con alta
productividad. Cada uno de estos modelos presenta ventajas y desventajas que
son los criterios a tener en cuenta en su selección para la expresión de una proteína
en particular. (Higgins, et al 1999).
2.5.1 Escherichia coli
Escherichia coli es una bacteria Gram negativa, no es esporoformadora y
usualmente tiene flagelos perítricos o fímbrias. La primera descripción fue hecha por
Escherich en 1885. Se encuentra frecuentemente en los intestinos de los animales,
incluido el humano (Susman M, 1999). Fue uno de los primeros microorganismos
de los cuales se tiene un análisis detallado tanto genética como molecularmente, y
fue el primero empleado para ingeniería genética y producción de proteínas
11
recombinantes. Además, de ser un organismo modelo usado en investigación, se ha
convertido en el microorganismo industrial más usado como sistema de expresión
de proteínas en procariotas, como también, para la producción de enzimas para
uso diagnóstico, propósitos analíticos y para producir proteínas sintéticas de uso
farmacéutico (Tabla 3). (Gellissen G, 2005).
Tabla 2. Criterios y claves de selección para una plataforma de expresión
SISTEMA DE
EXPRESIÓN
CLASIFICACIÓN PUENTES DISULFURO
GLICOSILACIÓN SECRECIÓN COSTOS DE LA FERMENTACIÓN
Células Mamíferos
Eucariota Si Si, parecida a la humana
Posible Alto
Células Plantas
Eucariota Si Si, L- fucosa terminal
Posible Alto
Sordaria macrospora
Hongo Filamentoso
Si Si, desconocida
aun
Posible Bajo
Aspergillus sojae
Hongo filamentoso
Si Si, desconocida
aun
Posible Bajo
Arxula adeninivoran
s
Levadura dimórfica
Si Si, desconocida
aun
Posible Bajo
Yarrowia lipolytica
Levadura dimórfica
si Si, desconocida
aun
Posible Bajo
Pichia pastoris
Levadura Metilotrófica
si Si, terminales manosa α1,3
Posible Bajo
Hansenula polimorpha
Levadura Metilotrófica
Si Si, terminales manosa α1,3
Posible Bajo
Staphylococcus carnosus
Coco Gram positivo
Limitado No Secreción al
periplasma
Bajo
Pseudomonas fluorescens
Bacteria Gram negativa
Si No Secreción al
periplasma
Bajo
Escherichia coli
Bacteria gram negativa
Si No Secreción al
periplasma
Bajo
Tomado de Gellissen G, 2005.
Algunas deficiencias que tiene la expresión de proteínas a nivel de fermentador
estan: el tiempo de inducción de la expresión de la proteína recombinante,
12
inestabilidad de los vectores, ineficiencia del promotor, inestabilidad del mRNA,
ineficiencia del sistema de traducción, carencia de la maquinaria para hacer ciertas
modificaciones postraduccionales como la glicosilación, toxicidad de los productos,
proteólisis, producción de proteínas insolubles almacenadas en cuerpos de
inclusión, un inadecuado plegamiento y consecuente inactividad de los productos
(Vaillancourt P, 2003).
En algunos casos cuando el inserto de ADN que se expresa produce cambios
significativos en la célula anfitriona, dicha modificación se utiliza para reflejar su
clonación exitosa. Sin embargo, la técnica o estrategia más común es la detección y
selección basadas en la presencia de genes marcadores en el vector; como por
ejemplo:
• Gen lac Z el cual expresa la enzima β– galactosidasa que le da la habilidad
de hidrolizar la β-galactosa. Este marcador se puede reconocer porque las
células transformadas exitosamente y crecidas sobre un agar que contenga
5-bromo-4cloro-3-indolil β-D-galactosido (X-gal), este sustrato se hidroliza
por la β– galactosidasa produciendo una coloración azul.
• Genes de resistencia a algún antibiótico, son aquellos vectores que
codifican una proteína, la cual permite el crecimiento de la célula anfitriona
en presencia de un antibiótico específico, por ejemplo el gen Ampr que
codifica una beta-lactamasa, capaz de degradar la ampicilina (Sambrook et
al, 2001)
13
TABLA 3. Productos farmacéuticos aplicados a la salud humana que provienen de organismos genéticamente modificados E. coli.
Producto Indicación terapéutica Activador del plasminógeno tisular Infarto de miocardio
Hormona de crecimiento Deficiencia de la hormona en niños, acromegalia, síndrome
de Turner Paratiróidea Osteoporosis Calcitonina Enfermedad de Paget
Factores hematopoyéticos Factor estimulante de colonias de
granulocitos/macrófagos (GM-CSF)
Netropenia, transplante autólogo de médula
Interferón e interleuquinas Interferón alfa (IFN alfa)
Hepatitis B y C, distintos tipos de cáncer
Interferon alfa-2a Esclerosis múltiple
Interferón gamma (IFN gamma 1b) Enfermedad granulomatosa crónica
Interleuquina 2 (IL-2) Cáncer de riñón
Anti-enfermedad de Lyme Inmunización contra la enfermedad de Lyme
Beta-glucocerebrosidasa Enfermedad de Gaucher
Tomado de Walsh G, 2003
2.5.1.1 Cepa E.coli BL21 : Ésta cepa de E.coli se usa como sistema de expresión de proteínas recombinantes
muy eficiente por las versatilidades que tiene para su posterior purificación, y es un
ejemplar ideal para la expresión de proteínas. Ésta cepa tiene una deleción en el
gen ompT, la cual se traduce en una deficiencia de proteasas; de ésta manera evita
degradar los productos recombinantes. Además, tiene deficiencia en la producción
de la mayor proteasa codificada por el gen Ion, el cual cataliza para el clivaje y el
daño de proteínas recombinantes dentro de la célula.
Dentro de las propiedades más importantes de ésta cepa se encuentra un alto nivel
de expresión de proteínas recombinantes, además permite una alta eficiencia de
14
transformación con un plásmido modificado (Amersham Biosciencies, 2002)
2.5.1.2. CEPA E.coli DH5α
Ésta cepa de rutina se usa principalmente para subclonar plásmidos, su genotipo es
(F- 80lacZ M15 (lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17(rk-, mk
+) phoA supE44
thi-1 gyrA96 relA1 tonA); las células portadoras del plásmido se pueden seleccionar
mediante el uso del sustrato X-gal, ésta cepa no requiere IPTG, para inducir la
expresión del promotor lac. Para seleccionar las colonias transformantes se
recomienda usar placas de agar selectivo con 50μg/ml de X-gal. (Invitrogen, 2004).
En el IEIM ya se realizaron unos ensayos con dicha cepa, en la cual se había
transfectado un constructo de pGEX-3X/IDS y obtenido unos clones, los cuales
presentaron resultados relevantes para continuar con el trabajo (Tabla 4).
Tabla 4. Resultados preliminares producción a nivel de erlenmeyer de la IDShr
con el constructo DH5α/pGEX-3X/IDS
EXPERIMENTO PROTEÍNA
TOTAL Proteína
IDShr ACTIVIDAD ESPECÍFICA
IDShr mg/ml ng/ml nmolmg-1h-1
3R 1,9 79,13 34,2 4R 2,22 94,35 25,97
Barrera L.A. et al., 2006
15
2.5.2 Vector Es un pequeño vehículo hecho de ADN, que llevará un fragmento foráneo de ADN.
Hay muchas clases de vectores de clonación: plásmidos y bacteriófagos, e incluso
otros que se usan para mayor capacidad de recepción de información genética
como son los BAC´s y cósmidos.
Los plásmidos son secuencias de ADN extracromosomal las cuales se replican
autónomamente y disponen de un marcador de selección. Algunos ejemplos de
ellos se mencionan a continuación. (Luque, J ; Herraez, A. 2001)
2.5.3 Plásmido pUC 13 El pUC13 (Figura 4) es un vector que tiene una secuencia regulatoria y contiene el
gen de la β- galactosidasa (gen lac Z), además contiene un sitio de múltiple
clonación, un origen de replicación, y el gen de resistencia a ampicilina. En trabajos
previos dicho vector se transformó insertando el ADNc de la IDS (1.7kb), en el sitio
de restricción de la enzima EcoRI siendo el tamaño total del constructo de 4.4 kb.
Este constructo almacenado en la cepa JM109, el JM109/pUC13/IDS, fue donado
por el Dr. Shunjji Tomatsu (Gifu University, Japón). (Landázuri, P. 2002).
Figura 4. Plásmido pUC13- IDS
Tomado de Landázuri, 2002.
2.5.4 Plásmido pGEX-3X Morales, D, 2007 realizó un mini-prep JM109/pUC13/IDS para la extracción
plasmídica, para luego realizar la digestión con EcoRI y obtener el ADNc de la IDSh.
Este gen se empleó para hacer la transformación del plásmido pGEX-3X; el
transformado pGEX-3X/IDS se insertó luego en las cepas de E.coli BL21 y DH5α.
16
El plásmido pGEX-3X es comúnmente utilizado por sus altos niveles de expresión
de proteínas recombinantes; además, porque tiene un gen Lac inducible que
controla la expresión. Porque permite la co-expresión de la proteína de interés con
una proteína de fusión, en este caso la glutation s-transferasa (GST), útil para el
proceso de purificación al emplearla como señal de reconocimiento en una columna
de afinidad.
En la figura 5 se visualiza el plásmido pGEX; éste plásmido se caracteriza por tener
un peso molecular de 4952bp. Se evidencia en el mapa el gen de resistencia a
ampicilina y el origen de replicación del pBR322 y el gen de la GST, Además es
posible purificar las proteínas de fusión GST, mediante una cromatografía de
afinidad, usando glutation inmovilizada. De tal manera que las proteínas se unen por
afinidad al medio, y se remueven algunas impurezas de los extractos celulares
provenientes de la ruptura.
Figura 5. Plásmidos pGEX
Tomado de Amersham Biosciencies, 2004
Control de la transcripción. El Operon Lactosa El operón lactosa domina tres genes para el adecuado catabolismo de la lactosa. La
proteína reguladora de éste dominio, se llama Lac I el cual es un represor que se
une al promotor del gen hibrido Taq, inhibiendo la trascripción. Por el contrario su
inducción ocurre cuando la molécula inductora se une al represor, y por tanto este
último no se puede unir al operador y la transcripción ocurre normalmente. La
posibilidad para el inductor de unirse al represor depende de la concentración de
17
éste en el interior de la célula, el cual depende también de la cantidad de inductor
que entra a las células por medio de las permeasas, como se puede ver en la figura
6. (Villar et al; 2003)
Figura 6. Operón Lactosa
Tomado de Vilar et al; 2003.
• Isopropil tiogalactosido (IPTG)
El Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosido (IPTG), un análogo de lactosa ilustrado en la
figura 7, es usado para inducir la trascripción del operón lactosa, y
consecuentemente de-reprimir la expresión del gen de interés. Esta molécula tiene
un átomo de azufre, estructura que impide la hidrolización del sacárido por parte de
la célula y con ello previene su degradación.
Figura 7. Estructura del IPTG
18
• Sitio de múltiple clonación.
En la figura 8 se evidencia el sitio de múltiple clonación del plásmido, lugar donde se
insertó el gen de interés, primero empleando diferentes enzimas de restricción para
linealizar el plásmido y luego ligasas para hacer la recombinación.
Figura 8. Plásmido pGEX-3X. Sitio de múltiple clonación
Tomado de Amersham Biosciencies, 2004
2.5. ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA La electroforesis de poliacrilamida- SDS (Sodium Dodecil Sulfato) se ha convertido
en un instrumento clave para la separación de proteínas, ya que a partir de éste
ensayo se puede obtener un análisis disponible y de excelente resolución, y con el
peso molecular de las proteínas obtenidas mucho más aproximadas. (Shägger H;
1994)
Las redes de los geles de poliacrilamida formadas de la polimerización de
archilamida y bisacrilamida, dichas moléculas se unen gracias a un agente
entrecruzador que forma una estructura definida (matriz). La polimerización se da
inicio gracias a dos agentes N,N,N',N'-tetrametilendiamina (TEMED) y el persultafo
de amonio.
19
Las muestras que van a ser corridas en SDS-PAGE deben ser puestas en
ebullición por 5 min y el tampón de corrido debe contener β-mercaptoetanol y SDS.
El tampón de corrido usualmente contiene azul de bromofenol para poder visualizar
las muestras y glicerol o sucrosa para darle mayor densidad a la muestra. (Walker
J; 2002)
2.6. WESTERN BLOT La técnica se basa en identificar y detectar proteínas separadas en un gel de
electroforesis, traspasándolas a una membrana porosa (usualmente nitrocelulosa), a
la cual se adhieren todas las proteínas del gel de electroforesis, mediante un
tampón que permite la unión específica de proteínas a la membrana. Se debe
colocar cada parte a transferir de la manera que se ilustra en la figura 9.
Figura 9. Montaje de un Western Blot
Tomado de Walker, J. 2002.
Luego de transferir las proteínas se debe bloquear la membrana, se pueden usar
soluciones de albúmina bovina, leche descremada, gelatina, Tween -20, Triton X-
100 esto se hace para evitar uniones inespecíficas y disminuir el ruido de fondo.
Luego de realizar la solución de bloqueo se coloca un anticuerpo primario que
detecte específicamente la proteína de interés adherida a la membrana. Tanto las
concentraciones de anticuerpo como de otros reactivos se pueden optimizar para
asegurar una alta especificidad y bajar el ruido de fondo. El anticuerpo secundario
20
se caracteriza por ser muy específico para el primario, es decir solo se une con éste
y no con otra proteína; existen algunos anticuerpos secundarios marcados con
enzimas, otros radio-marcados. Dependiendo del tipo de anticuerpo a detectar, y a
su vez de la especie de la cual se originario el anticuerpo primario, es decir que si es
anticuerpo de conejo, se debe tener un α-anticuerpo de conejo. Existen
principalmente cinco clases de marcado de los anticuerpos, tales como peroxidasas
HRP, fosfatasas alcalinas AP, biotinilados con avidina con HRP ó AP, o
componentes fluorescentes. Además para detectarlos visualmente se requieren de
reactivos como la diaminobenzidina, el TMB (3,3’5,5’ tetrametillbenzidina), el 4-cloro
1-naftol ó el nitroazul de tetrazolium. (Amersham Biosciencies, 1999) Como se
ilustra en la Figura 10; se puede evidenciar cada una de las uniones específicas que
se dan en el proceso.
Figura 10. Esquema del proceso para una reacción positiva de un Western Blot
Tomado de Amersham Biosciencies, 1999.
2.8 PCR (Polimerase Chain Reaction) La PCR es un método utilizado para amplificar ADN “in Vitro”. Con el cual se pueden
mejorar técnicas para manipular ADN. Para una simple reacción se necesitan dNTP
(Deoxinucleótidos), iniciadores, ADN Molde, ADN polimerasa, y un tampón que
21
contenga Magnesio. La síntesis puede ser repetida varias veces calentando el
nuevo ADN sintetizado y los iniciadores se anillarían a la secuencia complementaria.
Los ciclos de enfriamiento y calentamiento pueden ser repetidos y el ADN se
acumulará exponencialmente. A altas concentraciones de ADN, éste puede
comenzar a unirse inespecíficamente y resultar en productos no esperados.
La ADN polimerasa lleva a cabo la síntesis de la hebra complementaria de ADN en
sentido 5´ a 3´ usando una sola cadena molde. La primera reacción es la extensión,
la PCR emplea dos iniciadores cada uno complementario a los extremos del DNA
molde que ha sido denaturado por calentamiento.
La amplificación se debe realizar entre 25-35 ciclos, para lograr producir entre
100ng y 1μg de ADN. Se necesita una incubación final para el paso de extensión
(usualmente a 72°C) para volver las moléculas resultantes en doble cadena.
(Weaver, R ;2005)
• ADN Polimerasa. La mas comúnmente usada es la enzima aislada de
Thermus acuaticus, tiene ventajas en cuanto que tiene estabilidad
prolongada a altas temperaturas. Esta enzima es la encargada de catalizar la
síntesis de ADN a partir de Desoxirribonucleótidos. Se conocen varios tipos
de esta enzima, obtenida de otros microorganismos, la cual ofrece la misma
eficiencia en el proceso de síntesis. Esta enzima tiene la habilidad de
procesar fragmentos de hasta 1kb y funciona óptimamente a un pH entre
8.2 y 9.0.
• Desoxinucleosidos Trifosfatos (dNTPs). Para poder realizar una
amplificación adecuada se necesita tener una solución equimolar de los
cuatro dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) ya que el desequilibrio de las
concentraciones disminuye el rendimiento de la reacción y se aumenta la
tasa de error de copias.
• Tampón de reacción. Este tampón es esencial para que la enzima funcione
correctamente provocando la reacción de síntesis. Generalmente se usa
22
Tris 10 mM (pH 8.4), 50mM de KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.01% Gelatina, 0.01%
NP40, 0.01% Tween 20.
• Iniciadores. El iniciador es una secuencia sobre la cual la DNA polimerasa
va a unir al DNA molde, la elección de iniciadores u oligonucleótidos debe
ser tal que pueda amplificar una región de un gen. Un factor que se
considera crítico a la hora de diseñar una amplificación es la de utilizar
iniciadores específicos, que identifican una secuencia única, o iniciadores
degenerados, que identifican varias secuencias de diferentes organismos.
Habitualmente, los iniciadores suelen tener un tamaño de 18 a 25
nucleótidos (aunque pueden llegar a los 40), y con un contenido en GC
distribuido de forma regular a lo largo de su secuencia en proporción entre 4
a 6 de 10. En algunos casos, sin embargo, puede ser importante tener zonas
ricas en GC localizadas en la zona 3' del iniciador, de forma que el
anillamiento se favorezca en las áreas implicadas en la elongación. La pareja
de primers utilizada en una amplificación debe tener una temperatura de
anillamiento similar, con un máximo de 5 ºC de diferencia entre ellos. En
general, se requieren concentraciones equimolares de ambos iniciadores
para evitar condiciones de reacción asimétricas o inespecíficas.
Se recomienda revisar los posibles sitios de complementariedad entre
iniciadores y el DNA molde. Además, los iniciadores no deben ser auto-
complementarios, con el fin de evitar formación de estructuras secundarias y
dímeros de iniciadores que podrían bajar la eficiencia global de la reacción
de amplificación.
2.9 CUERPOS DE INCLUSIÓN
Dentro de las posibles formas de producción de proteínas por E. coli, se encuentran
las forma solubles en el citoplasma, e insoluble en el periplasma.
En la expresión de genes heterólogos, se generan depósitos intracelulares de dicha
expresión, en microfotografías electrónicas los cuerpos de inclusión se visualizan
como cristales amorfos, y se unen como agregados por aminoácidos, permitiendo
que la producción de la proteína de interés se vea afectada. De ésta manera a una
23
cadena se van agregando las proteínas expresadas en forma de dímeros o más
(Chrunyk, et al, 1993).
Además dichos cuerpos de inclusión se encuentran empaquetados, y para su
actividad y funcionalidad biológica se necesita de procesos de solubilización,
renaturación y purificación. Generalmente para la resolubilización de cuerpos de
inclusión se deben centrifugar la biomasa que ha sido lisada y luego a partir de los
restos celulares se debe resuspender en un tampón que contenga un detergente
como TritonX100 y Tris-HCl luego deben lavarse los restos celulares para eliminar el
exceso de detergente con un tampón de Tris HCl y NaCl, finalmente para solubilizar
dichos cuerpos se utiliza una solución denaturante de Guanidina HCl ó Urea junto
a un agente reductor como el β- mercaptoethanol o el DTT.(Yang, et al;2007) La
formación de cuerpos de inclusión formados por una alta expresión de la proteína de
interés, brinda algunas ventajas tales como un fácil aislamiento de los cuerpos de
inclusión eliminando otras proteínas, baja tasa de ataque proteolítico del producto
de interés y reducción de los pasos para purificar la proteína expresada.
Los cuerpos de inclusión pueden ser separados luego de la ruptura celular por
centrifugación; además, se sabe que están parcialmente plegados y están unidos
unos debido a su hidrofobicidad. Además realizando lavados con tampón de
detergentes y sales se pueden eliminar otras proteínas diferentes a la de interés, las
cuales luego de solubilizarlas con algún agente caotrópico y plegar adecuadamente
se puede recuperar un 95% de la proteína pura (Singh et al , 2005).
Dentro de las características especiales de los cuerpos de inclusión está el tener
una densidad de 1.3 mg/ml, ya que son mas densos que otros componentes
celulares por lo que pueden ser separados de los restos de la lisis celular a una alta
velocidad de centrifugación, los cuerpos de inclusión son partículas altamente
hidratadas y porosas. Y si se realizan gradientes de sucrosa, se pueden lavar y
preparar los cuerpos de inclusión para un posterior solubilización. La solubilización y
el replegamiento permiten que los cuerpos de inclusión puedan ser purificados en
un menor tiempo disminuyendo significativamente el proceso, en las columnas
cromatográficas. (Singh et al , 2005)
24
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN Cumpliendo con sus funciones universitarias, de atención diagnóstica, investigación
y docencia respecto a los errores innatos del metabolismo, el IEIM se ha propuesto
encontrar alternativas terapéuticas diferentes a las de soporte para muchas de estas
dolencias que por su baja incidencia han sido calificadas de “enfermedades raras”.
Por tanto, entre otras muchas actividades que desarrolla, se ha comprometido con
el trabajo de investigación de producción proteínas recombinantes para TRE, con la
intención de proponer métodos más económicos, respecto a las líneas celulares,
considerando inicialmente la producción de la IDS y empleando los modelos de E.
coli, Pichia pastoris, y Hansenula polymorpha (Acero, J 2004); (Garzón, K 2006);
(Landázuri, P 2002); (Poutou, RA 2006).
Enmarcado en los propósitos anteriormente descritos, en el trabajo de maestría
Morales, D., 2007, se obtuvieron clones de DH5α/pGEX-3x/IDS y BL21/pGEX-
3X/IDS, con los cuales se realizaron cultivos a nivel de matraz erlenmeyer agitado,
para evaluar la producción de IDShr, midiendo actividad biológica del producto, los
resultados se presentan en la tabla 4. Adicionalmente, se evaluó el proceso de
transformación del plásmido pGEX-3X con el gen de la IDS, haciendo uso de EcoRI
y PvUII.
Para hacer más eficiente el estudio de la producción de la IDS, este trabajo
pretende establecer un protocolo que permita evaluar el producto de la
transformación, antes de iniciar el proceso de producción a nivel de matraz
erlenmeyer agitado y escalado en biorreactores. Para ello se consideró el empleo
de técnicas de laboratorio como PCR, ELISA Indirecta y Western blot, con lo cual se
espera tener un conocimiento suficiente para continuar con los estudios de
producción de la IDShr.
25
4. OBJETIVO GENERAL
Evaluar la efectividad de la transformación de dos cepas de Escherichia coli con el
gen de la iduronato 2-sulfato humano.
4.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 4.1.1 Digerir del ADN plasmídico de los clones BL21/pGEX-3X/IDS y DH5α/pGEX-
3X/IDS.
4.1.2 Amplificar del ADNc de la IDS transformada en dos clones BL21/pGEX-3X/IDS
y DH5α/pGEX-3X/IDS.
4.1.3 Reconocer inmunológicamente de la IDS recombinante soluble producida en
dos clones BL21/pGEX-3X/IDS y DH5α/pGEX-3X/IDS mediante Western blot.
4.1.4 Cuantificacar de la IDS recombinante soluble, producida en dos clones
BL21/pGEX-3X/IDS y DH5α/pGEX-3X/IDS mediante ELISA Indirecta.
4.1.5 Ensayo preliminar de cuantificación de IDShr insoluble, producida en cuerpos
de inclusión.
26
5. MATERIALES Y MÉTODOS 5.1. Microorganismos Los clones BL21/pGEX-3X/IDS y DH5α/pGEX-3X/IDS, obtenidos por Morales D.,
2007; en la Universidad del Quindío, y las cepas BL21 y DH5α como controles
negativos fueron conservados a –80 °C en LBA/LB con glicerol al 30% (%v/v), luego
se inocularon 300 μl en 2.7 ml de medio LBA/LB fresco, se crecieron a 37°C por 16
h como inóculo. A 10 ml del cultivo anterior se inocularon a 90 ml en medio LBA/LB
fresco, se crecieron por 3h a 37°C. Al cultivo del clon BL21/pGEX-3X/IDS se le
adicionó IPTG a una concentración final de 1mM y se creció a las mismas
condiciones por 4 horas (Espejo, AJ; Sosa, AC. 2003). Los cultivos se efectuaron
por duplicado.
5.2. Lisis Celular Se centrifugaron los cultivos de todos los clones y cepas nativas a 3800 rpm por 15
minutos a 4° C, resuspendiendo la biomasa en el Tampón de lisis. Para realizar la
lisis celular se preparó el tampón de Lisis (Tris HCl 50 mM , NaCl 300 mM, 10mM
de Imidazol, 0.05% Tween 20, Ajustando el pH a 8.0 y adicionando finalmente 1
mM de DTT y 1 mM PMSF). Después de resuspendidas las muestras en el tampón
se sonicó por 1 s y 2 s de descanso en durante 12 min, con una amplitud de 20%.
Luego de la ruptura se centrifugó a 3800 rpm por 15 minutos a 4° C, y se guardaron
los sobrenadantes a -20°C. (Espejo, AJ; Sosa, AC. 2003) (Landázuri, P. 2002).
5.3. Extracción ADN Plasmídico Mini Prep
Una colonia aislada en Agar LB- Ampicilina 100μg /ml se resuspendió en 3 ml de
caldo LBA a 37°C y se creció durante 16 horas, luego se centrifugó la biomasa a
13200 rpm por 4 min a temperatura ambiente, se descartó el sobrenadante y se
adicionaron 100μl de la solución I (Sacarosa 5Mm; Tris HCl 25mM; EDTA 10mM
ajustando el pH a 8.0) y 15 μl de Rnasa, se mezcló por inversión y vórtex para
27
resuspender totalmente la biomasa. Luego se adicionaron 200μl de la solución II
(NaOH 0.2 M; SDS 1%), mezclando por inversión y dejando en reposo por 5min,
posteriormente se adicionó 150μl de la solución III (Acetato de Sodio 3M, pH 4.8).
Después se dejó la mezcla en reposo por 1 hora a 4°C. Seguidamente se centrifugó
a 10000 rpm por 5 min a temperatura ambiente, el sobrenadante se pasó a un tubo
estéril, y se adicionó 1ml de Isopropanol al 95%, luego se centrifugó por 15 min a
10000 rpm y se removió el isopropanol. Se lavó el pellet con 0.5ml de etanol al 70%
dos veces, se dejó secar en horno el exceso de etanol y se resuspendió en 50μl de
Tampón TE (Sambrook, 2001).
5.4. Digestiones Plásmido pGEX3X/IDS
Se realizaron dos diferentes digestiones para comprobar los tamaños moleculares
tanto del inserto como del plásmido en su totalidad, para la primera reacción se
empleó la enzima SmaI, y en la segunda reacción se empleó EcoRI. Las
condiciones se muestran en la Tabla 5.
Tabla 5. Digestiones enzimas de restricción.
Sma I Temperatura 30°C EcoR I Temperatura 37°C
ADN 8 μl ADN 8 μl
Agua 9.5 μl Agua 9.5 μl
Tampón 2 μl Tampón 2 μl
Enzima 0.5 μl Enzima 0.5 μl
Total Mezcla 20 μl Total Mezcla 20 μl
La digestión del constructo pGEX-3X/IDS se esperaba un corrido electroforético
como se indica en la Figura 11. Para la predicción de los sitios de restricción se
utilizó el programa pDRAW32 (V. 1.1.93). La enzima SmaI corta el plásmido en la
posición 941 produciendo una banda de 6382 pb, Mientras que la enzima EcoR I en
las posiciones 944 y 2374 produciendo dos fragmentos de 4952 pb y otra de 1430
pb esta última correspondiente del cDNA IDSh.
28
Figura 11. Predicción de cortes con enzimas de restricción.
5.5. Diseño de Iniciadores para amplificar el gen de la IDS Se diseñaron dos parejas de iniciadores en el programa PRIMER3 (v. 0.3.0)1 y con
los criterios estándar del programa, para verificar la presencia del inserto y la
direccionalidad del mismo. Esto se realizó sobre la secuencia del constructo
pGEX3X/IDS, el cual se muestra en la figura 12.
La primera pareja de iniciadores (pGEX-F y pGEX-R) se diseñó para que ésta se
anillara sobre el plásmido pGEX-3X en los extremos flanqueantes de la IDS, y
producir un fragmento de 1489pb. La segunda pareja de iniciadores (IDS –F y
pGEX-R) amplificará un fragmento de 813pb, el cual corresponde a la mitad del
ADNc de la IDS, lo que permitió confirmar la direccionalidad del inserto. Las
condiciones se muestran en la Tabla 6.
1 Este diseñó se efectuó en la página http://frodo.wi.mit.edu
29
Tabla 6. Iniciadores Diseñados
Iniciadores Sitio de inicio
Longitud Temperatura de
anillamiento
Secuencia Fragmento esperado
pGEX-F (Forward)
914 20 60.2° C ggatctgatcgaaggtcgtg
pGEX-R
(Reverse) 2403 20 59.9°C ggcagatcgtc
agtcagtca
1489 pb
IDS-F (Forward)
1590 20 59.9°C cgtcagccagtcctttcttc
813 pb
Para la amplificación se empleó el kit Go Green Taq (Promega®), bajo las
condiciones establecidas por el fabricante. El kit contiene una mezcla lista para usar
de dNTPs, Taq Polimerasa, MgCl2 3mM y tampón de carga y solo se deben
adicionar los iniciadores y el ADN de interés. Los volúmenes empleados para cada
reacción y las condiciones se muestran en la Tabla 7, tanto para la primera pareja
de iniciadores (pGEX-F; pGEX-R) como para la segunda pareja (IDS-F; pGEX-R).
Los productos de las amplificaciones se evidenciaron en gel de agarosa al 0.8% con
Bromuro de Etidio (0.5µl de una Solución stock 0.5mg/ml por cada 50ml de
agarosa).
Figura 12. Constructo pGEX-3X/IDS agcttatcgactgcacggtgcaccaatgcttctggcgtcaggcagccatcggaagctgtggtatggctgtgcaggtcgtaaatcactgcataattcgtgtcgctcaaggcgcactcccgttctggataatgttttttgcgccgacatcataacggttctggcaaatattctgaaatgagctgttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagtattcatgtcccctatactaggttattggaaaattaagggccttgtgcaacccactcgacttcttttggaatatcttgaagaaaaatatgaagagcatttgtatgagcgcgatgaaggtgataaatggcgaaacaaaaagtttgaattgggtttggagtttcccaatcttccttattatattgatggtgatgttaaattaacacagtctatggccatcatacgttatatagctgacaagcacaacatgttgggtggttgtccaaaagagcgtgcagagatttcaatgcttgaaggagcggttttggatattagatacggtgtttcgagaattgcatatagtaaagactttgaaactctcaaagttgattttcttagcaagctacctgaaatgctgaaaatgttcgaagatcgtttatgtcataaaacatatttaaatggtgatcatgtaacccatcctgacttcatgttgtatgacgctcttgatgttgttttatacatggacccaatgtgcctggatgcgttcccaaaattagtttgttttaaaaaacgtattgaagctatcccacaaattgataagtacttgaaatccagcaagtatatagcatggcctttgcagggctggcaagccacgtttggtggtggcgaccatcctccaaaatcggatctgatcgaaggtcgtgggatccccgggaattcatgccgccaccccggaccggccgaggccttctctggctgggtctggttctgagctccgtctgcgtcgccctcggatccgaaacgcaggccaactcgaccacagatgctctgaacgttcttctcatcatcgtggatgacctgcgcccctccctgggctgttatgggga
30
taagctggtgaggtccccaaatattgaccaactggcatcccacagcctcctcttccagaatgcctttgcgcagcaagcagtgtgcgccccgagccgcgtttctttcctcactggcaggagacctgacaccacccgcctgtacgacttcaactcctactggagggtgcacgctggaaacttctccaccatcccccagtacttcaaggagaatggctatgtgaccatgtcggtgggaaaagtctttcaccctgggatatcttctaaccataccgatgattctccgtatagctggtcttttccaccttatcatccttcctctgagaagtatgaaaacactaagacatgtcgagggccagatggagaactccatgccaacctgctttgccctgtggatgtgctggatgttcccgagggcaccttgcctgacaaacagagcactgagcaagccatacagttgttggaaaagatgaaaacgtcagccagtcctttcttcctggccgttgggtatcataagccacacatccccttcagataccccaaggaatttcagaagttgtatcccttggagaacatcaccctggcccccgatcccgaggtccctgatggcctaccccctgtggcctacaacccctggatggacatcaggcaacgggaagacgtccaagccttaaacatcagtgtgccgtatggtccaattcctgtggactttcagcggaaaatccgccagagctactttgcctctgtgtcatatttggatacacaggtcggccgcctcttgagtgctttggacgatcttcagctggccaacagcaccatcattgcatttacctcggatcatgggtgggctctaggtgaacatggagaatgggccaaatacagcaattttgatgttgctacccatgttcccctgatattctatgttcctggaaggacggcttcacttccggaggcaggcgagaagcttttcccttacctcgacccttttgattccgcctcacagttgatggagccaggcaggcaatccatggaccttgtggaacttgtgtctctttttcccacgctggctggacttgcaggactgcaggttccacctcgctgccccgttccttcatttcacgttgagctgtgcagagaaggcaagaaccttctgaagcattttcgattccgtgacttggaagaggatccgtacctccctggtaatccccgtgaactgattgcctatagccagtatccccggccttcagacatccctcagtggaattcatcgtgactgactgacgatctgcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtataattcttgaagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtgttgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgcagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgc
31
acacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcataaattccgacaccatcgaatggtgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaagcggcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggccctgcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtgccagcgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagggcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatctcggtagtgggatacgacgataccgaagacagctcatgttatatcccgccgttaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacggattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgctttgcctggtttccggcaccagaagcggtgccggaaagctggctggagtgcgatcttcctgaggccgatactgtcgtcgtcccctcaaactggcagatgcacggttacgatgcgcccatctacaccaacgtaacctatcccattacggtcaatccgccgtttgttcccacggagaatccgacgggttgttactcgctcacatttaatgttgatgaaagctggctacaggaaggccagacgcgaattatttttgatggcgttggaatt
32
Secuencia Relación
gaattc Sitio de corte enzima EcoRI
atgccgccaccccgga Secuencia IDS humana
ggatctgatcgaaggtcgtg Primer pGEX forward
tgactgactgacgatctgcc Primer pGEX reverse
cgtcagccagtcctttcttc Primer IDS forward
gcctacaacccctggatgg Secuencia que codifica para el epítope del anticuerpo α -IDS
Tabla 7. Condiciones PCR
Condiciones para amplificar primera pareja Condiciones para amplificar segunda pareja pareja
Paso Temperatura Tiempo Nro. de
ciclos
Paso Temperatura Tiempo Nro. de
ciclos
Denaturación
inicial
95°C 5´ 1 Denaturación
inicial
95°C 5´ 1
Denaturación 95°C 1´ 30 Denaturación 95°C 1´ 30
Anillamiento 60°C 1´ 30 Anillamiento 56°C 1´ 30
Extensión 72°C 1.5´ 30 Extensión 72°C 1.5´ 30
Extensión
final
72°C 10´ 1 Extensión
final
72°C 10´ 1
Sostenimiento 4°C --- 1 Sostenimiento 4°C --- 1
33
5.6. Determinación de la concentración de proteínas totales.
Se utilizó la técnica de Bradford, en la cual se colocaron 4 μl de muestra y 196 μl del
reactivo Bradford (Biorad). La curva de calibración se realizó con suero de albúmina
bovina, en el rango de 1.4 a 0.875 mg/ml.
La mezcla se leyó en un lector de placas Anthos 2020 Reader (Anthos Lactec
Instruments®) a 620 nm. Como referencia se toma la curva de calibración con
albúmina, aunque para cada medición de proteínas se empleó una curva de
calibración distinta (Dawson, R. M. C, 1986).
5.7. Determinación de biomasa
Una colonia aislada en Agar LB- Ampicilina (LBAmp) 100μg/ml se resuspendió en
10ml de caldo LBAmp 100μg/ml, y se creció a 37°C por 16h. El crecimiento se
inoculó en 90ml de medio fresco LBAmp 100μg/ml; a partir de éste momento y
durante las 6 horas subsecuentes se tomaron muestreos de 1 ml cada hora. Se
realizaron diluciones decimales seriadas hasta obtener la concentración óptima para
realizar recuento de colonias (UFC/ml). A partir de la dilución apropiada se
sembraron 100 μl en superficie en agar LBAmp 100μg /ml, se incubó a 37°C por 24
horas y se leyeron los resultados (Allaert, C et al; 2002)
5.8 Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) La electroforesis de proteínas se realizó en un gel de poliacrilamida al 10% en
condiciones reductoras, diluyendo las muestras en Tampón Laemmli (Biorad®)
adicionado con 2-mercaptoetanol (SIGMA). Las condiciones de corrido se
mantuvieron a 120V 60 mA durante 2 horas. Finalmente, los geles fueron teñidos
con azul de coomasie y el peso molecular de las muestras se determinó
comparando las bandas obtenidas con el marcador de peso molecular utilizado
SigmaMaker High, SIGMA®. (Walker J; 2002)
34
5.9 Detección de la IDShr por Western blot
Para las pruebas inmunológicas se usó un anticuerpo obtenido de yema de huevo
de Gallina. Éstas gallinas de 24 semanas de edad, fueron inmunizadas contra
epítopes específicos de la IDSh, diseñados en el programa Swiss- Pdb Viewer
program, verificando ausencia de reactividad cruzada con otras sulfatasas, el
anticuerpo del cual se obtuvo un mayor reconocimiento , fue purificado y usado para
estudios posteriores, como se observa en la figura 12, se señala la secuencia de
nucleótidos, que especifica la región de la IDSh que detecta el anticuerpo α-IDS
(Sosa A, Barrera L.A. 2005).
Después de realizar un corrido electroforético de los lisados bacterianos, los geles
fueron transferidos a una membrana de Nitrocelulosa HIBOND C-Extra 0.22μm
(Amersham), la cual debía ser previamente activada con un tampón de
Transferencia pH 8.3 (Tris Base, Glicina, Metanol, SDS) durante 2 horas
manteniendo como condiciones de transferencia 100V y 350mA. La membrana se
bloqueó con solución de bloqueo (TBS, Tween 20 0.1 %, Leche descremada 5%)
durante 2 horas a temperatura ambiente. Cada una de las membranas se incubó
con su respectivo anticuerpo primario, IgY α IDS producido en gallina y anticuerpo
IgY preinmune, en una dilución de 1/2000 y se incubó en las condiciones descritas
anteriormente.
Posteriormente se realizaron cinco lavados de 5 minutos cada uno con TBS –
Tween 20 0.2%. Se adicionó el anticuerpo secundario antichicken IgY HRP
(PROMEGA) en una dilución 1/2000 durante una hora. Se realizaron nuevamente
lavados y por último la reacción se reveló utilizando una solución de Imidazol,
TritonX100, Diaminobenzidina y Peróxido de Hidrógeno. (Sosa A, Barrera L.A. 2005) 5.10. Determinación de actividad biológica de la IDShr Para la determinación de la actividad enzimática de la IDShr se empleó un sustrato
fluorométrico llamado 4-metilumbeliferil - α - iduronato 2- sulfato (125mM). A 10μl
35
de muestra se adicionó 20μlde tampón del sustrato (CH3 COONa/CH3COO Y Pb
(CH3COO)2.3H2O 10mM; la mezcla se incubó a 37°C durante 4 horas, al cabo de
este tiempo se adicionó 40μl de Tampón Pi/Ci, (NaH2PO4 0.4M, C6H5Na3O7. 2H2O
0.2M pH 4.5 y NaN3 0.02%) y 10 μl de LEBT (Suspensión de enzimas lisosomales
de hígado de conejo parcialmente purificadas). Esta última mezcla se incubó por
24h a 37°C. La reacción se detuvo con 650μl de tampón de parada
(NaHCO3/NaCO3 0.5M, pH 10.7, con Glicina 1.7mM). La fluorescencia se determinó
en un fluorometro Turner 450, a 360 nm de excitación y 415 nm de emisión. Como
control se emplearon los sobrenadantes de las rupturas celulares de los cultivos de
las cepas sin el inserto. La actividad se expresa en nanomoles de sustrato
convertido por hora por miligramos de proteína total (nmolh-1mg-1). (Voznyi, Y et al
2001) 5.11 Determinación de concentración de IDShr por ELISA indirecta
Se colocaron 50μl de antígeno diluido en PBS 1X en una placa de poliestireno
(Nunc Maxisorp®) de 96 pozos. Se realizaron diluciones dobles seriadas de la
proteína IDS (TKT®) para la curva de calibración y las muestras a analizar a una
concentración final de 10μg/pozo; la placa se incubó a 37ºC durante 18 horas en
cámara húmeda. Luego se adicionaron 200μl de solución de bloqueo (PBS, Tween
0.05%, BSA 2%), durante 2 horas a 37ºC en cámara húmeda y se lavó con solución
de PBS Tween 0.05%.
Se adicionaron 100μl del anticuerpo primario, IgY α IDS producido en gallina, en
dilución 1/4000, y como control negativo de las muestras se utilizó IgYs
preinmunes. Se mantuvieron durante 1 hora a 37ºC en cámara húmeda, seguido de
lavados en las condiciones descritas anteriormente. Finalmente, se adicionó el
anticuerpo Anti-chicken IgY, HRP conjugate (Promega®) diluido 1/4000, y la prueba
se reveló con sustrato TMB 3,3´,5,5´tetrametilbenzidina (SureBlue Reserve KPL). La
reacción se detuvo con HCl 1N y fue leída en un lector de ELISA Anthos 2020
Reader (Anthos Lactec Instruments) a una longitud de onda de 450nm. (Sosa A,
Barrera L.A. 2005)
36
5.12 Solubilización cuerpos inclusión Por cada 100 ml de cultivo celular se utilizaron 4ml de solución de lisis, con las
condiciones de lisis descritas anteriormente, se centrifugó a una velocidad de 4000
rpm por 15 min a 4°C, luego se descartó el sobrenadante y se conservó el pellet
para realizar los lavados de los cuerpos de inclusión. Se resuspendió la biomasa
resultante de 100ml de cultivo en 1.5 ml de la solución de lavado 1 (0.5% Triton
X100, 50mM Tris-HCl pH 8, 100mM NaCl), se homogenizó la solución con los restos
celulares manteniendo las soluciones en condiciones de refrigeración, se repitieron
los lavados por 5 veces y se centrifugó a 12000 rpm a 4°C por 10 minutos. Luego de
realizar los lavados se utilizó la solución 2 para eliminar el resto de tritón presente
en los restos celulares, ésta contenía 50mM Tris pH 8, 100mM NaCl. El lavado se
realizó por dos veces más centrifugando a 12000 rpm a 4°C por 10 minutos, luego
se conservaron los restos celulares con la solución de resolubilización de cuerpos
de inclusión que contenía 10 mM NaHCO3 y Urea 2 M a pH 13, manteniendo la
temperatura a 4°C y bajo condiciones de agitación; luego de 24 h se centrifugó a
12000 rpm a 4°C por 10 minutos se tomó el sobrenadante y se resuspendió con
una solución 10 mM NaHCO3 , DTT 1mM y Urea 2 M a pH 8. Se procedió a leer
la concentración de proteínas (Bradford) (Freidell, E; et al, 2007).
37
6. RESULTADOS 6.1 Estabilidad Genética De la digestión del ADN plasmídico extraído de los clones de DH5α-pGEX3X/IDS y
BL21-pGEX3X/IDS con Sma I y EcoR I (Invitrogen), se obtuvieron los resultados
mostrados en la Figura 13.
Figura 13. Digestiones EcoR I y Sma I
Carril 1. Marcador de peso 1kb New England Biolabs. Carril 2. Muestra de ADN plasmídico BL21 pGEX 3X/IDS digerido con SmaI. Carril 3. Muestra de ADN plasmídico DH5α pGEX 3X/IDS digerido con SmaI, colonia 1. Carril 4. Muestra de ADN plasmídico DH5α pGEX 3X/IDS, colonia 2. Carril 5. Muestra de ADN plasmídico BL21 pGEX 3X/IDS digerido con EcoR I. Carril 6. Muestra de ADN plasmídico DH5α pGEX 3X/IDS digerido con EcoR I, colonia 1. Carril 7. Muestra de ADN plasmídico DH5α pGEX 3X/IDS digerido con EcoR I, colonia 2. Carril 8. Muestra de ADN plasmídico BL21 pGEX 3X/IDS. Carril 9. Muestra de ADN plasmídico DH5α pGEX 3X/IDS, colonia 1. Carril 10. Muestra de ADN plasmídico DH5α pGEX 3X/IDS, colonia 2.
Se efectuó de nuevo la digestión del plásmido pGEX-3X/IDS, extraído del clon
DH5α pGEX 3X/IDS, para verificar el talla molecular del constructo, Los resultados
se muestra en la Figura 14.
38
10000
8000
6000
5000
4000
3000
2000
1500
1000
500
3.5 Kb
10000
8000
6000
5000
4000
3000
2000
1500
1000
500
3.5 Kb
1 2 3 4
10000
8000
6000
5000
4000
3000
2000
1500
1000
500
3.5 Kb
10000
8000
6000
5000
4000
3000
2000
1500
1000
500
3.5 Kb
1 2 3 4
Figura 14. Miniprep DH5 α pGEX 3X/IDS
Carril 1. Muestra ADN plasmídico DH5α pGEX 3X/IDS. Carril 4. Marcardor de talla
molecular 1kb New England Biolabs
Para la amplificación del gen de la IDS se utilizaron las dos parejas de iniciadores,
luego de repetir varias veces la misma metodología disminuyendo la concentración
de iniciadores desde 0.5 mM hasta 0.3 mM y de cambiar la temperatura de
anillamiento en un rango de temperaturas que permitieran observar la reacción, se
establecieron las condiciones mostradas en la tabla 7. Los resultados se muestran
en la figura 15.
39
10000
8000
6000
5000
4000
3000
2000
1500
1000
500
10000
8000
6000
5000
4000
3000
2000
1500
1000
500
1 2 3 4 5
Figura 15. PCR pGEX –F y pGEX -R
Carril 1. Se encuentra el marcador de talla molecular de New England biolabs de 1Kb. Carril 2,3,4. Muestras de ADN molde las clones pGEX3X /IDS. Carril 5. Muestra de un control positivo de reacción, se utilizó para comprobar si en las muestras existe algun inhibidor de la PCR, la temperatura de anillamiento usada para este control era de 60.5°C. Este control proviene de un plásmido pIRES-EF1-GALNS, y se realizó la reacción con iniciadores específicos de unión para éste (EF1- F2 y AAT-R) de tal manera que a la mezcla de reacción se le colocaron 2µl de el ADN molde, empleado para las primeras reacciones , el resultado de ésta reacción esperado era de 1.3 Kb.
Para la segunda pareja de iniciadores (IDS-F y pGEX-R). Se utilizó un gradiente de
temperaturas de 56°, 57° y 58° con el ADN molde en el que se utilizarían los
iniciadores IDS-F y pGEX-R, en los 3 primeros pozos de la figura 16 se pueden
verificar las muestras corridas en gradiente de temperatura. En el pozo 10 se
muestra el control positivo de reacción que se explicó anteriormente y colocando de
nuevo en la mezcla 2μl de el ADN utilizado en las reacciones.
40
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
10000
8000
6000
5000
4000
3000
2000
1500
1000
500
1.3 Kb
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
10000
8000
6000
5000
4000
3000
2000
1500
1000
500
1.3 Kb
Figura 16. PCR IDS- F y pGEX-R
Carril 1. Muestra de ADN Plasmídico DH5α pGEX 3X IDS. Carril 2. Muestra de ADN Plasmídico BL21pGEX 3X IDS. Carril 10. Control positivo de reacción. Carril 11. Marcador de talla molecular 1 Kb New England Biolabs.
6.2. Ruptura celular por Sonicación Para realizar los ensayos inmunológicos era necesario estandarizar las condiciones
apropiadas para el proceso de ruptura celular en el sonicador Vibra Cell®. Se
probaron diferentes condiciones de ruptura comenzando con 30% de amplitud, ya
que el manual del equipo recomienda esta condición como la más apropiada. Se
tuvo en cuenta que durante el proceso de sonicación no se formara espuma ni se
calentara la muestra. Los ensayos preliminares se realizaron de acuerdo a lo
descrito en la tesis de Sosa y Espejo, 2003, utilizando 3 minutos por 1 segundo de
sonicado y dos de descanso en diferentes amplitudes 20%, 25%, 30%. Como se
observa en la Fig. 17, en los carriles 3 y 6 donde se utilizó el 20% de Amplitud, se
observa una clara visualización de las bandas correspondientes a los lisados
celulares, en relación a las otras condiciones.
41
1 2 3 4 5 6
Figura 17. Ruptura celular de E.coli
Carril 1.Muestra DH5α pGEX 3X/IDS sonicado a un 30% de Amplitud por 3 min; 1s de sonicado y 2s de descanso. Carril 2. Muestra DH5α pGEX 3X/IDS sonicada a un 25% de amplitud por 3 min; 1s de sonicado y 2s de descanso. Carril 3. Muestra DH5α pGEX 3X/IDS sonicada a un 20% de amplitud por 3 min; 1 seg de sonicado y 2s de descanso.Carril 4. Muestra de BL21 pGEX 3X/IDS sonicado a un 30% de Amplitud por 3 min; 1s de sonicado y 2s de descanso. Carril 5. Muestra BL21 pGEX 3X/IDS sonicada a un 25% de amplitud por 3 min; 1s de sonicado y 2s de descanso. Carril 6. Muestra BL21 pGEX 3X/IDS sonicada a un 20% de amplitud por 3 min; 1 seg de sonicado y 2s de descanso.
Utilizando 20% como la amplitud apropiada para el proceso, se realizaron nuevos
ensayos variando el tiempo de exposición de la muestra (3, 5, 7 y 12 minutos). En
la figura 18A y 18B se observan los corridos electroforéticos realizados a los lisados
celulares de las clones DH5α pGEX 3X/IDS y BL21 pGEX 3X/IDS donde las bandas
de las proteínas obtenidas después del rompimiento mecánico de las células son
mas evidentes exponerlas durante 12 minutos de sonicación.
42
1 2 3 4 5 6 7
Figura 18. Electroforesis de las muestras sonicadas con una amplitud del 20% a
diferentes tiempos.
A. Carril 1. Muestra de DH5α pGEX 3X/IDS sonicada a un 20% de amplitud por 3 minutos Carril 2. Muestra de DH5α pGEX 3X/IDS sonicada a un 20% de amplitud por 5 minutos Carril 3. Muestra de DH5α pGEX 3X/IDS sonicada a un 20% de amplitud por 7 min Carril 4. Muestra de BL21 pGEX 3X/IDS sonicada a un 20% de amplitud por 3min, 5. Muestra de BL21 pGEX 3X/IDS sonicada a un 20% de amplitud por 5min Carril 6. Muestra de BL21 pGEX 3X/IDS sonicada a un 20% de amplitud por 7min. B. Carril 1 Marcador de talla molecular Sigma SigmaMaker High (36kDA-205kDA) Carril 2. IDS TKT Carril 3 Muestra de DH5α control negativo sonicada por 12 min al 20% de amplitud. Carril 4 DH5α pGEX 3X/IDS sonicada por 12 min a un 20% de amplitud. Carril 5. Muestra de BL21 pGEX 3X control negativo sonicada por 12 min al 20% de amplitud. Carril 6. Muestra de BL21 pGEX 3X/IDS sin IPTG sonicada por 12 min a un 20% de amplitud. Carril 7. Muestra BL21 pGEX 3X/IDS inducida con IPTG sonicada por 12 min a un 20% de amplitud. 6.3. Crecimiento Celular Se evaluaron los clones DH5α pGEX3X/IDS y BL21 pGEX3X/IDS con el fin de
comparar el crecimiento de la biomasa de cada clon contra tiempo, en la figura 19,
se observa una de las placas leídas para realizar recuento. El recuento obtenido de
cada uno de los muestreos realizados se describe en la tabla 8. Como se puede
observar en la figura 20 se comparó el crecimiento celular entre los clones
analizados obteniendo una mayor crecimiento del clon DH5α pGEX3X/IDS.
43
Tabla 8. Crecimiento de los dos clones de E.coli
DH5 α pGEX3X/IDS
BL21 pGEX3X/IDS
Tiempo de cultivo (h)
Recuento en placa
(UFC/ml) Recuento en Placa
(UFC/ml) 1 2,32* 106 1,02*106
2 1,79* 107 2,5*106
3 2,89* 107 2,8*106
4 2,78* 108 1,5*107
5 1,12* 109 1,1*108
6 3,12*109 1,3*109
Figura 19. Crecimiento en placa LBAmp
44
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
0 1 2 3 4 5 6
Horas (h)
Ln X
/Xo
7
Ln X/XoDH5apGEX3X/IDS
Ln X/XoBL21pGEX3X/IDS
Crecimiento
Inducción
Figura 20.VELOCIDAD DE CRECIMIENTO CLONES BL21 pGEX3X/IDS Y DH5α
pGEX3X/IDS
6.4. Determinación de la concentración de proteínas totales La cuantificación de proteína total obtenida a partir de los lisados celulares de cada
clon se realizó mediante el método de Bradford (Bradford, M.M; 1976).
En la tabla 9, se presentan los resultados de la cuantificación de proteínas de los
sobrenadantes obtenidos en el lisado celular de los cultivos con las cepas indicadas.
Se evidenció que para el clon BL21 pGEX3X/IDS no existe una diferencia entre las
proteínas totales de los lisados celulares tanto inducidos como no inducidos.
45
Tabla 9. Determinación de proteínas totales por el método de Bradford
Muestra Proteínas Bradford Ensayo 1
Proteínas Bradford Ensayo2
DH5α-pGEX3X/IDS 2519.2 μg/ml 2148.5 μg/ml
DH5 α Control
Negativo
4181 μg/ml 3898 μg/ml
BL21-pGEX3X/IDS
inducida con IPTG
3066.5 μg/ml 3048.5 μg/ml
BL21 pGEX3X/IDS
Sin inducción
2888.5 μg/ml 2733.0 μg/ml
BL21-pGEX3X SIN
INSERTO
1881.5 μg/ml 1933.0 μg/ml
Debido a los resultados obtenidos se realizaron ensayos para comprobar la
formación de cuerpos de inclusión. En la tabla 10, se muestran las concentraciones
de proteína obtenidas después de realizar el correspondiente protocolo para la
solubilización de los cuerpos de inclusión. Durante los primeros lavados se ve una
clara disminución en la concentración de proteínas, sin embargo, en el momento de
adicionar la urea 2M se evidencia un leve incremento.
46
Tabla 10. Solubilización cuerpos de inclusión BL21 pGEX3X / IDS
Muestras Concentración
μg/ml Lavado 1 Solución 1 1260,25 Lavado 2
Solución 1 552,75 Lavado 3
Solución 1 215,25 Lavado 4
Solución 1 172,75 Lavado 5
Solución 1 150,25 Lavado 1 Solución 2 *ND
Solubilización 1 312,75
Solubilización 2 407,75
* ND (No Detectable)
6.5. Western Blot En los primeros ensayos realizados para detectar la IDShr en la fracción intracelular
de los lisados de E. coli, se colocaron 10μg de proteína por pozo para el corrido
electroforético. Después de la transferencia, la membrana se puso en contacto con
el anticuerpo primario (1/500) y el anticuerpo secundario (1/1000) como se describió
anteriormente en el numeral 5.9 de materiales y métodos.
Los resultados de este primer ensayo permitieron observar el reconocimiento de una
proteína aproximadamente a la altura de la IDS (TKT), sin embargo, se evidencia
una reactividad cruzada de los anticuerpos utilizados (IgY inmune) con otras
proteínas presentes en los lisados. Para minimizar este efecto se realizaron ensayos
variando las condiciones de la técnica. (DATOS NO MOSTRADOS)
Inicialmente se evaluaron 2 diluciones del anticuerpo conjugado 1/1000 y 1/2000,
con el fin de observar si en la menor dilución utilizada era posible detectar la IDS
(TKT). Simultáneamente, como control negativo del ensayo se omitió la adición del
anticuerpo primario para comprobar si había uniones inespecíficas entre la proteína
47
de los lisados celulares y el anticuerpo conjugado (figura 21).
Controles positivos Controles negativos Conjugado 1/1000 Conjugado 1/2000 Conjugado 1/1000 Conjugado 1/2000
1 2 3 4
Figura 21. Variación Anticuerpo conjugado en el Western blot Membrana 1, 2, 3, 4. Carril 1. Muestra lisado celular BL21 pGEX 3X/IDS Sin
Inductor. Carril 2. Control positivo, IDS (TKT) en una concentración de 10μg.
Adicionalmente se realizaron ensayos evaluando diferentes diluciones de anticuerpo
primario 1/500; 1/1000; y 1/2000, utilizando el anticuerpo conjugado 1/2000. Como
control del ensayo se utilizó el anticuerpo preinmune en las mismas diluciones
(figura 22).
48
Ac. Primario 1/500 Preinmune Inmune
Ac. Primario 1/2000 Preinmune Inmune
Ac. Primario 1/1000 Preinmune Inmune
Figura 22. Variación anticuerpo primario en Western blot Membrana 1, 2, 3, 4, 5, 6. Carril 1. Muestra lisado celular BL21 pGEX 3X/IDS Sin
Inductor. Carril 2. Control positivo la IDS TKT en una concentración de 10μg
Luego de observar que a esta dilución se disminuyó el ruido de fondo, se volvieron a
realizar ensayos con las concentraciones establecidas, Anticuerpo primario dilución
1/2000 y el Anticuerpo conjugado 1/2000.
49
Western blot Electroforesis
Inmune Preinmune
Figura 23. Ensayos con controles positivos y negativos de rupturas celulares
provenientes de los clones de E.coli
80KDa
60KDa
40KDa
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Carril 1. Muestra lisado DH5α pGEX 3X/IDS, Carril 2. Muestra lisado DH5α sin el plásmido control negativo, 3. Muestra lisado BL21 pGEX 5X sin el inserto control negativo, 4. Muestra lisado BL21 pGEX 3X/IDS Inducida con IPTG, 5. Muestra IDS TKT.
6.6. Actividad IDShr producida en E.coli Las muestras utilizadas para establecer la actividad biológica de la proteína IDShr
fueron los controles negativos y los transformados del clon BL21 pGEX3X/IDS. En la
tabla 12 se describen los resultados obtenidos en esta prueba donde se sugiere que
la actividad biológica de las muestras es muy baja, dado que en el IEIM el valor de
referencia para la prueba actividad biológica de la IDS en leucocitos de individuos
normales es de 12 nmolmg-1h-1, y los valores obtenidos se encuentran por debajo de
este valor (figura 25).
Tabla 11 Actividad IDShr
MUESTRA Fluorescencia – blanco
Proteína Total (mg/ml)
nmol/mg/h
BL21 CONTROL 2 1,97 0,914BL21 pGEX3X/IDS 2 2,53 0,711
50
Figura 24. Actividad enzimática E.coli comparada en las diferentes muestras.
6.7. Proteína detectada por ELISA Indirecta Como se observó en el numeral 5.11 de materiales y métodos, se fijaron las
muestras de los clones de E.coli en una concentración de 10μg por cada pozo,
como se ve en la tabla 12, Para cada ensayo de detección por ELISA indirecta se
realizó una curva de calibración en la que se correlacionan las absorbancias de las
muestras desconocidas con la curva de calibración de la IDSh (TKT). Dicha curva
de calibración se encuentra en el rango valores de 1000 ng, 500 ng, 250ng, 125ng,
62.5ng, 31.25ng y 0 ng. Estos puntos se extrapolaron en la ecuación obtenida de
cada ensayo, con los valores de absorbancia resultantes de la reacción con el
anticuerpo Inmune.
51
Tabla 12. IDShr detectada por ELISA Indirecta
Muestras
Proteína total
(μg/ml) Abs
[10μg/ml]IDS
[ng/ml]
[μg de IDS]/ml de Muestra
BL21pGEX3X CONTROL NEGATIVO 1933 0,278 210,25 406,4 BL21 pGEX3X/IDS Sin IPTG 2733 0,319 261,5 714,7 BL21pGEX3X/IDS Induc IPTG 3048 0,321 264 804,7 Lav 1Sln 1 BL21 pGEX3X/IDS 1260,25 0,199 111,5 140,5 Slb1 Cuerpos Inclusión 312,75 0,184 92,75 29,0 Slb2 Cuerpos de Inclusión 407,75 ND ND ND ND: No Detectable. Slb: Solubilizacion de cuerpos de inclusión. Lav: Lavados
0,0100,0200,0300,0400,0500,0600,0700,0800,0900,0
BL21
pGEX
3XC
ON
TRO
LN
EGAT
IVO
BL21
pGEX
3X/ID
S Si
nIP
TG
BL21
pGEX
3X/ID
SIn
duc
IPTG
Lav
1Sln
1
Slb1
Cue
rpos
Incl
usió
n
Slb2
Cue
rpos
de
Incl
usió
n
[mg
de ID
S]/m
l de
mue
stra
ND
*ND: No detectable
Figura 25. Comparación de la IDShr detectada por ELISA Indirecta en las muestras
de E. coli
52
7. Discusión de Resultados En una primera oportunidad se extrajo la proteína intracelular producida por la cepa
DH5-α/pGEX-3X/IDS, mediante protocolo de ruptura establecido en Morales D., en
2007; el sobrenadante del lisado mostró la presencia de IDShr, midiendo actividad
biológica como se muestra en la tabla 4.
El trabajo se inició evaluando el cambio de la crecimiento celular, tanto en los
cultivos con el clon DH5α/pGEX3X/IDS que se encontraba almacenado en el IEIM a
-80°C como con el clon BL21/pGEX3X/IDS; este último conservado en la
Universidad del Quindío. Se encontró que el clon DH5α/pGEX3X/IDS alcanzó una
mayor crecimiento celular en un tiempo similar respecto a la del clon BL21
pGEX3X/IDS como se observa en la tabla 8. La cepa DH5α se usa como una cepa
para subclonaje y no necesita de IPTG para inducir la expresión de la proteína,
puesto que en su genoma no tiene el gen lac Iq (INVITROGEN, 2004); mientras
que la cepa BL21 utilizada específicamente para expresar proteínas, necesita de un
elemento inductor de éste gen, y por referencias bibliográficas se conoce que el
IPTG reduce notablemente la velocidad de crecimiento, (Vilar et al; 2003), lo cual se
evidenció (Figura 20). Por tanto, se verificó que el clon BL21/pGEX3X/IDS es
promisorio para la expresión de la IDShr y efectuar estudios de escalado, tal como
está reportado en la literatura para muchas otras proteínas y como es recomendado
por el fabricante de la cepa BL21 (Amersham Bioscience).
Luego de conocer las diferencias en el crecimiento de las dos cepas, fue necesario
establecer un protocolo de sonicación para extraer las proteínas intracelulares
solubles presentes en los clones BL21 pGEX-3X/IDS y DH5-α/pGEX-3X/IDS. Se
partió de las condiciones establecidas en Espejo y Sosa en 2003 y como se muestra
en la figura 17 no se evidenció el patrón de bandeo característico lo cual podría
deberse a una ruptura celular incompleta. Para mejorarla se consideró que la
efectividad de este proceso dependía del número de ciclos y la energía aplicada al
medio (amplitud), sin embargo, altos valores en estos dos factores pueden afectar la
actividad biológica de la proteína analizada (Walker, J; 2002). Según las guías para
53
producir una proteína recombinante con los plásmidos pGEX, se recomienda que al
someter las muestras a proceso de sonicado, no se debe exceder un tiempo de
exposición de 10 minutos continuos para evitar la formación de espuma y
sobrecalentamiento de la muestra (Amersham Biosciences, 2002). Por éstas
razones y teniendo en cuenta la duración del ciclo de rompimiento establecido en el
trabajo de Espejo y Sosa en 2003, se fijaron tiempos de descanso de 2 segundos
dentro de los ciclos de sonicado. Mediante la técnica de Bradford como se puede
observar en la tabla 9 y las electroforesis de lisis celular (Figura 18), se confirmó que
a medida que aumentaba el tiempo de sonicado las proteínas presentes en el
sobrenadante intracelular aumentaban significativamente. También se observa que
las condiciones ensayadas en el procedimiento de ruptura celular, no afectaron las
proteínas en el sobrenadante, ya que no se observa proteína degradada. En los
ensayos con quince minutos de sonicado se observó un patrón de bandeo
característico de un proteínas degradadas (datos no mostrados). Estos ensayos
permitieron establecer las condiciones apropiadas para la ruptura celular de los
clones, determinando que al utilizar 12 minutos de sonicación, con pulsos de 1 s y
descansos de 2 s a una amplitud del 20%, se obtienen mayores concentraciones de
proteínas (Figura 18B) sin sobrecalentamiento de la muestra o formación de
espuma.
Con los lisados celulares obtenidos a partir de las rupturas se establecieron,
inicialmente para la cepa BL21/pGEX3X/IDS, las condiciones para implementar la
técnica de Western blot, para la cual, se estandarizaron las concentraciones de
anticuerpo conjugado a partir de las establecidas por Sosa y Barrera en 2005. Se
consideraron dos concentraciones de Anticuerpo conjugado (Figura 21) para
comprobar que en este rango de dilución 1/1000 a 1/2000, éste no se unió
inespecíficamente a otras proteínas del extracto celular (figura 21-3; 21-4). Variando
las concentraciones de anticuerpo primario se logró establecer que una dilución
1/2000 produjo un menor ruido de fondo, y mantuvo el reconocimiento de la IDShr
de TKT (figura 22).
El anticuerpo primario utilizado fue diseñado contra la región que se encontraba
corriente abajo del primer IDS-f (figura 12), con el cual se comprobó en estudios
54
previos de Sosa, A y Barrera, LA en el 2005 que el extracto de los anticuerpos
obtenidos de yema de huevo reconocieron la proteína IDShr. Sin embargo, debido a
que los extractos de anticuerpo contienen diferentes tipos de inmunoglobulinas,
tales como IgA, IgM, e IgY. (Schade, R et al 2005), en el IEIM se realizaron nuevos
trabajos en la purificación de estos anticuerpos por medio de una columna tiofílica
incrementando la especificidad en el reconocimiento de la proteína de interés. La
efectividad de éste método se comprobó en otros trabajos del IEIM, utilizando los
anticuerpos purificados para la detección de IDShr expresada en Pichia pastoris
donde no se observó reactividad cruzada con otras proteínas propias de la levadura.
En este trabajo, utilizando las diluciones establecidas de 1/2000 tanto para el
anticuerpo primario como para el conjugado, se realizó un ensayo empleando los
extractos celulares de los clones BL21/pGEX-3X/IDS, DH5-α/pGEX-3X/IDS y sus
respectivos controles negativos. En la figura 23 se muestra que el anticuerpo
primario reconoció 2 proteínas diferentes dentro de las cuales se observó unas
banda alrededor de los 40kDa, 80 kDa, peso molecular correspondiente a las
proteínas de interés esperadas, no glicosiladas, teniendo en cuenta que estas
formas la mas pesada 80 kDa tiene la IDShr (aproximadamente 55 kDa) y el de la
GST (aproximadamente 26 kDa) ; la de 40 kDa como se explica según Morales, D
en 2007 como una modificación proteolítica de la IDShr y como la forma de la
proteína sin el gen de la proteína de fusión GST; sin embargo, el reconocimiento de
las bandas adicionales, en los controles negativos, posiblemente se debe a que las
soluciones de anticuerpos purificados contienen tanto IgYs-α IDS como otras IgYs
producidas por el animal ante antígenos externos, de esta forma en el sistema de
detección estos anticuerpos podrían estar reconociendo proteínas de E. coli de
diferente peso molecular presentes en el extracto intracelular del mismo peso de la
proteína de interés (Figura 23, carriles 2 y 3).
Ante la posible detección de la proteína se cuantificó por la prueba de ELISA
Indirecta, para lo cual se estableció previamente que el clon DH5 α pGEX-3X/IDS
se excluiría de los ensayos por tratarse de una cepa óptima para clonaje de
fragmentos y no para expresión de proteínas. Por ésta razón, se centró el ensayo
55
para estudiar el clon BL21 pGEX-3X/IDS y medir la proteína presente en los
extractos de lisados intracelulares de proteína soluble, obteniendo concentraciones
de 714,7 [μg de IDS]/ml de muestra, para el clon sin inducir y 804,7 [μg de IDS]/ml
de muestra, en el clon inducido con IPTG. Las diferencias entre éstos dos valores
no fueron las esperadas, como en otros trabajos. Se comprobó este mismo
resultado, midiendo la concentración de proteína total por Bradford de los extractos
celulares de éste clon como se observa en la tabla 9 y 10.
Los resultados anteriores sugirieron que la IDShr se podría encontrar en forma
insoluble. Se conoce en trabajos previos (Rattenholl, A et al 2001) que la cepa BL21
al expresar proteínas recombinantes, provoca un desequilibrio entre la forma soluble
y la insoluble y por tanto, acumula proteínas en cuerpos de inclusión. Para hacer
esta verificación se solubilizó la proteína proveniente de éstos cuerpos de inclusión,
y se realizaron los ensayos como se muestra en la tabla 10, se logró solubilizar en
un primer ensayo 312,75 μg/ ml de proteína total y por ELISA indirecta permitió
evidenciar 29 μg IDS/ ml y en un segundo ensayo 407,75μg/ ml de proteína total y
no se detectó IDS (tabla 12). Estos últimos resultados al parecer confirman que lo
observado por Western Blot es un reconocimiento inespecífico en los lisados de los
controles negativos.
Para confirmar los anteriores resultados se observó la estabilidad genética de los
plásmidos construidos y transfectados en las cepas; para lo cual, se realizaron
minipreps en los clones DH5-α/pGEX-3X/IDS y BL21/pGEX-3X/IDS y se efectuaron
digestiones con las enzimas de restricción EcoRI y SmaI, como se muestra en la
figura 13. El análisis de digestión permitió evidenciar que el tamaño del plásmido no
coincide con el teórico calculado de 6.3 kb, pues al linearizarlo con la enzima de
restricción Sma I se observó que el tamaño era aproximadamente de 4.8 kb, lo cual
coincidió con la digestión realizada con EcoR I en la que se obtuvieron dos bandas
de aproximadamente 3.5 kb y 1.3 kb.
A partir de éstas observaciones encontradas en el plásmido pGEX3X/IDS; se
procedió a realizar la amplificación del gen de la IDS y su correcta dirección de
56
lectura dentro del vector y de tal manera, obtener un sistema de expresión de la
IDShr con el cual posteriormente se logre escalar la producción de esta sulfatasa.
En el trabajo de Morales, D, 2007 esta verificación no se efectuó. Para ello, se
diseñaron dos parejas de iniciadores como se muestra en la tabla 6, con las cuales
se espera amplificar el gen completo y con la otra pareja verificar la direccionalidad
de la inserción. En las figuras 15 y 16 se muestran los resultados de la PCR
efectuada para esta determinación.
La ausencia de amplificado tras el PCR con la pareja de iniciadores pGEX-f y
pGEX-r, que fueron diseñados para anillarse en los extremos flanqueantes del
ADNc de IDS permitió confirmar la sospecha de que existía una alteración en la
integridad del plásmido pGEX3X-IDS en los dos clones utilizados. Luego se realizó
una PCR con la segunda pareja de iniciadores (IDS-f y pGEX-r) y se observó un
patrón de bandeo indicativo de la unión de un solo primer, posiblemente el de IDS-f
(figura 16), pues con los otros dos no se observó este mismo patrón de bandeo.
Estos resultados sugieren la pérdida de una secuencia del plásmido de
aproximadamente 1.5 kb, el cual se propone sea el gen de resistencia a Ampicilina
(952pb) y parte del gen de la IDS, lo cual puede ser explicado por una
recombinación entre el plásmido y el genoma de la bacteria.
Los genes de antibióticos usados en los plásmidos para conferirle resistencia en un
medio selectivo que contiene el antibiótico, favorece la permanencia del
transformado dentro de la célula. Sin embargo, si las condiciones metabólicas o de
temperatura cambian, se ha observado la eliminación total de los plásmidos o la
integración del gen de resistencia al antibiótico dentro del ADN genómico (Martinez-
Morales F, et al, 1999). Estos autores también proponen que este hecho puede ser
mediado por transposones y replicones del plásmido, los cuales interfieren
directamente en las construcciones realizadas. Otro mecanismo que explica la
integración del gen de Ampicilina al ADN genómico es por medio de las integrasas,
las cuales han sido encontradas en regiones conservadas de los integrones, un
elemento genético involucrado en la resistencia de genes presentes en varios tipos
de bacterias (Francia V, et al, 1996).
57
Como prueba confirmatoria se realizó la lectura de actividad enzimática de la
proteína soluble proveniente de los extractos celulares, los cuales indicaron los
problemas de la expresión de la proteína, éstos confirman que la IDShr producida
en el clon BL21 pGEX-3X/IDS tiene una actividad biológica que se considera como
no detectable o muy baja, cuando se compararon, los controles negativos frente a
los clones que tenían el inserto. Una posibilidad es que la cepa transformada haya
perdido parte del inserto y por tanto la posibilidad de expresar una proteína activa.
58
8. CONCLUSIONES
• Se logró establecer para los dos clones DH5α pGEX3X/IDS y BL21
pGEX3X/IDS mediante las restricciones realizadas al constructo la perdida
de un fragmento de 1.5 kb.
• Se pudo verificar la presencia del ADNc de la IDSh en el constructo
mediante la técnica PCR, por la unión del primer IDS-f.
• Se detectó y cuantificó la proteína proveniente de los extractos celulares de
los clones DH5α pGEX3X/IDS y BL21 pGEX3X/IDS para los ensayos de
Western blot y ELISA indirecta.
• Se evaluaron los clones DH5α pGEX3X/IDS y BL21 pGEX3X/IDS mediante
las técnicas de PCR, Western blot y ELISA Indirecta y la medición de la
actividad enzimática utilizadas como pasos secuenciales apoyadas en
ayudas bioinformáticas que permitieron estudiar en conjunto la viabilidad
del producto de la transformación de un hospedero como E. coli. Estos
ensayos posibilitan evaluar de forma precisa cualquier tipo de clonación o
microorganismo transformado, y a futuro se propone utilizar estos protocolos
como paso previo a los estudios de producción y escalado de estos sistemas
de expresión.
• Se establecieron las condiciones de lisis celular en un 20% de amplitud con
12 minutos de duración en ciclos de 1 segundo de sonicado y 2 de descanso
para los clones DH5α pGEX3X/IDS y BL21 pGEX3X/IDS.
59
9. RECOMENDACIONES
• Efectuar una nueva transformación del plásmido pGEX-3X con el gen de la
IDS y transfectarlo en la cepa BL21 basados en que dicha cepa se encuentra
ampliamente documentada en la literatura como un sistema de expresión
óptimo, además facilita la purificación por afinidad ya que incluye la proteína
de fusión GST y dado el caso, se puede llegar a purificar una proteína
(IDShr) a partir de cuerpos de inclusión.
• A futuro, se recomienda efectuar estudios de estabilidad en los sistemas
recombinantes, estableciendo previamente a cualquier trabajo de escalado
los puntos críticos durante la clonación que pueden variar la expresión
correcta de una proteína.
• Para ensayos posteriores de Western blot y ELISA Indirecta, se recomienda
obtener un anticuerpo IgY α– IDS purificado de una manera más específica,
mediante el uso de una columna en la cual se fije el péptido contra el cual
fue producido dicho anticuerpo, con el propósito de disminuir los problemas
de reconocimiento de proteínas y uniones inespecíficas.
• Se recomienda para los ensayos de fermentación relacionar los datos
obtenidos mediante la proteína detectada por ELISA Indirecta con los valores
de actividad biológica.
60
10. ANEXO 1 Reactivos
ELECTROFORESIS DE POLIACRILAMIDA • Gel Separador 10%
Agua Desionizada 3.9ml Tampón Tris HCl pH8.8 2.5ml SDS 10% 0.1ml Arcrilamida/Bisacrilamida 3.3ml *Persulfato de Amonio 60µl *Temed 20µl *Se adicionan al final , al mismo tiempo.
• Gel de almacenamiento Agua Desionizada 3ml Tampón Tris HCl pH 6.8 1.25ml SDS 10% 0.1ml Arcrilamida/Bisacrilamida 0.7ml *Persulfato de Amonio 50 µl *Temed 10 µl ELECTROFORESIS DE AGAROSA Agarosa 0.8% 0.32 Tampón TBE 40ml CALDO LB Extracto de Levadura 0.5% Tristona 1% NaCl 0.5% Agua 200ml
61
ANEXO 2 Curva Calibración Albúmina 1 [ ]mg/ml Abs
2,8 1,044 1,4 0,703 0,7 0,518
0,35 0,422 0,175 0,32
0 0,34
Curva Calibración Albúminay = 0,2614x + 0,3215
R2 = 0,9917
00,20,40,60,8
11,2
0 1 2 3
mg/ml
Abs
Curva Calibración Albúmina 2 [ ]mg/ml Abs
1,4 1,302 0,7 0,6655
0,35 0,523 0,175 0,438
0,0875 0,391 0 0,302
Curva Calibración Albúmina y = 0,6828x + 0,2949R2 = 0,9755
0
0,5
1
1,5
0 0,5 1 1,5
mg/ml
AB
S
62
ANEXO 3 Curva Calibración IDS ABS μg/ml
2,604 1000 1,1845 500
0,587 250 0,2415 125 0,1745 62,5
0,064 31,25 0,048 0
Curva Calibración IDSy = 0,0026x - 0,0238
R2 = 0,9962
-1
0
1
2
3
0 500 1000 1500
Concentración
AB
S
63
ANEXO 4
BL21 DH5α
Verificación del Banco Mini- prep
Digestión EcoRI
IDShr
Escherichia coli
Plásmido digerido
Cultivo medio LBA
Cultivo en 100 ml
Cultivo en 10 ml
Actividad Western Blott ELISA Indirecta
LISADOS CELULARES
64
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69
EVALUACIÓN DE DOS CLONES DE Escherichia coli TRANSFORMADOS MEDIANTE UN VECTOR PLASMÍDICO CON EL ADN COMPLEMENTARIO
DE LA IDURONATO 2- SULFATO SULFATASA HUMANA
Rojas Molano, Andrea1 ; Córdoba Ruiz, Henry2; Barrera Avellaneda, Luis Alejandro
1Microbiologia Industrial. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. 2 Ingeniero Químico, Maestría Ing. Química. Profesor del Departamento de Química. Pontificia
Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. 3Director Instituto de Errores Innatos del Metabolismo.
Resumen La expresión de proteínas recombinantes, ha sido de gran utilidad en el empleo para la terapia de reemplazo enzimático. El síndrome de Hunter, enfermedad metabólica en la que la enzima Iduronato 2- sulfato sulfatasa ha perdido su funcionalidad y se encuentra deficiente. El Instituto de Errores Innatos del Metabolismo ha diseñado un nuevo modelo de expresión empleando procariotas para la expresión de proteínas. Por tanto, se desea expresar la IDSh en un modelo recombinante Escherichia coli transformado en la Universidad del Quindío, microorganismo ampliamente utilizado para expresar proteínas menos complejas. En el presente trabajo se pretende evaluar la transformación del plásmido pGEX3X/IDS en las cepas BL21 y DH5α, por medio de la técnica PCR, para cual se diseñaron los primers que permitan verificar la inserción completa del ADNc en el plásmido, y su correcta direccionalidad dentro del marco de lectura, evidenciando la pérdida de un fragmento de 1.5 kb. Además, se establecieron condiciones de ruptura celular, y con base en la lectura de proteínas totales de los lisados se logró estandarizar las condiciones de detección para Western blot y ELISA indirecta. Adicionalmente, se consideraron protocolos básicos para identificar la presencia del producto de interés como proteína insoluble en cuerpos de inclusión. Se propone esta metodología previa a estudios de producción y escalado de este producto recombinante. Abstract The expression of recombinant proteins in Eukariotic and procariotic organisms has been very useful in enzyme replacement therapies, including Hunter disease or Mucopolysaccharidosis II (MPS II). MPS II is caused by the deficiency of Iduronate 2- sulphate sulphatase (IDS). The Institute for the Study of Inborn Errors of Metabolism (IEIM) has develop a new expression model utilizing Escherichia coli expression of proteins such as IDS.The purpose of the study was to express IDS in the recombinant model of Escherichia coli transformed at University of Quindio. The aim of this work was to the transformation efficiency conditions for the plasmid pGEX3X/IDS in strains BL21 and DH5 α by means of PCR technique. The primers were designed to verify the complete insert of the cDNA in the plasmid, and their correct orientation within the reading frame. In addition, conditions for cellular rupture were standardized. Based on lysate total proteins it was possible to standardize the detection conditions for Western blot and indirect ELISA. Moreover, basic protocols were used in order to identify IDS as insoluble proteins in inclusion bodies. We propose this methodology to evaluate the efficacy of the insertion steps, before the scaling up process for the enzyme production. 1. INTRODUCCIÓN En el síndrome de Hunter (MPSII), ó mucopolisacaridosis tipo II la enzima Iduronato 2-Sulfato Sulfatasa (IDS) ha perdido su funcionalidad; ésta sulfatasa lisosomal hace parte del catabolismo de dos glicosaminoglicanos (GAGs), tales como los sulfatos de heparán y dermatán (Scriver et al, 2001). De este síndrome se conocen dos formas clínicas
diferentes: la forma leve (MPSII B) y la severa (MPSII A). En la secuencia de la IDS se encuentran ocho sitios potenciales de N-glicosilación (Millat, et al 1997). En esta enfermedad, como en otros errores innatos del metabolismo, el defecto se halla a nivel del gen que codifica para la enzima, lo cual, la convierte en una patología intratable mediante la terapéutica convencional. Por ser una “enfermedad rara” dada su incidencia, el manejo de MPS II, tradicionalmente ha estado dirigido a la corrección de las manifestaciones clínicas de la enfermedad; en este sentido, el uso de audífonos y la terapia ortopédica han sido de utilidad. Sin embargo, la búsqueda de soluciones terapéuticas, ha llevado a diferentes ensayos como, proporcionar a los pacientes la enzima IDS activa mediante Terapia de Reemplazo Enzimático (TRE). Mediante esta técnica en la actualidad se ofrece comercialmente, elaprase®, idursulfasa®. La TRE ha mostrado efectividad en otros desordenes metabólicos como el Síndrome de Gaucher, Fabry, Hurler, Maroteaux- Lamy y Pompe. (Brady et al, 1973). Para TRE se pueden emplear modelos más económicos respecto a las líneas celulares, como lo son E. coli y levaduras, y su caracterización bioquímica, con lo cual se ha abierto una ventana de esperanza para el tratamiento del Síndrome de Hunter. En el Instituto de Errores Innatos del Metabolismo (IEIM) se ha logrado avanzar en la Expresión de la IDShr tanto en Escherichia coli, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha como modelos expresión recombinantes de expresión de proteína; como también, se están estudiando alternativas como la Terapia Génica, o las Células Madre. (Acero, J 2004) (Garzón, K 2006) (Gutiérrez, M 2005) (Landázuri, P 2002) (Poutou, RA 2006) En trabajos previos realizados por la doctora Patricia Landázuri de la Universidad del Quindío, se extrajo el ADN de la IDShr del plásmido pUC13-IDSh (plásmido donado por el Doctor Tomatsu, de la Universidad de Saint Louis) el cual se insertó en el plásmido pGEX-3X . Este constructo, pGEX-3X/IDS se electroporó, en dos diferentes cepas de E. coli, BL21 y DH5α, se evidenció experimentalmente actividad biológica de la proteína producida en con el clon DH5α/pGEX-3X/IDS. En este trabajo, se presentan los pasos principales que se deben tener en cuenta para evaluar un microorganismo transformado genéticamente, teniendo en cuenta técnicas como PCR, digestiones enzimáticas, y otras más especificas para verificar la expresión del gen insertado, usando Western blot y ELISA Indirecta. Para escalar la producción de la IDShr, suficiente para estudios de TRE, será necesario posteriormente, evaluar la producción y actividad de la proteína en los transformados en los medios tradicionales recomendados por Invitrogen a nivel de matraz erlenmeyer agitado. 2. Materiales y Métodos 2.1 Microorganismos Los clones BL21/pGEX-3X/IDS y DH5α/pGEX-3X/IDS, obtenidos por Morales D.,2007, y las cepas BL21 y DH5α como controles negativos fueron conservados a –80 °C en LBA/LB con glicerol al 30%, luego se inocularon 300 μl en 2.7 ml de medio LBA/LB fresco, se crecieron a 37°C por 16 h como inóculo. De 10 ml del anterior cultivo se inocularon a 90 ml en medio LBA/LB fresco, se crecieron por 3h a 37°C. Al cultivo del clon BL21/pGEX-3X/IDS se le adicionó IPTG a una concentración final de 1mM y se creció a las mismas condiciones por 4 horas. (Espejo, AJ; Sosa, AC. 2003) 2.2. Lisis Celular Se centrifugaron los cultivos de todos los clones y cepas nativas a 3800 rpm por 15 minutos a 4° C, resuspendiendo la biomasa en el buffer de lisis. Para realizar la lisis celular se preparó el buffer de Lisis (Tris HCl 50 mM , NaCl 300 mM, 10mM de Imidazol, 0.05% Tween 20, Ajustando el pH a 8.0 y adicionando finalmente 1 mM de DTT y 1 mM PMSF). Después de resuspendidas las muestras en el buffer se sonicó por 1
s y 2 s de descanso en durante 12 min, con una amplitud de 20%. Luego de la ruptura se centrifugó a 3800 rpm por 15 minutos a 4° C, y se guardaron los sobrenadantes a -20°C. Este método consideró el usado en el trabajo de Espejo, AJ; Sosa, AC. 2003, y de la tesis doctoral de Landázuri, P. 2002 tomando modificaciones de cada uno. 2.3. Extracción ADN Plasmídico Mini Prep Una colonia aislada en Agar LB- Ampicilina 100μg /ml se resuspendió en 3 ml de caldo LBA a 37°C y se creció durante 16 horas, luego se centrifugó la biomasa a 13200 rpm por 4 min a temperatura ambiente, se descartó el sobrenadante y se adicionaron 100μl de la solución I ;se mezcló por inversión y vórtex para resuspender totalmente la biomasa. Luego se adicionaron 200μl de la solución II, mezclando por inversión y dejando en reposo por 5min, para posteriormente se adicionó 150μl de la solución III. Después se dejó la mezcla en reposo por 1 hora a 4°C. Seguidamente se centrifugó a 10000 rpm por 5 min a temperatura ambiente, el sobrenadante se pasó a un tubo estéril, y se adicionó 1ml de Isopropanol al 95%, luego se centrifugó por 15 min a 10000 rpm y se removió el isopropanol. Se lavó el pellet con 0.5ml de etanol al 70% dos veces, se dejó secar en horno el exceso de etanol y se resuspendió en 50μl de Buffer TE. (Sambrook, 2001) 2.4. Digestiones Plásmido pGEX3X/IDS Se realizaron dos diferentes digestiones para comprobar los tamaños moleculares tanto del inserto como del plásmido en su totalidad, para la primera reacción se empleó la enzima Sma I, y en la segunda reacción se empleó EcoR I. 2.5. Diseño de Primers para amplificar el gen de la IDS Se diseñaron dos parejas de primers en el programa PRIMER3 (v. 0.3.0)1 y con los criterios estándar del programa, para verificar la presencia del inserto y la direccionalidad del mismo. Esto se realizó sobre la secuencia del constructo pGEX3X/IDS. La primera pareja de primers (pGEX-F y pGEX-R) se diseñó para que ésta se anillara sobre el plásmido pGEX-3X en los extremos flanqueantes de la IDS, y producir un fragmento de 1489pb. La segunda pareja de primers (IDS –F y pGEX-R) amplificará un fragmento de 813pb, el cual corresponde a la mitad del ADNc de la IDS, lo que permitió confirmar la direccionalidad del inserto. Las condiciones se muestran en la Tabla 1. Tabla 1. Condiciones PCR
Condiciones para amplificar primera pareja Condiciones para amplificar segunda pareja Paso Temperatura Tiempo Nro.
de ciclos
Paso Temperatura Tiempo Nro. de
ciclos Denaturación
inicial
95°C 5´ 1 Denaturación
inicial
95°C 5´ 1
Denaturación 95°C 1´ 30 Denaturación 95°C 1´ 30
Anillamiento 60°C 1´ 30 Anillamiento 56°C 1´ 30
Extensión 72°C 1.5´ 30 Extensión 72°C 1.5´ 30
Extensión
final
72°C 10´ 1 Extensión
final
72°C 10´ 1
Sostenimiento 4°C --- 1 Sostenimiento 4°C --- 1
1 Este diseñó se efectuó en la página http://frodo.wi.mit.edu
2.6. Determinación de la concentración de proteínas totales. Además, se utilizó la técnica de Bradford, en la cual se colocaron 4 μl de muestra y 196 μl del reactivo Bradford (Biorad). La curva de calibración se realizó con suero de albúmina bovina, en el rango de 1.4 a 0.875 mg/ml.La mezcla se leyó en un lector de placas Anthos 2020 Reader (Anthos Lactec Instruments®) a 620 nm. Como referencia se toma la curva de calibración con albúmina, aunque para cada medición de proteínas se empleó una curva de calibración distinta. (Dawson, R. M. C, 1986). 2.7. Determinación de biomasa Una colonia aislada en Agar LB- Ampicilina (LBAmp) 100μg/ml se resuspendió en 10ml de caldo LBAmp 100μg/ml, y se creció a 37°C por 16h. El crecimiento se inoculó en 90ml de medio fresco LBAmp 100μg/ml; a partir de éste momento y durante las 6 horas subsecuentes se tomaron muestreos de 1 ml cada hora. Se realizaron diluciones decimales seriadas hasta obtener la concentración óptima para realizar recuento de colonias (UFC/ml). A partir de la dilución apropiada se sembraron 100 μl en superficie en agar LBAmp 100μg /ml, se incubó a 37°C por 24 horas y se leyeron los resultados (Allaert, C et al; 2002) 2.8 Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) La electroforesis de proteínas se realizó en un gel de poliacrilamida al 10% en condiciones reductoras, diluyendo las muestras en Buffer Laemmli (Biorad®) adicionado con 2-mercaptoetanol (SIGMA). Las condiciones de corrido se mantuvieron a 120V 60 mA durante 2 horas. Finalmente, los geles fueron teñidos con azul de coomasie y el peso molecular de las muestras se determinó comparando las bandas obtenidas con el marcador de peso molecular utilizado SigmaMaker High, SIGMA®. (Walker J; 2002) 2.9. Detección de la IDShr por Western blot Después de realizar un corrido electroforético de los lisados bacterianos, los geles fueron transferidos a una membrana de Nitrocelulosa HIBOND C-Extra 0.22μm (Amersham), la cual debía ser previamente activada con un buffer de Transferencia pH 8.3 (Tris Base, Glicina, Metanol, SDS) durante 2 horas manteniendo como condiciones de transferencia 100V y 350mA. La membrana se bloqueó con solución de bloqueo (TBS, Tween 0.1 %, Leche descremada 5%) durante 2 horas a temperatura ambiente. Cada una de las membranas se incubó con su respectivo anticuerpo primario, IgY α IDS producido en gallina y anticuerpo IgY preinmune, en una dilución de 1/2000 y se incubó en las condiciones descritas anteriormente. Posteriormente se realizaron cinco lavados de 5 minutos cada uno con TBS – Tween 20 0.2%. Se adicionó el anticuerpo secundario antichicken IgY HRP (PROMEGA) en una dilución 1/2000 durante una hora. Se realizaron nuevamente lavados y por último la reacción se reveló utilizando una solución de Imidazol, TritonX100, Diaminobenzidina y Peróxido de Hidrógeno. (Sosa A, Barrera L.A. 2005) 2.10. Determinación de actividad específica de la IDShr Para la determinación de la actividad enzimática de la IDShr se empleó un sustrato fluorométrico llamado 4-metilumbeliferil - α - iduronato 2- sulfato (125mM). A 10μl de muestra se adicionó 20�lde buffer del sustrato (CH3 COONa/CH3COO Y Pb (CH3COO)2.3H2O 10mM; la mezcla se incubó a 37°C durante 4 horas, al cabo de este tiempo se adicionó 40μl de Buffer Pi/Ci, (NaH2PO4 0.4M, C6H5Na3O7. 2H2O 0.2M pH 4.5 y NaN3 0.02%) y 10 μl de LEBT (Suspensión de enzimas lisosomales de hígado de conejo parcialmente purificadas). Esta última mezcla se incubó por 24h a 37°C. La reacción se detuvo con 650μl de buffer de parada (NaHCO3/NaCO3 0.5M, pH 10.7, con
Glicina 1.7mM). La fluorescencia se determinó en un fluorometro Turner 450, a 360 nm de excitación y 415 nm de emisión. Como control se emplearon los sobrenadantes de las rupturas celulares de los cultivos de las cepas sin el inserto. La actividad se expresa en nanomoles de sustrato convertido por hora por miligramos de proteína total (nmolh-1mg-
1). (Voznyi, Y et al 2001) 2.11 Determinación de concentración de IDShr por ELISA indirecta Se colocaron 50μl de antígeno diluido en PBS 1X en una placa de poliestireno (Nunc Maxisorp®) de 96 pozos. Se realizaron diluciones dobles seriadas de la proteína IDS (TKT®) para la curva de calibración y las muestras a analizar a una concentración final de 10μg/pozo; la placa se incubó a 37ºC durante 18 horas en cámara húmeda. Luego se adicionaron 200μl de solución de bloqueo, durante 2 horas a 37ºC en cámara húmeda y se lavó con solución de PBS Tween 0.05%. Se adicionaron 100μl del anticuerpo primario, IgY α IDS producido en gallina, en dilución 1/4000, y como control negativo de las muestras se utilizó IgYs preinmunes. Se mantuvieron durante 1 hora a 37ºC en cámara húmeda, seguido de lavados en las condiciones descritas anteriormente. Finalmente, se adicionó el anticuerpo Anti-chicken IgY, HRP conjugate (Promega®) diluido 1/4000, y la prueba se reveló con sustrato TMB 3,3´,5,5´tetrametilbenzidina (SureBlue Reserve KPL). La reacción se detuvo con HCl 1N y fue leída en un lector de ELISA Anthos 2020 Reader (Anthos Lactec Instruments) a una longitud de onda de 450nm. (Sosa A, Barrera L.A. 2005) 2.12 Solubilización cuerpos inclusión Por cada 100 ml de cultivo celular se utilizaron 4ml de solución de lisis, se centrifugó a una velocidad de 4000 rpm por 15 min a 4°C, luego se descartó el sobrenadante y se conservó el pellet. Se disolvió la biomasa resultante de 100ml de cultivo en 1.5 ml de la solución de lavado 1 (0.5% Triton X100, 50mM Tris-HCl pH 8, 100mM NaCl), se homogenizó la solución con los restos celulares manteniendo las soluciones en condiciones de refrigeración, se repitieron los lavados por 5 veces y se centrifugó a 12000 rpm a 4°C por 10 minutos. Luego de realizar los lavados se utilizó la solución 2 para eliminar el resto de tritón presente en los restos celulares, ésta contenía 50mM Tris pH 8, 100mM NaCl.El lavado se realizó por dos veces más centrifugando a 12000 rpm a 4°C por 10 minutos, luego se conservaron los restos celulares con la solución de resolubilización de cuerpos de inclusión que contenía 10 mM NaHCO3 y Urea 2 M a pH 13, manteniendo la temperatura a 4°C y bajo condiciones de agitación; luego de 24 h se centrifugó a 12000 rpm a 4°C por 10 minutos se tomó el sobrenadante y se resuspendió con una solución 10 mM NaHCO3 , DTT 1mM y Urea 2 M a pH 8. Se procedió a leer la concentración de proteínas (Bradford) (Freidell, E; et al, 2007) 3.Resultados 3.1 Estabilidad Genética De la digestión del ADN plasmídico extraído de los clones de DH5α-pGEX3X/IDS y BL21-pGEX3X/IDS con Sma I y EcoR I (Invitrogen), se obtuvieron los resultados mostrados en la Figura 1.
Figura 1. Digestiones EcoRI y SmaI Carril 1. Marcador de peso 1kb New England Biolabs. Carril 2. Muestra de ADN plasmídico BL21 pGEX 3X/IDS digerido con SmaI. Carril 3. Muestra de ADN plasmídico DH5α pGEX 3X/IDS digerido con SmaI, colonia 1. Carril 4. Muestra de ADN plasmídico DH5α pGEX 3X/IDS, colonia 2. Carril 5. Muestra de ADN plasmídico BL21 pGEX 3X/IDS digerido con EcoR I. Carril 6. Muestra de ADN plasmídico DH5α pGEX 3X/IDS digerido con EcoR I, colonia 1. Carril 7. Muestra de ADN plasmídico DH5α pGEX 3X/IDS digerido con EcoR I, colonia 2. Carril 8. Muestra de ADN plasmídico BL21 pGEX 3X/IDS. Carril 9. Muestra de ADN plasmídico DH5α pGEX 3X/IDS, colonia 1. Carril 10. Muestra de ADN plasmídico DH5α pGEX 3X/IDS, colonia 2.
Para la amplificación del gen de la IDS se utilizaron las dos parejas de primers, luego de repetir varias veces la misma metodología disminuyendo la concentración de primers desde 0.5 mM hasta 0.3 mM y de cambiar la temperatura de anillamiento en un rango de temperaturas que permitieran observar la reacción Los resultados se muestran en la figura 2.
Figura 2. PCR pGEX –F y pGEX–R
10000
8000
6000
5000
4000
3000
2000
1500
1000
500
10000
8000
6000
5000
4000
3000
2000
1500
1000
500
1 2 3 4 5
Carril 1. Se encuentra el marcador de peso molecular de New England biolabs de 1Kb. Carril 2,3,4. Muestras de ADN molde las clones pGEX3X /IDS. Carril 5. Muestra de un control positivo de reacción, se utilizó para comprobar si en las muestras existe algun inhibidor de la PCR, la temperatura de anillamiento usada para este control era de 60.5°C. Este control proviene de un plásmido pIRES-EF1-GALNS, y se realizó la reacción con primers específicos de unión para éste (EF1- F2 y AAT-R) de tal manera que a la mezcla de reacción se le colocaron 2µl de el ADN molde, empleado para las primeras reacciones , el resultado de ésta reacción esperado era de 1.3 Kb.
igura 3. PCR IDS- F y pGEX-R EX 3X
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
10000
8000
6000
5000
4000
3000
2000
1500
1000
500
1.3 Kb
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
10000
8000
6000
5000
4000
3000
2000
1500
1000
500
1.3 Kb
FCarril 1. Muestra de ADN Plasmídico DH5α pGIDS. Carril 2. Muestra de ADN Plasmídico BL21pGEX 3X IDS. Carril 10. Control positivo de reacción. Carril 11. Marcador de peso molecular 1 Kb New England Biolabs.
3.2 Ruptura celular por Sonicación icos era necesario estandarizar las condiciones
plitud apropiada para el proceso, se realizaron nuevos
Para poder realizar los ensayos inmunológapropiadas para el proceso de ruptura celular en el sonicador Vibra Cell®. Se probaron diferentes condiciones de ruptura comenzando con 30% de amplitud, ya que el manual del equipo recomienda esta condición como la más apropiada. Se tuvo en cuenta que durante el proceso de sonicación no se formara espuma ni se calentara la muestra. Los ensayos preliminares se realizaron de acuerdo a lo descrito en la tesis de Sosa y Espejo, 2003, utilizando 3 minutos por 1 segundo de sonicado y dos de descanso en diferentes amplitudes 20%, 25%, 30%. Utilizando 20% como la amensayos variando el tiempo de exposición de la muestra (3, 5, 7 y 12 minutos). En la figura 4A y 4B se observan los corridos electroforéticos realizados a los lisados celulares de las clones DH5α pGEX 3X/IDS y BL21 pGEX 3X/IDS donde las bandas de las proteínas obtenidas después del rompimiento mecánico de las células son mas evidentes exponerlas durante 12 minutos de sonicación.
A B
esis de las muestras sonicadas con una amplitud del 20%
5α pGEX 3X/IDS sonicada a un 20% de amplitud por 3 minutos Carril
.3 Densidad Celular
ente los clones DH5α pGEX3X/IDS y BL21 pGEX3X/IDS con
Figura 4. Electrofor
a diferentes tiempos.
A. Carril 1. Muestra de DH2. Muestra de DH5α pGEX 3X/IDS sonicada a un 20% de amplitud por 5 minutos Carril 3. Muestra de DH5α pGEX 3X/IDS sonicada a un 20% de amplitud por 7 min Carril 4. Muestra de BL21 pGEX 3X/IDS sonicada a un 20% de amplitud por 3min, 5. Muestra de BL21 pGEX 3X/IDS sonicada a un 20% de amplitud por 5min Carril 6. Muestra de BL21 pGEX 3X/IDS sonicada a un 20% de amplitud por 7min. B. Carril 1 Marcador de peso molecular Sigma SigmaMaker High (36kDA-205kDA) Carril 2. IDS TKT Carril 3 Muestra de DH5α control negativo sonicada por 12 min al 20% de amplitud. Carril 4 DH5α pGEX 3X/IDS sonicada por 12 min a un 20% de amplitud. Carril 5. Muestra de BL21 pGEX 3X control negativo sonicada por 12 min al 20% de amplitud. Carril 6. Muestra de BL21 pGEX 3X/IDS sin IPTG sonicada por 12 min a un 20% de amplitud. Carril 7. Muestra BL21 pGEX 3X/IDS inducida con IPTG sonicada por 12 min a un 20% de amplitud. 3
. Se evaluaron principalmel fin de comparar el crecimiento de la biomasa de cada clon contra tiempo, se observa una de las placas leídas para realizar recuento. El recuento obtenido de cada uno de los muestreos realizados se describe en la tabla 2. Como se puede observar en la tabla 2 se comparó el crecimiento celular entre los clones analizados obteniendo un mayor crecimiento del clon DH5α pGEX3X/IDS.
Tabla 2. Crecimiento de los dos clones de E.coli
/IDS pGEX3X/IDS DH5 α BL21
pGEX3X Tiempo de
Recuento en Placa Recuento en Placa cultivo (h) (UFC/ml) (UFC/ml) 1 2,32* 106 1,02*106
2 1,79* 107 2,5*106
3 2,89* 107 2,8*106
4 2,78* 108 1,5*107
5 1,12* 109 1,1*108
6 3,12*109 1,3*109
3.4 Determinación de la concentración de proteínas totales elulares de cada clon
abla 3. Determinación de proteínas totales por el método de Bradford
La cuantificación de proteína total obtenida a partir de los lisados cse realizó mediante el método de Bradford (Bradford, M.M; 1976). Tabla 3. T
Muestra Proteínas Bradford Proteínas Bradford Ensayo 1 Ensayo2
DH5α-pGEX3X/IDS 2 l 21 l 519.2 μg/m 48.5 μg/m
DH5 α Control Negativo 4181 μg/ml 3898 μg/ml
BL21-pGEX3X/IDS 3066.5 μg/ml 3048.5 μg/ml inducida con IPTG
BL n 2888.5 μg/ml 2733.0 μg/ml 21 pGEX3X/IDS Siinducción
BL2 SIN 1881.5 μg/ml 1933.0 μg/ml 1-pGEX3X INSERTO
ebido a los resultados obtenidos se realizaron ensayos para comprobar la formación de
ión cuerpos de inclusión BL21 pGEX3X / IDS
Muestras
Dcuerpos de inclusión. En la tabla 4, se muestran las concentraciones de proteína obtenidas después de realizar el correspondiente protocolo para la solubilización de los posibles cuerpos de inclusión. Tabla 4. Solubilizac
Concentración μg/ml
Lavado 1 Solución 1 1260,25 Lavado 2
Solución 1 552,75 Lavado 3
Solución 1 215,25 Lavado 4
Solución 1 172,75 Lavado 5
Solución 1 150,25 Lavado 1 Solución 2 ND*
Solubilización 1 3 12,75Solubilización 2 407,75
*ND (No Detectable
3.5 estern Blot
) W
Western blot
icialmente se evaluaron 2 diluciones del anticuerpo conjugado 1/1000 y 1/2000,
itivos Controles negativos
Conjug do 1/2000
igura do en el Western blot Sin Inductor . Carril 2. Control
igura 23. Ensayos con controles positivos y negativos de rupturas celulares
, Carril 2. Muestra lisado DH5α sin el plásmido control
cida en E.coli
Incon el fin de observar si en la menor dilución utilizada era posible detectar la IDS (TKT). Simultáneamente, como control negativo del ensayo se omitió la adición del anticuerpo primario para comprobar si había uniones inespecíficas entre la proteína de los lisados celulares y el anticuerpo conjugado (figura 5). Adicionalmente se realizaron ensayos evaluando diferentes concentraciones de anticuerpo primario 1/500; 1/1000; y 1/2000, utilizando el anticuerpo conjugado 1/2000. Como control del ensayo se utilizó el anticuerpo preinmune en las mimas diluciones (figura 6).
Controles pos
ado 1/1000 Conjugado 1/200 Conjugado 1/1000 Conjuga
1 2 3 4 F 5. Variación Anticuerpo conjuga Membrana 1, 2, 3, 4. Carril 1. Muestra lisado celular BL21 pGEX 3X/IDS
positivo, IDS (TKT) en una concentración de 10μg.
Electroforesis
Inmune Preinmune
2 3 4 5 3 4 5
Fprovenientes de los clones de E.coli Carril 1. Muestra lisado DH5α pGEX 3X/IDSnegativo, 3. Muestra lisado BL21 pGEX 5X sin el inserto control negativo, 4. Muestra lisado BL21 pGEX 3X/IDS Inducida con IPTG, 5. Muestra IDS TKT. 3.6 Actividad IDShr produ
1 2 3 4 5 1 1 2
80KDa
60KDa
40KDa
Las muestras utilizadas para establecer la actividad biológica de la proteína IDShr
abla 5 Actividad IDShr cencia - Proteína Total nmol/mg/h
fueron los controles negativos y los transformados del clon BL21 pGEX3X/IDS. En la tabla 5 se describen los resultados obtenidos en esta prueba donde se sugiere que la actividad biológica de las muestras es muy baja, dado que en el IEIM el valor de referencia para la prueba actividad biológica de la IDS en leucocitos de individuos normales es de 12 nmolmg-1h-1, y los valores obtenidos se encuentran por debajo de este valor (figura 25). TMUESTRA Fluores
blanco (mg/ml)
BL21 CONTROL 2 0,914 1,97 B L21 pGEX3X/IDS 2 2,53 0,711
3.7 Proteína detectada por ELISA Indirecta
omo se observó en el numeral 5.11 de materiales y métodos, se fijaron las
abla 6. IDShr detectada por ELISA Indirecta
Muestras Proteína
to )Abs
[10 l] IDS
[n
[μg de IDS]/ml de
Cmuestras de los clones de E.coli en una concentración de 10μg por cada pozo, como se ve en la tabla 6, Para cada ensayo de detección por ELISA indirecta se realizó una curva de calibración en la que se correlacionan las absorbancias de las muestras desconocidas con la curva de calibración de la IDSh (TKT). Dicha curva de calibración se encuentra en el rango valores de 1000 ng, 500 ng, 250ng, 125ng, 62.5ng, 31.25ng y 0 ng. Estos puntos se extrapolaron en la ecuación obtenida de cada ensayo, con los valores de absorbancia resultantes de la reacción con el anticuerpo Inmune. T
tal (μg/ml μg/m g/ml] Muestra BL21p
1933 0,278 210,25 406,4
GEX3X CONTROL NEGATIVOBL21 pGEX3X/IDS
2733 0,319 261,5 714,7 Sin IPTG BL21pGEX3X/IDS
3048 0,321 264 804,7 Induc IPTG DH5α Control
3898 0,418 385,25 1501,7 Negativo
DH5α pGEX3X/IDS 1898 0,18 87,75 166,5 Ac. Inmune
Lav 1Sln 1 BL21 1260,25 0,199 111,5 140,5 pGEX3X/IDS
Slb1 Cuerpos Inclusión 312,75 0,184 92,75 29,0 Slb2 Cuerpos de Inclusión 407,75 ND* ND* ND*
*ND: NO DETECTABLE
DISCUSIÓN
n una primera oportunidad se extrajo la proteína intracelular producida por la
l cambio de la densidad celular. Se encontró que
ra extraer las proteínas intracelulares
on los lisados celulares obtenidos a partir de las rupturas se establecieron,
Ecepa DH5−α/pGEX-3X/IDS, mediante protocolo de ruptura establecido en Morales D., en 2007; el sobrenadante del lisado mostró la presencia de IDShr, midiendo actividad biológica. El trabajo se inició evaluando eel clon DH5α/pGEX3X/IDS alcanzó una mayor densidad celular en un tiempo similar respecto a la del clon BL21 pGEX3X/IDS como se observa en la tabla 2. La cepa DH5α se usa como una cepa para subclonaje y no necesita de IPTG para inducir la expresión de la proteína, puesto que en su genoma no tiene el gen lac Iq (INVITROGEN, 2004); mientras que la cepa BL21 utilizada específicamente para expresar proteínas, necesita de un elemento inductor de éste gen, y por referencias bibliográficas se conoce que el IPTG reduce notablemente la velocidad de crecimiento, (Vilar et al; 2003), lo cual se evidenció (figura 4). Por tanto, se verificó que el clon BL21/pGEX3X/IDS es promisoria para la expresión de la IDShr, como es recomendado por el fabricante de la cepa BL21 (Amersham Bioscience). Se estableció un protocolo de sonicación pasolubles presentes en los clones BL21 pGEX-3X/IDS y DH5-α/pGEX-3X/IDS. Se partió de las condiciones establecidas en Espejo y Sosa en 2003 no se evidenció el patrón de bandeo característico lo cual podría deberse a una ruptura celular incompleta. Para mejorarla se consideró que la efectividad de este proceso dependía del número de ciclos y la energía aplicada al medio (amplitud), sin embargo, altos valores en estos dos factores pueden afectar la actividad biológica de la proteína analizada (Walker, J; 2002). Según las guías para producir una proteína recombinante con los plásmidos pGEX, se recomienda que al someter las muestras a proceso de sonicado, no se debe exceder un tiempo de exposición de 10 minutos continuos para evitar la formación de espuma y sobrecalentamiento de la muestra (Amersham Biosciences, 2002). Por éstas razones y teniendo en cuenta la duración del ciclo de rompimiento establecido en el trabajo de Espejo y Sosa en 2003, se fijaron tiempos de descanso de 2 segundos dentro de los ciclos de sonicado. Mediante la técnica de Bradford como se puede observar en la tabla 2 y las electroforesis de lisis celular (figura 4B), se confirmó que a medida que aumentaba el tiempo de sonicado las proteínas presentes en el sobrenadante intracelular aumentaban significativamente. También se observa que las condiciones ensayadas en el procedimiento de ruptura celular, no afectaron las proteínas en el sobrenadante, ya que no se observa proteína degradada. En los ensayos con quince minutos de sonicado se observó un patrón de bandeo característico de una proteína degradada (datos no mostrados). Estos ensayos permitieron establecer las condiciones apropiadas para la ruptura celular de los clones, determinando que al utilizar 12 minutos de sonicación, con pulsos de 1 s y descansos de 2 s a una amplitud del 20%, se obtienen mayores concentraciones de proteínas (figura 4) sin sobrecalentamiento de la muestra o formación de espuma. Cinicialmente para la cepa BL21/pGEX3X/IDS, las condiciones para implementar
la técnica de Western blot, para la cual, se estandarizaron las concentraciones de anticuerpo conjugado a partir de las establecidas por Sosa y Barrera en 2005. Se consideraron dos concentraciones de Anticuerpo conjugado (figura 5) para comprobar que en este rango de dilución 1/1000 a 1/2000, éste no se unió inespecíficamente a otras proteínas del extracto celular (figura 5-3; 5-4). Variando las concentraciones de anticuerpo primario se logró establecer que una dilución 1/2000 produjo un menor ruido de fondo, y mantuvo el reconocimiento de la IDShr de TKT (figura 6). El anticuerpo primario utilizado fue diseñado contra la región que se encontraba corriente abajo del primer IDS-f, con el cual se comprobó en estudios previos de Sosa, A y Barrera, LA en el 2005 que el extracto de los anticuerpos obtenidos de yema de huevo reconocieron la proteína IDShr. Sin embargo, debido a que los extractos de anticuerpo contienen diferentes tipos de inmunoglobulinas, tales como IgA, IgM, e IgY. (Schade, R et al 2005), en el IEIM se realizaron nuevos trabajos en la purificación de estos anticuerpos por medio de una columna tiofílica incrementando la especificidad en el reconocimiento de la proteína de interés. La efectividad de éste método se comprobó en otros trabajos del IEIM, utilizando los anticuerpos purificados para la detección de IDShr expresada en Pichia pastoris donde no se observó reactividad cruzada con otras proteínas propias de la levadura. En este trabajo, utilizando las diluciones establecidas de 1/2000 tanto para el anticuerpo primario como para el conjugado, se realizó un ensayo empleando los extractos celulares de los clones BL21/pGEX-3X/IDS, DH5-α/pGEX-3X/IDS y sus respectivos controles negativos. En la figura 6 se muestra que el anticuerpo primario reconoció 3 proteínas diferentes dentro de las cuales se observa una banda alrededor de los 40 KDa, 60KDa,80kDA, peso molecular correspondiente a las proteínas de interés esperadas, no glicosiladas, teniendo en cuenta que estas formas la mas pesada 80kDA tiene la IDShr (aproximadamente 55KDa) y el de la GST (aproximadamente 26 kDA); la de aproximadamente 60KDa se explica según Morales, D en 2007 como una modificación proteolítica de la IDShr y la de 40KDa como la forma de la proteína sin el gen de la proteína de fusión GST; sin embargo, el reconocimiento de las bandas adicionales, en los controles negativos, posiblemente se debe a que las soluciones de anticuerpos purificados contienen tanto IgYs-α IDS como otras IgYs producidas por el animal ante antígenos externos, de esta forma en el sistema de detección estos anticuerpos podrían estar reconociendo proteínas de E. coli de diferentes peso molecular presentes en el extracto intracelular del mismo peso de la proteína de interés. (figura 6, carriles 2 y 3) Ante la posible detección de la proteína se cuantificó por la prueba de ELISA Indirecta, para lo cual se estableció previamente que el clon DH5 α pGEX-3X/IDS se excluiría de los ensayos por tratarse de una cepa óptima para clonaje de fragmentos y no para expresión de proteínas. Por ésta razón, se centró el ensayo para estudiar el clon BL21 pGEX-3X/IDS y medir la proteína presente en los extractos de lisados intracelulares de proteína soluble, obteniendo concentraciones de 714,7 [μg de IDS]/ml de muestra, para el clon sin inducir y 804,7[μg de IDS]/ml de muestra, en el clon inducido con IPTG. Las diferencias entre éstos dos valores no fueron las esperadas, como en otros trabajos. Se comprobó este mismo
resultado, midiendo la concentración de proteína total por Bradford de los extractos celulares de éste clon como se observa en la tabla 3 y 4. Los anteriores resultados sugieren que la IDShr se podría encontrar en forma insoluble. Se conoce en trabajos previos (Rattenholl, A et al 2001) que la cepa BL21 al expresar proteínas recombinantes, provoca un desequilibrio entre la forma soluble y la insoluble y por tanto, acumula proteínas en cuerpos de inclusión. Para hacer esta verificación se solubilizó la proteína proveniente de éstos cuerpos de inclusión, y se realizaron los ensayos como se muestra en la tabla 6, se logró solubilizar en un primer ensayo 312,75 μg/ ml de proteína total y por ELISA indirecta permitió evidenciar 29 μg IDS/ ml y en un segundo ensayo 407,75μg/ ml de proteína total y no se detectó IDS (tabla 6). Estos últimos resultados al parecer confirman que lo observado por Western Blot es un reconocimiento inespecífico en los lisados de los controles negativos. Para confirmar los anteriores resultados se observó la estabilidad genética de los plásmidos construidos y transfectados en las cepas; para lo cual, se realizaron minipreps en los clones DH5-α/pGEX-3X/IDS y BL21/pGEX-3X/IDS y se efectuaron digestiones con las enzimas de restricción EcoRI y SmaI, como se muestra en la figura 1. El análisis de digestión permitió evidenciar que el tamaño del plásmido no coincide con el teórico calculado de 6.3 kb, pues al linearizarlo con la enzima de restricción Sma I se observó que el tamaño era aproximadamente de 4.8 kb, lo cual coincidió con la digestión realizada con EcoR I en la que se obtuvieron dos bandas de aproximadamente 3.5 kb y 1.3 kb. A partir de éstas observaciones encontradas en el plásmido pGEX3X/IDS; se procedió a realizar la amplificación del gen de la IDS y su correcta dirección de lectura dentro del vector y de tal manera, obtener un sistema de expresión de la IDShr con el cual posteriormente se logre escalar la producción de esta sulfatasa. En el trabajo de Morales, D, 2007 esta verificación no se efectuó. Para ello, se diseñaron dos parejas de primers, con las cuales se espera amplificar el gen completo y con la otra pareja verificar la direccionalidad de la inserción. En las figuras 2 y 3 se muestran los resultados de la PCR efectuada para esta determinación. La ausencia de amplificado tras el PCR con la pareja de primers pGEX-f y pGEX-r, que fueron diseñados para anillarse en los extremos flanqueantes del ADNc de IDS permitió confirmar la sospecha de que existía una alteración en la integridad del plásmido pGEX3X-IDS en los dos clones utilizados. Luego se realizó una PCR con la segunda pareja de primers (IDS-f y pGEX-r) y se observó un patrón de bandeo indicativo de la unión de un solo primer, posiblemente el de IDS-f (figura 3), pues con los otros dos no se observó este mismo patrón de bandeo. Estos resultados sugieren la pérdida de una secuencia del plásmido de aproximadamente 1.5 kb, el cual se propone sea el gen de resistencia a β-lactamasa (952pb) y parte del gen de la IDS, lo cual puede ser explicado por una recombinación entre el plásmido y el genoma de la bacteria. Los genes de antibióticos usados en los plásmidos para conferirle resistencia en un
medio selectivo que contiene el antibiótico, favorece la permanencia del transformado dentro de la célula. Sin embargo, si las condiciones metabólicas o de temperatura cambian, se ha observado la eliminación total de los plásmidos o la integración del gen de resistencia al antibiótico dentro del ADN genómico (Martinez-Morales F, et al, 1999). Estos autores también proponen que este hecho puede ser mediado por transposones y replicones del plásmido, los cuales interfieren directamente en las construcciones realizadas. Otro mecanismo que explica la integración del gen de Ampicilina al ADN genómico es por medio de las integrasas, las cuales han sido encontradas en regiones conservadas de los integrones, un elemento genético involucrado en la resistencia de genes presentes en varios tipos de bacterias (Francia V, et al, 1996). Como prueba confirmatoria se realizó la lectura de actividad enzimática, éstos confirman que la IDShr producida en el clon BL21 pGEX-3X/IDS tiene una actividad biológica que se considera como no detectable o muy baja, ya que si se comparan los controles negativos frente a los clones que tenían el inserto. Se pueden considerar los resultados como similares indicando que parte de la proteína expresada puede haber perdido el sitio activo y por lo tanto reportó una actividad muy baja. BIBLIOGRAFIA
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