Efecto post-Antibiótico (PAE)

Juando

Introducción

Se describe como, la supresión del crecimiento bacteriano que persiste después de una corta exposición del

microorganismo a los antimicrobianos.

Supresión del desarrollo bacteriano después de una breve exposición a

un antimicrobiano.

Capacidad del ATB de suprimir el nuevo crecimiento bacteriano pese a que su concentración sérica cae por debajo

de la CIM. El efecto persiste hasta que la concentración disminuye y las bacterias sobrevivientes comienzan a

multiplicarse . 3-6h.

Determinación in vitro del PAE

Eliminación rápida del fármaco: El lavado repetido de los microorganismos es el método mas

comúnmente usado para la remoción rápida de los medicamentos.

• Se realiza por centrifugación de las colonias de crecimiento a 1200 X g por 5-10 min, se remueve el sobrenadante, y se resuspende el botón en un medio libre de medicamento. (2 veces)

• Descartando el 90% del sobrenadante, 2 lavados reducen la concentración del medicamento hasta 100 veces menos.

• Descartando completamente el sobrenadante, 2 lavados pueden reducir la concentración mucho mas de 10,000 veces.

• Un método mas rápido y simple para remover el medicamento es la inactivación del mismo. (ß-lactámicos)

• Otros investigadores han usado filtros para remover el medicamento que se difunde en la superficie del agar. La ventaja es que no se expone al microorganismo a factores que puedan afectar su crecimiento.

• También se ha usado la tecnología E-test,

en la cual se transfiere a un tubo o superficie de agar y se mide la concentración.

Cuantificación del PAEConteo de viables:

Generalmente se usa el conteo de UFC/ml para el seguimiento del crecimiento bacteriano después de la eliminación de los medicamentos.

PAE: T-CT: tiempo (en horas) que tarda el cultivo de microorganismos tratados en

incrementar 1 log10 su concentración a partir del tiempo O (dilución del antimicrobiano).

C: tiempo (en horas) que tarda el cultivo control en incrementar 1 log10 su concentración a partir del tiempo 0.

Se ha usado también la técnica por filtro de membrana para la cuantificación del PAE.

Mediciones mecánicas • La mediciones ópticas y de impedancia han sido usados por muchos

investigadores para medir PAE de antibióticos contra bacterias, tanto gram negativas como gram positivas.

• La densidad óptica y la impedancia no pueden detectar números bacterianos menores a 106 UFC/ml, la determinación logarítmica del crecimiento bacteriano por estos métodos presenta un aparente exceso en el numero del umbral de detección.

Mediciones bioquímicas • La medición de ATP por ensayos de

bioluminiscencia ha sido también usado para la determinación del PAE.

• Este método se basa en la reacción entre luciferasa de luciérnaga y la reducción a luciferina, que, en presencia de ATP y Mg, da un complejo de rendimiento ATP-luciferina. Cuando se introduce también oxigeno, este complejo se disocia y se libera energía de luz, que puede ser medida por una variedad de instrumentos que detectan luz.

Morfología

• Diversos estudios han usado un microscopio de contraste de fases para evaluar los cambios morfológicos que se presentan cuando se expone algún tipo de bacteria (E.coli) a ciertos medicamentos (cipro y amp) a la mitad de la concentración de la CIM. Esta exposición resulta en la formación de filamentos.

• Tiempo para que la población bacteriana se revierta a 90% bacilos 10% formas aberrantes.(arbitraria)

• Las alteraciones que se han visto no son uniformes en todos los

microorganismos, pero sin embargo, persiste una buena

correlación con la determinación del PAE determinado por el

conteo de viables.

The effects of bothb-lactam antibiotics were apparent at the first time point atwhich the cells were examined, which was 15 min after the

antibiotics were removed. All of the cells in both suspensionsappeared as long filaments of 25 to 60 mm in length, whereasin negative control cultures the cells were 1.5 to 6.0 mm long.

Very few of the elongated rods were motile, and those thatwere moved much more slowly than the cells in the negative

control cultures. No change in either antibiotic-containing mediumwas apparent until 75 min after antibiotic removal, when

a few short, motile cells began to appearco

ntro

l

Métodos específicos • Técnica de crecimiento o Se recomiendan los medios Mueller-Hilton y tripticasa soya para los microorganismos indicados. o La dilución de antimicrobianos se hace en agua estéril a una concentración 100 veces mayor a la designada. Se

agrega una alícuota de 100 µl de esta solución a 8.9 ml del medio a analizar previamente calentado a 37°C. o El organismo analizado debe estar en la fase logarítmica de crecimiento al tiempo de exposición a los

antimicrobianos. Se escoge el cultivo que después de incubado a 37°C toda la noche no sobrepase 0.3 de la densidad óptica medida a 580 nm.

o Se incuban los tubos a 37°C agitándolos por el periodo de exposición.

o Se remueve el antimicrobiano por uno de estos métodos: 1. Centrifugación a 1200Xg por 10 minutos 2. Adición de B-lactamasas para inhibir completamente a los susceptibles 3. Diluciones 10-2 10-3 en el medio precalentado 4. Filtración por membrana

o Se mantiene en agitación a 37°C o Adicionar los tubos controles para asegurar que hay crecimiento después de los lavados o Conteo de UFC/ML en la hora 0, luego de los lavados diluciones e inactivación con B-lactamicos y cada 1-1.5

horas. o Realizar graficas de las UFC/ml

• Técnica membrana/agaro debe ser realizado en el medio adecuado para cada caso. La concentración debe ser 4 o 5 veces

el MIC. o Se coloca en el agar varios filtros de membrana de poros de 0.3 µm y se deja a temperatura

ambiente de 5-10 minutos. o Una alícuota de 100 µl de diluciones de 1:10 o 1:100 del inoculo bacteriano, es colocado en las

membranas y propagado en un tubo de vidrio en forma de L. se incuba a 37°C por 2-3 horas para obtener la fase logarítmica de crecimiento.

o Se extraen las membranas con pinzas, se pone en agar precalentado con medicamento y se reincuba.

o Luego se llevan las membranas a un medio libre de medicamento por 10 minutos lo que permite que el medicamento se difunda en el agar.

o Las membranas son analizadas después de la inoculación, antes y después de la exposición a los medicamentos y por intervalos de 1-2 horas. Después se coloca las membranas en tubos con hielo NaCl se vorterizan y se remueve las bacterias de la membrana. Se hace conteo de las colonias en 10 diluciones seriadas en s.s.

o Se procesan las membranas control o Se expresan los resultados en UFC/filtro y se grafican.

Modelos farmacocinéticos

• la exposición a los medicamentos difiere considerablemente de la situación en vivo en que los organismos son usualmente expuestos a niveles fluctuantes de medicamentos. Se usa entonces 2 modelos:

o Modelo de diluciones o Modelo de diálisis

Modelo de diluciones

• Consiste de un cultivo en frasco que se le añade un medio fresco y del cual el mismo volumen será removido. Si el antimicrobiano es añadido directamente dentro del frasco, la dilución continua del fármaco simula los niveles de antimicrobianos después de la administración en bolo intravenoso.

• El mayor problema con este modelo es que tanto los microorganismos como el medicamento se diluyen.

Modelo de diálisis

Consisten en un sistema cerrado que contiene el microorganismo

separado por una membrana semipermeable que proviene de un

sistema de medio fresco.

Factores que afectan la medición in vitro del PAE

• El microorganismo (tipo)• El antimicrobiano (clase) • Condiciones del experimento • Tamaño del inoculo • Fase de crecimiento del microorganismo• Mecanismo de extracción del cultivo • pH y temperatura • Efecto de re-exposición• Sub MIC’s • Combinación de antimicrobianos

Factores que afectan el PAE

Tipo de microorganismo y antimicrobiano

• La presencia del PAE puede diferir significativamente con una combinación organismo/antimicrobiano especifico.

• En contraste con los datos que se observan con cocos gram positivos, se marcan diferencias en la supresión post-antibiótica observada para diferentes antimicrobianos en bacilos gram negativos.

Concentración

• Eagle. Penicilina G y varios cocos gram positivos. El PAE solo fue observado en la ultima concentración que fue letal para el organismo.

• La duración del PAE incrementa con concentraciones crecientes pero alcanza un máximo en la concentración de penicilina mas rápidamente bactericida para el organismo.

• Ensayos realizados con rifampicina, tetraciclina y cefamandole contra cepa estándar de E.coli, se observo que el PAE fue medible solo cuando se observaba concentración igual o mayor que el CIM.

La duración del PAE con antibióticos β-lactámicos es relativamente corta, según varios estudios.

Duración de la exposición

• El alargamiento del tiempo de exposición al antimicrobiano se ha visto también que prolonga la duración del PAE.

• En cocos gram positivos la duración del PAE se da en 4 de 9 cepas, siguiendo la duración del incremento de la exposición a penicilinas.

• En bacilos gram negativos, se ha observado que la duración del PAE es mucho mas larga expuestos a B-lactámicos.

Tamaño del inoculo

• No se observa el PAE con altas concentraciones del inoculo (S.aureus-penicilina) en bacilos gram negativos el efecto del aumento del inoculo es mucho mas pequeño (imipenem).

Fase de crecimiento del organismo

Siempre se ha probado los estudios de PAE en la fase

logarítmica de crecimiento. Pero diversos estudios

demuestran que tanto en la fase logarítmica como en la fase de retraso la duración

del PAE es muy similar.

Agitación mecánica

No se ha observado diferencias significativas entre el PAE de ensayos

estacionarios y de ensayos en agitación

pH

• Muy pocos estudios han estudiado la influencias del pH en el PAE.

• La actividad de aminoglucosidos y fluoroquinolonas se ve bastante afectada por los pH, no tanto como los β-lactámicos.

• La corrección del pH puede ayudar a corregir los ensayos.

Temperatura

• Se ha observado que tiene un efecto variable en la farmacocinética de los antimicrobianos.

• El incremento de la temperatura resulta en una reducción de 4 veces el MIC, pero en otros ensayos solo se ven alteraciones mínimas del PAE.

Oxígeno

• Vancomicina, aminoglucosidos, y

quinolonas son alteradas por cambios en la tensión de

oxigeno.

• Sin embargo, la baja tensión de oxigeno representa la

tensión normal encontrada en los tejidos, que no influencia

la duración del PAE

Tipo de medio

• Diferentes medios muestras diferentes efectos variables en el PAE.

• El efecto mas pronunciado se ha observado con trimetoprin, con S.aureus en tripticasa soya y en Mueller Hilton. La diferencia fue explicada por el contenido de timina que se sabe inhibe la actividad del trimetoprin.

• Estudios realizados en agar solidos y líquidos, revela que el efecto del PAE es similar o ligeramente mayor en agar que en medio liquido.

Suero humano

• La influencia del suero humano no ha sido

ampliamente estudiada en la determinación del PAE,

algunos estudios revelan un comportamiento muy similar del PAE tanto en agar como en suero humano, otros en

cambio, muestras diferencias significativas (E.coli,

tetraciclina)

Leucocitos y plaquetas

• Los leucocitos pueden también afectar la duración del PAE. Se ha demostrado que los organismos en la fase de PAE son mas susceptibles a la actividad antibacteriana de los leucocitos humanos. Esto también es llamado PALE, fenómeno de realce de leucocitos post-antibíoticos.

• Las plaquetas secretan proteínas plaquetarias microbicidas, que se ha demostrado inducen reducción del antibiótico e incremento de la duración del PAE.

Sub-MICs

• Se ha demostrado que los microorganismos en la fase PAE son mas susceptibles a los efectos inhibitorios de la concentración del medicamento sub-MIC.

• Han usado el nombre de “efecto post-antibiótico sub-MIC”, para describir la combinación del efecto aditivo del PAE de exposición a niveles sub-MIC.

Re-exposición

Se ha demostrado que múltiples exposiciones de un m.o a un medicamento

produce decremento significativo del PAE, con

reducción concomitante en la muerte bacteriana, pero se ha observado aumentos

del MIC.

Combinación de antimicrobianos

• En general estas combinaciones producen PAEs en S.aureus y otros Estreptotococcus que son aditivos o sinérgico, pero en otros microorganismos no se observa.

• El aumento del nivel del PAE en BGN por combinación de antimicrobianos depende en primer lugar de la habilidad individual de cada medicamento para inducir el PAE.

Determinación in vivo del PAE

• Se podría examinar el PAE en vivo en tejidos y fluidos corporales cuando es posible hacer ensayos de UFC y concentración del medicamento.

• Se define como la diferencia en el tiempo para que el número de bacterias en tratamiento y el control de tejidos o fluidos biológicos incremente en 1 log10 sobre los valores cuando la concentración del medicamento en suero o el sitio de la infección cae por debajo del MIC.

Modelo de infección en ratones

Normales o neutropénicos

[ ] exacta en el sitio de la infección.

[ ] suero, [ ] antimicrobiana en

los fluidos musculares.

Cuantificación bacteriana

Modelo de neumonía en ratones

PAE K.pneumoniae

14 h < ATB

[ ] en suero, ˂ATB??

El inoculo es mas variable

Modelo meningitis en conejos

PAE in vivo, por separado.

[ ] ATB se mide directa/

Infección de tejidos en conejos

Tratado Sin Tratar Endocarditis en ratas

Curso de la actividad antimicrobiana

E.faecalisP.aeuroginosa

Métodos específicos • Modelo de infección en ratones neutropenicos:o Se inyecta ciclofosfamida 150 mg/kg intraperitoneal en el día 0 y 3. Lo que produce una

severa neutropenia. o Se inyecta aproximadamente 106UFC en 0.1ml en 40-60 ratones, se pueden estudiar 2

diferentes organismos si se inyectan en músculos opuestos. o Después que el microorganismo a crecido por 2 horas, se aplica una inyección de

antimicrobiano vía subcutánea a aproximadamente el 60% de los ratones.(hora 0) o Ratones con tratamiento son sacrificados por dislocación cervical a la 1,2,3,4,6,8,10,12,16,24

horas después de la dosis antimicrobiana. Los ratones control sin tratamiento pueden ser sacrificados al menos en la -1,0,2,4,6 y 8 horas.

o Los músculos son removidos y homogenizados en 9 ml de NaCL 0.85% helado, y se determina el conteo de viables en el agar apropiado.

o El conteo de UFC son graficados y la duración del PAE se calcula por l siguiente ecuación: PAE: T-C-M

M:tiempo en que los niveles en suero exceden el MICT: tiempo requerido para el conteo de UFC en el musculo de ratones tratados C: tiempo requerido para el conteo de UFC en el musculo de los ratones control

Factores que afectan el PAE in vivo

• Tipo de microorganismo• La clase de antimicrobiano• La dosis del medicamento• Simulación de la farmacocinética humana• Presencia de leucocitos• Sitio de infección

Mecanismos del PAE

• El mecanismo por el cual el antimicrobiano induce la supresión del crecimiento postantibiotico es ampliamente desconocido.

Esto claramente no se debe a un cambio en la población en los medios de cultivo por variantes de lento crecimiento, porque la curva de crecimiento de los cultivos de ensayo y de control son paralelos en la fase post-PAE. Esto sugiere que existen varias vías y mecanismos metabólicos envueltos en este proceso.

Persistencia limitada en los sitios de acción

• Algunos medicamentos se unen reversiblemente a las subunidades especificas de las bacterias susceptibles. Esto podría representar el tiempo que toma el antibiótico para difundirse por los ribosomas. Esto no representa a todos los microorganismo, por ejemplo, una proteína de baja peso molecular es usualmente el mayor PBP para bacilos pero no para cocos.

Recuperación de daños no letales

• Se ha visto que la alteraciones ultra estructurales en las bacterias durante el PAE son muy similares a las observadas durante continua exposición a concentraciones inhibitorias. Estas alteraciones retornan al estado anterior de crecimiento, y es determinado por conteo de viables.

Resintensis de proteínas y enzimas • Los aminoglucosidos tiene una letal e irreversible fijación a las

subunidades del ribosoma, esto demuestra la dificultad de determinar el PAE in vitro con este medicamento.

• Los largos PAE’s observados en in vivo con los aminoglucosidos puede representar la unión de cantidades sub-letales de medicamento, con la subsecuente ruptura de la síntesis de proteínas.

• Podría concluirse que durante la exposición a los medicamentos que inhiben la síntesis de proteínas y de ácidos nucleicos los microorganismos agotan las proteínas funcionales necesarias para sus metabolismo intermediario y crecimiento sin obstáculos. El PAE puede representar un periodo de resintesis de estas proteínas.

Significado biológico del PAE

• La presencia del PAE puede ser solo una curiosidad microbiológica de cuestionable valor a menos que la relevancia para la situaciones clínicas sea demostrada.

• el PAE tiene su mayor importancia en el régimen de dosis de antimicrobianos.

• La combinación de antimicrobiano/medicamento que no demuestre PAE requiere administración mas frecuente de antimicrobianos que aquellos que exhiben el PAE.

Implicación del régimen de dosificación

• Algunas experiencias clínicas con penicilina G sugieren que algunas infecciones pueden ser tratadas adecuadamente con terapia antimicrobiana intermitente aunque los niveles de penicilina en suero y tejidos caigan por debajo del MIC por algunas horas.

• Esto depende de el microorganismo que cause la infección y el medicamento usado. Los regimenes de dosificación pueden ser aplicados en principio a combinación de organismo/medicamento que muestre un PAE prolongado.

Decrecimiento de la actividad bactericida durante el PAE.

• Se cree que los organismos en la fase del PAE pueden demostrar alteración de la susceptibilidad a la actividad bactericida de ciertos antimicrobianos.

Ensayos clínicos

• Hay muy pocos ensayos clínicos que hayan examinado la eficacia de concentración intermitente contra mayores dosis de antimicrobianos.

• Estudios con antibióticos orales en infecciones respiratorias altas han demostrado que un par de dosis diarias es tan efectivo como la administración del medicamento 3 o 4 veces por día.

• La administración de dosis intermitentes en modelos animales ha resultado en la reducción de la oto y nefrotoxicidad.