Diagnóstico y caracterización de Salmonella...
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Manual de Procedimientos Diagnóstico y caracterización de Salmonella spp. 2008
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Manual de Procedimientos
Diagnóstico y caracterización
de Salmonella spp.
2008
2
AUTORES
María Inés Caffer
Raqurel Terragno
Norma Binsztein
Departamento Bacteriología
Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas
A.N.L.I.S. “Dr. Carlos G. Malbrán”
Centro Regional de Referencia del WHO Global Salm Surv
para América del Sur
3
INDICE
CAPÍTULO I- INTRODUCCIÓN 5
CAPÍTULO II- AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE SAMONELLA spp. 9
1.-EPECÍMENES 9
2.-PROCESAMIENTO 10
2.1.-AISLAMIENTO 10
Flujograma de aislamiento e identificación bioquímica de Salmonella spp
a partir de heces 14
2.2.-IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN BIOQUIMICA DE
SALMONELLA spp. 15
2.2.1.- Pruebas Bioquímicas 22
Agar Hierro Tres Azúcares y Agar Kligler 22
Prueba de la β-Galactosidasa 23
Agar Lisina Hierro 25
Agar SIM 26
Test de Utilización de Azúcares 27
Test de Decarboxilasa-Dehidrolasa 29
Prueba del Malonato 32
Ensayo del Rojo de Metilo 33
Ensayo de Voges-Proskauer 35
Prueba de la Urea 36
Prueba del Indol 38
2.2.2.- Problemas de Diagnóstico Diferencial 40
2.3.-SEROTIPIFICACIÓN DE SALMONELLA spp. 42
Antígenos Somáticos 43
Antígenos Flagelares 44
Antígeno Capsular 45
Descripción del Esquema de Kauffmann-White 45
2.3.1. SEROTIPIFICACION SOMÁTICA O 49
2.3.2. SEROTIPIFICACION FLAGELAR H 51
Flujograma para Serotipificación de Salmonella spp. 56
4
CAPÍTULO III- PRECAUCIONES DE BIOSEGURIDAD 59
1.- NIVEL DE LABORATORIOS 59
2.-ELEMENTOS DE PROTECCIÓN. 60
3.- INSTRUCCIONES PARA EL TRABAJO. 61
4.- ACCIONES A REALIZAR EN CASO DE INCENDIO 61
5.- CENTROS PARA REQUERIR AYUDA 62
6.- TRANSPORTE DE MUESTRAS 62
CAPÍTULO IV- MEDIOS DE CULTIVO Y SOLUCIONES 64
Caldo Selenito 64
Caldo Tetrationato 64
Caldo Flagelar 65
Solución Salina 65
Agar Movilidad (Swarm Agar) 65
Agar Nutritivo 65
Agar Mueller-Hinton 66
Agar EMB 66
Agar McConkey 66
Agar SS 67
Agar Hektoen 68
Agar Verde Brillante 69
Agar XLD 69
CAPÍTULO V- PLANILLAS DE RESULTADOS 71
5
CAPÍTULO I -- INTRODUCCIÓN
El género Salmonella pertenece a la tribu Salmonelleae, de la familia Enterobacteriaceae.
Los miembros del género Salmonella son bacilos gram-negativos, de 0,7-1,5 x 2,0-5µm,
generalmente móviles por flagelos perítricos (excepto S. Gallinarum), anaerobios facultativos,
no esporulados.
El género Salmonella fue objeto de sucesivas modificaciones, a través de los años, en lo que
respecta a su nomenclatura y taxonomía. Sin embargo, todavía siguen vigentes las ideas
desarrolladas por P.R. Edwards y H.W. Ewing, en la década del 40, cuando definieron e
identificaron las primeras cepas del género Salmonella y de otros miembros de la familia
Enterobacteriaceae.
Estudios del DNA mediante técnicas de hibridación mostraron que el género Salmonella está
constituído por 2 especies: Salmonella enterica y Salmonella bongori. Salmonella enterica
está compuesta por 6 subespecies: Salmonella enterica subespecie enterica, Salmonella
enterica subespecie salamae, Salmonella enterica subespecie arizonae, Salmonella enterica
subespcie diarizonae, Salmonella enterica subespespecie houtenae y Salmonella enterica
subespecie indica.
A su vez las subespecies de Salmonella enterica y la especie Salmonella bongori se dividen
en más de 2400 serovariedades, que están definidas en función de diferentes asociaciones de
factores antigénicos somáticos O y flagelares H.
La mayoría de las serovariedades aisladas del hombre y de los animales de sangre caliente
pertenecen a la subespecie enterica (subespecie I) y llevan un nombre por lo general
relacionado con el lugar geográfico donde se la aisló por primera vez.
Como las serovariedades no tienen nivel taxonómico de especie, sus nombres no siguen las
reglas del “International Code of Nomenclature of Bacteria”, de manera que sus nombres se
deben escribir en letras romanas (no itálicas) y con mayúscula; por ejemplo el nombre
completo de Salmonella Typhimurium es Salmonella enterica subesp. enterica serovariedad
Typhimurium. Como este nombre es muy largo, a los fines prácticos se usa directamente
Salmonella Typhimurium
6
Las serovariedades pertenecientes a las subespecies restantes y a Salmonella bongori, de baja
incidencia en patología humana o animal, se designan con el nombre de la subespecie, seguido
de la fórmula antigénica, por ej: Salmonella subesp. IV 50: b : - (Salmonella enterica subesp.
houtenae 50:b : -)
Los nombres de todas las serovariedades están contenidos en el Esquema de Kauffmann-
White, publicado por el “Centro Colaborador de la OMS de Referencia e Investigación de
Salmonella”, del Instituto Pasteur de París (1).
Los miembros del género Salmonella están ampliamente distribuidos en la naturaleza, se los
encuentra como comensales y como patógenos en el tracto gastrointestinal de mamíferos
domésticos y salvajes, reptiles, aves e insectos, causando un amplio espectro de enfermedades
en el hombre y los animales.
Los miembros del género se pueden clasificar en tres grupos:
a) Los que no tienen preferencia por algún huésped en especial, por lo que infectan tanto
al hombre como a los animales. En este grupo se encuentran la mayoría de las
serovariedades responsables de las salmonelosis.
b) Los que infectan sólo al hombre: Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi A y
Salmonella Paratyphi C
c) Los que están adaptados a un huésped animal: S. Abortusovis, a los ovinos; S.
Abortusequi, a los equinos y S. Gallinarum, a las aves
La salmonelosis es una zoonosis de distribución mundial. La tasa de incidencia de la infección
es mayor en los lactantes y en niños de corta edad. Epidemiologicamente, las infecciones por
Salmonella pueden causar pequeños brotes en la población en general, sin embargo el 60 -
80% de los casos son esporádicos; a veces se producen grandes brotes en hospitales, jardines
maternales, geriátricos, restaurantes.
Es una enfermedad fundamentalmente de origen alimentario, la fuente más frecuente de
infección son los alimentos contaminados, incluido agua. También puede ocurrir la
transmisión de persona a persona.
A pesar de todos los controles que se han puesto en práctica, las infecciones por Salmonella
debidas al consumo de alimentos contaminados continúa siendo un problema serio con
millones de casos que ocurren anualmente en todo el mundo, provocando grandes pérdidas
7
económicas. En el 2003, se estimó que solamente en los Estados Unidos, el costo de las
salmonelosis producidas por alimentos contaminados llegaba a la cifra de 3.000.000.000
dólares.
La vigilancia de Salmonella spp. en todas las etapas de la cadena de procesamiento de los
alimentos constituye un elemento importante en la investigación de la epidemiología de la
salmonelosis transmitida por alimentos y en el desarrollo e implementación de estrategias
eficientes de control de la misma.
En programas de monitoreo y control es esencial contar con métodos de laboratorio eficientes
para el aislamiento, identificación y tipificación de Salmonella spp.
Se debe destacar que hay muchos procedimientos distintos para el aislamiento de Salmonella.
El método ideal debe tener una alta sensibilidad y especificidad, y ser al mismo tiempo
simple, rápido y económico. Ningún método cumple con todos criterios y ninguno es óptimo
para todas las condiciones. Por lo tanto es aconsejable consultar la literatura antes de elegir un
método para un determinado propósito y es recomendable la comparación frecuente de los
métodos de cada laboratorio con los nuevos métodos que surjan.
Los criterios para la identificación bioquímica de Salmonella spp. están ampliamente
descritos, sin embargo estas pruebas dependen de la expresión fenotípica de las características
analizadas y pueden verse afectadas por variaciones en los medios de cultivo y en las
condiciones de incubación. Como una alternativa se están introduciendo cada vez más los
métodos moleculares; que permiten un diagnóstico más rápido y pueden ser más simples de
realizar, pero tienen la desventaja que son caros.
El sistema de serotipificación de Salmonella spp. es probablemente el mejor sistema de
tipificación fenotípica bacteriano. Tiene un alto poder discriminatorio y provee información
con significado epidemiológico, desde el punto de vista de la vigilancia basada en laboratorio.
La disponibilidad y el costo de antisueros de alta calidad es un problema en algunos países y
regiones. La subtipificación molecular da información adicional, de mayor discriminación sin
embargo no es un sustituto de la serotipificación.
Los microorganismos del género Salmonellae son bacilos Gram negativos (0.7 a 1.5 x 5 µm),
no fermentadores de lactosa. Son móviles por medio de flagelos peritricos, con la excepción
de Salmonella Pullorum y Salmonella Gallinarum. Fermentan glucosa con producción de
8
ácido y gas (excepto S. Typhi). También fermentan L-arabinosa, maltosa, D-manitol, D-
manosa, L-ramnosa, D-sorbitol, trehalosa, D-xilosa y D-dulcita. Son oxidasa negativo,
catalasa positivo, indol y Voges-Proskauer (VP) negativo, rojo de metilo y citrato de Simmons
positivo, urea negativo y producen SH2.
Los procedimientos siguientes servirán como guía para realizar los pasos necesarios para
aislar adecuadamente Salmonella spp. de heces, efectuar la identificación bioquímica de
Salmonella spp. y serotipificar los aislamientos utilizando antisueros somáticos y flagelares
adecuados.
Recolección y transporte de muestras
• Aislamiento de Salmonella spp. de heces.
• Identificación bioquímica de Salmonella spp.
• Serotipificación de Salmonella spp.
Bioseguridad
Los procedimientos de laboratorio se realizan de acuerdo con las recomendaciones
establecidas en “Biosefety in Microbiological and Biomedical Laboratories”, 4 th. CDC/NIH
(Ver Capítulo III - Precauciones de Bioseguridad)
9
CAPÍTULO II– AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE SALMONELLA
spp.
1.-. ESPECÍMENES
Para el diagnóstico de Salmonella spp. se pueden usar muestras de materia fecal y fluidos
(sangre, orina, bilis y pus de abscesos).
a) Materia fecal:
La muestra debe obtenerse en el período agudo de la enfermedad, antes de iniciar el
tratamiento con antimicrobianos. Con un hisopo estéril, se recoge una pequeña cantidad de
una evacuación espontánea reciente, seleccionando las partes mucosas o sanguinolentas. En
caso de no poder obtener esta muestra, se hace un hisopado rectal. Las muestras que no se
pueden procesar dentro de las dos horas, se deben colocar en medio de transporte. Como
medio de transporte se usa Cary – Blair, que tiene la ventaja de ser estable hasta 18 meses
después de su preparación, cuando las condiciones de almacenamiento son correctas. En este
medio de transporte se puede conservar la muestra hasta 5 días, siempre en refrigeración.
b) Sangre:
La muestra se toma en el momento del pico de fiebre. Se siembran 10 ml de sangre en un
frasco de hemocultivo de 100 ml (relación 1:10). Se incuba a 35 - 37ºC, durante 7 días,
haciendo un control (en medio de agar sangre) a ciegas a las 8 horas de incubación y controles
periódicos de acuerdo a la turbidez observada. El hemocultivo reviste un interés especial en el
caso de fiebre tifoidea y paratifoidea; pero no es constantemente positivo. Los porcentajes de
positividad, en ausencia de tratamiento antibiótico, son: 90% durante la primera semana de
evolución, 75% en la segunda, 40% en la tercera y 10% en la cuarta.
Los hemocultivos son negativos en los sindromes de infecciones transmitidas por alimentos
por serovariedades como S. Typhimurium ó S. Enteritidis, sin embargo estas serovariedades
causan septicemia en los inmunocomprometidos.
c) Material de abscesos y orina:
El pus y la orina se recogen en recipientes estériles y una alícuota se siembra directamente en
los medios de cultivo.
10
2.- PROCESAMIENTO
2.1.- AISLAMIENTO
Materiales y equipamiento
• Ansas descartables (10 µl)
• Placas de Petri descartables (9 cm diámetro) estériles
• Balanza
• Estufas a 37oC
• Mechero bunsen
• Hisopos de algodón
Medios
• Caldo nutritivo
• Caldo selenito
• Agar hierro – tres azúcares (TSI)
• Agar lisina – hierro (LIA)
• Estrías de agar tripticas de soja (TSA)
• Placas de agar Salmonella Shigella (SS)
• Placas de agar MacConkey (MC)
Procedimiento Comentarios
Día 1 Cultivo primario en placas de agar
(Camino I) y enriquecimiento selectivo
(Camino II) (Figura 1)
• Resuspender el hisopo en 1 ml de
caldo nutritivo de manera de tener una
suspensión homogénea de la materia fecal.
• Sembrar con ansa una muestra de la
suspensión de materia fecal, en placas de
agar MC y SS (o XLD) (Camino I- Cultivo
directo)
• Subcultivar el hisopo en un tubo de
• Para estas muestras se recomiendan dos
caminos simultáneos:
• Cultivo directo en medios sólidos,
aislamiento e identificación de las colonias
• Enriquecimiento en caldo selectivo,
11
caldo selenito, (Camino II - Enrequicimiento
para la detección de Salmonella spp)
• Incubar las placas del Camino I y el
tubo (con el hisopo incluido) del Camino II,
a 37ºC, 18-24 horas
se usa para favorecer el aislamiento de los
microorganismos cuando se encuentran en
muy bajo número en la muestra. La elección
del método depende del número de
microorganismos presentes en la materia
fecal, que está en relación con el proceso
diarreico o el estado de portador.
• Si en el camino de aislamiento directo
(Camino I) se identifica y confirma
Salmonella spp., no es necesario continuar
la vía del enriquecimiento (Camino II)
Día 2 Subcultivo de las colonias
sospechosas de ser Salmonella
• Observar la morfología y
características fenotípicas de las colonias
aisladas en las placas de agar MC y de agar
SS (Camino I).
• Anotar los resultados en la Planilla 1
Registro de Resultados: Aislamiento de
Salmonella spp. Morfología en placas de
agar selectivo (Camino I)
• Subcultivar 2 colonias sospechosas
de ser Salmonella de las placas de agar MC
y SS en estrías de agar TSA, agar TSI y agar
LIA (Camino I).
• En la placa de agar MC las colonias
típicas son lactosa negativas e incoloras, y
en las de agar SS: las colonias típicas son
incoloras, translúcidas con un centro negro
debido a la producción de SH2. (Ver Tabla
1: Características de las colonias en medios
selectivos y diferenciales )
• El subcultivo de colonias sospechosas
de Salmonella en estrías de agar TSA al
mismo tiempo que la inoculación en TSI y
LIA permite ganar un día en la
12
• Sembrar con ansa una muestra del caldo
selenito en placas de agar MC y SS. Incubar
todos los medios a 37ºC, 18-24 horas.
(Camino II)
identificación y serotipificación
• Si se obtienen resultados por el Camino I,
no continuar adelante por el Camino II.
Día 3 Confirmación bioquímica y
serotipificación de Salmonella (Camino I) y
subcultivo de colonias sospechosas de
Salmonella provenientes del camino de
enriquecimiento (Camino II)
• Leer las reacciones bioquímicas TSI
y LIA, si son compatibles con Salmonella
spp., realizar las pruebas bioquímicas
complementarias y la serotipificación
somática (Camino I). [Ver Procedimiento
Identificación y caracterización de
Salmonella spp (2.2) y Serotipificación de
Salmonella spp. (2.3) ]
• Subcultivar 2 colonias sospechosas
de Salmonella de las placas de agar MC y
SS provenientes del enriquecimiento en
caldo selenito (Camino II), en estrías de agar
TSA, agar TSI y agar LIA.
• Si se obtienen resultados por el
Camino I, no continuar adelante por el
Camino II
Día 4
• Leer los resultados de las pruebas
bioquímicas complementarias y realizar la
serotipificación flagelar de Salmonella spp.
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(Camino I) y/ o los resultados de la
confirmación bioquímica preliminar y
realizar la serotipificación somática de
Salmonella spp. (Camino II).
TABLA 1. Características de las colonias en medios selectivos y diferenciales
Medio de cultivo Selectividad Aspecto de las colonias
Agar MC Baja Incoloras Agar EMB Baja Incoloras
Agar SS Alta Incoloras con centro negro Agar XLD Alta Rojas con centro negro Agar HK Alta Verdes-azuladas con centro negro
Agar BGA Alta Rosadas pálidas
Ver Flujograma de aislamiento e identificación bioquímica (Figura 1)
14
FIGURA 1.- FLUJOGRAMA DE AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA DE SALMONELLA spp. A PARTIR HECES
Camino II Camino I
(1) Caldo selenito (2) Agar MacConkey y agar SS, o agar Hektoen, o agar xilosa lisina desoxicolato, o agar verde
brillante. (3) Se seleccionan de 2 a 3 colonias. (4) Si TSI y LIA dan resultados compatibles con Salmonella, se siembran Pruebas bioquímicas
complementarias (P.bioq.) y se realiza la serotipificación O (Serotip. O) (5) Pruebas bioquímicas complementarias: RM-VP, decarboxilasas, dulcita, malonato. (6) Serotip: Serotipificación. Si la serotipificación somática O de las colonias obtenidas por ambos
procedimientos de aislamiento diera igual, la serotipificación flagelar H debe hacerse en una sola de ellas.
MATERIA FECAL (HISOPO)
Suspensión en solución fisiológica
Caldo de enriquecimiento (1) Aislamiento en medios selectivos y diferenciales (2)
18-24 hs, 37ºC
Aislamiento en medios selectivos y diferenciales (2)
Colonias típicas (3)
TSI LIA Estría
18-24 hs, 37ºC
Lectura (4) Colonias típicas (3)
TSI LIA Estría
P. bioq. (5)
Serotip. O (6)
Caldo Flagelar
Lectura (4)
P. bioq. (5)
Serotip. O (6)
18-24 hs, 37ºC
Lectura Serotip. H
1er. día
2do. día
3er. día
4to. día
15
2.2.- IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN BIOQUIMICA DE
SALMONELLA spp.
Las probables colonias de Salmonella spp. en los medios de aislamiento utilizados se
confirman mediante pruebas bioquímicas recomendadas por Le Minor y Richard: desarrollo
en agar hierro-tres- azúcares (TSI), utilización de urea de Christensen, determinación de lisina
y ornitina decarboxilasa y de arginina dehidrolasa, prueba de la beta-galactosidasa (ONPG),
prueba del rojo de metilo, reacción de Voges-Proskauer, prueba de fermentación de la dulcita
y utilización del malonato.
La mayoría de las serovariedades (99,8%) de Salmonella aisladas del hombre y de los
animales de sangre caliente pertenecen a Salmonella enterica subesp. enterica (I) y tienen
propiedades bioquímicas características (Tabla 2), siendo excepciones las serovariedades
S. Typhi y S. Paratyphi A.
TABLA 2. Pruebas bioquímicas de Salmonella enterica subesp. enterica (I)
Pruebas bioquímicas Salmonella enterica subep. enterica (I)
Lactosa *** - ONPG - Producción de SH2 + Glucosa (fermentación) *** +/con gas Dulcita (fermentación) *** + Adonita (fermentación) *** - Lisina decarboxilasa ** + Ornitina decarboxilasa** + Arginina dihidrolasa ** + Urea (hidrólisis)** - Indol - Rojo de Metilo * + Voges Proskauer * - Citrato de Simmons ** + Malonato (utilización)* -
*Lectura a los 2 días; ** Lectura hasta los 4 días; *** Lectura hasta los 7 días; **** Lectura hasta los 30 días
16
Las características bioquímicas que permiten diferenciar las distintas subespecies dentro de la
especie S. enterica y la diferenciación con la especie S. bongori se indican en la Tabla 3.
TABLA 3. Propiedades bioquímicas diferenciales de las subespecies de Salmonella spp.
Pruebas bioquímicas
S. enterica subesp. Enterica
(I)
S. enterica subesp. salamae
(II)
S. enterica subesp. arizonae
(IIIa)
S. enterica subesp.
diarizonae (IIIb)
S. enterica subesp.
houtenae (IV)
S. enterica subesp. indica (VI)
S. bongori
(V)
Dulcita + + - - - d + ONPG - - + + - d + Malonato - + + + - - - Gelatina - + + + + + - Sorbita + + + + + - + KCN - - - - + - + L(+) tartrato + - - - - - - Mucato + + + - (70%) - + + Salicina - - - - + - - Lactosa - - - (75%) + (75%) - d - Habitat de las cepas
Animales de sangre caliente
Animales de sangre fría y medio ambiente
+ 90% ó más de los resultados positivos; - 90% ó más de los resultados negativos; d: diferentes
reacciones
Es importante tener en cuenta la posibilidad de aislar más de una serovariedad de Salmonella
de un alimento ó de un material patológico. Si bien esto no ocurre con frecuencia, hay que
tenerlo presente cuando se trabaja con muestras de materia fecal o de ganglios mesentéricos y
sobre todo en el caso de ciertos alimentos para consumo humano o animal, como huevos a
granel, embutidos, harinas de carnes o huesos. Es por ello que se recomienda estudiar varias
colonias simultáneamente.
Materiales y equipamiento
• Ansas descartables (1 µl)
• Ansa aguja
• Mechero Bunsen
• Estufa a 37oC
17
Medios
• Medio para la prueba de urea
• Medio para la prueba de fenilalanina
• Medio Citrato de Simmons
• Medio para la prueba de la lisina decarboxilasa (LDC)
• Medio para la prueba de la ornitina decarboxilasa (ODC)
• Medio para la prueba de la arginina dihidrolasa (ADH)
• Medio control para las pruebas con aminoácidos.
• Vaselina estéril
• Medio base para azúcares
• Solución madre de dulcita al 5%
• Solución madre de salicina al 10%
• Solución madre de sorbita al 10%
• Solución madre de lactosa al 10%
• Solución madre de adonita al 10%
• Solución madre de glicerol al 10%
• Slución madre de manita al 10%
• Solución madre de glucosa al 10%
• Solución madre de dulcita al 10%
• Solución madre de ramnosa al 10%
• Solución madre de silosa al 10%
• Caldo Malonato
• Discos de o-nitrofenil-β-D-galactopiranósido (ONPG) o reactivo para la prueba de la
β-galactosidasa
• Agar SIM
• Reactivo de Erlich para la prueba de indol
• Medio RM/VP para la prueba de Voges-Proskauer
• Solución de KOH 40% para la prueba de Voges-Proskauer
• Solución alcohólica de alfa-naftol para la prueba de Voges Proskauer
18
Cepas bacterianas
• Cepas de referencia para el control de calidad de los medios.
Procedimiento Comentarios
Día 3 Siembra de las pruebas bioquímicas
complementarias
• Inocular a partir de un cultivo en estrías
de agar TSA, los medios para las
siguientes pruebas:
• Medio para la prueba urea.
• Medio para la prueba de LDC, ADH y
ODC y el medio control. Cubrir con una
capa de vaselina estéril.
• Medio para ONPG.
• Medio RM/VP.
• Agar SIM.
• Dulcita
• Caldo Malonato
• Incubar todas las pruebas bioquímicas a
37ºC por 18-24 horas.
• Test de la β-galactosidasa: Resuspender
un ansa del cultivo proveniente del TSI en
un tubo que contiene 0.5 ml de medio de
ONPG e incubar a 37°C. Se debe ver una
reacción positiva dentro de los 20 minutos
pero usualmente la prueba se lee a las 3-4
horas o más. También se pueden usar discos
de ONPG siguiendo las indicaciones del
fabricante
• La β-galactosidasa es una enzima
inducible, y como la lactosa, presente en el
TSI, es uno de los inductores del operón
lactosa, la prueba se realiza a partir del
desarrollo en este medio.
19
Día 4 Lectura de las pruebas bioquímicas
complementarias
• Prueba de urea.
• Prueba de LDC, ADH y ODC.
• Prueba de ONPG.
• Prueba de RM/VP.
• Prueba de SIM.
• Fermentación de Dulcita
• Utilización de Malonato
• Agregar los reactivos correspondientes a
las siguientes pruebas:
• RM: agregar a 0,5 ml del caldo
RM/VP 1 gota de rojo de metilo
• VP: agregar a 1 ml del caldo RM/VP,
0,6 ml de la solución alcohólica de α-
naftol y 0,2 ml de la solución de KOH.
• Indol: agregar 1 ml del reactivo de
Erlich al medio SIM.
• Leer los resultados de acuerdo a las
Tablas 4, 5 y ver Pruebas Bioquímicas –
Propiedades e Interpretación de los
Resultados.
• Anotar los resultados en las planillas de
registro.
• Si se presentan resultados no
concordantes con los esperados para la
identificación bioquímica de Salmonella
spp. se deben realizar pruebas diferenciales.
Ver Problemas de Diagnóstico Diferencial,
donde se presentan pruebas bioquímicas
comparativas con otros géneros de la familia
Enterobacteriaceae
• Agitar muy bien luego de la adición de
cada reactivo
.
20
TABLA 4. Pruebas bioquímicas: interpretación de los resultados
Resultados Medio Reacciones/enzimas
Negativo Positivo TSI Producción de ácido (si el fondo es
amarillo y la estría es roja, (la producción de ácido es sólo a partir de glucosa).
Fondo rojo Fondo amarillo
TSI Producción de ácido a partir de lactosa y/o sacarosa.
Estría roja Estría amarilla
TSI Producción de gas No hay burbujas en el fondo
Burbujas de aire en el fondo
TSI Producción de H2S No hay color negro Color negro LIA La decarboxilación de la lisina
produce una reacción alcalina (color violeta) a través del medio. Los organismos que no decarboxilan la lisina producen una estría alcalina y un fondo ácido (color amarillo).
Botón
purpura/Superficie amarilla
Botón púrpura/Superficie
púrpura
LIA Producción de H2S No hay color negro Color negro Urea Ureasa Amarillo Rosa/Cereza LDC Lisina decarboxilasa Color amarillo/marrón Color púrpura y color
amarillo/marrón en el medio control.
ODC test Ornitina decarboxilasa Color amarillo/marrón Color púrpura y color amarillo/marrón en el
medio control ADH test Arginina dihidrolasa Color amarillo/marrón Color púrpura y
amarillo/marrón en el medio control
ONPG β-Galactosidasa Permanece incoloro Amarillo Voges Proskauer
Producción de acetoína Permanece incoloro Color rojo/rosado
Indol Producción de Indol anillo amarillo anillo rojo/rosado SIM agar Producción de H2S No color negro Color negro SIM agar Producción de indol Anillo amarillo anillo rojo/rosado SIM agar Movilidad Desarrollo solo a lo
largo de la línea de punción
Muestra un crecimiento difuso que se disemina a
partir del punto de inoculación
21
TABLA 5. Resultados de las pruebas bioquímicas para Salmonella spp.
Prueba1) Reacción positiva o
negativa % de aislamientos de Salmonella
que muestran la reacción2) TSI glucosa (ácido) TSI glucosa (gas) TSI lactosa TSI sacarosa TSI sulfuro de hidrógeno LIA agar SIM agar (H2S) SIM agar (indol) SIM agar (movilidad) Utilización de urea Lisina decarboxilasa Ornitina decarboxilasa Arginina dihidrolasa Reacción de β-galactosidasa Reacción de Voges-Proskauer Reacción de indol Utilización del Malonato Fermentación de Dulcita
+ + - - + + + - + - + + + - - - - +
100 91.93) 99.24) 99.5 91.6 98 97
98.9 97 99
94.65)
97 70
98.44) 100 98.9 100 96
1) Ewing W. H. and Ball M. M., The biochemical reactions of members of the genus Salmonella. National Communicable Disease Center, Atlanta, Georgia, USA (1966). 2) Estos porcentajes indican solo que no todas las cepas de Salmonella muestran las reacciones marcadas + o -. 3) Salmonella Typhi es anaerogénica. 4) Salmonella (subgénero) subespecie III (Arizona) da reacciones + o – para lactosa pero es siempre β-galactosidasa positiva. Salmonella (subgénero) subespecie II da una reacción negativa para lactosa y una reacción negativa para β-galactosidasa, (Antigenic Formulas of the Salmonella serovars, 2001). Para el estudio de las cepas, puede ser útil realizar pruebas bioquímicas complementarias. 5) S. Paratyphi A es negativa.
22
2.2.1.- PRUEBAS BIOQUÍMICAS
Agar Hierro Tres Azúcares (TSI) y Agar Kligler
I. Principio
El medio fue diseñado para determinar la habilidad de las bacterias de fermentar hidratos de
carbono y producir sulfuro de hidrógeno (SH2). El medio contiene 1 parte (0.1%) de glucosa y
10 partes (1.0%) de lactosa y sacarosa. El indicador de pH es el rojo fenol y el sulfato ferroso
pone en evidencia la formación de SH2. Si el microorganismo fermenta glucosa, tanto la
punción como la estría aparecerán de color amarillo. Si el organismo fermenta lactosa y/o
sacarosa, la estría permanecerá ácida (amarilla). Si no fermenta lactosa, la estría se vuelve
alcalina (roja). Los organismos que no fermentan glucosa no producen cambios en el pH del
medio o producirán productos alcalinos y el medio TSI permanecerá rojo. La producción de
SH2 se manifiesta por un ennegrecimiento del medio.
El agar de Kligler contiene dos azúcares: lactosa (1%) y glucosa (0.1%). Este medio puede
reemplazar al TSI, la diferencia entre ambos es la ausencia de sacarosa. Los fundamentos
bioquímicos y la interpretación de los resultados son los mismos para ambos medios.
II. Materiales
El medio está disponible comercialmente. Disolver en agua destilada y dispensar volumenes
de 5.0 ml en tubos con tapa a rosca; autoclavar a 121ºC por 15 minutos y enfriar inclinado
dejando un fondo de 5 a 10 mm. El sustrato es estable por 3 meses. Rotular indicando fecha
de preparación y de expiración.
Guardar en heladera; si hay cambio de color no usar.
II. Resultados
A. Estría ácida/fondo ácido (amarillo/amarillo): fermentación de glucosa, sacarosa y/o
lactosa (E. coli).
B. Estría alcalina/fondo ácido (rojo/amarillo): fermentación de glucosa solamente
(Shigella spp.).
C. Estría alcalina/fondo alcalino (rojo/rojo): no fermentador (Pseudomonas aeruginosa).
D. Precipitado negro en el fondo: producción de SH2 (Salmonella spp).
23
E. Burbujas o roturas: producción de gas (E. coli, Salmonella spp.).
III. Control de Calidad
Bacteria Punción Estria Sh2
Salmonella Typhi Ac Alc + (*)
Salmonella Paratyphi A Ac/g Alc -
Salmonella spp. Ac Alc +
Shigella spp. Ac Alc -
Enterobacter aerogenes Ac/g Ac -
Enterobacter cloacae Ac/g Ac -
Escherichia coli Ac/g Ac -
Citrobacter Ac/g Ac +
Klebsiella Ac/g Ac -
Proteus vulgaris Ac/g o Ac Ac +(sucio)
Proteus mirabilis Ac/g o Ac Alc + (sucio)
Klebsiella pneumoniae Ac/g o Ac Alc -
(*) sólo en la parte superior de la punción o formación de un anillo.
Para el control de calidad selecionar entre aquellos microorganismos disponibles.
Prueba de la β-galactosidasa
I. Principio
La fermentación de la lactosa requiere dos enzimas; mientras la permeasa facilita la
penetración de la molécula de lactosa dentro de la célula bacteriana, la β-galactosidasa
hidroliza la lactosa para formar galactosa y glucosa. Las bacterias no fermentadoras de lactosa
carecen de ambas enzimas, sin embargo hay bacterias que tienen β-galactosidasa pero no
permeasa. El o-nitrofenil-β-D-galactósido (ONPG) es un compuesto incoloro estructuralmente
similar a la lactosa. En presencia de β-galactosidasa, ONPG se rompe en galactosa y o-
nitrofenil, un compuesto color amarillo. Como la familia Enterobacteriaceae se agrupan de
acuerdo a su habilidad de fermentar lactosa, este test es útil en la identificación de
fermentadores de lactosa.
24
II. Materiales
A. Solución de ONPG
Disolver 80.0 mg de ONPG en 15.0 ml de agua destilada a 37º C, agregar 5.0 ml del buffer
fosfato, ajustar a pH 7.0 y esterilizar por filtración. La solución es estable por 6 meses.
Guardar refrigerada
(4 a 8º C), en recipientes de color caramelo o envueltos en papel de aluminio.
Rotular la solución, indicando fecha de preparación y de expiración.
B. Buffer fosfato de sodio 1M (pH 7.0)
Disolver 6,9 gr de NaHPO4.H2O en 45.0 ml de agua destilada. Agregar 3.0 ml de una
solución de NaOH al 30% (w/v) y ajustar el pH a 7.0. Llevar el volumen a 50.0 ml con agua
destilada y guardar a 4º C.III. Procedimiento
A. A partir de un cultivo en TSI, hacer una suspensión espesa del organismo a ensayar en
0.5 ml de solución salina. El volumen no tiene mayor importancia porque es una
prueba basada en la observación de un cambio de color.
B. Agregar un disco o dos gotas de solución de ONPG.
C. Incubar la mezcla a 37ºC y examinar cambio de color hasta 24 horas.
IV. Resultados
Ensayo positivo: desarrollo de color amarillo.
Ensayo negativo: no hay desarrollo de color.
V. Control de calidad
Escherichia coli (+)
Salmonella (-)
VI. Consideraciones
A. Se puede partir de estrías de agar nutritivo con 1% de lactosa, cuando no se dispone de
TSI.
B. La solución de ONPG preparada debe ser incolora antes de su empleo.
25
Agar Lisina Hierro (LIA)
I. Principio
La decarboxilación de la lisina a cadaverina produce una alcalinización del medio y un viraje
al violeta del indicador púrpura de bromocresol. Como la reacción tiene lugar en medio ácido,
es necesaria la fermentación previa de la glucosa.
Los microorganismos que no decarboxilan lisina, pero fermentan la glucosa producen un
viraje al amarillo en todo el medio.
La formación de SH2 produce una coloración negra debido al sulfuro de hierro producido.
Las bacterias del grupo Proteus-Providencia, con excepción de Morganella morganii,
desaminan la lisina a ácido α-cetocarbónico que forma compuestos pardo-rojizos en el medio
de cultivo con la sal de hierro y en aerobiosis.
II. Materiales
El medio está disponible comercialmente. Disolver el polvo en agua destilada y dispensar en
volúmenes de 3 ml en tubos con tapa a rosca. Esterilizar a 121ºC por 15 minutos. Enfriar de
manera de tener estría y fondo. Guardar en heladera.
II. Resultados
Los microorganismos que descarboxilan la lisina producen un viraje al violeta.
Los microorganismos que no descarboxilan la lisina y fermentan glucosa producen un viraje al
amarillo.
La formación de SH2 se indica por la aparición de una coloración negra.
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III. Control de Calidad
Bacteria Punción Estria Sh2
Salmonella sp. Violeta Violeta +
Proteus mirabilis Amarilla Pardo-rojiza +
Proteus vulgaris Amarilla Pardo-rojiza +
Morganella morganii Amarilla Pardo-rojiza -
Prov. rettgeri Amarilla Pardo-rojiza -
Providencia spp. Amarilla Pardo-rojiza -
Citrobacter spp. Amarilla Violeta +
Escherichia coli Amarilla Violeta -
Shigella spp. Amarilla Violeta -
Klebsiella Violeta Violeta -
Para el control de calidad seleccionar entre aquellos microorganismos disponibles.
Agar SIM
I. Principio
Es un medio que se usa para determinar la formación de sulfuro de hidrógeno, la producción
de indol y la movilidad en el diagnóstico de Enterobacterias.
II. Materiales
El medio está disponible comercialmente. Disolver en agua destilada, calentar suavemente
hasta su disolución y dispensar en volumenes de 5 ml en tubos con tapa a rosca. Autoclavar a
121ºC, 15 minutos; enfriar en posición vertical y guardar en heladera.
III. Procedimiento
A.Con un ansa tomar material de una colonia y sembrar por punción.
B.Incubar a 37ºC por 18 a 24 horas.
IV. Resultados
A. Para la producción de SH2
Ensayo positivo: ennegrecimiento del medio.
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Ensayo negativo: no hay ennegrecimiento.
B. Para la movilidad
Ensayo positivo: hay una turbidez difusa del medio.
Ensayo negativo: sólo hay crecimiento a lo largo de la punción.
C. Para la producción de indol
Ensayo positivo: aparición de color rojo cuando se agrega el reactivo de Erlich.
Ensayo negativo: no hay aparición de color.
V. Control de Calidad
Escherichia coli: SH2 -, indol +, movilidad +
Klebsiella pneumoniae: SH2 -, indol -, movilidad -
Proteus vulgaris: SH2 +, indol +, movilidad +
VI. Consideraciones
Un organismo que produce sulfuro de hidrógeno puede mostrar ennegrecimiento en SIM pero
no en TSI por la presencia de sacarosa en este último medio. La utilización de la sacarosa
puede suprimir los mecanismos enzimáticos responsables de la producción del sulfuro de
hidrógeno.
Test de Utilización de Azúcares
I. Principio
Es un ensayo para determinar la capacidad de un microorganismo de fermentar un hidrato de
carbono con producción de ácido o ácido y gas. El patrón de utilización de azúcares ayuda en
la diferenciación e identificación de muchas bacterias. En este ensayo, determinados azúcares
se agregan a un medio basal estéril. La producción de ácido se manifiesta por un cambio de
color del indicador. La elección del medio y del indicador depende del camino metabólico del
organismo y de la claridad visual del cambio de pH.
II. Materiales
A. Medio base
• Peptona 10.0 g
• Extracto de carne 1.0 g
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• Cloruro de sodio 5.0 g
• Azul de bromotimol 10.0 ml
• Indicador de Andrade 5.0 ml
• Agua destilada 1000 ml
Rehidratar los ingredientes con agua destilada, calentando suavemente si es necesario; ajustar
el pH a 7.1-7.2 (7.4). Autoclavar a 121ºC por 15 minutos y enfriar en baño de agua a 50ºC.
Fraccionar el medio base en alícuotas y agregar los azúcares esterilizados por filtración en
concentraciones de: 0.5% para dulcita y salicina y 1.0% para los otros azúcares. Dispensar en
volumenes de 4-5 ml en tubos con tapa a rosca, estériles. El medio se guarda en heladera y es
estable por 3 meses.
Para la glucosa y glicerol, el medio base se dispensa en tubos con campanita de Durham antes
de autoclavar. La campanita se llenará con el medio y luego se agrega el azúcar en forma
estéril después de enfriar a 50º C.
B. Indicador de Andrade
Disolver 0.5 gr de fucsina ácida en 100 ml de agua destilada, agregar 15.0 ml de NaOH 1N
(4%); mezclar bien y dejar descansar a temperatura ambiente durante 24 horas, agitando
frecuentemente. El color rojo se debe transformar en un color castaño. Si no se produce una
decoloración suficiente agregar 1.0 ml de NaOH 1N (4%).
III. Procedimiento
1) Con un ansa estéril tomar material de un cultivo en medio sólido.
2) Sumergir el ansa en cada tubo de hidrato de carbono.
Para una batería de 8 a 10 azúcares, es suficiente un único inóculo, no hay necesidad
de flamear el ansa entre tubo y tubo. La posibilidad de transportar el hidrato de
carbono de tubo a tubo es infinitesimal y no afectará los resultados. Para una batería
grande (15 a 20) de azúcares, puede ser necesario emplear 2 a 3 inóculos, flameando el
ansa antes de tomar nueva muestra.
3) Incubar a 37º C y examinar día por día por 4 a 5 días. Para algunos microorganismos
puede ser necesario una incubación más prolongada (7 días), registrando los resultados
día por día.
4) En laboratorios de referencia las lecturas se deben prolongar hasta 30 días.
29
IV. Resultados
Ensayo positivo: viraje del indicador al rojo-rosado por acidificación del medio.
Ensayo negativo: no hay cambio de color.
V. Control de calidad
Con distintos microorganismos que fermenten los azúcares, como por ejemplo:
Escherichia coli: glucosa +
Klebsiella: lactosa +
Yersinia enterocolitica: sacarosa +
VI. Consideraciones
A. Inocular un medio basal sin azúcar para cada microorganismo.
B. La campanita de Durham se usa en el tubo con glucosa.
C. Como cualquier indicio de gas, aún una burbuja pequeña, es evidencia de producción
de gas, observar cuidadosamente la campanita antes de inocular.
D. La campanita de Durham se agrega únicamente al medio con glucosa porque si el
microorganismo produce gas con glucosa producirá gas con los otros azúcares. No
obstante, si se sabe que el microorganismo en estudio no fermenta glucosa, es
aconsejable agregar campanita a otros azúcares, pero hay que tener en cuenta que todas
las Enterobacterias son fermentadoras de glucosa por definición, entonces sólo se pone
campanita al medio con glucosa.
Test de Decarboxilasa-Dehidrolasa
I. Principio
La descarboxilación es un proceso en el cual las decarboxilasas atacan el extremo carboxilo de
los aminoácidos, formando la correspondiente amina. Los tres aminoácidos que se ensayan en
la identificación de Enterobacterias son arginina, lisina y ornitina. La decarboxilación de lisina
y ornitina da cadaverina y putrescina (diaminas), mientras que arginina da citrulina por acción
de una dihidrolasa. El test se debe acompañar con un tubo control que contiene el medio base
sin aminoácido. Como la decarboxilación es una reacción anaeróbica, se debe cubrir el medio
con una capa de aceite mineral estéril. El proceso ocurre en dos etapas: por fermentación de la
glucosa se produce una acidificación del medio (pH < 6.0), apareciendo color amarillo. La
30
acidificación es necesaria para que ocurra la decarboxilación. Este último proceso de lugar a la
formación de las aminas que elevan el pH con el consiguiente viraje del indicador al color
violeta.
La prueba de la lisina ayuda en la diferenciación de Edwardsiella (+), y Salmonella (+) de
Citrobacter (-); de Enterobacter aerogenes (+) de Enterobacter cloacae (-) y Enterobacter
agglomerans (-)
La prueba de ornitina ayuda a diferenciar Klebsiella (-), Proteus mirabilis (+) de Proteus
vulgaris (-); Morganella morganii (+) de Providencia rettgeri (-); Yersinia enterocolitica (+)
de Yersinia pestis y Yersinia pseutuberculosis (-).
II. Materiales
El medio basal más utilizado es el medio de decarboxilasa de Moeller. El medio contiene
peptona 5.0 g, extracto de carne 5.0 g, glucosa 0.5 g, bromocresol púrpura 0.01 g, rojo cresol
0.005 g piridoxal 0.005 g pero está disponible comercialmente. Las concentraciones de
aminoácidos a usar son: 1% para la forma L y 2% para la forma DL. Fraccionar el medio base
en 4 porciones de 250 ml cada una. Agregar los aminoácidos a 3 porciones del medio. El pH
de la fracción que lleva ornitina se debe reajustar después de agregar el aminoácido y antes de
esterilizar. Fraccionar en volumenes de 3 a 4 ml en tubos con tapa a rosca y autoclavar a
121ºC por 10 minutos. El sustrato es estable por 3 meses. Rotular los tubos, indicando fecha
de preparación y de expiración y guardar en heladera.
Al aceite mineral se le agrega 1 ml de agua por cada 100 ml de vaselina, y se autoclava a
121ºC por 45 minutos.
III. Procedimiento
A. Tomar material con un ansa e inocular el tubo control y los tubos con los aminoácidos.
B. Cubrir todos los tubos con una capa de vaselina estéril.
C. Incubar a 37ºC
D. Efectuar las lecturas día por día hasta 4 días, registrando los resultados día por día.
IV. Resultados
Ensayo positivo: medio turbio y púrpura a púrpura amarillento.
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Ensayo negativo: color amarillo
Tubo control: permanece con su color original o se vuelve amarillo si el organismo es un
fermentador de glucosa (se debe ver turbidez en el tubo).
V. Control de calidad
Bacteria Arginina Lisina Ornitina
Proteus vulgaris - - -
Morganella morganii - - +
Enterobacter cloacae + - +
Enterobacter
aerogenes
- + +
S. Typhimurium + + +
Klebsiella - + -
VI. Consideraciones
A. Inocular siempre un tubo control.
B. Debe haber desarrollo para que el resultado sea válido.
C. Si se observan capas de color amarillo y violeta, agitar suavemente el tubo antes de
interpretar la reacción.
D. Comparar todos los tubos positivos con el tubo control. Un color grisáceo puede
indicar reducción del indicador más que formación de productos alcalinos. Se debe
agregar más indicador antes de interpretar el resultado.
E. Si la reacción es difícil de interpretar, comparar el tubo con un tubo sin inocular.
Luego de 24 horas cualquier traza de color púrpura indica un resultado postivo.
F. Si se usa el medio de Moeller, se debe incubar por lo menos 18 horas ante de
interpretar los resultados.
G. Si no se agrega el aceite mineral, las reacciones se deben leer sólo a las 24 horas.
H. Un pequeño precipitado floculento en la ornitina no interfiere con su uso.
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Prueba del Malonato
I. Principio
El ensayo pone en evidencia la capacidad de las bacterias de utilizar malonato como fuente de
carbono. Las cantidades mínimas de glucosa del medio, permiten el desarrollo de organismos
que no pueden usar malonato o sales de amonio, sin embargo esos organismos no pueden
mantener un pH alcalino. La producción de ácido por la fermentación de la glucosa impide
una posible alcalinización. Solamente los microorganismos que pueden usar simultáneamente
malonato de sodio como fuente de carbono y sulfato de amonio como fuente de nitrógeno son
capaces de ejercer una acción buffer produciendo hidróxido de sodio. El aumento de la
alcalinidad resultante hace que el azul de bromotimol cambie de verde a azul. Los
microorganismos malonato negativos que fermentan glucosa hacen que el indicador cambie
de verde a amarillo. La mayoría de las especies de Enterobacter y Klebsiella utilizan malonato
de sodio. El ensayo también sirve para separar Salmonella arizonae (+) de otras especies de
Salmonella (-).
II. Materiales
El medio contiene: extracto de lavadura 1.0g, sulfato de amonio 2.0g, fosfato dipotásico 0.6g,
fosfato monopotásico 0.4g, ClNa 2.0g, malonato de sodio3.0g, glucosa 0.25g, azul de
brotimol (1g/500ml) 12.5g . Disolver en 1000 ml de agua destilada, dispensar 3 ml en tubos
con tapa a rosca y autoclavar a 121ºC por 15 minutos. Enfriar antes de usar; el sustrato es
estable por 2 a 3 meses. Rotular los tubos, indicando fecha de preparación y de expiración y
guardar en heladera. Si hay cambio de color en el medio no usar.
III. Procedimiento
A. Con ansa estéril tomar material e inocular el medio.
B. Incubar a 37ºC por 24 a 48 horas.
C. Continuar incubando los tubos negativos hasta 4 días, registrando los resultados día
por día.
IV. Resultados
Ensayo positivo: reacción alcalina (azul).
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Ensayo negativo: no hay cambio de color (verde).
Ensayo negativo: reacción ácida, sólo fermentación de glucosa (amarillo).
V. Control de Calidad
Enterobacter aerogenes +
Escherichia coli -
VI. Consideraciones
A. Algunos organismos malonato (+) producen una ligera alcalinidad, que hace la
interpretación difícil. Cuando hay duda comparar con un tubo sin inocular. Cualquier
vestigio de color azul denota una prueba positiva luego de una incubación de 48 horas.
No se debe hacer una interpretación final negativa hasta no haber incubado los tubos
durante 48 horas.
B. A veces es necesario agregar extracto de levadura y glucosa para estimular el
crecimiento de algunos organismos.
C. Algunas cepas malonato (-) dan color amarillo por la fermentación de la glucosa
solamente. Esto produce una disminución del pH y el viraje del indicador al amarillo.
Ensayo del Rojo de Metilo
I. Principio
El test se usa para determinar la presencia de iones hidrógeno cuando un microorganismo
fermenta glucosa. Todos los miembros de la familia Enterobacteriaceae convierten glucosa en
ácido pirúvico por el camino de Embden-Meyerhof. Los organismos que metabolizan ácido
pirúvico producen ácido y bajan el pH a menos de 4.4. Los organismos que utilizan, en
cambio, el camino del butilenglicol producen acetoína y butanodiol (diacetilo). El indicador
del medio, rojo de metilo, es rojo a pH < 5.0 y amarillo a pH > 5.8. El test es útil para la
diferenciación de Escherichia coli (rojo metilo positivo) de Klebsiella (rojo metilo negativo).
La mayoría de las Enterobacteriaceae tienen uno u otro camino metabólico, pero raramente
ambos.
II. Materiales
A. Preparación del medio
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El medio está disponible comercialmente. Disolver en agua destilada, dispensar 5 ml en tubos
con tapa a rosca y autoclavar a 121ºC por 15 minutos. El sustrato es estable por 2 a 3 meses.
Rotular los tubos, indicando fecha de preparación y de expiración. Guardar en heladera.
B. Preparación del reactivo
Disolver 0.1 gr de rojo de metilo en 300 ml de etanol y diluir con 200 ml de agua destilada,
para alcanzar un volumen total de 500 ml. El reactivo es estable por 1 año. Rotular indicando
fecha de preparación y de expiración. Guardar en heladera.
III. Procedimiento
A. Con un ansa estéril tomar material e inocular un tubo con caldo RM/VP.
B. Incubar a 35º C por un mínimo de 48 horas.
C. Transferir 2.5 ml de la suspensión a un tubo.
D. Agregar 5 gotas del indicador y observar si hay cambio de color.
IV. Resultados
Ensayo positivo: el reactivo permanece rojo.
Ensayo negativo: el reactivo se torna amarillo-naranja.
Si el resultado es negativo continuar la incubación de la bacteria por 24 horas más.
V. Control de Calidad
Escherichia coli +
Enterobacter aerogenes -
VI. Consideraciones
A. Variaciones en la cantidad de peptona del medio puede afectar el resultado.
B. Aumentando la concentración de glucosa en el medio no se acelera la reacción del rojo
de metilo.
C. No sobreinocular, el crecimiento bacteriano se inhibe cuando el inóculo es grande.
D. Una incubación de 48 horas es suficiente para la mayoría de los cultivos; pero el
ensayo no se debe realizar con cultivos que tengan menos de 48 horas de incubación.
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Ensayo de Voges-Proskauer
I. Principio
El piruvato es un intermediario en el metabolismo de la glucosa. A partir del ácido pirúvico un
microorganismo puede seguir varios caminos. Algunos lo rompen para formar como
productos finales ácidos láctico, acético o fórmico. Otros metabolizan el piruvato por el
camino del butilenglicol para formar como productos finales acetoína (acetilmetilcarbinol) y
2,3-butanodiol (diacetilo). El ensayo de Voges-Proskauer (VP) detecta estos productos
metabólicos. En presencia de oxígeno e KOH, la acetoína se oxida a diacetilo, que da un
complejo rojo. La sensibilidad del ensayo se aumenta por el agregado de α-naftol antes del
agregado de KOH.
II. Materiales
A.Preparación del medio
El medio está disponible comercialmente. Para la preparación del caldo RM/VP, ver el
procedimiento indicado para el test de rojo de metilo.
B. Preparación de solución de α-naftol
Disolver 5.0 gr de α- naftol en una pequeña cantidad de alcohol absoluto y luego llevar el
volumen a 100 ml. La solución debe ser incolora. El reactivo es estable por 1 año. Rotular
indicando fecha de preparación y de expiración. Guardar en heladera en frascos color
caramelo.
C. Preparación de la solución de KOH
Disolver los pellets de KOH en agua destilada y luego llevar el volumen final a 100 ml
(trabajar sobre baño de agua fría para evitar recalentamiento). El reactivo es estable por 1 año.
Rotular indicando fecha de preparación y de expiración.
III. Procedimiento
A. Con un ansa estéril tomar material e inocular un tubo de caldo RM/VP.
B. Incubar a 37ºC por un mínimo de 48 horas.
C. Transferir 2.5 ml de la suspensión a otro tubo.
D. Agregar 0.6 ml del reactivo de α-naftol.
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E. Agregar 0.2 ml del reactivo de KOH.
F. Agitar el tubo y dejar descansar 10 a 15 minutos.
G. Observar la formación de un color rosado a rojo.
IV. Resultados
Ensayo positivo: desarrollo de color rojo dentro de los 15 minutos.
Ensayo negativo: no hay desarrollo de color.
V. Control de Calidad
Klebsiella pneumoniae –
Escherichia coli +
VI. Consideraciones
A. Cuando hay una incubación prolongada (más de 3 días) algunos organismos VP +
pueden producir un aumento de la acidez del medio, dando reacciones positivas
débiles o falsas reacciones negativas.
B. La mayoría de los miembros de la familia Enterobacteriaceae dan reacciones opuestas
entre el rojo de metilo y VP, sin embargo algunos organismos como Hafnia alvei
pueden dar ambas reacciones positivas.
C. Los reactivos se deben agregar en el orden indicado. Una inversión del orden puede
dar un resultado positivo débil o un falso negativo.
D. No se debe agregar KOH en exceso, porque se puede enmascarar una reacción positiva
débil por la formación de un color cobrizo por la reacción del KOH con el α-naftol.
No leer el ensayo después de 1 hora; puede aparecer una coloración cobriza dando un
resultado falso positivo.
Prueba de la Urea
I. Principio
La urea es una diamida del ácido carbónico, cuya hidrólisis por acción de la ureasa da 2
moléculas de amoníaco. La ureasa es una enzima constitutiva que se sintetiza
independientemente de la presencia o no de la urea. La prueba determina la capacidad de la
bacteria de desdoblar la urea, con la consiguiente alcalinización del medio. Es una actividad
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característica de especies de Proteus y se usa para diferenciar Klebsiella (+) de Escherichia (-)
y Proteus (+ rápido) de Providencia (-); Yersinia pseudotuberculosis (+) de Yersinia pestis (-)
II. Materiales
El medio base está disponible comercialmente, es el medio base de urea de Christensen, que
contiene peptona 1.0 g, glucosa 1.0 g cloruro de sodio 5.0 g, fosfato monopotásico 5.0 g,
solución de rojo fenol al 0.2% 6 ml. Se disuelve medio en agua destilada y esterilizar a 121ºC
por 15 minutos. Enfriar a 50ºC y agregar 5 ml de una solución de urea al 40% por cada 100 ml
de medio. Mezclar y fraccionar en volumenes de 2.5 ml en tubos estériles. Guardar en
heladera.
La urea se pesa asepticamente, se disuelve en agua y se calienta a 70ºC por 20 minutos, se
guarda en frascos estériles con cloroformo (igual que para los azúcares).
III. Procedimiento
A) Con un ansa estéril se toma abundante material y se inocula por punción
B) Se incuba a 37ºC y se efectúan lecturas a las 2, 4, 6 y 18 horas. Los tubos negativos se
observan diariamente por 4 a 7 días para detectar reacciones tardías que dan ciertos
miembros de la familia, registrando los resultados día por día.
IV. Resultados
Ensayo positivo: aparición de color rojo en el medio por una alcalinización del mismo.
Ensayo negativo: no hay cambio de color.
V. Control de Calidad
Enterobacter aerogenes –
Escherichia coli –
Proeus vulgaris +
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Prueba del Indol
I. Principio
El indol es uno de los productos del metabolismo del aminoácido triptofano. Con un medio
rico en triptofano, el indol se puede detectar por su habilidad para combinarse con ciertos
aldehidos para formar un compuesto coloreado. El ensayo constituye un método rápido para
detectar organismos productores de indol. Como indicador de la presencia del aldehído se usa
el reactivo de Erlich. Es especialmente útil en la identificación preliminar de Escherichia coli,
y para diferenciar Edwardsiella (+) de Salmonella (-).
II. Materiales
A. Caldo triptofano
• Peptona 20.0 gr
• Cloruro de sodio 5.0 gr
• Agua destilada 1000 ml
A este caldo se le incorpora triptofano en una concentración del 1%. El medio se esteriliza a
121ºC durante 15 minutos y luego se ajusta el pH a 7.5. Dejar enfriar antes de su empleo y
guardar a 4-10ºC para su conservación.
B. Reactivo de Erlich
• p-dimetilaminobenzaldehido 1.0 g
• alcohol etílico, 95% 95.0 ml
• ácido clorhidríco, concentrado 20.0 ml
Se disuelve el aldehído en el alcohol (puede requerir un calentamiento suave), luego se agrega
lentamente el ácido. El reactivo de color amarillo es estable por un año. Identificar el reactivo
con una etiqueta donde conste la fecha de preparación y de expiración. Guardar refrigerado en
botellas color caramelo.
III. Procedimiento
1) Con un ansa tomar material de una colonia aislada e inocular el caldo que contiene
triptofano.
2) Incubar a 37ºC por 18 a 24 horas.
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3) Transferir 2 ml de la suspensión de caldo a un segundo tubo.
4) Agregar 5 gotas del reactivo de Erlich por la pared del tubo.
5) Agitar el tubo y observar un color rosado en la interfase entre el caldo y el reactivo.
6) Si el ensayo es negativo, el cultivo se debe reincubar otras 24 horas.
IV. Resultados
Ensayo positivo: desarrollo de un color rojo en la interfase del reactivo y el caldo, segundos
después de agregar el reactivo.
Ensayo negativo: no hay cambio de color o hay un color amarillo en la interfase.
V. Control de Calidad
Cualquiera de los reactivos debe ser controlado con cultivos positivos y negativos conocidos,
antes de su empleo general. Como controles resultan convenientes cepas de fácil obtención y
que su conservación en cultivos madre no ofrezca problemas.
Escherichia coli +
Enterobacter aerogenes -
Klebsiella pneumoniae –
VI. Consideraciones
1) El pH óptimo para la actividad de la triptofanasa es ligeramente alcalino (7.4-7.8). La
disminución del pH provoca una reducción en la producción de indol y una reacción
falsamente negativa o débilmente positiva.
2) Los cultivos a los cuales se les efectúa la prueba del indol deben ser incubados
aerobicamente. El descenso en la tensión de oxígeno disminuye la producción de
indol.
3) No debe emplearse un medio de peptona que contenga glucosa porque la elevada
acidez producida por la fermentación del azúcar puede inhibir la actividad de la
triptofanasa. El agregado de triptofano estimula la producción de indol, mientras que la
glucosa la inhibe.
40
2.2.2.-PROBLEMAS DEL DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL
A) Salmonella Typhi y Salmonella Paratyphi A, pueden diferenciarse de otras Salmonella spp,
por las siguientes pruebas bioquímicas:
TABLA 6. Pruebas bioquímicas diferenciales entre Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi A y
Salmonella spp.
P. Bioquímicas S. Typhi S. Paratyphi A Salmonella spp.
SH2 (TSI) Trazas - +
Lisina decarboxilasa + - +
Ornitina decarboxilasa - + +
Arginina dihidrolasa - - +
Glucosa (gas) - + +
Citrato Simmons - - +
+ 90% ó más de los resultados positivos; - 90% ó más de los resultados negativos
B) Algunas cepas de Salmonella spp. se pueden confundir con otras enterobacterias
productoras de SH2 como Proteus mirabilis y Citrobacter freundii que son comensales del
aparato digestivo del hombre y de los animales de sangre caliente, pero que no son
enteropatógenos.
TABLA 7. Caracteres bioquímicos diferenciales entre Salmonella subesp. enterica (I) Proteus
mirabilis y Citrobacter freundii
Pruebas bioquímicas Salmonella enterica
subesp. enterica (I) Citrobacter freundii Proteus mirabilis
SH2 (TSI) + + +
Urea (hidrólisis) - d +
Fenilalanina deaminasa - - +
Lisina decarboxilasa + - -
Ornitina decarboxilasa + d +
Lactosa (fermentación) - d -
Dulcita (fermentación) + d -
ONPG - + -
+ 90% ó más de los resultados positivos; - 90% ó más de los resultados negativos; d: diferentes reacciones
41
C) Las cepas de Citrobacter freundii suelen ser identificadas por error como S. enterica
subesp. arizonae (IIIa) (serovariedades monofásicas) y S.enterica subesp. diarizonae (IIIb)
(serovariedades difásicas), (ex-género Arizona), en razón de compartir caracteres bioquímicos
tales como: SH2 (TSI) +, ONPG + y un perfil de fermentación de hidratos de carbono muy
parecido.
TABLA 8. Caracteres bioquímicos diferenciales entre Salmonella subesp. enterica IIIa y IIIb y
Citrobacter freundii
Pruebas bioquímicas Salmonella subesp. enterica
IIIa y IIIb
Citrobacter freundii
Lisina decarboxilasa + -
Ornitina decarboxilasa + - (con excepciones)
Glicerol (fermentación) - +
Malonato (utilización) + -
Gelatina (hidrólisis) + (lenta) -
+ 90% ó más de los resultados positivos; - 90% ó más de los resultados negativos
D) Muy raramente Salmonella pueden confundirse con otras entrobacterias productoras de
SH2, como E. coli SH2 + o Edwardsiella tarda
TABLA 9. Caracteres bioquímicos diferenciales entre Salmonella enterica subesp. enterica (I),
Edwarsiella tarda y Esherichia coli SH2 +
P. Bioquímicas S. enterica subesp.
enterica (I) E. tarda E. coli SH2 +
Indol - + +
Citrato Simmons + - -
Lisina decarboxilasa + + +
Arginina dihidrolasa + - -/+
Manita (fermentación) + - +
Dulcita (fermentación) + - +/-
Ramnosa (fermentación) + - +
Xilosa (fermentación) + - +
ONPG - - +
+ 90% ó más de los resultados positivos; - 90% ó más de los resultados negativos
42
E) Puede suceder que dos o más serovares tengan la misma fórmula antigénica global, por lo
que su diferenciación se hace en base a pruebas bioquímicas.
TABLA 10. Caracteres diferenciales de las serovariedades S.Cholerasuis, S. Typhisuis y S.
Paratyphi C.
Pruebas Bioquímicas Cholerasuis Paratyphi C Typhisuis
SH2 - + +
Citrato deSimmons + o (+) + -
Arginina dihidrolasa - + o - -
Lisina decarboxilasa + + -
Ornitina decarboxilasa + + +
Tartrato de Jordan + o - + -
Arabinosa - + +
Dulcita - + -
Sorbita + o (+) + -
+ 90% o más de los resultados positivos; - 90% o más de los resultados negativos; (+) reacciones positivas después de 3 o más días.
2.3.- SEROTIPIFICACIÓN DE SALMONELLA spp.
La serotipificación constituye un importante complemento de la identificación bioquímica y
desde el punto de vista epidemiológico permite determinar la prevalencia de una serovariedad
en distintas zonas geográficas, como así también es de utilidad para el estudio de brotes y para
conocer la fuente de infección y las vías de transmisión.
El uso de reacciones antígeno – anticuerpo para la serotipificación de las bacterias se basa en
que los microorganismos presentan diferencias en su constitución antigénica, aún entre grupos
de microorganismos relacionados. Los microorganismos expresan una gran variedad de
antígenos (Ags): componentes estructurales de la célula (pared, cápsula, fimbrias); productos
de excreción (exotoxinas, enzimas extracelulares).
Químicamente, los Ags pueden ser proteínas, hidratos de carbono y complejos de polipéptidos
y carbohidratos. Como son moléculas complejas tienen más de una subestructura que puede
servir como determinante antigénico. Debido a esto en los sueros inmunes se encuentran
anticuerpos que reaccionan contra distintos determinantes antigénicos de la misma molécula.
43
La base de la serotipificación para todas las enterobacterias es similar: se pone en evidencia la
presencia de antígenos somáticos, flagelares y capsulares.
La serotipificación de cepas de Salmonella enterica involucra la identificación de antígenos
somáticos de superficie (LPS, antígenos O) y antígenos flagelares (proteínas, antígenos H). La
mayoría de las cepas de Salmonella expresan dos fases flagelares pero también se conocen
variantes afásicas, monofásicas y trifásicas.
La identificación de las serovariedades surge como consecuencia de la combinación
antigénica de factores somáticos O y flagelares H, con el agregado del antigeno capsular Vi
para unas pocas serovariedades y se presenta en el “Esquema de Kauffmann-White” (Popoff,
M.Y., 8ª Ed, WHO Centre for Referente and Research on Salmonella, Instituto Pasteur, París,
Francia, 2001).
A) Antígenos somáticos (Ags O)
Están compuestos por complejos de fosfolípidos y polisacáridos; su composición es
aproximadamente: 60% polisacáridos, 20-30% lípidos y 3,5-4% hexosamina.
Son cadenas laterales de polisacáridos del lipopolisacárido de envoltura (LPS) que se
encuentra en todos los microorganismos gram-negativos.
La cadena de polisacáridos del Ag O es un polímero de unidades repetidas de oligosacáridos
(de 3 a 5 azúcares) lineales o ramificados. La naturaleza de los grupos terminales y el orden en
que se encuentran las unidades repetidas de la cadena determina la especificidad antigénica
somática de la bacteria. Como esta estructura difiere ampliamente entre las distintas
serovariedades, hay diferencias en la especificidad antigénica O.
Estos antígenos son termoestables y resistentes a ácidos diluidos y alcohol.
La estructura somática se denomina con la letra O seguida de números arábigos separados por
comas, por ej. S. Typhimurium O:1,4,5,12; S. Enteritidis O:1,9,12
44
Los Ags O se pueden clasificar de la siguiente manera:
1) Factores mayores, que identifican el grupo antigénico O; por ej., el factor O:4, el
factor O:9
2) Factores menores, que pueden ser:
a) Los que tienen poco o ningún valor discriminativo porque siempre están asociados
a otro factor; por ej., O:12 que siempre está asociado con O:2, O:4 y O:9, como se presenta en
S. Paratyphi A O: 1,2,12; S. Typhimurium O: 1,4,5,12 y S. Enteritidis O: 1,9,12
b) Los que surgen como consecuencia de una modificación química de los Ags
mayores; por ej., O:5 resulta de la acetilación de la abecuosa presente en las unidades
repetidas del polisacárido responsable de la especificidad O:4,12; O:1 resulta de la inserción
de un residuo de glucosa en la galactosa de la cadena de polisacárido, como es el caso de la
serovariedad S. Typhimurium O:1,4,5,12
B) Antígenos Flagelares (Ags H)
El flagelo es una estructura compleja que consiste en un cuerpo basal, un segmento de unión
(“hook”) y un filamento. El cuerpo basal ancla el flagelo a la envoltura de la célula y el
“hook” une el cuerpo basal con el filamento. En la serotipificación flagelar de Salmonella se
usa solamente la especificidad antigénica del filamento.
El filamento esta constituido por flagelina, proteína de alto peso molecular. En Salmonella se
han encontrado más de 60 especificidades antigénicas flagelares. Las diferencias antigénicas
surgen debido a variaciones en la estructura primaria (contenido en aminoácidos y orden de
ubicación) de las distintas moléculas de flagelina.
Estos antígenos son sensibles al calor.
Unas pocas serovariedades de Salmonella poseen una sola fase flagelar, esas cepas se llaman
monofásicas, por ej. Salmonella Enteritidis (9,12:g,m:-), Salmonella Typhi (9,12 [VI]:d:-);
pero la gran mayoría de las serovariedades tienen dos fases flagelares o sea son cepas
difásicas; por ej., Salmonella Typhimurium (1,4,5,12:i:1,2) y Salmonella Hadar
(6,8:z10:e,n,x), que expresan la fase 1 (constituida en los ejemplos por los antígenos: i ó z10 ) y
la fase 2 ( por los antigenos: 1,2 y e,n,x respectivamente).
45
C) Antígeno Capsular (Ag Vi)
El antígeno capsular es un polisacárido, constituido por ácido N-acetilglucosaminourónico.
Entre los antígenos capsulares de las Enterobacterias, el Vi es el más importante en el género
Salmonella. Se encuentra en sólo tres serovariedades: S. Typhi, S. Paratyphi C y en algunas
cepas de S. Dublin.
Descripción del Esquema de Kauffmann - White
Sobre la base de los componentes antigénicos somáticos O y flagelares H se ha establecido lo
que se denomina el Esquema de Kauffmann-White, que agrupa a todas las serovariedades
conocidas.
El esquema está conformado por cuatro columnas:
Primera columna: indica el nombre de la serovariedad, si la misma pertenece a
S. enterica subesp. enterica (I) ó las siglas S. II, S. IIIa, S. IIIb, S. IV, S. V, S. VI; indicando
que la serovariedad considerada pertenece a la subespecie II ó III a, etc.
Segunda columna: Antígenos somáticos (O). Los números indican el ó los factores del
antígeno O y se escriben, separados por una coma. Las serovariedades son agrupadas en
grupos somáticos, cada uno de ellos caracterizado por un factor O mayor. Así se determinan
los grupos A, B, C, etc. Por ej. el grupo O:2 (A) está integrado por S. Paratyphi A (1,2,12:a:-)
entre otras, el grupo O:4 (B) por S. Typhimurium (1,4,5,12:i:1,2); S. Agona (1,4,12:f,g,s:- );
S. Saintpaul (1,4,5,12:e,h:1,2), entre otras, etc.
El Esquema de Kauffmann-White presenta 67 grupos O, desde el grupo A hasta el Z y luego
continúa con números, desde el O:51 hasta el O:67
Tercera y cuarta columna: Antígenos flagelares (H). Se indican los factores de las fases 1 y
2, del antígeno H, respectivamente. Para la fase 1 los factores se denominan con letras
minúsculas, seguidas algunas veces por un número que figura como subíndice y para la fase 2
se emplean en general números arábigos, aunque también se utilizan letras minúsculas. Un
signo "negativo" indica que la fase considerada está ausente y por lo tanto la serovariedad es
monofásica.
46
� Los símbolos para los factores somáticos determinados por conversión fágica están
subrayados (por ej. 1,2,12)
� [ ] = los factores O o H entre corchetes, no subrayados, pueden estar presentes o
ausentes sin relación con la conversión fágica. Por ej. factor [5] del grupo O:4 (B).
Cuando los factores H están entre corchetes significa que ellos se encuentran
excepcionalmente en cepas salvajes.
Ejemplos:
Salmonella Enteritidis 1, 9,12:g,m:-
El Ag O es 1, 9,12; el Ag H (fase 1) es g,m;
El Ag H (fase 2)es -; la fase 2 está ausente, por lo tanto
la serovariedad es monofásica.
Salmonella Typhimurium 1, 4,5,12:i:1,2
El Ag O es 1,4,5,12 ; el Ag H (fase 1) es i ; el Ag H (fase
2) es 1,2; las dos fases flagelares están presentes, por lo
tanto la serovariedad es difásica.
Salmonella Hadar 6,8:z10:e,n,x
Salmonella Typhi 1, 9,12[Vi]:d:-
47
ESQUEMA DE KAUFFMANN-WHITE (*)
48
Materiales y equipamiento
• Estufa de cultivo a 37ºC
• Heladera a 4ºC
• Baño de agua a 50ºC
• Ansas
• Tubos de ensayo
• Tubos de 13x100 mm con tapa a rosca
• Tubos de Craigie
• Cajas de Petri
• Láminas de vidrio de 20x20 cm
• Pipetas de 5 ml
• Gradillas
• Mecheros
• Lámparas para leer aglutinaciones
• Palillos de madera
Medios
• Estrías de agar tripticasa de soja (TSA)
• Agar movilidad al 0,7% (para inversión de fase)
• Agar movilidad al 0,5% (para Craigie)
• Caldo flagelar
Reactivos y Soluciones
• Antisueros diagnósticos O y H
• Solución salina al 2%
• Solución fisiológica formolada al 1%
Cepas bacterianas
Cepas de Salmonella spp. en agar TSA, cultivos de 18 horas a 37ºC
Esquema de Kauffmann-White (Poppof, M.Y., 8ª Ed, WHO Centre for Referente and
Research on Salmonella, Instituto Pasteur, París, Francia, 2001).
49
2.3.1- SEROTIPIFICACIÓN SOMÁTICA O
Procedimiento Comentario
Dia 1 Serotipificación somática O
• La determinación del antígno O de
Salmonella spp. se hace en lámina a partir
de un cultivo en agar TSA, incubado a 37ºC
por 18-24 horas
• Verificar que el cultivo se encuentre en
forma lisa:
- Mezclar una ansada de cultivo puro se
mezcla con una gota de solución salina al
2%, cuiadosammente con un palillo. Rotar
suavemente la lámina, durante 2 minutos.
Observar la presencia o ausencia de grumos:
a) Si hay grumos la cepa está rugosa.
b) Si no presenta grumos se realiza la
serotipificación somática O
• La detección de los antígenos somáticos se
realiza por aglutinación en lámina. Los
anticuerpos en el suero específico aglutinan
con la bacteria cuando el antígeno
correspondiente está presente. Es
importante que el aislamiento esté en forma
lisa.
• La aglutinación con solución salina al
2% debe dar negativa
• Para revertir la rugosidad se deben
realizar subcultivos de la cepa en agar
sangre o en agar Mueller Hinton, de manera
de recuperar la forma lisa y poder continuar
con la serotipificación somática O.
• Si no es posible la reversión de la forma
rugosa a la lisa, se debe confirmar su
identificación bioquímica y realizar la
seropitificación flagelar H.
50
• Enfrentar sobre una lámina de vidrio una
ansada del cultivo en agar TSA, con una
gota de los antisueros polivantes OS-A y
OS-B. Mezclar cuidadosamente con un
palillo. Mover suavemente la lámina,
durante 2 minutos, para favorecer la
reacción antígeno-anticuerpo y observar
presencia o ausencia de aglutinación, con luz
indirecta.
• Si hay aglutinación con alguno de los dos
antisueros polivalentes, probar los antisueros
de grupo O correspondientes.
• Si hay aglutinación con un antisuero de
grupo O, probar los antisueros de factores O
• Lectura e interpretación de resultados
Registrar el grado de aglutinación de la
siguiente manera:
• 4+: 75 a 100% de microorganismos
aglutinados
• 3+: 75% aproximadamente de
• Estos polivalentes comprenden el 98%
de las serovariedades aisladas del hombre y
de los animales. Estos antisueros cumplen
la función de una primera selección en
grandes grupos. Si la aglutinación no ocurre
con los polivalentes OS-A y OS-B puede
ser:
a) Una serovariedad no comprendida
en dichos antisueros, en tal caso remitir
la cepa al Laboratorio de Referencia
b) Una serovariedad que presente
antígeno de envoltura Vi (S. Typhi, S.
Paratyphi C y algunas cepas de S.
Dublin). En este caso se debe enfrentar
el cultivo con el antisuero Vi
51
microorganismos aglutinados
• 2+: 50% aproximadamente de
microorganismos aglutinados
• 1+: menos de 2% de microorganismos
aglutinados
• Negativo: ausencia de aglutinación. Se
observa una suspensión homogénea.
• Registrar los resultados tanto negativos
como positivos para los antígenos O
estudiados, en la Planilla 3 - Registro de
Resultados: Serotipificación Somática de
Cepas de Salmonella.
2.3.2- SEROTIPIFICACIÓN FLAGELAR H
Procedimiento Comentario
Día 1 Serotipificación flagelar H
• Sembrar la cepa de Salmonella spp. en 5
ml de caldo flagelar e incubar a 37ºC,
durante 18-24 horas.
Día 2
• Separar del caldo flagelar una alícuota de
0.5 ml en un tubo estéril de 13x100 con tapa
a rosca.
• Agregar al caldo flagelar restante 5 ml de
solución fisiológica formolada al 1% (caldo
• La detección de los antígenos flagelares
H se realiza por aglutinación en tubo o en
placa dependiendo de las características de
los antisueros. En este protocolo se describe
la aglutinación en tubo, ya que los
antisueros están preparados por el productor
para realizar la aglutinación en tubo.
52
formolado) y dejar reposar durante 1 hora a
temperatura ambiente
• Colocar en 4 tubos de ensayo una gota de
cada uno de los antisueros flagelares
polivalentes (HS-1, HS-A, HS-B y HS-C) y
agregar a cada tubo 0.5 ml del caldo
formolado.
• Incubar 1 hora a 50ºC en baño de agua y
registrar la presencia o ausencia de flóculos
con luz indirecta.
• Si hay aglutinación, con uno o dos de los
antisueros flagelares polivalentes, enfrentar
el caldo formolado, con los antisueros de
fase H correspondientes (una gota del
antisuero más 0,5 ml del caldo formolado)
• Si el antisuero de fase flagelar está
compuesto por más de un factor (por ej. 1,2),
determinar los factores H correspondientes,
utilizando los antisueros de factores
específicos
• La aglutinación flagelar tiene una
apariencia flocular, menos compacta que la
aglutinación somática. Su estructura
tridimensional no es estable, por lo tanto no
se deben agitar los tubos luego de la
incubación a fin de no disgregar los
flóculos.
• Si la cepa de Salmonella spp., de la cual
se ha identificado el antígeno O, no
reacciona con ninguno de los antisueros
flagelares polivalentes, hay que tener en
cuenta:
a) La cepa puede presentar un
antígeno no incluido en los
antisueros polivalentes, en este caso
debe ser remitida al Laboratorio de
Referencia, para completar su
serotipificación
b) Se puede tratar de una cepa
inmóvil, por la ausencia de flagelos
c) Se puede tratar de una cepa con
movilidad reducida. En este caso se
debe exaltar la movilidad por
53
Método de Inversión de Fase
• Fundir 10 ml de agar movilidad al 0.7%,
dejar enfriar a 50ºC.
• Mezclar en una caja de Petri dos gotas
del antisuero de la fase flagelar
predeterminada con el agar movilidad al
0.7%, homogenizar con movimientos de
rotación y dejar solidificar.
pasajes sucesivos en tubos Craigie o
en tubo en U con agar movilidad al
0.5%
• Si el cultivo aglutina con un solo
antisuero polivalente flagelar, puede ser:
a) Que se trate de una
serovariedad monofásica
b) Que sea una serovariedad
difásica, de acuerdo al Esquema de
Kauffmann-White, por los
resultados de la aglutinación O y
únicamente se expresa una sola fase
H, por lo tanto hay que poner en
evidencia la fase no detectada,
usando el “Método de inversión de
fase”.
• Es un método que permite poner en
evidencia, en caso de serovariedades
difásicas, la fase que no se expresó. Para
ello se inmoviliza la fase flagelar
establecida previamente con el antisuero
correspondiente a esa fase flagelar. Se trata
de un método de selección de los
microorganismos que presentan la fase
flagelar no expresada hasta ese momento.
54
• Sembrar una ansada del cultivo sin
formolar en el centro de la superficie del
agar
• Incubar a 37ºC, durante 18-24 horas.
Día 3
• Tomar el desarrollo bacteriano de la
periferia de la placa y enfrentar con el
antisuero de la fase sospechada.
• Lectura e interpretación de resultados
Registrar el grado de aglutinación de la
siguiente manera:
• 4+: 75 a 100% de microorganismos
aglutinados y el sobrenadante es un líquido
claro
• 3+: 75% aproximadamente de
microorganismos aglutinados y el
sobrenadante es un líquido ligeramente
turbio
• 2+: 50% aproximadamente de
microorganismos aglutinados y el
sobrenadante es un líquido moderamente
turbio
• 1+: menos de 2% de microorganismos
aglutinados y el sobrenadante es turbio
• Negativo: ausencia de aglutinación,
caracterizada por una suspensión
homogénea.
55
• Registrar los resultados tanto negativos
como positivos para los antígenos H
estudiados, en la Planilla 4 - Registro de
Resultados: Serotipificación Flagelar de
Cepas de Salmonella spp.
• Identificación de la serovariedad
Combinando los antígenos O y H
identificados se determina la serovaridad de
acuerdo con el Esquema de Kauffmann-
White.
Ver Tubos de Craigie y en U (Figura 2)
Ver Flujograma de Serotipificación (Figura 3)
FIGURA 2.- TUBOS DE CRAIGIE Y EN U
Tubo de Craigie Siembra del inóculo
Recolección del desarrollo
Tubo en U
Siembra del Inóculo Recolección del
desarrollo
56
FIGURA 3.- FLUJOGRAMA DE SETROTIPIFICACIÓN DE SALMONELLA
Cepa con características bioquímicas de Salmonella
Serotipificación somática Estría en TSA Serotipificación flagelar (aglutinación en lámina) (aglutinación en tubo)
Aglutinación con solución salina al 2% Caldo flagelar
Negativa Positiva Aglutinación c/ antisueros
poliv. flagelares H (4) Aglutinación c/ Cepa Rugosa (2) antisueros poliv. Negativa (5) Positiva somáticos (1) Aglutinación c/ Negativa (3) Positiva antisueros de fases H / factores H (6) Aglutinación c/ antisueros Positiva de grupo O
Positiva
Aglutinación c/ antisueros de factores O Positiva RESULTADO FINAL
(1) Antisueros polivalentes somáticos: OS-A y OS-B (2) Para revertir una cepa de la forma rugosa a lisa, se realizan subcultivos en agar sangre o Mueller Hinton. Si
no es posible revertir la rugosidad, se debe confirmar la identificación por pruebas bioquímicas y realizar la serotipificación flagelar H.
(3) Ver Consideraciones a tener en cuenta en "Serotipificación somática" (4) Antisueros polivalentes flagelares: HS-1; HS-A; HS-B; HS-C (5) Ver Consideraciones a tener en cuenta en "Serotipificación flagelar”. (6) Si la serovariedad de Salmonella es difásica y sólo expresa una fase, realizar "Método de inversión de fases"
57
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58
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Centre for Reference and Research on Salmonella. Institut Pasteur, Paris.
59
CAPÍTULO III –– PRECAUCIONES DE BIOSEGURIDAD
Los laboratorios de microbiología son ambientes de trabajo que pueden presentar riesgos de adquirir
enfermedades infecciosas para las personas que trabajan en ellos. Los accidentes en el laboratorio
ocurren por ausencia de entrenamiento, desconocimiento, experiencia escasa, cansancio, trabajar muy
rápido, no seguir prácticas seguras y subestimar la peligrosidad del trabajo.
Frente a estas situaciones se introdujo el concepto de bioseguridad que es el “conjunto de métodos
tendientes a minimizar el riesgo asociado al manejo de microorganismos, mediante la protección de
los operadores, personas del entorno, productos y medio ambiente”. Define las condiciones de
contención provistas por el uso de equipos de seguridad.
Los microorganismos se han clasificado en grupos de riesgo en función de su patogenicidad, forma y
facilidad de transmisión, la dosis infecciosa, y la existencia de tratamiento.
Los microorganismos con los cuales se trabajará Salmonella, Shigella y otros miembros de la Familia
Enterobacteriaceae, pertenecen al Grupo de Riesgo II, donde el riesgo individual es moderado y el
riesgo comunitario limitado. Estos microorganismos pueden provocar enfermedades en humanos y
animales, pero con pocas probabilidades de riesgo grave para el personal de laboratorio, animales o
medio ambiente. La exposición en el laboratorio puede provocar una infección pero se dispone de
medidas de tratamiento y de prevención y el riesgo de propagación es limitado.
1.- NIVEL DE LABORATORIO
El laboratorio donde se trabaja con estos microorganismos es de Nivel de Bioseguridad 2. En
este nivel el personal debe contar con una capacitación específica para el manejo de los
agentes patógenos y el director es un profesional competente. El acceso al laboratorio está
restringido cuando se están desarrollando actividades y la puerta de entrada debe tener el
símbolo indicador. Se toman precauciones especiales cuando se manejan elementos corto-
punzantes y se utilizan elementos de protección (ambos, delantales, guantes, máscaras
faciales) con los procedimientos que pueden representar un riesgo para el operador. Las
mesadas de trabajo tienen que ser impermeables al agua, resistentes al calor moderado y a los
productos químicos empleados en la desinfección.
60
El laboratorio debe disponer de un lavatorio para el lavado de manos y de adecuados sistemas
de decontaminación del material.
En los laboratorios está prohibido comer, beber, fumar, manipular lentes de contacto,
maquillarse.
2.- ELEMENTOS DE PROTECCION
a) Ambos, delantales o uniformes de laboratorio durante la permanencia en el mismo; esta
vestimenta no debe salir del laboratorio y el personal no puede llevarla a su casa para el
lavado.
b) Guantes cuando es posible que las manos entren en contacto con materiales infecciosos o
superficies contaminadas. Los guantes se descartan luego de su uso, no se lavan ni se reusan y
no se deben usar fuera del laboratorio.
c) Protección facial se requiere su uso cuando existe la posibilidad que algún procedimiento
genere gotas o aerosoles La protección facial esta dada por anteojos, máscaras faciales,
barbijos.
d) Gabinete de seguridad biológica, cuando existe la posibilidad de generación de gotas o
aerosoles. El gabinete que se utiliza es Clase II que protege al operador, los productos y el
medio ambiente. El aire externo no entra directamente a la mesa de trabajo sino que
previamente pasa por un filtro HEPA para luego ingresar al área de trabajo, y también sale al
ambiente a través de otro filtro, (Fig. 1).
Es obligatorio que los gabinetes se evalúen y certifiquen en el momento de la instalación en el
laboratorio, cuando se trasladan y por lo menos una vez por año a partir de ese momento.
FIGURA 1
61
Dentro del gabinete debe ingresar solamente el material indispensable para trabajar para
perturbar lo menos posible la circulación del aire dentro del gabinete.
3.- INSTRUCCIONES PARA EL TRABAJO
1. Leer cuidadosamente todas las instrucciones antes de comenzar con los protocolos de
trabajo.
2. Considerar POTENCIALMENTE CONTAMINADO a todo material de vidrio,
plástico, pipetas, espátulas, que esté en contacto con las suspensiones bacterianas.
3. Todo material contaminado potencialmente infeccioso se tratará en autoclave. No
efectuar ninguna limpieza del mismo en el laboratorio.
4. Descartar los residuos plásticos potencialmente infecciosos en recipientes resistentes a
la perforación, que contienen hipoclorito de sodio al 1%. Estos NO SE DEBEN
LLENAR COMPLETAMENTE.
5. Descartar los materiales con cultivos microbianos en recipientes con bolsas plásticas
de color rojo, para su posterior eliminación.
6. Descartar material de vidrio en recipientes de acero inoxidable con tapa de seguridad
para su posterior descontaminación en autoclave.
7. Cada mesada debe tener propipetas, guantes, alcohol 70% y una solución de
hipoclorito de sodio al 10%.
8. Notificar a las personas responsables del área o instructores de trabajos prácticos
cuando se produzcan derrames, quienes tomarán las medidas adecuadas según el caso.
9. Descartar el material de vidrio roto envolviendo los trozos en papel, colocarlo en bolsa
plástica y finalmente en un recipiente resistente y rotulado con claridad “vidrios rotos”.
4.- ACCIONES A REALIZAR EN CASO DE INCENDIO
1. Mantener la calma y avisar al resto de las personas.
2. Dar aviso al Departamento de Seguridad e Higiene.
3. Si el fuego es pequeño y sabe utilizar un extintor, úselo. Si el fuego es de
consideración no se arriesgue y evacue el laboratorio.
4. No corra, camine rápido, cerrando a su paso la mayor cantidad de puertas.
5. No lleve objetos ya que pueden entorpecer su salida.
62
6. Si pudo salir del laboratorio, por ninguna causa vuelva a entrar. Deje que los equipos
especializados se encarguen.
5.- CENTROS PARA REQUERIR AYUDA
Se deben tener disponibles los números telefónicos correspondientes.
6.- TRANSPORTE DE MUESTRAS
El acondicionamiento seguro de muestras para diagnóstico bacteriológico es responsabilidad
de todos los involucrados en el proceso: el profesional, el responsable del laboratorio y el
personal de la empresa de transporte. El embalaje de los materiales infecciosos debe evitar la
fuga de los mismos por rotura o mal empaque del envío.
Los materiales para diagnóstico se deben enviar en el “sistema de triple envase” de acuerdo a
las recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud WHO/EMC/97.3. (Fig. 2)
El sistema consiste de:
a) Recipiente primario, a prueba de pérdidas, con cierre hermético (tubo pequeño o vial),
en el cual se coloca la muestra.
b) Recipiente secundario, resistente, a prueba de fugas, impermeable, donde se incluye el
recipiente primario.
c) Envoltorio externo, para proteger el envase secundario de influencias externas, como
daño físico o agua.
El espacio entre los recipientes primario y secundario se debe llenar con material absorbente,
para retener el contenido del recipiente primario en caso que ocurra una pérdida durante el
transporte.
Los formularios con datos de la muestra, notas y todo otro tipo de información que
identifiquen o describan a la muestra, al remitente y al destinatario, se deben colocar alrededor
del recipiente secundario.
63
FIGURA 2
REFERENCIAS
Laboratory Biosafety Manual, 3rd ed., World Health Organization Geneva, 2004 www.who.int
Biological Safety. Principles and Practices, 3rd ed. Fleming, D.O., Hunt, D.L. Ed.
Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 4th ed., Richmond J., McKinney Ed. CDC/NIH,
2001. www.cdc.gov.
Safety in Health-Care Laboratories. World Health Organization Geneva, 1997. www.who.int/.
64
CAPÍTULO IV - MEDIOS DE CULTIVOY SOLUCIONES
Descripción y Preparación
La mayoría de los medios de cultivo se encuentran disponibles comercialmente
Caldo Selenito
Para el enriquecimiento selectivo de Salmonella en materia fecal, orina y tejidos infectados,
incluída Salmonella Typhi, pero no sirve para Shigella.
El selenito inhibe el crecimiento de coliformes intestinales y enterococos, principalmente en
las primeras 6 a 12 horas de incubación.
No son inhibidos Salmonella, Proteus, Pseudomonas.
Los componentes del medio son: peptona o triptona 5.0 g, lactosa 4.0 g, selenito de sodio 4.0
g, fosfato dipotásico (K2HPO4) 3.5 g, fosfato monopotásico (KH2PO4) 6.5 g. Disolver los
componentes en 1000 ml de agua destilada calentando hasta 60ºC si es necesario y esterilizar
por filtración. NO AUTOCLAVAR
Si se observa un color rojo ladrillo de selenito precipitado, el medio no se debe utilizar.
El material sólido se inocula directamente en el caldo, el material líquido se debe mezclar en
una relación 1:1 con caldo a doble concentración. Se incuba 24 horas a 37ºC. El pasaje a
medios selectivos se puede hacer al cabo de 6 a 12 horas.
Caldo Tetrationato
Es un caldo que se usa para el enriquecimiento selectivo de Salmonella, excepto para S.
Typhi, S. Pullorum y S. Gallinarum. El tetrationato junto con el tiosulfato inhibe los
coliformes, mientras que las bacterias reductoras de tetrationato como Salmonella y Proteus
pueden crecer sin dificultad. Las sales biliares inhiben a todos los micoorganismos intestinales
acompañantes y el verde brillante inhibe la flora gram positiva.
Solución de verde brillante: se disuelve 0.1 g del colorante en 100 ml de agua destilada estéril.
Solución de iodo-ioduro de potasio: se disuelven en 16 g de yodo y 20 g de yoduro de potasio
en 80 ml de agua destilada estéril.
65
Los componentes del medio son: extracto de carne 0.9g, peptona 4.5 g, extracto de levadura
1.8 g, cloruro de sodio 4.5 g, carbonato de calcio 25.0 g, tiosulfato de sodio 40.7 g, sales
biliares 4.75 g, solución de verde brillante 1:1000 10 ml, solución de iodo-ioduro de potasio
20 ml. Se disuelven los componentes 1000 ml de agua destilada estéril con agitación. Se
agrega en forma aséptica la solución de verde brillante y luego la solución de iodo-ioduro de
potasio. Se ajusta el pH a 7.4-7.8 a 25ºC. El caldo se guarda en heladera. NO
AUTOCLAVAR. El caldo preparado y listo para usar debe ser utilizado el mismo día de su
preparación.
Caldo Flagelar
Es un caldo que se usa para la determinación de antígenos flagelares. Los componentes del
medio son: caldo tripticasa de soja 15.0 g, caldo triptosa 13.0 g. Disolver los componentes en
1000 ml de agua destilada con ebullición hasta disolución completa. Se fracciona en
volúmenes de 5 ml en tubos de 16x150 con tapa a rosca y se autoclava a 121ºC por 15
minutos.
Solución Salina
Se disuelve 8.5 g de cloruro de sodio en 1000 ml de agua destilada, ajustar a pH 7.0 y
autoclavar a 121ºC por 20 minutos.
Agar Movilidad (Swarm Agar)
Los componentes del medio son: extracto de levadura 1,0g, extracto de carne 5,0g, caldo
tripticasa de soja 30g, agar-agar de 5 a 10g dependiendo de la dureza deseada. Los
componentes se disuelven en 1000 ml de agua destilada calentando si es necesario. Se ajusta
el pH a 7.4 y se autoclava a 121ºC por 15 minutos.
Agar Nutritivo
Los componentes del medio son: extracto de carne 3.0 g, peptona 5.0 g, agar 12.0 a 18.0 g.
Disolver los componentes en 1000 ml de agua destilada con ebullición si es necesario,
autoclavar a 121ºC por 20 minutos, ajustar el pH a 7.0 luego de esterilizar.
66
Agar Mueller-Hinton
El medio contiene: extracto de carne 2.0 g, hidrolizado ácido de caseína 17.5 g, almidón 1.5 g,
agar 17.0. Disolver los componentes en 1000 ml de agua destilada calentando si fuera
necesario, ajustar el pH a 7.2-7.4 y autoclavar a 110ºC por 20 minutos.
Agar EMB
Es un medio selectivo y diferencial para el aislamiento de bacterias patógenas intestinales
Gram (-). El contenido de lactosa y sacarosa hace posible la diferenciación de Salmonella y
Shigella lac/sac (-), de la flora acompañante lac (-)/lac (+) (Proteus vulgaris, Citrobacter,
Aeromonas hydrophila). La combinación de colorantes es la que permite diferenciar entre los
fermentadores y no fermentadores de lactosa. La sacarosa se incluye porque algunos
coliformes la fermentan más rápido que a la lactosa.
El desarrollo de las bacterias Gram (+) está inhibido por los colorantes del medio (eosina
amarilla y azul de metileno).
Agar EMB Levine contiene solamente lactosa.
Los componentes del medio son: peptona 10.0 g, fosfato dipotásico (K2HPO4) 2.0 g, lactosa
5.0 g, sacarosa 5.0 g, eosina amarilla 0.4 g, azul de metileno 0.07 g. Disolver los componentes
en 1000 ml de agua destilada y autoclavar a 121ºC por 15 minutos.
Aspecto de las colonias
Salmonella, Shigella transparentes, ámbar rosado
Escherichia violáceas con brillo metálico y centro negro azulado
Enterobacter, Klebsiella más grandes que las anteriores, mucosas sin brillo
metálico y centro oscuro.
Bacterias lac (+) negras o centro oscuro, halo transparente
Bacterias lac (+) o sac (-) incoloras
Agar MacConkey
Es un medio selectivo y diferencial para aislar microorganismos fermentadores y no
fermentadores de lactosa.
67
Sirve para aislar Salmonella, Shigella, y coliformes de materia fecal, orina, alimentos y aguas
residuales.
Es un medio de baja selectividad para usar con inóculos pequeños.
Las sales biliares y el cristal violeta inhiben microorganismos Gram (+). La presencia de
lactosa permite el desarrollo de las cepas lac (+) que se manifiesta por el viraje del indicador
debido a la producción de ácido; luego se absorbe el rojo neutro dando color rojo a la colonia
y un halo turbio por la precipitación de las sales biliares por la acidez del medio. Las bacterias
no fermentadoras de lactosa (S. Typhi, S. Paratyphi, Shigella dysentariae) no alteran el medio,
dando colonias incoloras y transparentes. Para detectar S. Typhi hay que usar medio
MacConkey con agar SS y agar bismuto sulfito.
Los componentes del medio son: peptona 1.7 g, proteosa-peptona 3.0 g, lactosa 10.0 g sales
biliares 1.5 g, rojo neutro 0.03 g, cristal violeta 0.001g, cloruro de sodio 5.0 g. Disolver los
componentes en 1000 ml de agua destilada, calentando si es necesario, ajustar a pH 7.1 y
esterilizar a 121ºC, durante 15 minutos.
Aspecto de las colonias
Salmonella, Shigella incoloras, medio amarillo
Escherichia rojas, halo turbio
Enterobacter, Klebsiella grandes, rosadas a rojo, mucosas
Proteus Incoloras
Agar SS
Es un medio selectivo para Salmonella y Shigella a partir de materia fecal, alimentos y
animales; pero no es el ideal para Sh. dysenteriae y Sh. boydii. Sirve también para Y.
enterocolitica y para diferenciar fermentadores de lactosa de los no fermentadores. La
presencia de verde brillante, bilis de buey, alta concentración de tiosulfato y el citrato inhiben
la flora acompañante. El tiosulfato y la sal de hierro ponen en evidencia la formación de
sulfuro de hierro. La degradación de la lactosa a ácido provoca el viraje del indicador rojo
neutro a rojo.
68
Los componentes del medio son: extracto de carne 5.0 g, proteosa-peptona 5.0 g, lactosa 10.0
g, citrato de hierro amoniacal 1.0 g, tiosulfato de sodio 8.5 g, sales biliares 8.5 g, verde
brillante 0.003 g, rojo neutro 0.025 g, agar 13.5 g. Disolver los componentes en 1000 ml de
agua destilada calentando hasta disolución de los mismos. NO AUTOCLAVAR
Aspecto de las colonias
Salmonella incoloras, transparentes, centro negro
Shigella incoloras, transparentes, medio amarillo
Proteus transparentes, centro rojo, medio amarillo
Escherichia coli rosadas a rojo, medio rojo
Enterobacter aerogenes rosadas a crema, opacas, mucosas
Bacterias lactosa+ rojizas, mucoides, centro negro
Agar Hektoen
Es un medio selectivo para bacterias intestinales, incluídas algunas shigellas. No tiene efecto
inhibidor sobre Salmonella y Shigella pero si sobre flora acompañante. Debido a los dos
indicadores (azul de bromotimol y fucsina), las colonias lac+ tienen una diferencia cromática
con las colonias lac-; lo mismo ocurre con bacterias fermentadoras de sacarosa y salicina. El
tiosulfato con el hierro dan coloración negra a las colonias sulfídrico+. Las sales biliares
inhiben a la flora acompañante. Puede agregarse novobiocina para inhibir Citrobacter y
Proteus.
Los componentes del medio son: peptona 15.0 g, extracto de levadura 3.0 g, sacarosa 14.0 g,
lactosa 14.0 g, salicina 2.0 g, tiosulfato de sodio 5.0 g, citrato de hierro amoniacal 1.5 g, sales
biliares 2.0 g, azul de bromotimol 0.05 g, fucsina ácida 0.08 g, agar 13.5 g. Disolver los
componentes en 1000 ml de agua destilada estéril. NO AUTOCLAVAR.
Aspecto de las colonias
Shigella, Providencia verdes, planas, transparentes
Salmonella, Proteus verde-azuladas, c/s centro negro
Pseudomonas verde-azuladas, planas, borde irregular
Coliformes salmón, halo de precipitación
69
Agar Verde Brillante
Excelente medio de gran selectividad para el aislamiento de Salmonella a partir de materia
fecal; pero no puede usarse para aislar S. Typhi.
Los fermentadores de lactosa o sacarosa que pueden crecer en este medio se diferencian
rápidamente debido a la formación de colonias verde-amarillentas, rodeadas de una zona de
igual color. Esto se debe a la fermentación de los azúcares que produce acidez, haciendo virar
el indicador (rojo fenol) a amarillo. En medio alcalino se observa un color rojo intenso.
El verde brillante inhibe microorganismos Gram (+), S. Typhi y Shigella. Para inhibir Proteus
se recomienda agregar 0,2% de desoxicolato de sodio. La selectividad del medio permite usar
inóculos densos. Si se exceden los 15 minutos de esterilización a 121ºC, disminuye la
selectividad del medio.
Los componentes del medio son: proteosa-peptona 10.0 g, lactosa 10.0 g, sacarosa 10.0 g
extracto de levadura 3.0 g, rojo fenol 0.09 g, verde brillante 0.0047 g, agar 12.0 g. Disolver
los componentes en 1000 ml de agua destilada hasta ebullición y mantener por 1 minuto;
ajustar a pH 6.7-7.1. NO AUTOCLAVAR
Aspecto de las colonias
Salmonella a veces Proteus y Citrobacer rosa pálido, transparentes
E. coli, Enterobacter verde-amarillo
Klebsiella, Bacterias lactosa + opacas, halo verde-amarillo
Agar XLD
Es un medio de selectividad moderada a alta que permite ser usado con Salmonella y Shigella.
La degradación de xilosa, lactosa y sacarosa produce acidez que hace virar el indicador al
amarillo. El tiosulfato y la sal de hierro ponen en evidencia la producción de sulfídrico. La
decarboxilación de la lisina a cadaverina se visualiza por la presencia de un color rojo púrpura
por aumento del pH. El desoxicolato inhibe Gram (+). La diferenciación de
Salmonella/Shigella de otras enterobacterias se basa en tres reacciones: fermentación de
xilosa, decarboxilación de lisina y producción de sulfídrico. La xilosa diferencia Shigella de
Providencia que no fermenta xilosa o lo hace muy lentamente; la lisina diferencia Salmonella
70
de los fermentadores de xilosa no patógenos. La lactosa y la sacarosa en exceso evitan que los
coliformes lis+ reviertan la condición alcalina de los microorganismos consumidores rápidos
de xilosa/lisina. La producción de sulfídrico ocurre en condiciones alcalinas dando colonias
con centro negro; en condiciones ácidas la precipitación negra se inhibe.
Los componentes del medio son: extracto de levadura 3.0 g, xilosa 3.75 g, lactosa 7.5 g,
sacarosa 7.5 g, l-lisina hidrocloruro 5.0 g, desoxicolato de sodio 1.0 g, tiosulfato de sodio 6.8
g, citrato de hierro amoniacal 0.8 g, rojo fenol 0.08 g,cloruro de sodio 5.0 g, agar 15.0 g.
Disolver los componentes en 1000 ml de agua destilada. Calentar hasta que comience a hervir
(no sobrecalentar); llevar a un baño de 50ºC siempre con agitación. Ajustar el pH a 7.4±0.2 a
25ºC. Guardar a 4ºC por 14 días, en la oscuridad.
El precipitado que ocasionalmente presenta el medio no perjudica su rendimiento, puede
eliminarse por filtración.
Aspecto de las colonias
E. coli, Enterobacter amarilla, opacas, con precipitado
Aeromonas amarilla, opacas, con precipitado
Klebsiella amarilla, opacas, mucosas, c/precipitado
Citrobacter amarilla, opacas, centro negro
Serrati, Hafnia amarilla, opacas
P. vulgaris, P. mirabilis amarilla, translúcidas, centro negro
Salmonella igual color del medio, centro negro
Shigella, Providencia igual color del medio, translúcidas
S. Typhi amarilla, ligeramente opacas
71
CAPITULO V - PLANILLA DE RESULTADOS
PLANILLA 1 – REGISTRO DE RESULTADOS:
AISLAMIENTO DE SALMONELLA spp.
MORFOLOGIA EN PLACAS DE AGAR SELECTIVO
Fecha:
Nombre:
Muestra: ____________
Color Resultados Comentarios Morfología en MC
Morfología en SS
Morfología en XLD
De Selenito: Morfología en MC
Morfología en SS
72
PLANILLA 2 – REGISTRO DE REDULTADOS: AISLAMIENTO DE SALMONELLA spp. PRUEBAS BIOQUIMICAS
Fecha:
Nombre:
Muestra:
Color Resultados Comentarios
TSI Botón
TSI Estría
TSI Gas
TSI H2S
LIA Botón
LIA Estría
LIA H2S
Hidrólisis de urea
Lisina decarboxilasa
Ornitina decarboxilasa
Arnina dehidrolasa
Reacción deβ-galactosidasa
Reacción de Voges-Proskauer
Reacción de indol
Agar SIM (H2S)
Agar SIM (Indol)
Agar SIM (Movilidad)
Fermentación de Dulcita
Utilización del Molonato
Resultado general: _______________________________________
73
PLANILLA 3 – REGISTRO DE RESULTADOS: SEROTIPIFICACION SOMATICA DE CEPAS DE SALMONELLA spp.
Fecha:
Nombre:
Muestra: ________________
OSA OMB OMC OMD OME OMF Control
OSA 1,2,12 4,5,12 9,12 9,46 3,10 3,15 1,3,19 21
OSB 6,7,8 6,7 6,8 13,22 13,23 6,14,24 6,14 8,20 11
OSC 16 17 18 28 30
OSD 35 38 39 40 41 42 43 44 45
OSE 47 48 50 51 52
OSF
74
PLANILLA 4 – REGISTRO DE RESULTADOS: SEROTIPIFICACION FLAGELAR DE CEPAS DE SALMONELLA spp.
Fecha:
Nombre:
Muestra: ______________
HSA HSB HSC HS1 Control
HSA a B c d i z10 Z29
HSB e,h e,n,x e,n,z15 f.g g,m g,p m,t
HSC k l,v l,w r y Z z4,z23
HS1 1,2 1,5 1,6 1,7 z6
HSA HSB HSC HSD HS1 Control
HSA a b c d i z10 z29
HSB e,h E,n,x e,n,z15 f.g g,m g,p m,t
HSC k l,v l,w r y Z z4,z23
HS1 1,2 1,5 1,6 1,7 z6
75
PLANILLA 5 – REGISTRO DE RESULTADOS: SEROTIPIFICACION DE CEPAS
DE SALMONELLA spp.
Fecha: Nombre: Muestra: ________________
Antígeno O A-67 A-I Gr. A Gr. B Gr. C Gr. D Gr. E
Gr. A O:1 O:2 O:12
Gr. B O:1 O:4 O:5 O:12 O:27
Gr. C O:6 O:7 O:8 O:14 O:20
Gr. D O:1 O:9 O:12 O:46
Gr. E O:1 O:10 O:15 O:19 O:34
Antígeno H H:H(a-z) H:L H:G H: no específico
H:L H:lv H:v H:w H:z13 H:z28
H:G H:f H:g H:s H:t H:m H:p H:q
H: no específico H:2 H:5 H:6 H:7 H:z6
Gr. B H:a H:b H:c H:d H:eh H:i
Gr. C H:a H:b H:c H:eh H:r
H:h H:x H:z15 H:z23 H:z24 H:z32
Fórmula Antigéncia: ___________________________ Serovariedad: _____________________
76
PLANILLA 6 – REGISTRO DE RESULTADOS: SEROTIPIFICACION DE CEPAS
DE SALMONELLA spp.
Fecha: Nombre:
Muestra: ________________
O:5 O:9 O:10 O:15 O:19 O:27 O:34 O:46
O:7 O:8 O:20 O:22 O:23
H:h H:x H:z15 H:m H:p H:s H:t H:f H:q H:u
H:v H:w H:z23 H:z24 H:z32 H:z13 H:z28
H:2 H:5 H:6 H:7
Fórmula Antigéncia: ___________________________ Serovariedad: _____________________
